MXNL06000077A - Un antigeno modificado para deteccion de anticuerpos contra brucella y metodo de uso. - Google Patents

Abstract

Un método que utiliza un antígeno extraído de brucilla y modificado mediante la conjugación con un fluorocromo, que se emplea para detección de anticuerpos contra brucelas lisas por medio de la prueba de fluorescencia polarizada, de forma que mejora el proceso de diagnostico de la brucelosis caprina aceptado internacionalmente.??.

Description

UN ANTÍGENO MODIFICADO PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA BRUCELLA Y MÉTODO DE USO.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al campo de la Inmunología, es una técnica de fluorescencia polarizada para medir la cantidad de anticuerpos en suero y fluidos corporales contra Brucella. Esta prueba es altamente sensible y específica, capaz de diferenciar anticuerpos vacunales de aquellos producidos durante la infección de campo.

OBJETO DE LA INVENCIÓN El Objetivo de la invención es el uso del inmunoanálisis de fluorescencia polarizada con un antígeno conjugado con isotiocianato de fluoresceína, para el diagnóstico de brucelosis caprina, aportando una mejora técnica a los métodos actuales que se han aceptado internacionalmente para usarse en el diagnóstico de brucelosis en cabras.

ANTECEDENTES La brucelosis es una enfermedad infecciosa de importancia mundial para la ganadería debido a que ocasiona perdidas elevadas ocasionadas por abortos, infertilidad, baja de la producción láctea e interrupción de los programas genéticos, entre otros, y se mantiene como una de las zoonosis de mayor distribución en el mundo. Es ocasionada por bacterias del género Brucella, el cual esta compuesto por cinco especies que afectan a diversas especies animales, así B. abortus, afecta principalmente bovinos; B. melitensis, afecta cabras, ovinos, bovinos y humanos; la B. suis afecta cerdos y humanos; B. ovis afecta ovinos y la B. canis afecta a perros. Las tres primeras tienen repercusiones en las actividades pecuarias, afectando con pérdidas elevadas la economía de los países afectados, como México. Las medidas de control y erradicación de brucelosis se basan principalmente en campañas de vacunación, diagnóstico y sacrificio de animales positivos a las pruebas de diagnóstico. Las pruebas de diagnóstico de brucelosis aceptadas por la Oficina Internacional de Epizootias (2004) son las pruebas de aglutinación de rosa de Bengala (conocida como prueba de tarjeta o prueba de antígeno buferado de tarjeta), que se usa en como prueba de escrutinio y la prueba de fijación de complemento que se usa como prueba complementaria o confirmatoria para los sueros positivos al rosa de Bengala.

Esas pruebas tienen la desventaja de que también detectan anticuerpos que se producen contra otras bacterias que tienen en su superficie el lipopolisacárido liso que es similar al de Brucella (Nielsen, 2004), particularmente Yersinia enterocolitica 0:9 (Corbel and Cuiten, 1970). Otra desventaja del uso de la combinación de la prueba de tarjeta y fijación de complemento es que esta combinación es tardada, cara y técnicamente difícil de realizar por la mayoría de los laboratorios de diagnóstico, debido a lo complicado que resulta la prueba de fijación de complemento. A diferencia de su uso en bovinos, en caprinos y ovinos se utiliza la prueba de tarjeta a una concentración de 3% de células de bacterias con el propósito de aumentar su sensibilidad (Diaz-Aparicio, et al, 1994), aunque con esto su especificidad disminuye a 65%, o sea que de 100 resultados positivos, 35 son falsos positivos. Además, se reconoce que ambas pruebas tienen una baja especificidad cuando se utilizan para probar animales inmunizados con vacunas vivas de cepas lisas de brúcela. (Blasco, 1992, OIE 1996, Díaz-Aparicio et al., 1994), Por ello, para disminuir el número de falsos positivos que ofrece la prueba de tarjeta se requiere de la confirmación de resultados positivos a la prueba de tarjeta con la prueba de fijación de complemento (OIE, 2004), de otra forma los animales falsos positivos, en la mayoría de los países con campañas de erradicación de la enfermedad, son enviados al rastro por considerarse infectados erróneamente. El pobre desempeño de la prueba de tarjeta y de la prueba de fijación de complemento en el diagnóstico de brucelosis favoreció el desarrollo de pruebas altamente sensibles, específicas y confiables, capaces de discriminar entre resultados positivos debidos a vacunación, económicas, rápidas para ser usadas para vigilancia y diagnóstico. Así, Díaz en la patente española 504488 con fecha 31 de julio de 1981 (caduca actualmente) describió la extracción de un antígeno-polisacárido B (conocido también como PoliB) de una cepa rugosa de Brucella melitensis para el diagnóstico de brucelosis bovina mediante la prueba de la inmunodifusión radial. Por otro lado también se ha descrito con ese fin el uso del hapteno nativo extraído de la cepa lisa de B. melitensis 16M, y el cual de acuerdo a que Hernández, A, L, y Díaz A. E. (2001 ) al usarse con la prueba en pruebas de inmunodifusión en gel (IDG) en cabras ofrece una sensibilidad y especificidad de 95 y 100 % respectivamente, además en cabritas vacunadas con dosis clásica muestra una especificidad de 100% a los 60 días posvacunación y en ovinos entra 90 a 100% de sensibilidad, dependiendo de la ruta de vacunación empleada. Esto indica, que al igual de la cadena O del polisacárido el PoliB, el hapteno nativo tiene la ventaja de que al usarse no se afecta por anticuerpos inducidos por la vacunación en bovinos. Sin embargo, su uso no se ha generalizado dado que esta prueba es relativamente insensible y el tiempo para realizarla es largo (Jones, L, et al., 1980) y no son aceptadas por la OIE (2004). Dentro de las técnicas descritas para medir la cantidad de anticuerpos en suero y fluidos corporales contra Brucella abortus y que no se afecta por anticuerpos inducidos por vacunación, está la prueba de fluorescencia polarizada, que se emplea también para diversos fines en medicina en humanos, entre ellos la detección de hormonas, drogas terapéuticas y drogas de abuso, entre otras. Para el diagnóstico de brucelosis en bovinos, cerdos, cérvidos y bisontes la fluorescencia polarizada se emplea el antígeno de la cadena O de lipopolisacárido (O-LPS) de Brucella abortus conjugado con isotiocianato de fluoresceína como marcador de la unión antígeno anticuerpo (Nielsen, et al., 1996; USPAT nums 5,976,820; Pat. Española 504482; Pat. Europea 2,215,197; USPAT 6,596,546). Esta prueba ha mostrado que es altamente sensible y específica para el diagnóstico de brucelosis en bovinos en los que es capaz de diferenciar anticuerpos vacunales de aquellos producidos durante la infección de campo. Sin embargo, en muestras de cabras provenientes de zonas con alta prevalencia y donde se aplica la vacuna Rev de Brucella melitensis su desempeño es inferior al que se obtiene en bovinos cuando se compara con las pruebas estándares recomendadas por la Organización Internacional de Epizootias (OIE) para el diagnóstico de brucelosis caprina. (Nielsen, et al., 2005; Ramírez-Pfeiffer, et al., 2006), por lo que no se ha aceptado oficialmente para usarse en el diagnóstico de brucelosis en cabras y ovinos y se han requerido mas estudios para comprobar su utilidad. Entre los antígenos principales contra los que se induce la producción de anticuerpos de un animal al ser infectados, está la cadena O del lippolisacárido liso (S-LPS) que se encuentra sobre todo en la pared celular de la brúcela, que es una molécula inmunodominante de la superficie celular, capaz de inducir respuestas de anticuerpos en la mayoría de los animales expuestos a brúcelas lisas (Schurig, 1998). El LPS, consta de un glicolípido (lípido A) insertado en la membrana externa y por tanto no expuesto a la superficie, y un polisacárido dirigido hacia el exterior (Moriyon y López-Goñi, 2001 ); este polisacárido se divide en dos secciones, el núcleo, más interno, y la cadena O-polisacárido (OPS). EL LPS está formado por un solo azúcar, la N-formil-perosamina, que es un polímero linear de glucosa sin ramificaciones (Cherwonogrodzky et al., 1991 ). Además del O-polisacárido, las brúcelas en fase lisa contienen un segundo antígeno llamado hapteno nativo (HN) de superficie (Moriyon y López-Goñi, 1998, 2001 ) que es químicamente equivalente a la cadena O-polisacárido y aunque su estructura epitópica es semejante, su papel biológico podría ser diferente, pues el hapteno nativo podría representar una molécula de superficie que se inserta entre los lipopolisacáridos de de tipo liso (LPS-S) y que contribuirían a dar a la superficie características de tipo liso, sin incrementar la densidad de lipopolisacárido y sus secciones internas (Moriyon y López-Goñi, 2001 ). La cadena o del polisacárido y el hapteno nativo, están relacionadas serologica y químicamente, (Chernowodorowsky el al, 1991 , USPAT 5,006,463). Aunque existen variaciones en de la cadena O de B. abortus y B. melitensis, que acarrean los epítopes A (A de abortus) y B (B de melitensis), respectivamente (Weymants, et al., 1996). Así, el polisacárido tipo O (O-PS) del lipopolisacárido (O-LPS) de Brucella abortus, descrito para su uso en el diagnóstico de la brucelosis bovina por medio de la prueba de fluorescencia polarizada, esta compuesto por subunidades de cadena O (conteniendo residuos de 4,6-dideoxi-4-formamido-D-manopiranosa), según lo descrito en las patentes: USPAT 5,976,820 del 2 de noviembre del 1999, USAPAT 5,006,463 del 9 de abril de 1991 , en la patente europea 2215197 del 13 de agosto de 1997 así como en la patente de Estados Unidos 6,596,546 del 22 de julio del 2003, mientras que en B. melitensis la cadena O que forma el hapteno nativo consiste en bloques repetidos de cinco residuos de N-formylperosamina, cuatro ligados a a-1 ,2 y uno ligado a a-1 ,3 (Perry y Bundle, 1990, Moriyon y López-Goñy, 1998). Tanto el lipopolisacárido liso como el hapteno nativo son moléculas relevantes en el diagnóstico serológico (Alonso-Urnamenta, et al., 1998). La generalidad de las pruebas serológicas que se utilizan actualmente detecta anticuerpos dirigidos al LPS-S (Nielsen et al., 1996a; Schurig, 1998).

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN En la presente invención se utiliza el hapteno nativo de Brucella melitensis conjugado con un fluoróforo que es disuelto en una solución tamponada a una concentración definida y a esta solución se le agrega un volumen definido de una solución que contenga anticuerpos y que se unen entre sí formando un complejo cuya intensidad de la fluorescencia es que es posible cuantificar por medio de un lector de fluorescencia. Se realiza una lectura inicial después de mezclar el hapteno nativo de Brucella melitensis conjugado con un fluoróforo y una lectura final, después de 3 a 5 minutos de agregar la solución con los anticuerpos. Lo que mejora la capacidad diagnóstica de la prueba de fluorescencia polarizada descrita con anterioridad.

El objeto de esta invención es proporcionar un método de detección de anticuerpos de cabras dirigidos contra Brucella que es simple, ya que se realiza con un sólo reactivo y dos pasos para la preparación de la mezcla de prueba para la lectura de la fluorescencia polarizada mediante un lector de fluorescencia polarizada.

Para el desarrollo de esta invención se pueden utilizar diferentes fluoróforos para la conjugación del hapteno nativo de B. melitensis, mismos que ya han sido descritos en detalle en el Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, by Richard P. Haugland, PH.D., 1996. Published by Molecular Probes, Inc; sin embargo, se prefiere para la conjugación del hapteno nativo de la cepa Revi de B. melitensis, motivo de este invento, al isotiocianato de fluoresceína para detectar anticuerpos de Brucella en cabras por medio de la prueba de fluorescencia polarizada.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En la Figura 1. Se observa la distribución las lecturas obtenidas en repeticiones de las pruebas realizadas a los sueros seleccionados como controles de cabras. En el eje X se observan las lecturas individuales de las repeticiones practicadas a cada tipo de suero en diferentes tiempos, 214 repeticiones del suero negativo (1 ), 163 repeticiones del suero positivo débil (2), y 230 repeticiones del suero positivo fuerte (3), mientras que en el eje Y se observa la medición de la fluorescencia polarizada determinada por el lector de fluorescencia polarizada representadas en Unidades de milipolarización denominadas milipees y representadas como mP.

En la Figura 2 se observa la sensibilidad y la especificidad para varios puntos de corte, cada uno corresponde a la sensibilidad y especificidad de la lectura de cada punto y se forma con el conjunto una curva; y en la gráfica en el eje de las X se encuentra la especificidad y en el eje de las Y la especificidad- 00, o sea que para cualquier punto de la curva existe una sensibilidad y especificidad. Si los resultados de las pruebas tuvieran 100% de sensibilidad y 100% de especificidad la curva llenaría el gráfico hasta el punto superior izquierdo. De acuerdo al análisis ROC practicado con un punto de corte para la prueba de florescencia polarizada con el cual se obtiene una máxima sensibilidad y especificidad es de > a 104 mP. Lo que significa que cualquier suero con una lectura superior a 104 mP es considerado como positivo.

En la Figura 3 se observa el análisis de la curva ROC de resultados del marcador de hapteno nativo con sueros de caprinos considerados como positivos y negativos por las pruebas aceptadas por la OIE (2004). El análisis ROC gráfica todos los pares de sensibilidades/especificidades y gráficamente ilustra el efecto del cambio del valor de corte en los pares de sensibilidad/especificidad; esto significa que para cada resultado individual se calcula su sensibilidad y especificidad, y con todos ellos se genera una curva, que llega a la esquina superior izquierda cuando una prueba tiene 100% de sensibilidad y 100% de especificidad, y cuando los resultados son debidos al azar se encuentran en la línea diagonal.

En la Figura 4 se observa la gráfica del análisis ROC de los resultados del marcador del hapteno nativo con el método estándar. En la figura se observa que la curva que se aproxima más hacia la esquina superior izquierda es la que corresponde al marcador de HN, seguido por el marcador de OPS y la prueba de fijación de complemento, tiene una curva igual a la que tiene la misma fijación de complemento con la prueba de tarjeta; y la prueba de tarjeta tiene una curva que corresponde con la línea diagonal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente invención se hace uso del inmunoensayo de fluorescencia polarizada para la detección de anticuerpos contra Brucella empleando como indicador de la reacción al hapteno nativo de la cepa lisa de Revi de B. melitensis, el cual en un primer paso fue obtenido y purificado por medio de la técnica descrita por Díaz-Aparicio, E., et al., (1994) para la extracción del hapteno nativo, mismo que fue adaptado del método descrito por Díaz er al., en 1981 para la extracción del antígeno-polisacárido B de B. melitensis M19 para ser utilizada en el diagnóstico de brucelosis mediante la prueba de inmunodifusión. Para esta invención se extrajo el hapteno nativo de un cultivo de 48 horas a 37 °C de la cepa de S. melitensis Revi , la cual fue sembrada en placas petri con agar Brucella. Después de esta incubación se cosecharon las bacterias y se agregó de fenol 0.5% final, se agitó la solución ligeramente y se incubó por otras 24 horas a 37° C, después de lo cual se cosecharon las bacterias por centrifugación y se resuspendieron en 100 mi de agua destilada y se esterilizaron a 120° C por 15 minutos, Se centrifugó el cultivo y al sobrenadante se le agregaron de 2 a 1 a 5 a 1 volúmenes de etanol, preferentemente 3 a 1 ; y se mantuvo en agitación por 18h a 4-8 °C. Posteriormente se centrifugó y al sobrenadante de esta última centrifugación se le añadió una proporción volumétrica entre 2 a 1 a 5 a 1 volúmenes de etanol, preferentemente 2 volúmenes y se mantuvo a -20° C durante 18 horas. El precipitado resultante se colectó por centrifugación, se dializó contra agua destilada y se liofilizó.

En un segundo paso, el hapteno nativo obtenido de la cepa lisa Revi de Brucella melitensis se conjugó con un fluorocromo, en esta invención se utiliza preferentemente isotiocianato de fluoresceina (FITC) para obtener el indicador de la unión antígeno-anticuerpo mediante la prueba de fluorescencia polarizada, para ello se siguió el procedimiento el descrito por Nielsen, K, et al., en 1996, que es como sigue: 3.0 mg del hapteno nativo se disuelven en 600 µ? de hidróxido de sodio 0.1 M, la solución se incuba durante una hora a 37 °C.

La conjugación se realiza añadiendo 30 mg de isotiocianato de fluoresceína disuelto en 100 µ? de dimetil sulfóxido, la mezcla se incuba a 37 °C por una hora.

Se aplica a una columna de DEAE-Sephadex A25, con una cama de 20 mi de volumen equilibrada con buffer de fosfatos 0.01 M, pH 7.4.

El mismo buffer se utiliza para eluir la columna. La primera fracción (7 mi) es buffer y la segunda, de color verde fluorescente en otros 7 mi, se separa de la primera.

Se cambia el buffer a 0.1 M de fosfatos, pH 7.4 y se colectan la fracción con color verde fluorescente, que corresponde a los 10 primeros mililitros del eluído.

Para estandarizar los antígenos, el conjugado se diluye con 0.01 M de fosfato de sodio, pH 7.4, con 0.15M de NaCI y 0.1 % de azida de sodio, hasta que una dilución se obtenga una intensidad de fluorescencia aproximada a 1.5 nM de fluoresceína con el lector de fluorescencia polarizada. La que es utilizada en cada prueba.

Las ventajas que ofrece la presente invención se ponen de manifiesto en los Ejemplos siguientes: Ejemplo 1 .

Las características del desempeño inicial del HN con 48 sueros positivos a bacteriología y/o a PCR, así como 96 sueros controles negativos procedentes de Canadá. La evaluación del desempeño de la prueba indica que sus parámetros son: certeza 97.3 %; con un punto de corte mayor a 86 mP en la que se maximiza la sensibilidad y especificidad, tiene una sensibilidad de 95.9% (85.7- 99.4%) y una especificidad 99.% (94.3- 99.8%). En la figura 1 se observa una gráfica de puntos en la que cada punto representa un resultado que se coloca de acuerdo al valor de la lectura en mP. Los sueros controles negativos (0) y los positivos, se encuentran del lado izquierdo y derecho. La línea horizontal representa el punto de corte mayor a >86 mP en el cual se maximiza la sensibilidad y especificidad, que es de 97.9% y 99%, respectivamente.

Ejemplo 2 Repetibilidad de la prueba de fluorescencia polarizada utilizando el hapteno nativo conjugado con isotiocianato de fluoresceína como marcador de reacción antígeno anticuerpo con sueros de cabras Con el fin de determinar la repetibilidad del marcador de hapteno nativo, se realizaron 86 corridas de pruebas en diferentes días a tres diferentes sueros controles de cabra, uno negativo, uno positivo débil y uno positivo fuerte. En la Tabla 1 , se muestra la media y desviación estándar de cada suero y se aprecia que las medias y desviaciones permiten ver que existe una elevada repetibilidad, ya que las desviaciones respecto a la media son pequeñas y que con los resultados de las lecturas obtenidos para cada tipo de suero se logra identificar por separado a que suero se refiere el resultado. El coeficiente de variabilidad, que es un índice de la variabilidad de datos, para los tres sueros se encuentra entra 5.36 y 6.95, la Organización Mundial de la Salud Animal (2004) considera que hasta un 20% es aceptable.

Tabla.1 Repetibilidad de sueros controles con sueros controles Coeficiente de Control Repeticiones Valor Bajo Valor Alto Promedio variación Negativo 214 70 103 88.61 6.95 Positivo + 163 107 146 129.93 6.56 Positivo ++ 230 206 269 243.7 5.36 Ejemplo 3 Resultados obtenidos con la prueba de fluorescencia polarizada utilizando el hapteno nativo conjugado con isotiocianato de fluoresceína utilizando sueros de cabras de campo previamente clasificados como positivos y negativos por pruebas recomendadas internacionalmente.

Se compararon los resultados de la combinación de la prueba de tarjeta y de la prueba de fijación de complemento de acuerdo al criterio de la Organización Mundial de la Salud Animal (OIE, 2004), en el cual se considera que la prueba de tarjeta 3% como prueba de escrutinio ya que tiene una sensibilidad mayor y a la prueba de fijación de complemento, que tiene mayor especificidad como prueba diagnóstica confirmatoria para las muestras con resultados positivos a la prueba de tarjeta. En este proceso los animales cuyas muestras son negativas a la prueba de tarjeta son considerados como "no infectados", y las positivas que son comprobados por la de prueba de fijación de complemento, si resultan negativos a esta son considerados también como "no infectados" pero los que resultan positivos son considerados como "infectados por Brucella" y deben ser eliminados.

En total se utilizaron 3710 sueros de cabras de campo en los que existe una prevalencia de 9% provenientes de una zona en la que se practica una campaña de vacunación masiva, procesados con la combinación de la prueba de tarjeta y prueba de fijación de complemento, como método estándar de diagnóstico, de ellos 1 106 fueron clasificados "positivos" y 2604 como "negativos" de acuerdo a los resultados de las pruebas estándares aceptadas internacionalmente para diagnóstico de brucelosis en cabras, siendo estas la conocida como prueba de tarjeta o de rosa de bengala, con una concentración de 3% células de Brucella abortus y la prueba de fijación de complemento, siendo utilizada la primera como prueba de escrutinio y la segunda como confirmatoria para las pruebas positivas a la prueba inicial.

Los resultados obtenidos por el hapteno nativo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Figura 3) muestran que tiene una certeza de 88% para sueros clasificados por el criterio de la OIE, y además que con un punto de corte mayor a 104.6 se obtiene una sensibilidad relativa de 85.7 por ciento y una especificidad relativa de 91.9 por ciento, o sea que en 857 por ciento de los casos hay una coincidencia en los resultados positivos y en el 91.9 por ciento con los resultados negativos del método estándar de diagnóstico.

Ejemplo 4 Resultados de la comparación de la prueba de fluorescencia polarizada, usando el hapteno nativo de B. melitensis conjugado con isotiocianato de fluoresceína motivo de esta invención y otras pruebas con sueros clasificados como negativos y positivos por ELISA indirecta y ELISA competitiva.

En este caso, se emplearon las pruebas de ensayos inmunoenzimáticos, conocidas como ELISA indirecta y ELISA competitiva, las que de acuerdo a estudios modernos, tienen mejor desempeño que la pruebas convencionales aceptados por la OIE, que fueron pruebas de tarjeta 3% y fijación del complemento. Los sueros de referencia positivos provenían de explotaciones sin vacunación y con resultados positivos tanto a ELISA indirecta como a ELISA competitiva; y los sueros de referencia negativos provenían de rebaños sin infección, de cabras no vacunados y con resultados negativos tanto a ELISA indirecta como a ELISA competitiva. Los sueros de referencia fueron probados con las pruebas convencionales y con la prueba de fluorescencia polarizada empleando el marcador de hapteno nativo de B. melitensis, desarrollado en este trabajo y el marcador con antígeno OPS de S. abortus En la Figura 4, se observa el análisis ROC de la comparación del área bajo la curva de las pruebas comparadas con los resultados de la prueba de ELISA indirecta y ELISA competitiva. Los resultados del marcador de hapteno nativo muestran un desempeño superior al de las otras pruebas. El análisis ROC mostró que el marcador de HN tiene una certeza y sensibilidad y especificidad son de: 92.5%, 85.9% y 91 .9%, respectivamente. Mientras estos parámetros para el, OPS fueron de 87.4%, 77.5% y 91 .3%; para la tarjeta 66.2%, 99.7% y 32.7%; para la fijación de complemento 73, 55.4% y 86.9%; y para el método recomendado por OIE (2004), que es la combinación de pruebas convencionales (tarjeta y fijación de complemento) 74%, y 74% y 50%.

MODALIDAD PREFERENTE DE LA INVENCION El objeto de esta invención es proporcionar un método simple de detección de anticuerpos de caprinos dirigidos contra Brucella, con el uso de un antígeno modificado por medio de su adaptación a un fluorocromo el cual mediante el uso de la prueba de la fluorescencia polarizada mejora el proceso del diagnóstico aceptado actualmente.

Claims (4)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito de manera suficiente y clara mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. Un antígeno de superficie de Brucella melitensis llamado hapteno nativo (HN) que consiste en bloques repetidos de cinco residuos de N-formylperosamina, cuatro ligados a a-1 ,2 y uno ligado a s-1 ,3 modificado con isotiocianato de fluoresceína para usarse en la detección de anticuerpos contra Brucella con la prueba de fluorescencia polarizada.

2. Un método de inmunoanálisis mediante un antígeno modificado para la detección de anticuerpos dirigidos contra Brucella mediante un antígeno de acuerdo a la reivindicación 1.

3. Un método de inmunoanálisis mediante un antígeno modificado de acuerdo a la reivindicación 1 , que mediante la prueba de fluorescencia polarizada, presenta frente al criterio de la Organización Mundial de la Salud Animal una certeza de 88%, y con un punto de corte mayor a 104.6 mP una sensibilidad relativa de 85.7% y especificidad relativa de 91 .9%%. Ya que de un total de 3710 sueros procesados, con la combinación de la prueba de tarjeta y prueba de fijación de complemento, 1 106 clasificados como positivos y 2604 como negativos, resultaron que en el 85.7% de los casos hay coincidencia en los resultados positivos y en el 91 .9 % en los resultados negativos con la prueba de fluorescencia polarizada. Y que la capacidad del hapteno nativo para considerar como negativos a sueros negativos es mayor en un 20.9% a la de la prueba de tarjeta al compararse con sueros negativos a la prueba de fijación de complemento.

4. Un método de inmunoanálisis mediante un antígeno modificado para la detección de anticuerpos de cabras dirigidos contra Brucella mediante una adaptación a un fluorocromo y fluorescencia polarizada de acuerdo a la reivindicación 1 , que mediante la prueba de fluorescencia polarizada, presenta mejor desempeño frente al criterio de las pruebas de ELISA indirecta y ELISA competitiva, que tienen mejor desempeño que las pruebas convencionales aceptadas por la OIE, que son la prueba la tarjeta y la prueba de fijación de complemento y su combinación; ya que su certeza, sensibilidad y especificidad son de: 92.5%, 85.9% y 91.9%, respectivamente; mientras estos parámetros para el marcador OPS fueron de 87.4%, 77.5% y 91 .3%; para la tarjeta 66.2%, 99.7% y 32.7%; para la fijación de complemento 73, 55.4% y 86.9%; y para la combinación de pruebas convencionales (tarjeta y fijación de complemento) 74%, y 74% y 50%. El Uso de un antígeno modificado de acuerdo a la reivindicación 1 , para la detección de anticuerpos contra Brucella.