WO2008051065A1 - Un antígeno modificado para detección de anticuerpos contra brucella y método de uso. - Google Patents

Un antígeno modificado para detección de anticuerpos contra brucella y método de uso. Download PDF

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WO2008051065A1
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native
antibodies
hapten
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Inventor
Ricardo Alberto GÒMEZ FLORES
Carlos RAMÍREZ PFEIFFER
Cristina RODRÍGUEZ PADILLA
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Universidad Autónoma De Nuevo León
Instituto Nacional De Investigaciones Forestales Agrícolas Y Pecuarías
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Definitions

  • the present invention belongs to the field of Immunology, it is a polarized fluorescence technique to measure the amount of antibodies in serum and body fluids against Brucella. This test is highly sensitive and specific, capable of differentiating vaccine antibodies from those produced during field infection.
  • the Objective of the invention is the use of polarized fluorescence immunoassay with an antigen conjugated to fluorescein sothiocyanate, for the diagnosis of caprine brucellosis, providing a technical improvement to the current methods that have been accepted internationally for use in the diagnosis of brucellosis. in goats
  • Brucellosis is an infectious disease of global importance for livestock because it causes high losses caused by abortions, infertility, low milk production and interruption of genetic programs, among others, and remains one of the most widely distributed zoonoses in the world. It is caused by bacteria of the genus Brucella, which is composed of five species that affect various animal species, thus B. abortus, mainly affects cattle; B. melitensis, affects goats, sheep, cattle and humans; Ia suis affects pigs and humans; B. ovis affects sheep and B. canis affects dogs. The first three have repercussions on livestock activities, affecting the economy of the affected countries, such as Mexico, with high losses.
  • the control and eradication measures of brucellosis are mainly based on vaccination campaigns, diagnosis and slaughter of animals positive to diagnostic tests.
  • the brucellosis diagnostic tests accepted by the International Office of Epizootics (2004) are the Bengal rose agglutination tests (known as card test or card buffered antigen test), which is used as a screening test and the test of complement fixation that is used as a complementary or confirmatory test for sera positive to Rose Bengal.
  • These tests have the disadvantage that they also detect antibodies that are produced against other bacteria that have on their surface smooth lipopolysaccharide that is similar to Brucella (Nielsen, 2004), particularly Yersinia enterocolitica O: 9 (Corbel and Cullen, 1970).
  • the card test is used at a concentration of 3% of bacterial cells in order to increase their sensitivity (Diaz-Aparicio, et al, 1994), although with this their specificity decreases to 65%, that is, of 100 positive results, 35 are false positive.
  • both tests have a low specificity when used to test animals immunized with live vaccines of smooth strains of bruce.
  • 16M melitensis which according to Hernández, A, L., and D ⁇ az AE (2001) when used with the test in gel immunodiffusion tests (IDG) in goats offers a sensitivity and specificity of 95 and 100% respectively
  • IDG gel immunodiffusion tests
  • the polarized fluorescence uses the antigen of the O chain of lipopolysaccharide (O-LPS) of Brucella abortus conjugated with fluorescein isothiocyanate as a marker of the antibody antigen binding (Nielsen, et al., 1996; USPAT nums 5,976,820; Spanish Pat. 504482; European Pat. 2,215,197; USPAT 6,596,546).
  • O-LPS O chain of lipopolysaccharide
  • the direct polarized fluorescence test has the advantage of being able to develop in minutes and does not require extensive preparation of the sample. It is carried out in two stages, in the first one a dilution of the serum is made and an initial bleaching is done in a polarized fluorescence analyzer to obtain a baseline (auto fluorescence). In the second stage, an established amount of the label (conjugated antigen) is added and after an incubation period so that the possible antibodies of the sample will interfere and the final reading is made. If there are specific antibodies present in the serum (positive serum), then the result will be in high millipolarization units (mP). In the absence of antibodies (negative serum), the result is low mP readings.
  • mP millipolarization units
  • the LPS consists of a glycolipid (lipid A) inserted in the outer membrane and therefore not exposed to the surface, and a polysaccharide directed towards the outside (Moriyon and López-Go ⁇ i, 2001); This polysaccharide is divided into two sections, the core, more internal, and the O-polysaccharide chain (OPS).
  • LPS is formed by a single sugar, N-formyl-perosamine, which is a linear polymer of glucose without branches (Cherwonogrodzky et al., 1991).
  • smooth phase br ⁇ celas contain a second antigen called surface hapten (HN) surface (Moriyon and López-Go ⁇ i, 1998, 2001) that is chemically equivalent to the O-polysaccharide chain and although its epitopic structure is similar, its biological role could be different, since the native hapten could represent a surface molecule that is inserted between the smooth-type lipopolysaccharides (LPS-S) and that would contribute to giving the surface smooth-type characteristics, without increasing the density of lipopolysaccharide and its internal sections (Moriyon and López-Go ⁇ i, 2001).
  • LPS-S smooth-type lipopolysaccharides
  • the chain or polysaccharide and the native hapten are serologically and chemically related, (Chemowodorowsky al, 1991, USPAT 5,006,463). Although there are variations in the O chain of B. abortus and B. melitensis, which carry the epitopes A (A of abortus) and B (B of melitensis), respectively (Weymants, et al., 1996).
  • the polysaccharide type O (O-PS) of the lipopolysaccharide (O-LPS) of Brucella abortus described for use in the diagnosis of bovine brucellosis by means of the polarized fluorescence test, is composed of O-chain subunits ( containing 4,6-dideoxy-4-formamido-D-manopyranose residues), as described in the patents: USPAT 5,976,820 of November 2, 1999, USAPAT 5,006,463 of April 9, 1991, in European patent 2215197 of 13 of August 1997 as well as in US Patent 6,596,546 of July 22, 2003, while in B.
  • melitens is the O chain that forms the native hapten consists of repeated blocks of five N-formylperosamine residues, four linked to ⁇ -1,2 and one linked to ⁇ -1,3 (Perry and Bundle, 1990, Moriyon and López-Go ⁇ y, 1998). Both smooth lipopolysaccharide and native hapten are relevant molecules in serological diagnosis (Alonso-Urnamenta, et al., 1998). The generality of the serological tests that are currently used detects antibodies directed to LPS-S (Nielsen et al., 1996a; Schurig, 1998).
  • the advantages offered by the present invention are an increase in the performance of the goat antibody detection test directed against Brucella, since an increase in specificity is obtained with respect to the combination of card tests and complement fixation, which is recommended by the World Organization for Animal Health.
  • the HN marker improves the detection of antibodies obtained by the OPS marker since it also increases the sensitivity and specificity related to indirect ELISA and competitive ELISA tests.
  • the polarized fluorescence immunoassay is used for the detection of specific antibodies against Brucella using as an indicator of the reaction an extract of Brucella comprising a native hapten conjugated with a fluorochrome, which is added to a mixture of a solution buffer with a fluid that possibly contains antibodies and to which the intrinsic fluorescence intensity has been obtained by means of a fluorescence reader, and after 3 to 5 minutes of adding said indicator to give rise to the formation of a marker complex- antibody; The intensity of the fluorescence is quantified, by means of a final reading with said reader. Which improves the diagnostic capacity of the polarized fluorescence test described above.
  • the object of this invention is to provide a method of detecting goat antibodies directed against Brucella that is simple, since it is carried out with a single reagent and two steps for the preparation of the test mixture for the reading of polarized fluorescence by means of a polarized fluorescence reader.
  • Figure 1 shows a plot of points of the individual results of sera of positive and negative goats, on the horizontal axis, as “0" are the results of the measurement of the polarized fluorescence corresponding to 96 negative sera and as “1" to results of 48 sera positive for bacteriological isolation or by the PCR test, in the vertical axis is the reading value determined by the polarized fluorescence reader represented in Millpolarization Units called milliperes and represented as mP.
  • Figure 2 shows the analysis of the ROC curve of results of the native hapten marker with goat sera considered positive and negative by the tests accepted by the OIE (2004).
  • the ROC analysis graphs all pairs of sensitivities / specificities and graphically illustrates the effect of changing the cut-off value on the sensitivity / specificity pairs; This means that for each individual result its sensitivity and specificity are calculated, and with all of them a curve is generated, if the curve formed reaches the upper left corner means that the test has 100% sensitivity and 100% specificity, and when The results are due to chance found in the diagonal line.
  • Figure 3 shows the graph of the ROC analysis of the results of the comparison of the area under the curve with goat sera of the native hapten marker with the standard method.
  • the curve (a) that is closer to the upper left corner is the one corresponding to the native hapten marker followed by the curve
  • Figure 4 shows the graph of the ROC analysis of the results of the comparison of the area under the curve with bovine sera of the native hapten marker with the standard method.
  • the curve (a) is that corresponding to the native hapten marker followed by the curve (b) the marker prepared with the O-chain of the Brucella abortus polysaccharide.
  • polarized fluorescence immunoassay is used for the detection of antibodies against Brucella using as an indicator of the reaction to the native hapten of the smooth strain of Revi de S. melitensis, which in a first step was obtained and purified by means of the technique described by D ⁇ az-Aparicio, E., et al., (1994) for the extraction of the native hapten, which was adapted from the method described by D ⁇ az e ⁇ al., in 1981 for the extraction of the B-polysaccharide antigen of ⁇ . M 19 melitensis to be used in the diagnosis of brucellosis by means of the immunodiffusion test.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the same buffer is used to elute the column.
  • the first fraction (7 ml) is buffer and the second, fluorescent green in another 7 ml, is separated from the first.
  • the buffer is changed to 0.1 M phosphate, pH 7.4 and the fraction is collected with fluorescent green color, which corresponds to the first 10 milliliters of the eluate.
  • the conjugate is diluted in a buffer solution prepared with 0.01 M sodium phosphate, pH 7.4, with 0.15M NaCI and 0.1% sodium azide, until a dilution obtains a fluorescence intensity Approximately 1.5 nM fluorescein with polarized fluorescence reader. The one that is used in each test.
  • the polarized fluorescence test is used which, among other applications, is used to detect changes in size of molecules.
  • the value of an initial polarized fluorescence reading obtained by a polarized fluorescence reader of the mixture of the buffer solution is compared with a fluid that possibly contains antibodies, with the value of a second reading made after having been added to said mixture a predetermined volume of the native hapten marker and have waited a time to give rise to the formation of a marker-antibody complex.
  • Example 3 Results obtained with the polarized fluorescence test using the native hapten conjugated with fluorescein isothiocyanate using sera from field goats previously classified as positive and negative by internationally recommended tests.
  • the results of the combination of the card test and the complement fixation test were compared according to the criteria of the World Organization for Animal Health (OIE, 2004), in which the 3% card test is considered as a screening test since it has a higher sensitivity and the complement fixation test, which has greater specificity as a confirmatory diagnostic test for samples with positive results to the card test.
  • OIE World Organization for Animal Health
  • the tests of immunoenzymatic assays were used, which according to modern studies, perform better than the conventional tests accepted by the OIE, which were 3% card tests and fixation of the complement.
  • the positive reference sera came from farms without vaccination and with positive results to both indirect ELISA and competitive ELISA; and the negative reference sera came from flocks without infection, from goats not vaccinated and with negative results to both indirect ELISA and competitive ELISA.
  • the reference sera were tested with conventional tests and with the polarized fluorescence test using the native hapten marker of B. melitensis, developed in this work and the OPS antigen marker of S. abortus
  • the ROC analysis of the comparison of the area under the curve of the tests is compared with the results of the indirect ELISA and competitive ELISA test.
  • the results of the native hapten marker show superior performance than the other tests.
  • the ROC analysis showed that a) the Brucella native hapten marker has a certainty and sensitivity and specificity are: 92.5%, 85.9% and 91.9%, respectively, these parameters being greater than b) the marker prepared with the O chain of the Brucella abortus polysaccharide, which were 87.4%, 77.5% and 91.3%; c) the complement fixation test that presented 73%, 55.4% and 86.9%, d) that the method recommended by OIE (2004), which is the combination of conventional tests (card and complement fixation) 74%, and 74 % and 50%; and that d) the 66.2%, 99.7% and 32.7% card test, respectively.
  • melitensis (a) had a superior performance since its certainty and sensitivity and specificity was 91.5%, 88.3% and 93%, respectively. While these parameters for the marker prepared with the O chain of the Brucella abortus polysaccharide (b), were 88.9%, 80.5% and
  • the object of this invention is to provide a simple method of detecting goat antibodies directed against Brucella, with the use of a modified antigen by means of its adaptation to a fluorochrome which, through the use of the polarized fluorescence test, improves the process of the diagnosis currently accepted by the World Organization for Animal Health.

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Abstract

Un método que utiliza un antígeno extraído de Brucella y modificado mediante Ia conjugación con un fluorocromo, que se emplea para Ia detección de anticuerpos contra brúcelas lisas por medio de Ia prueba de fluorescencia polarizada, de forma que mejora el proceso de diagnóstico de Ia brucelosis caprina aceptado intemacionalmente.

Description

UN ANTÍGENO MODIFICADO PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA BRUCELLA Y MÉTODO DE USO.
DESCRIPCIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de Ia Inmunología, es una técnica de fluorescencia polarizada para medir Ia cantidad de anticuerpos en suero y fluidos corporales contra Brucella. Esta prueba es altamente sensible y específica, capaz de diferenciar anticuerpos vacunales de aquellos producidos durante Ia infección de campo.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El Objetivo de Ia invención es el uso del inmunoanálisis de fluorescencia polarizada con un antígeno conjugado con ¡sotiocianato de fluoresceína, para el diagnóstico de brucelosis caprina, aportando una mejora técnica a los métodos actuales que se han aceptado intemacionalmente para usarse en el diagnóstico de brucelosis en cabras.
ANTECEDENTES
La brucelosis es una enfermedad infecciosa de importancia mundial para Ia ganadería debido a que ocasiona perdidas elevadas ocasionadas por abortos, infertilidad, baja de Ia producción láctea e interrupción de los programas genéticos, entre otros, y se mantiene como una de las zoonosis de mayor distribución en el mundo. Es ocasionada por bacterias del género Brucella, el cual esta compuesto por cinco especies que afectan a diversas especies animales, así B. abortus, afecta principalmente bovinos; B. melitensis, afecta cabras, ovinos, bovinos y humanos; Ia B. suis afecta cerdos y humanos; B. ovis afecta ovinos y Ia B. canis afecta a perros. Las tres primeras tienen repercusiones en las actividades pecuarias, afectando con pérdidas elevadas Ia economía de los países afectados, como México. Las medidas de control y erradicación de brucelosis se basan principalmente en campañas de vacunación, diagnóstico y sacrificio de animales positivos a las pruebas de diagnóstico. Las pruebas de diagnóstico de brucelosis aceptadas por Ia Oficina Internacional de Epizootias (2004) son las pruebas de aglutinación de rosa de Bengala (conocida como prueba de tarjeta o prueba de antígeno buferado de tarjeta), que se usa como prueba de escrutinio y Ia prueba de fijación de complemento que se usa como prueba complementaria o confirmatoria para los sueros positivos al rosa de Bengala. Esas pruebas tienen Ia desventaja de que también detectan anticuerpos que se producen contra otras bacterias que tienen en su superficie el lipopolisacárido liso que es similar al de Brucella (Nielsen, 2004), particularmente Yersinia enterocolitica O:9 (Corbel and Cullen, 1970). Otra desventaja del uso de Ia combinación de Ia prueba de tarjeta y fijación de complemento es que esta combinación es tardada, cara y técnicamente difícil de realizar por Ia mayoría de los laboratorios de diagnóstico, debido a Io complicado que resulta Ia prueba de fijación de complemento. A diferencia de su uso en bovinos, en caprinos y ovinos se utiliza Ia prueba de tarjeta a una concentración de 3% de células de bacterias con el propósito de aumentar su sensibilidad (Diaz-Aparicio, et al, 1994), aunque con esto su especificidad disminuye a 65%, o sea que de 100 resultados positivos, 35 son falsos positivos. Además, se reconoce que ambas pruebas tienen una baja especificidad cuando se utilizan para probar animales inmunizados con vacunas vivas de cepas lisas de brúcela. (Blasco, 1992, OIE 1996, Díaz-Aparicio et al., 1994), Por ello, para disminuir el número de falsos positivos que ofrece Ia prueba de tarjeta se requiere de Ia confirmación de resultados positivos a Ia prueba de tarjeta con Ia prueba de fijación de complemento (OIE, 2004), de otra forma los animales falsos positivos, en Ia mayoría de los países con campañas de erradicación de Ia enfermedad, son enviados al rastro por considerarse infectados erróneamente.
El pobre desempeño de Ia prueba de tarjeta y de Ia prueba de fijación de complemento en el diagnóstico de brucelosis favoreció el desarrollo de pruebas altamente sensibles, específicas y confiables, capaces de discriminar entre resultados positivos debidos a vacunación, económicas, rápidas para ser usadas para vigilancia y diagnóstico. Así, Díaz en Ia patente española 504488 con fecha 31 de julio de 1981 (caduca actualmente) describió Ia extracción de un antígeno-polisacárido B (conocido también como PoIiB) de una cepa rugosa de Brucella melitensis para el diagnóstico de brucelosis bovina mediante Ia prueba de Ia ¡nmunodifusión radial. Por otro lado también se ha descrito con ese fin el uso del hapteno nativo extraído de Ia cepa lisa de β. melitensis 16M, y el cual de acuerdo a que Hernández, A, L., y Díaz A. E. (2001) al usarse con Ia prueba en pruebas de inmunodifusión en gel (IDG) en cabras ofrece una sensibilidad y especificidad de 95 y 100 % respectivamente, además en cabritas vacunadas con dosis clásica muestra una especificidad de 100% a los 60 días posvacunación y en ovinos entra 90 a 100% de sensibilidad, dependiendo de Ia ruta de vacunación empleada. Esto indica, que al igual de Ia cadena O del polisacárido el PoIiB, el hapteno nativo tiene Ia ventaja de que al usarse no se afecta por anticuerpos inducidos por Ia vacunación en bovinos. Sin embargo, su uso no se ha generalizado dado que esta prueba es relativamente insensible y el tiempo para realizarla es largo (Jones, L., et al., 1980) y no son aceptadas por Ia OIE (2004). Dentro de las técnicas descritas para medir Ia cantidad de anticuerpos en suero y fluidos corporales contra Brucella abortus y que no se afecta por anticuerpos inducidos por vacunación, está Ia prueba de fluorescencia polarizada, que se emplea también para diversos fines en diversas ramas de Ia biología, entre ellos Ia detección y cuantificación de proteínas, anticuerpos, toxinas, hormonas, drogas terapéuticas y drogas de abuso, en diversos sustratos y de forma directa y competitiva, para una revisión de éstas técnicas se puede revisar Io descrito por Nasir y Jolley en 1999. En cuanto al diagnóstico de brucelosis en bovinos, cerdos, cérvidos y bisontes Ia fluorescencia polarizada se emplea el antígeno de Ia cadena O de lipopolisacárido (O-LPS) de Brucella abortus conjugado con isotiocianato de fluoresceína como marcador de Ia unión antígeno anticuerpo (Nielsen, et al., 1996; USPAT nums 5,976,820; Pat. Española 504482; Pat. Europea 2,215,197; USPAT 6,596,546).
La prueba de fluorescencia polarizada directa tiene Ia ventaja de poder desarrollarse en minutos y no requiere de una preparación extensa de Ia muestra. Se realiza en dos etapas, en Ia primera se hace una dilución del suero y se hace un blanqueo inicial en un analizador de fluorescencia polarizada para obtener una línea basal (auto fluorescencia). En Ia segunda etapa, se añade una cantidad establecida de marcador (antígeno conjugado) y después de un periodo de incubación para que los posibles anticuerpos de Ia muestra ¡nteractúen y se hace Ia lectura final. Si hay anticuerpos específicos presentes en el suero (suero positivo), entonces el resultado será en unidades de milipolarización (mP) elevadas. En ausencia de anticuerpos (suero negativo), el resultado es lecturas de mP bajas.
Esta prueba ha mostrado que es altamente sensible y específica para el diagnóstico de brucelosis en bovinos en los que es capaz de diferenciar anticuerpos vacunales de aquellos producidos durante Ia infección de campo. Sin embargo, en muestras de cabras provenientes de zonas con alta prevalencia y donde se aplica Ia vacuna Revi de Brucella melitensis su desempeño es inferior al que se obtiene en bovinos cuando se compara con las pruebas estándares recomendadas por Ia Organización Internacional de Epizootias (O1E) para el diagnóstico de brucelosis caprina. (Nielsen, et al., 2005; Ramírez-Pfeiffer, et al., 2006), por Io que no se ha aceptado oficialmente para usarse en el diagnóstico de brucelosis en cabras y ovinos y se han requerido mas estudios para comprobar su utilidad. Entre los antígenos principales contra los que se induce Ia producción de anticuerpos de un animal al ser infectados, está Ia cadena O del lipolisacárido liso (S-LPS) que se encuentra sobre todo en la pared celular de Ia brúcela, que es una molécula inmunodominante de Ia superficie celular, capaz de inducir respuestas de anticuerpos en Ia mayoría de los animales expuestos a brúcelas lisas (Schurig, 1998). El LPS, consta de un glicolípido (lípido A) insertado en Ia membrana externa y por tanto no expuesto a Ia superficie, y un polisacárido dirigido hacia el exterior (Moriyon y López-Goñi, 2001); este polisacárido se divide en dos secciones, el núcleo, más interno, y Ia cadena O-polisacárido (OPS). EL LPS está formado por un solo azúcar, Ia N-formil-perosamina, que es un polímero linear de glucosa sin ramificaciones (Cherwonogrodzky et al., 1991). Además del O-polisacárido, las brúcelas en fase lisa contienen un segundo antígeno llamado hapteno nativo (HN) de superficie (Moriyon y López-Goñi, 1998, 2001) que es químicamente equivalente a Ia cadena O-polisacárido y aunque su estructura epitópica es semejante, su papel biológico podría ser diferente, pues el hapteno nativo podría representar una molécula de superficie que se inserta entre los lipopolisacáridos de de tipo liso (LPS-S) y que contribuirían a dar a Ia superficie características de tipo liso, sin incrementar Ia densidad de lipopolisacárido y sus secciones internas (Moriyon y López-Goñi, 2001). La cadena o del polisacárido y el hapteno nativo, están relacionadas serológica y químicamente, (Chemowodorowsky el al, 1991, USPAT 5,006,463). Aunque existen variaciones en de Ia cadena O de B. abortus y B. melitensis, que acarrean los epítopes A (A de abortus) y B (B de melitensis), respectivamente (Weymants, et al., 1996). Así, el polisacárido tipo O (O-PS) del lipopolisacárido (O-LPS) de Brucella abortus, descrito para su uso en el diagnóstico de Ia brucelosis bovina por medio de Ia prueba de fluorescencia polarizada, esta compuesto por subunidades de cadena O (conteniendo residuos de 4,6-dideoxi-4-formamido-D- manopiranosa), según Io descrito en las patentes: USPAT 5,976,820 del 2 de noviembre del 1999, USAPAT 5,006,463 del 9 de abril de 1991, en Ia patente europea 2215197 del 13 de agosto de 1997 así como en Ia patente de Estados Unidos 6,596,546 del 22 de julio del 2003, mientras que en B. melitensis Ia cadena O que forma el hapteno nativo consiste en bloques repetidos de cinco residuos de N-formylperosamina, cuatro ligados a α-1,2 y uno ligado a α-1,3 (Perry y Bundle, 1990, Moriyon y López-Goñy, 1998). Tanto el lipopolisacárido liso como el hapteno nativo son moléculas relevantes en el diagnóstico serológico (Alonso-Urnamenta, et al., 1998). La generalidad de las pruebas serológicas que se utilizan actualmente detecta anticuerpos dirigidos al LPS-S (Nielsen et al., 1996a; Schurig, 1998).
Las ventajas que ofrece Ia presente invención son un aumento en el desempeño de Ia prueba de detección de anticuerpos de cabras dirigidos contra Brucella, ya que se obtiene un incremento de en Ia especificidad respecto a Ia combinación de las pruebas de tarjeta y fijación de complemento, que es recomendada por Ia organización Mundial de Salud Animal. Así mismo el marcador HN mejora Ia detección de anticuerpos obtenida por el marcador OPS ya que aumenta también Ia sensibilidad y Ia especificidad relativas a las pruebas en serie ELISA indirecta y ELISA competitiva.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En Ia presente invención se hace uso del inmunoensayo de fluorescencia polarizada para Ia detección de anticuerpos específicos contra Brucella empleando como indicador de Ia reacción un extracto de Brucella que comprende un hapteno nativo conjugado con un fluorocromo, mismo que es añadido a una mezcla de una solución amortiguadora con un fluido que posiblemente contiene anticuerpos y a Ia cual se Ie ha obtenido Ia intensidad de fluorescencia intrínseca por medio de un lector de fluorescencia, y después de 3 a 5 minutos de agregarse dicho indicador para dar lugar a la formación de un complejo marcador-anticuerpo; se cuantifica Ia intensidad de Ia fluorescencia, mediante una lectura final con el dicho lector. Lo que mejora Ia capacidad diagnóstica de Ia prueba de fluorescencia polarizada descrita con anterioridad. El objeto de esta invención es proporcionar un método de detección de anticuerpos de cabras dirigidos contra Brucella que es simple, ya que se realiza con un sólo reactivo y dos pasos para Ia preparación de Ia mezcla de prueba para Ia lectura de Ia fluorescencia polarizada mediante un lector de fluorescencia polarizada.
Para el desarrollo de esta invención se pueden utilizar diferentes fluoróforos para Ia conjugación del hapteno nativo de B. melitensis, mismos que ya han sido descritos en detalle en el Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, by Richard P. Haugland, PH.D., 1996. Published by Molecular Probes, Inc; sin embargo, se prefiere para Ia conjugación del hapteno nativo de Ia cepa Revi de B. melitensis, motivo de este invento, al isotiocianato de fluoresceína para detectar anticuerpos de Brucella en cabras por medio de Ia prueba de fluorescencia polarizada.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
En Ia Figura 1 se observa Ia una gráfica de puntos de los resultados individuales de sueros de caprinos positivos y negativos, en el eje horizontal, como "0" se encuentran los resultados de Ia medición de Ia fluorescencia polarizada correspondientes a 96 sueros negativos y como "1" a resultados de 48 sueros positivos al aislamiento bacteriológico o por Ia prueba de PCR, en el eje vertical se encuentra el valor de lectura determinada por el lector de fluorescencia polarizada representadas en Unidades de millpolarización denominadas milipees y representadas como mP.
En Ia Figura 2 se observa el análisis de Ia curva ROC de resultados del marcador de hapteno nativo con sueros de caprinos considerados como positivos y negativos por las pruebas aceptadas por Ia OIE (2004). El análisis ROC gráfica todos los pares de sensibilidades/especificidades y gráficamente ilustra el efecto del cambio del valor de corte en los pares de sensibilidad/especificidad; esto significa que para cada resultado individual se calcula su sensibilidad y especificidad, y con todos ellos se genera una curva, si Ia curva formada llega a Ia esquina superior izquierda significa que Ia prueba tiene 100% de sensibilidad y 100% de especificidad, y cuando los resultados son debidos al azar se encuentran en Ia línea diagonal.
En Ia Figura 3 se observa Ia gráfica del análisis ROC de los resultados de Ia comparación del área bajo Ia curva con sueros de caprinos del marcador del hapteno nativo con el método estándar. En Ia figura se observa que Ia curva (a) que se aproxima más hacia Ia esquina superior izquierda es Ia que corresponde al marcador del hapteno nativo seguido por Ia curva
(b) el marcador preparado con Ia cadena O del polisacárido de Brucella abortus, y por Ia curva
(c) de Ia prueba de fijación de complemento, que a su vez es igual a la curva (d), que se forma por la combinación de Ia misma fijación de complemento con Ia prueba de tarjeta; mientras que Ia curva (e) corresponde a Ia prueba de tarjeta tiene una curva que corresponde con Ia línea diagonal.
En Ia Figura 4 se observa Ia gráfica del análisis ROC de los resultados de Ia comparación del área bajo Ia curva con sueros de bovinos del marcador del hapteno nativo con el método estándar. En Ia figura se observa que Ia curva (a) es Ia que corresponde al marcardor de hapteno nativo seguido por Ia curva (b) el marcador preparado con Ia cadena O del polisacárido de Brucella abortus.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En Ia presente invención se hace uso del inmunoensayo de fluorescencia polarizada para Ia detección de anticuerpos contra Brucella empleando como indicador de Ia reacción al hapteno nativo de Ia cepa lisa de Revi de S. melitensis, el cual en un primer paso fue obtenido y purificado por medio de Ia técnica descrita por Díaz-Aparicio, E., et al., (1994) para la extracción del hapteno nativo, mismo que fue adaptado del método descrito por Díaz eí al., en 1981 para Ia extracción del antígeno-polisacárido B de β. melitensis M 19 para ser utilizada en el diagnóstico de brucelosis mediante Ia prueba de inmunodifusión. Para esta invención se extrajo el hapteno nativo de un cultivo de 48 horas a 37 0C de Ia cepa de S. melitensis Revi , Ia cual fue sembrada en placas petri con agar Brucella. Después de esta incubación se cosecharon las bacterias y se agregó de fenol 0.5% final, se agitó Ia solución ligeramente y se incubó por otras 24 horas a 37° C, después de Io cual se cosecharon las bacterias por centrifugación y se resuspendieron en 100 mi de agua destilada y se esterilizaron a 120° C por 15 minutos, Se centrifugó el cultivo y al sobrenadante se Ie agregaron de 2 a 1 a 5 a 1 volúmenes de etanol, preferentemente 3 a 1; y se mantuvo en agitación por 18h a 4-8 0C. Posteriormente se centrifugó y al sobrenadante de esta última centrifugación se Ie añadió una proporción volumétrica entre 2 a 1 a 5 a 1 volúmenes de etanol, preferentemente 2 volúmenes y se mantuvo a -20° C durante 18 horas. El precipitado resultante se colectó por centrifugación, se dializó contra agua destilada y se liofilizó.
En un segundo paso, el hapteno nativo obtenido de Ia cepa lisa Revi de Brucella melitensis se conjugó con un fluorocromo, en esta invención se utiliza preferentemente isotiocianato de fluoresceína (FITC) para obtener el indicador de Ia unión antígeno-anticuerpo mediante Ia prueba de fluorescencia polarizada, para ello se siguió el procedimiento el descrito por Nielsen, K, et al., en 1996, que es como sigue:
a) 3.0 mg del hapteno nativo se disuelven en 600 μl de hidróxido de sodio 0.1 M, Ia solución se incuba durante una hora a 37 0C. b) La conjugación se realiza añadiendo 30 mg de isotiocianato de fluoresceína disuelto en 100 μl de dimetil sulfóxido, Ia mezcla se incuba a 370C por una hora.
c) Se aplica a una columna de DEAE-Sephadex A25, con una cama de 20 mi de volumen equilibrada con buffer de fosfatos 0.01 M1 pH 7.4.
d) El mismo buffer se utiliza para eluir Ia columna. La primera fracción (7 mi) es buffer y Ia segunda, de color verde fluorescente en otros 7 mi, se separa de Ia primera.
e) Se cambia el buffer a 0.1 M de fosfatos, pH 7.4 y se colectan Ia fracción con color verde fluorescente, que corresponde a los 10 primeros mililitros del eluído.
f) Para estandarizar los antígenos, el conjugado se diluye en una solución amortiguadora preparado con 0.01 M de fosfato de sodio, pH 7.4, con 0.15M de NaCI y 0.1% de azida de sodio, hasta que una dilución se obtenga una intensidad de fluorescencia aproximada a 1.5 nM de fluoresceína con el lector de fluorescencia polarizada. La que es utilizada en cada prueba.
Para detectar anticuerpos específicos contra Brucella en fluidos de animales con el antígeno conjugado o marcador preparado con el hapteno nativo de Brucella melitensis conjugado con isotiocianato de fluoresceína se utiliza Ia prueba de fluorescencia polarizada que es utilizada, entre otras aplicaciones, para detectar cambios en el tamaño de moléculas. En este caso, se compara el valor de una lectura inicial de fluorescencia polarizada obtenido mediante un lector de fluorescencia polarizada de Ia mezcla de Ia solución amortiguadora con un fluido que posiblemente contiene anticuerpos, con el valor de una segunda lectura realizada después de haber agregado a dicha mezcla un volumen predeterminado del marcador hapteno nativo y haber esperado un tiempo para dar lugar a Ia formación de un complejo marcador- anticuerpo.
Para las pruebas se utilizan como controles a muestras de sueros de animales negativos, positivos débiles y positivos fuertes que muestran valores finales de lectura para establecer Ia validez de las pruebas que se efectúen.
Las ventajas que ofrece Ia presente invención se ponen de manifiesto en los Ejemplos siguientes:
Ejemplo 1.
Las características del desempeño inicial de Ia prueba de fluorescencia polarizada con el marcador preparado con el hapteno nativo de Brucella melitensis con 48 sueros de cabras positivos a bacteriología y/o a PCR, así como 96 sueros controles negativos procedentes de Canadá para evaluar el desempeño de Ia prueba indica que sus se obtiene una muy elevada certeza de 97.3 %; con un punto de corte mayor a 86 mP en Ia que se maximiza Ia sensibilidad y especificidad, y que tiene una sensibilidad de 95.9% (85.7- 99.4%) y una especificidad 99% (94.3- 99.8%). En Ia figura 1 se observa una gráfica de puntos en Ia que cada punto representa un resultado que se coloca de acuerdo al valor de Ia lectura en mP. Los sueros controles negativos (0) y los positivos (1), se encuentran del lado izquierdo y derecho. La línea horizontal representa el punto de corte mayor a >86 mP en el cual se maximiza Ia sensibilidad y especificidad, que es de 97.9% y 99%, respectivamente.
Ejemplo 2
Repetibilidad de Ia prueba de fluorescencia polarizada utilizando el hapteno nativo conjugado con isotiocianato de fluoresceína como marcador de reacción antígeno anticuerpo con sueros de cabras.
Con el fin de determinar Ia repetibilidad del marcador de hapteno nativo, se realizaron 86 corridas de pruebas en diferentes días a tres diferentes sueros controles de cabra, uno negativo, uno positivo débil y uno positivo fuerte. En Ia Tabla 1, se muestra Ia media y desviación estándar de cada suero y se aprecia que las medias y desviaciones permiten ver que existe una elevada repetibilidad, ya que las desviaciones respecto a Ia media son pequeñas y que con los resultados de las lecturas obtenidos para cada tipo de suero se logra identificar por separado a que suero se refiere el resultado. El coeficiente de variabilidad, que es un índice de Ia variabilidad de datos, para los tres sueros se encuentra entra 5.36 y 6.95, que es más bajo que el recomendado por Ia Organización Mundial de Ia Salud Animal (2004) considera que hasta un 20% es aceptable. Esto significa que los resultados de esta prueba son consistentes entre pruebas.
Tabla.1 Repetibilidad de sueros controles con sueros controles
Coeficiente de Control Repeticiones Valor Bajo Valor Alto Promedio variación
Negativo 214 70 103 88.61 6.95
Positivo + 163 107 146 129.93 6.56
Positivo ++ 230 206 269 243.7 5.36
Ejemplo 3 Resultados obtenidos con Ia prueba de fluorescencia polarizada utilizando el hapteno nativo conjugado con isotiocianato de fluoresceína utilizando sueros de cabras de campo previamente clasificados como positivos y negativos por pruebas recomendadas internacionalmente. Se compararon los resultados de Ia combinación de Ia prueba de tarjeta y de Ia prueba de fijación de complemento de acuerdo al criterio de la Organización Mundial de Ia Salud Animal (OIE, 2004), en el cual se considera que la prueba de tarjeta 3% como prueba de escrutinio ya que tiene una sensibilidad mayor y a Ia prueba de fijación de complemento, que tiene mayor especificidad como prueba diagnóstica confirmatoria para las muestras con resultados positivos a Ia prueba de tarjeta. En este proceso los animales cuyas muestras son negativas a Ia prueba de tarjeta son considerados como "no infectados", y las positivas que son comprobados por Ia de prueba de fijación de complemento, si resultan negativos a esta son considerados también como "no infectados" pero los que resultan positivos son considerados como "infectados por Brucella" y deben ser eliminados.
En total se utilizaron 3710 sueros de cabras de campo en los que existe una prevalencia de 9% provenientes de una zona en Ia que se practica una campaña de vacunación masiva, procesados con Ia combinación de Ia prueba de tarjeta y prueba de fijación de complemento, como método estándar de diagnóstico, de ellos 1106 fueron clasificados "positivos" y 2604 como "negativos" de acuerdo a los resultados de las pruebas estándares aceptadas internacionalmente para diagnóstico de brucelosis en cabras, siendo estas Ia conocida como prueba de tarjeta o de rosa de bengala, con una concentración de 3% células de Brucella abortus y Ia prueba de fijación de complemento, siendo utilizada Ia primera como prueba de escrutinio y Ia segunda como confirmatoria para las pruebas positivas a Ia prueba inicial. Los resultados obtenidos por el hapteno nativo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Figura 3) muestran que tiene una certeza de 88% para sueros clasificados por el criterio de Ia OIE, y además que con un punto de corte mayor a 104.6 se obtiene una sensibilidad relativa de 85.7 por ciento y una especificidad relativa de 91.9 por ciento, o sea que en 85.7 por ciento de los casos hay una coincidencia en los resultados positivos y en el 91.9 por ciento con los resultados negativos del método estándar de diagnóstico. Esta especificidad supera al 65% que se estima para las pruebas convencionales.
Ejemplo 4
Resultados de Ia comparación de Ia prueba de fluorescencia polarizada, usando el hapteno nativo de S. melitensis conjugado con isotiocianato de fluoresceína motivo de esta invención y otras pruebas con sueros clasificados como negativos y positivos por ELISA indirecta y ELISA competitiva.
En este caso, se emplearon las pruebas de ensayos inmunoenzimáticos, conocidas como ELISA indirecta y ELISA competitiva, las que de acuerdo a estudios modernos, tienen mejor desempeño que la pruebas convencionales aceptados por Ia OIE, que fueron pruebas de tarjeta 3% y fijación del complemento. Los sueros de referencia positivos provenían de explotaciones sin vacunación y con resultados positivos tanto a ELISA indirecta como a ELISA competitiva; y los sueros de referencia negativos provenían de rebaños sin infección, de cabras no vacunados y con resultados negativos tanto a ELISA indirecta como a ELISA competitiva. Los sueros de referencia fueron probados con las pruebas convencionales y con Ia prueba de fluorescencia polarizada empleando el marcador de hapteno nativo de B. melitensis, desarrollado en este trabajo y el marcador con antígeno OPS de S. abortus
En Ia Figura 3, se observa el análisis ROC de Ia comparación del área bajo Ia curva de las pruebas comparadas con los resultados de Ia prueba de ELISA indirecta y ELISA competitiva. Los resultados del marcador de hapteno nativo muestran un desempeño superior al de las otras pruebas. El análisis ROC mostró que a) el marcador de hapteno nativo de Brucella tiene una certeza y sensibilidad y especificidad son de: 92.5%, 85.9% y 91.9%, respectivamente, siendo estos parámetros superiores a los b) el marcador preparado con Ia cadena O del polisacárido de Brucella abortus, que fueron de 87.4%, 77.5% y 91.3%; c) Ia prueba de fijación de complemento que presentó 73%, 55.4% y 86.9%, d) que el método recomendado por OIE (2004), que es Ia combinación de pruebas convencionales (tarjeta y fijación de complemento) 74%, y 74% y 50%; y que d) Ia prueba de tarjeta 66.2%, 99.7% y 32.7%, respectivamente.
Ejemplo 5
Resultados de Ia comparación de Ia prueba de fluorescencia polarizada, usando como marcadores el hapteno nativo de β. melitensis conjugado con isotiocianato de fluoresceína (a) motivo de esta invención y Ia cadena O de lipopolisacárido de B. abortus conjugado con isotiocianato de fluoresceína (b), con sueros de bovinos clasificados como negativos y positivos por las pruebas en serie de tarjeta y Fijación de complemento.
En este caso, conforme a Io descrito y aceptado por Ia Organización Mundial de Salud Animal para el diagnóstico en bovinos, se emplearon 162 sueros bovinos, 77 se clasificaron como positivos y 85 como negativos por medio de las pruebas de tarjeta y fijación del complemento en serie para incrementar Ia especificidad final en Ia selección de los sueros contra los que se compararían el marcador de hapteno nativo de B. melitensis, desarrollado en este trabajo y el marcador preparado con Ia cadena O del polisacárido de Brucella abortus, utilizando a Ia prueba de fluorescencia polarizada como herramienta diagnóstica. Se utilizaron sueros controles de Ia Organización Mundial de Salud Animal para las pruebas de fluorescencia polarizada. Los resultados del análisis ROC, muestra que el marcador de hapteno nativo de B. melitensis (a) tuvo un desempeño superior ya que su certeza y sensibilidad y especificidad fue de: 91.5%, 88.3% y 93%, respectivamente. Mientras estos parámetros para el marcador preparado con Ia cadena O del polisacárido de Brucella abortus (b), fueron de 88.9%, 80.5% y
91.8, respectivamente. Ejemplo 6.
Resultados de la comparación de la prueba de fluorescencia polarizada, usando como marcadores el hapteno nativo de β. melitensis conjugado con isotiocianato de fluoresceína (a) motivo de esta invención y Ia cadena O de lipopolisacárido de B. abortus conjugado con isotiocianato de fluoresceína (b), con sueros de humanos clasificados como negativos y positivos por pruebas en serie, usando Ia prueba de Tarjeta como método de escrutinio y Ia titulación de anticuerpos se llevará a cabo en estudios simultáneos con las pruebas de aglutinación en tubo y Ia combinación de las pruebas de aglutinación en placa (SAT)y 2-
Mercaptoetanol (2.ME) como confirmatorias, considerando como positivos los títulos igual o mayores a 1:80 y 1:20 respectivamente .
En total se probaron 72 sueros negativos y 81 positivos a dichas pruebas y el análisis de resultados muestra que con una precisión de 81.5% se obtiene una sensibilidad de 69.4% y una especificidad de 91.4% con Ia prueba de fluorescencia polarizada utilizando el marcador hapteno nativo cíe B. melitensis, Io que muestra que inicialmente éste posee características que Io hacen ser útil para Ia detección de anticuerpos en humanos.
MODALIDAD PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
El objeto de esta invención es proporcionar un método simple de detección de anticuerpos de caprinos dirigidos contra Brucella, con el uso de un antígeno modificado por medio de su adaptación a un fluorocromo el cual mediante el uso de Ia prueba de la fluorescencia polarizada mejora el proceso del diagnóstico aceptado actualmente por Ia Organización Mundial de Ia Salud Animal.

Claims

REIVINDICACIONESHabiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por Io tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, Io contenido en las siguientes cláusulas:
1. Un extracto de Brucella caracterizado porque comprende un hapteno nativo conjugado con un fluoróforo.
2. Un extracto de Brucella de acuerdo a Ia reivindicación 1, en donde el fluorofóro utilizado es isotiocianato de fluoresceína.
3. Un procedimiento de inmunoanálisis de una muestra de fluido para detectar anticuerpos contra el antígeno bacteriano modificado contenido en el extracto de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende: a. Agregar un fluido que puede contener anticuerpos contra el hapteno nativo bacteriano de pared de Brucella a una solución amortiguadora y determinar el nivel de fluorescencia polarizada basal de dicha mezcla, b. Añadir a Ia mezcla el extracto de Brucella que comprende un hapteno nativo conjugado con un fluoróforo. c. Mezclar y dejar dicha mezcla por un periodo entre 3 a 5 minutos para permitir Ia interacción del hapteno nativo conjugado con los anticuerpos que pudieran estar presentes en el fluido, d. Al término de esta incubación, medir el nivel de fluorescencia polarizada final debido a Ia formación del complejo hapteno nativo conjugado y los anticuerpos de Ia muestra polarizada que pudieran haber estado presentes y compararlo con el nivel basal.
4. El uso de un extracto de Brucella de conformidad con Ia reivindicación 1, para Ia fabricación de una composición de diagnóstico, para Ia detección de anticuerpos contra Brucella, mediante la técnica de fluorescencia polarizada.
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