BRPI0615678A2 - método para diagnosticar infecções - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA DIAGNOSTICAR INFECçõES Os antígenos são removidos da superfície de um organismo, como um microorganismo, sem romper o organismo e liberar antígenos internos do organismo, que é conhecido como "deslocamento delicado" dos antígenos dos organísmos. Os antígenos de superfície livres do organismo podem ser usados para determinar a presença da infecção em um animal causada pelo organismo pela determinação da presença de anticorpos que se ligam aos antigenos de superfície livres em uma amostra obtida do animal.

Description

"MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR INFECÇÕES"

Campo da invenção

A invenção pertence ao campo do diagnóstico de in-fecção causado por um organismo, como um organismo microbia-no.

Antecedente da invenção

Talvez o aspecto mais importante no diagnóstico dacausa de sintomas experimentados por um paciente quando umagente infeccioso for suspeito de ser a causa dos sintomas,seja o estabelecimento da identidade do organismo especificoque é etiologicamente responsável pelos sintomas. Além dis-so, existe uma necessidade significativa de um método paraidentificar pessoas e animais que foram infectados com umorganismo, como um microorganismo, incluindo pessoas e ani-mais que não mostram sinais ou sintomas de doença associadacom o organismo.

Classicamente, a presença de infecção causada porum microorganismo infeccioso em particular foi estabelecidapelo isolamento do organismo do corpo de um paciente, o cul-tivo do organismo em um meio de cultura adequado e a identi-ficação do organismo cultivado com base em testes bioquími-cos, imunológicos ou outros testes. Este método tem váriasdesvantagens. O diagnóstico por cultura e identificação fre-qüentemente necessita de um período de tempo substancialquando cultiva organismos que possuem uma taxa de crescimen-to lenta. Por exemplo, métodos de cultivo padrão e identifi-cação para Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis, oorganismo causador da doença de Johne em bovinos e doença deCrohn em pessoas, podem levar de 8 a 16 semanas ou mais paraserem realizados devido a baixa taxa de crescimento desteorganismo. Outra desvantagem dos métodos de diagnóstico cul-tivo e identificação é que o organismo causador da doença emparticular em um paciente pode não crescer em um meio decultura padrão, levando a um resultado de cultura negativo euma falha no diagnóstico. Além disso, como estes métodos ne-cessitam do isolamento de um organismo infeccioso de um pa-ciente, estes métodos são inapropriados nas ocasiões em queo paciente não está excretando o organismo ou se o organismoestá localizado em um local inacessível no corpo do pacien-te.

Recentemente, métodos imunológicos e de biologiamolecular foram desenvolvidos para o diagnóstico de doençasinfecciosas. Estes métodos geralmente entram em três catego-rias, detecção dos ácidos nucléicos do genoma, detecção deproteína e detecção de anticorpos direcionados contra um pa-tógeno.

O diagnóstico pela identificação dos ácidos nu-cléicos do genoma é realizado tipicamente usando amplifica-ção do DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) seguidoda identificação dos fragmentos de PCR produzidos ou pelouso de sondas que se ligam especificamente a uma fração dogenoma de um organismo causador suspeito ou ambos. Estes mé-todos, especificamente quando usado em combinação, podem sermétodos muito sensíveis e específicos para estabelecer umdiagnóstico de um organismo causador. Existem várias desvan-tagens associadas com estes métodos. Eles são caros, neces-sitam de experiência técnica sofisticada para serem realiza-dos e geralmente leva vários dias para obter microorganismoo suficiente para o diagnóstico. Outra desvantagem signifi-cativa associada com o diagnóstico pela detecção de ácidonucléico do genoma é que um organismo deve ser isolado a fimde obter os ácidos nucléicos do genoma.

0 diagnóstico pela identificação de proteínas étipicamente realizado por um ensaio imunosorbente ligado aenzima (ELISA). Neste teste, um antígeno de um microorganis-mo, tipicamente um microorganismo rompido ou uma fração deum microorganismo, está ligado a um suporte sólido e reagiucom um primeiro anticorpo em uma amostra teste, tipicamentesoro, que é específico para o antígeno de interesse. Um se-gundo anticorpo marcado que se liga aos anticorpos no soroteste é então exposto ao complexo do suporte sólido parafornecer um meio para a identificação da presença do antíge-no. Testes de ELISA, entretanto, tem várias desvantagens in-cluindo baixa sensibilidade e a necessidade de dois anticor-pos diferentes para a detecção de um antígeno. 0 teste ELISAnecessita de profissionais de laboratório qualificados e po-de gerar resultados falso positivo se as amostras contém re-ação cruzada de anticorpos.

Um exemplo de uma doença infecciosa para a qual osmétodos de diagnóstico disponíveis atualmente são inadequa-dos é a doença de Johne, uma doença em bovinos causada pelaMycobacterium avium subsp. Paratuberculosis (MAP). A doençade Johne resulta na produção reduzida de leite e seleçãoprecipitada de vacas infectadas resultando em uma perda anu-al de aproximadamente $ 1,5 bilhões da indústria agrícolados Estados Unidos. Existem evidências consideráveis de queMAP também seja o organismo causador da doença de Crohn emhumanos. Apesar deste impacto significativo na economia ame-ricana e na saúde humana, não há teste diagnóstico efetivopara determinar as infecções iniciais por MAP.

No momento, o cultivo de fezes é considerado comosendo o meio mais preciso de diagnóstico da infecção porMAP. Entretanto, este teste diagnóstico tem baixa sensibili-dade (menos de 50%) e é capaz de detectar infecções apenasem animais que estejam excretando MAP ativamente em suas fe-zes. Além disso, o diagnóstico de MAP por cultura tipicamen-te necessita de 8 a 16 semanas para o crescimento do orga-nismo .

Outros testes diagnósticos para a doença de Johneincluem PCR, fixação de complemento, imunodifusão em agargel e ELISA. Estes testes, cada um deles utiliza um extratomolecular de MAP, tem naturalmente baixa especificidade ousensibilidade para MAP e tem as desvantagens presentes comestes métodos conforme indicado acima.

Existe uma necessidade significativa para um méto-do diagnóstico para detectar infecção por um organismo, comoum microorganismo, que possa ser realizado rapidamente, queseja altamente sensível, seja altamente específico e quepossa ser realizado por um indivíduo sem treinamento labora-torial sofisticado. Particularmente, existe uma necessidadesignificativa para tal método significativo que seja útilpara o diagnóstico de doenças como aquelas causadas por MAP.Breve descrição das figuras

A figura 1 é um gráfico de barras mostrando a li-gação de anticorpos aos antigenos livres de superfície ex-traídos de acordo com a invenção com vários solventes. Ossolventes mostrados são 1 - água destilada, 2 - metanol, 3- etanol, 4 - propanol, 5 - acetonitrila, 6 - acetona, 7 -cloreto de metileno, 8 - clorofórmio, 9 - éter e 10 - hexa-no. As barras sombreadas representam soro de gado sabidamen-te livre da infecção por MAP. As barras pretas representamsoro de gado sabidamente infectado por MAP. As barras aber-tas representam amostras contendo apenas tampão de diluiçãoe nenhum soro. A densidade ótica foi determinada no poçocontendo várias amostras.

A figura 2 é um gráfico mostrando a habilidade re-lativa de extratos de MAP e MAA obtidos de acordo com a in-venção com tratamento usando concentrações variadas de eta-nol de se ligar a anticorpos no soro de animais sabidamenteinfectados com MAP. Os círculos sólidos representam extratoscom etanol de MAP. Ao círculos abertos representam extratoscom etanol de MAA.

A figura 3 é um gráfico de barras comparando a li-gação de anticorpos aos extratos de MAP e MAA obtidos de a-cordo com a invenção usando 70% de etanol em animais sabida-mente infectados com MAP e animais sabidamente não infecta-dos com MAP. As barras sólidas representam gado infectadocom MAP. As barras abertas representam gado não infectadopor MAP. No gado infectado e não infectado, a ligação do an-ticorpo aos extratos de MAP foi notavelmente muito maior queos extratos de ΜΑΑ.

A figura 4 é um gráfico mostrando os efeitos douso de várias concentrações de formaldeido como um agente deextração na ligação de anticorpo no soro do gado positivopara MAP e negativo para MAP. Os círculos sólidos represen-tam soro de animais positivos para MAP. Os círculos abertosrepresentam soro de animais negativos para MAP. Os triângu-los abertos representam tampão de diluição e nenhum soro.

A figura 5 é um gráfico mostrando os efeitos douso de diferentes durações da sonicação guando extrai os an-tígenos de superfície de MAP na ligação de anticorpo no sorode gado positivo para MAP e negativo para MAP. Os círculossólidos representam o soro de animais positivos para MAP. Oscírculos abertos representam o soro de animais negativos pa-ra MAP. Os triângulos abertos representam tampão de diluiçãoe nenhum soro.

A figura 6 é um gráfico mostrando a habilidade dométodo da invenção de detectar a infecção por MAP em duaspopulações de bovinos negativos para doença de Johne e posi-tivo para doença de Johne. Um valor S/P de o,3 foi usado co-mo limite de modo gue a ligação do anticorpo acima deste ní-vel foi determinada como sendo um diagnóstico positivo e a-baixo deste nível foi determinado como sendo um diagnósticonegativo. As amostras de soro na coluna 1 foram do gado ne-gativo para a doença de Johne. As amostras de soro na coluna2 foram de gado positivo para doença de Johne.

A figura 7 é um gráfico de valores S/P obtido emamostras pareadas de soro e leite de vacas individuais, al-gumas das quais estavam infectadas com MAP e outras dasquais não estavam infectadas com MAP. Para o soro, um valorS/P de 0,25 foi determinado como sendo um limite e para oleite um valor S/P de - 0,6 foi determinado como sendo umlimite. No gráfico, as reações (círculos abertos) abaixo dovalor S/P horizontal (eixo X) de 0,25 e a esquerda do valorS/P vertical (eixo Y) de - 0,6 são negativas.

A figura 8 é uma tabela mostrando resultados dostestes de 3 grupos de vacas quanto a infecção com MAP. 0grupo I (n=30) eram vacas com resultado negativo para a do-ença de Johne por cultura fecal, ELISA convencional e inter-feron gama. 0 grupo II (n=52) eram vacas com resultado nega-tivo para a doença de Johne por cultura fecal e ELISA con-vencional, mas desenvolveram sinais clínicos da doença deJohne. 0 grupo III (n=23) eram vacas submetidas a váriasculturas de fezes se mostraram positivas para doença de Joh-ne em pelo menos um teste de cultura de fezes. Na coluna de-nominada "Testes de cultura de fezes""negativo" significaque nenhuma cultura de MAP foi identificada em qualquer cul-tura de fezes daquela vaca em particular, números indica onúmero de colônias que foram encontradas nos testes seriais.

Na coluna denominada "MAP intacto" e "antígenos de superfí-cie MAP", números indica a densidade ótica. Os valores deteste de 0,23 ou superior sob "MAP intacto" indicam um testepositivo. Os valores de teste de 0,35 ou maior sob "antíge-nos de superfície MAP" indicam um teste positivo. Os valoresde teste indicando um teste positivo para MAP estão nos qua-drados sombreados. Números entre parênteses indicam um valornegativo. 3xTNTC e 4xTNTC indicam que o teste da cultura fe-cal foi conduzido 3 ou 4 vezes e que o número de colôniasera alto demais para ser contado.

Descrição da invenção

Foi inesperadamente descoberto que a precisão au-mentada do diagnóstico de infecção, como evidenciado peloaumento da especificidade e sensibilidade, pode ser obtidoutilizando múltiplos antigenos de superfície livres de umorganismo, como um microorganismo, como um antígeno testepara determinar a presença de uma infecção em um animal de-vido ao organismo em particular.

Nesta especificação, o termo "antígeno de superfí-cie livre" se refere a um antígeno que é normalmente encon-trado na superfície de um organismo, como um microorganismo,mas que foi removido da superfície do organismo.

A invenção é descrita em detalhes aqui em relaçãoprimariamente às infecções microbianas, como infecções bac-terianas exemplificadas pelas infecções micobacterianas, eparticularmente em relação ao Mycobacterium avium e maisparticularmente em relação ao Mycobacterium avium subsp. Pa-ratuberculosis (MAP), o organismo causador da doença de Joh-ne em bovinos e da doença de Crohn em humanos. Este organis-mo se provou um organismo muito difícil de ser estabelecidocomo a causa dos sintomas de doença em bovinos e em pessoase apresenta, portanto, um teste significativo para estabele-cer a eficácia, especificidade e sensibilidade do método dapresente invenção. Deve ficar claro, entretanto, que MAP émeramente um exemplo ilustrativo e que o método da invençãoé aplicável a infecção devido a qualquer organismo, conformeespecificado abaixo.

Em uma modalidade, a invenção é um método para ob-ter antigenos de superfície livres de um organismo, como ummicroorganismo. De acordo com esta modalidade da invenção,um organismo é mantido em suspensão em um fluido contendo umagente de extração químico, os antigenos da superfície sãoremovidos do organismo e ficam em suspensão ou solução nofluido, e os antigenos de superfície livres no fluido sãoseparados das frações do organismo que não sejam os antige-nos de superfície livres.

Preferivelmente, de acordo com esta modalidade dainvenção, a integridade do organismo não é destruída duranteo processo pelo qual os antigenos de superfície são removi-dos da superfície do organismo. Isto é, é preferível que osúnicos antigenos removidos do organismo sejam aqueles queestão normalmente presentes na superfície do organismo e queo organismo se mantenha intacto exceto pela perda dos anti-genos de sua superfície.

De acordo com a invenção, um organismo, como ummicroorganismo, é ressuspendido em um líquido no qual os an-tigenos de superfície serão removidos do organismo. Se o or-ganismo foi cultivado em um meio de cultura sólido, uma oumais colônias do organismo pode ser colocada em um fluido desuspensão contendo um agente de extração. Se o organismo foicultivado ou mantido em um meio de cultura liquido, é prefe-rível remover o organismo do meio de cultura, como por cen-trifugação para produzir um pellet contendo o organismo eressuspender o organismo precipitado em uma suspensão con-tendo o agente de extração. Após a remoção dos antigenos desuperfície do organismo, os antigenos de superfície livressão isolados, como por centrifugação com retenção do sobre-nadante ou por filtração com retenção do fluído filtrado.

O agente de extração que é adequado para o métododa invenção é um composto químico que pode ser usado pararemover os antigenos da superfície de um organismo. Antige-nos polares, como carboidratos, polipeptídios e lipídios po-lares, podem ser extraídos por agentes de extração como ál-coois e aldeídos. Antigenos apolares, como a maioria dos li-pídios, podem ser extraídos por agentes de extração como a-cetona, clorofórmio e hexanos. Se desejado, misturas de a-gentes de extração, como misturas de agentes de extração pa-ra antigenos polares e apolares, podem ser usadas. Um exem-plo de tal mistura é clorofórmio e metanol.

Os antigenos de superfície podem ser removidos dasuperfície do organismo por qualquer método pelo qual talremoção possa ser realizada. Por exemplo, a remoção pode serpor tratamento mecânico do organismo. Exemplos de métodos detratamento mecânico incluem sonicação, agitação(vortex) ouprensas francesa e Ribi.

Antigenos de superfície podem ser removidos portratamento químico do organismo. Exemplos de agentes quími-cos que possam ser usados para remover antigenos da superfí-cie de um microorganismo incluem fenol, metanol, clorofór-mio, álcool isopropil, etanol, butirol terciário, éter, de-tergentes como TWEEN™ 20 ou TWEEN™ 80, dodecil sulfato desódio e tratamento ácido ou alcalino.

Preferivelmente, os antigenos de superfície sãoremovidos por tratamento mecânico do organismo, e mais pre-ferivelmente pelo tratamento mecânico do organismo combinadocom o tratamento do organismo com um agente de extração. Mé-todos mecânicos são capazes de serem modulados de modo queos antigenos sejam removidos da superfície de um organismosem romper a integridade do próprio organismo. Embora talremoção do antígeno de superfície mantendo o organismo in-tacto seja possível usando somente agentes químicos, é maisdifícil de conseguir sem romper a integridade do organismo,isto é, sem liberar antigenos do organismo que estão normal-mente localizado dentro do organismo e não estão expostos nasuperfície do organismo.

A remoção dos antigenos da superfície de um orga-nismo sem romper o organismo e remover antigenos internos doorganismo é chamada de "deslocamento delicado" dos antigenosde superfície. Sabe-se que tal deslocamento delicado é umcomponente essencial do método desta modalidade da invenção.

O organismo da invenção pode ser qualquer organis-mo infectante que tenha um ou mais antigenos na sua superfí-cie que possa ser removido do organismo sem romper o próprioorganismo. Exemplos de microorganismos adequados para inven-ção incluem bactérias, fungos, protozoários, ricketesia eclamídia. O organismo adequado para a invenção também podeser um endoparasita multicelular, tipicamente um helminto.Como muitos vírus produzem antigenos de superfície que sãoderivados do organismo hospedeiro, foi determinado que o mé-todo da invenção não é aplicável aos virus e, portanto, osvirus estão especificamente excluídos do escopo da invenção.

Exemplos de microorganismos específicos dos quaisos antígenos de superfície possam ser obtidos pelo método dainvenção incluem mas não se limitam a Campylobacter, Acti-nomyces, Streptococcus, Staphyloeoeeus, Salmonella, Chlamy-dia, Listeria, Borrelia, Pasteurella, Yersinia, Brueella,Leptospira, Listeria, Shigella, Myeobaeteriumf Haemophilus,Bordatella, Legionella, Eseheriehia eoli, Aetinobaeillus,Clostridium, Helieobaeter, Eimeria, Toxoplasma, Sacroeystis,Neospora, Cryptosporidium, Cyclospora, Trypanosoma, Plasmo-dium, Babesia, Theileria, Entamoeba, Aeanthomoeba, Naegleri-a, e Candida.

Exemplos de helmintos dos quais os antígenos desuperfície possam ser obtidos pelo método da invenção inclu-em mas não se limitam a Ostertagia, Trichostrongylus, Hae-monehus, Cooperia , Nematodirus, Oesophagostomum, Dirofila-ria , Asearisr Toxaeara, Triehuris, Neeator, Aneylostoma ,Enterobius, Sehistosoma e vários vermes parasitas.

De acordo com uma modalidade preferida do métododa invenção para obter antígenos de superfície de um orga-nismo, um organismo, como um microorganismo, é resuspendidoem um fluido que contém um agente de extração, como formal-deído com ou sem metanol ou como etanol, e a suspensão é en-tão agitada, por sonicação ou vórtex, em uma intensidade epelo tempo suficiente para deslocar delicadamente antígenosde superfície do organismo. A sonicação é preferivelmenteaplicada como um pulso breve, como entre cerca de meio se-gundo e menos de 10 segundos, preferivelmente menos de cincosegundos e mais preferivelmente cerca de dois segundos, oupor agitação no vortex. Na agitação com vortex, por ser me-nos forte que a sonicação, tempos de tratamento mais longospodem ser empregados sem o risco de destruir a integridadedo organismo. Portanto, o tempo de tratamento por vortex va-riando de um a dois segundos até vários minutos ou mais podeser empregado para o deslocamento delicado dos antigenos desuperfície. Após o deslocamento delicado, antigenos de su-perfície livres são então removidos do fluído, como por cen-trifugação com retenção do sobrenadante ou por filtração comretenção do líquido filtrado pra remover o material particu-lado.

Um teste para determinar se os antigenos de super-fície foram deslocados delicadamente de um organismo de a-cordo com a invenção pode ser baseada no grau de reatividadedo produto obtido pelo processo de remoção de antigenos desuperfície descrito acima. Especificamente, pode-se determi-nar se a quantidade de tratamento químico ou mecânico de umorganismo é suficiente ou é excessivo pela determinação dograu de ligação de uma amostra conhecida por conter anticor-pos contra um ou mais antigenos de superfície do organismode interesse. Deste modo, uma curva é obtida que permite aum profissional da área otimizar o tratamento de um organis-mo a fim de obter os antigenos de superfície a ser usado nodiagnóstico.

O tratamento ótimo de um organismo para removerantigenos de superfície do organismo vai resultar na ligaçãomáxima dos anticorpos presentes em um fluido em contato comos antigenos de superfície livres. Se um organismo é tratadoaté um ponto no qual os antigenos de superfície não são re-movidos de forma alguma do organismo, então o contato doproduto do tratamento com um fluido teste que sabidamentecontém anticorpos contra o organismo mostrará ligações míni-mas ou nenhuma ligação. Se um organismo é tratado até umponto no qual os antigenos de superfície são removidos doorganismo, mas a um nível abaixo do ótimo, então será obser-vada a ligação reduzida dos antigenos de superfície aos an-ticorpos no fluido teste. Por outro lado, se o organismo étratado até um ponto no qual os antigenos de superfície sãoremovidos mas tal tratamento é continuado de modo que o or-ganismo é rompido, resultando na liberação de antigenos mi-crobianos internos, então a ligação dos anticorpos no fluidoteste aos antigenos de superfície livre também estarão abai-xo do ótimo. Preferivelmente, pode-se realizar tal teste,como aumentando o tempo de sonicação ou de vortex, para ob-ter dados gráficos que indicarão a quantidade de tratamentoque vai fornecer a quantidade ótima de ligação de anticorposem um fluido teste aos antigenos de superfície livres do or-ganismo .

Em outra modalidade, a invenção é um método paradiagnosticar uma infecção em um animal causada por um orga-nismo, como um microorganismo. 0 método de diagnóstico dainvenção é baseado na ligação de um ou mais anticorpos em umfluido obtido de um animal a um ou mais sítios de ligaçãoespecíficos de anticorpo que existem ou existiam na superfí-cie de um organismo infectante em particular. De acordo comeste método, uma amostra teste, preferivelmente uma amostrafluida, é obtida de um animal suspeito de ter sido infectadopor um organismo. A amostra teste é exposta a antigenos desuperfície livres do organismo, como antigenos de superfícielivres que foram obtidos pelo método da invenção descritoacima para obter antigenos de superfície livres de um orga-nismo, pelo tempo suficiente para permitir que um anticorpona amostra teste que se ligue a um sítio de ligação ao anti-corpo em um antígeno de superfície do organismo, se ligue aosítio de ligação ao anticorpo. Foi então determinado se aamostra teste contém um anticorpo que se ligue aos antigenosde superfície livres. O teste é positivo para infecção peloorganismo se os anticorpos na amostra teste se ligam aos an-tígenos de superfície livres do organismo, como determinadopela presença de conjugados anticorpo/antígeno de superfí-cie .

Em uma modalidade preferida, a amostra teste é ex-posta a antigenos de superfície livres de múltiplos organis-mos diferentes, como diferentes microorganismos. Deste modo,o método da invenção pode ser usado como um teste de seleçãopara infecção devido a um grupo de organismos. Este tipo deteste de seleção é particularmente útil para avaliar a pre-sença de infecção em animais que devem ser enviados, especi-almente em situações como o transporte de um animal de umaárea na qual certas doenças são prevalentes para uma áreaonde estas doenças não são encontradas. Se o teste for posi-tivo para a infecção, mais testes podem então ser realizadospara determinar o organismo especifico com o qual o sujeitofoi infectado.

0 método da invenção é distinto dos métodos atual-mente utilizados para o diagnóstico de infecção microbiana efornece várias vantagens que não são obtidas destes métodos.Por exemplo, o método da invenção pode ser feito rapidamen-te. Em uma versão de campo do método da invenção, um resul-tado de teste positivo ou negativo pode ser obtido rapida-mente, tipicamente dentro de cerca de duas horas, em con-traste com métodos de cultura que necessitam de dias ou se-manas. O método da invenção é extremamente sensível, maissensível que os métodos atualmente disponíveis. Diferentedos métodos de cultura, o método da invenção não necessita oisolamento de um organismo de um animal infectado ou a ne-cessidade de cultivar um organismo in vitro. O método da in-venção pode ser usado para fornecer um diagnóstico positivomesmo durante períodos quando um patógeno infeccioso não édetectável em, ou isolado de, um animal hospedeiro. Alémdisso, o método da invenção tem uma especificidade que émaior do que a obtida com outros métodos de diagnóstico dis-poníveis atualmente.

Diferente das recentes inovações no diagnósticocomo aquelas baseadas na identificação de ácidos nucléicosou proteínas, o método da invenção não é baseado na determi-nação da presença em um animal infectado de qualquer macro-molécula específica peculiar a um organismo particular. Alémdisso, diferente dos testes atualmente disponíveis baseadosna ligação de anticorpo, como o teste ELISA, o método da in-venção não apresenta um anticorpo externo para determinar seele se liga a um extrato de um organismo ou fração de um or-ganismo que está presente em um animal hospedeiro. Pelo con-trário, o método da invenção é baseado na determinação de seum ou mais anticorpos presentes em uma amostra teste isoladade um corpo de um animal hospedeiro se liga aos antigenosobtidos de um organismo em particular e quais antigenos fo-ram colocados em contato com a amostra testes.

Em comparação com os testes de ELISA atualmentedisponíveis em cada fluido, como soro, de um animal é colo-cado em contato com antigenos ligados obtidos pelo rompimen-to de um microorganismo e assim liberando antigenos microbi-anos internos e de superfície, o método de diagnóstico dainvenção fornece um diagnóstico mais preciso da infecção de-vido a um organismo em particular. Tal aumento na precisãodo diagnóstico pode ser baseado, por exemplo, nas medidas desensibilidade e especificidade.

Portanto, o método de invenção fornece várias van-tagens adicionais anteriormente não obtidas pelos métodos dediagnósticos presentes. 0 método da invenção pode ser reali-zado rapidamente. Em uma versão de campo dos métodos da in-venção, um resultado de teste positivo ou negativo pode serobtido rapidamente, tipicamente dentro de cerca de duas ho-ras. 0 método da invenção é extremamente sensível, mais sen-sível do que os métodos atualmente disponíveis. 0 método dainvenção pode ser usado para fornecer um diagnóstico positi-vo mesmo durante períodos em que um patógeno microbiano nãoé detectável em, ou isolável de, um animal hospedeiro. Alémdisso, o método da invenção tem uma especificidade que émaior do que a obtida com outros métodos de diagnostica atu-almente disponiveis.

0 método da invenção é útil para o diagnóstico deinfecções em animais. Tais animais incluem mamíferos, comohumanos e primatas não humanos, carnívoros como cachorros,gatos, ursos e doninhas, ungulados ruminantes e não ruminan-tes como cavalos, bovinos, cabras, ovelhas e porcos, rumi-nantes não ungulados como camelos e lhamas, pinipedis comofocas e leões marinhos, logomorpha como coelhos e lebres,roedores como esquilos, ratos e camundongos, cetáceos comobaleias, golfinhos e botos, e proboscídea como elefantes.Tais animais também incluem vertebrados não mamíferos comoaves, répteis, anfíbios e peixe.

Uma amostra teste que é obtida de um animal de a-cordo com o método da invenção pode ser qualquer fluído outecido no qual um anticorpo que se liga especificamente a umorganismo suspeito de ser o causador provavelmente estariapresente se o animal estivesse infectado com este organismo.Tipicamente, a amostra teste é sangue ou sua fração, comoplasma ou preferivelmente soro. Entretanto, considera-se queoutras fontes de amostras podem ser utilizadas de acordo coma invenção. A seleção de tal fonte de amostra teste vai va-riar dependendo, primariamente, dos sintomas e sinais de umanimal infectado e da causa suspeita de tais sintomas ou si-nais. Portanto, a amostra teste pode ser obtida de fluidoscomo saliva, leite, pus, lágrimas e outros fluídos oculares,fluídos nasais, muco, fluído cerebroespinhal, fluído perito-neal ou pleural, urina, fezes e secreções e fluidos vagi-nais, uterinas ou da uretra. Os fluidos também podem incluiraqueles que são produzidos como parte de um processo patoló-gico como exudatos ou transudatos, como os provenientes dapele, cavidade pleural ou peritoneal, cavidade oral ou dosistema digestivo, respiratório ou genital. A amostra testetambém pode ser uma amostra de tecido sólido se apropriadopara o diagnóstico de uma doença particular.

A amostra teste pode ser obtida por qualquer méto-do que seja apropriado para obter tal amostra. Portanto, aamostra teste pode ser obtida pelos métodos como retirada dofluido por seringa,incluindo punção vascular, como por pun-ção venosa, ou retirada do fluido proveniente de outras fon-tes conforme descrito acima, ou por biópsia.

O organismo que é diagnosticado pelo método da in-venção é qualquer organismo, como um microorganismo, que écapaz de gerar uma resposta de anticorpo em um animal infec-tado por tais organismos e de cujo organismo os antigenos desuperfície possam ser extraídos sem o rompimento do organis-mo e conseqüente liberação de antigenos internos, não de su-perfície. Portanto, microorganismos infectantes que possamser diagnosticados pelo método da invenção incluem bactéria,fungo, protozoário, ricketesia e clamídia. Organismos multi-celulares infectantes que podem ser diagnosticados pelo mé-todo da invenção incluem helmintos.

A amostra teste pode ser exposta aos antigenos desuperfície livres de um organismo, como um microorganismo,preferivelmente antigenos de superfície livres que foramdeslocados delicadamente de um organismo, de qualquer manei-ra que permita que os anticorpos que estão contidos na amos-tra teste interajam com os antigenos de superfície livre.Portanto, em uma modalidade preferida, a amostra teste e osantigenos de superfície livres são combinados em um frascocomo um tubo de ensaio ou um poço e são misturados, por e-xemplo, por agitação, vibração, oscilação ou tapando o tubode ensaio ou poço. A amostra teste e os antigenos de super-fície livre também podem reagir juntos em uma superfície co-mo um slide, filtro ou membrana, como uma membrana de nitro-celulose.

De acordo com o método da invenção, a amostra tes-te é exposta a uma população de antigenos de superfície li-vre, como aqueles que foram deslocados delicadamente de umorganismo, por exemplo, por sonicação, preferivelmente rea-lizada enquanto o organismo está em suspensão em um fluidocontendo um agente de extração. Tais antigenos de superfícielivres preferivelmente contém múltiplos sítios de ligaçãoantigênicos que são apresentados aos anticorpos em uma amos-tra teste. Foi descoberto inesperadamente que tais antigenosde superfície livres, como aqueles que foram obtidos pordeslocamento delicado de um organismo, como por sonicação ouvortex em um nível que desloque os antigenos da superfíciede um organismo mas não rompa o organismo de modo a liberarantigenos internos, possuem disponibilidade ótima de sítiosde ligação para a ligação de anticorpos na amostra teste.

Se desejado, antes do deslocamento delicado dosantigenos de superfície, os organismos pode opcionalmenteser morto, pela exposição dos organismos a um fixador quími-co. 0 fixador químico também pode funcionar como um agentede extração. Um fixador químico preferido é o formaldeídoque, por exemplo, quando usado para matar organismos MAP,mantém a habilidade dos sítios de ligação ao anticorpo nasuperfície do MAP de se ligar com anticorpos no soro de ani-mais infectados com o organismo. Uma concentração preferidade formaldeído é de cerca de 1% a 10% v/v, com uma concen-tração de cerca de 2% preferivelmente. Outros fixadores quí-micos que podem ser usados para matar organismos infectantespara o uso nos métodos da invenção incluem fixadores não co-agulantes como acetona, gliceraldeído, glutaraldeído e para-formaldeído, e menos preferivelmente fixadores coagulantescomo etanol e cloreto de mercúrio.

Após a exposição da amostra teste à população deantígenos de superfície livre, é então determinado se os an-ticorpos da amostra teste se ligaram aos antígenos. Tal de-terminação tipicamente é feita pela detecção de conjugadosde anticorpos da amostra teste e antígenos de superfície Ii-vres. Qualquer método que seja adequado para detectar a pre-sença da ligação do anticorpo a um antígeno é adequado parao método da invenção.

Em uma modalidade preferida, a ligação anticorpo-antigeno de superfície livre é determinada por citometria defluxo. Tal determinação por citometria de fluxo pode ser re-alizada pela análise de uma amostra obtida misturando umasuspensão contendo uma amostra de soro e uma população deantígenos de superfície livres que estão preferivelmente li-gados às superfícies em um fluido, como contas de vidro ouplástico. Um anti-anticorpo marcado, tipicamente um anti-anticorpo marcado com fluoresceína pode ser útil na determi-nação da ligação deste modo.

Em outra modalidade preferida, a ligação anticor-po-antígenos de superfície livres é determinada por análiseem blot, como do blot ou Western blot. A determinação pordot-blot pode ser realizada misturando uma suspensão conten-do uma amostra de soro e uma população de antígenos de su-perfície livres com um anti-anticorpo que está marcado, com,por exemplo, biotina ou ouro coloidal, aplicando esta mistu-ra em uma membrana como uma membrana de nitrocelulose ou defluoreto de polivinilidona (PVDF), e determinando a presençade conjugados antígenos de superfície livres-anticorpo mar-cados fixados na membrana. Conforme detalhado abaixo, o di-agnóstico da infecção com tais métodos é preciso, sensível eespecífico. A determinação da infecção como métodos como a-nálise por dot blot permite que o diagnóstico seja feito porinspeção visual e tais métodos são portanto capazes de serrealizados por indivíduos que não estejam treinados tecnica-mente em técnicas de laboratório sofisticadas.

Outros meios de determinação da ligação anticorpo-antigeno de superfície livre é um método semelhante ao ELISAonde antígenos de superfície livres são imobilizados na su-perfície de um ou mais poços e o grau de ligação dos anti-corpos em uma amostra teste é determinado pelas medidas dedensidade ótica. Outro meio é por um teste de tiras reagen-tes como é freqüentemente usado na determinação de gravidezem mulheres. Os antígenos de superfície livres são imobili-zados em uma superfície de teste, como uma tira de papel ounitrocelulose, e são colocados em contato com anticorpos emuma amostra de fluido mergulhando a superfície onde os antí-genos estão imobilizados no fluido. Em um teste de tiras re-agentes, tipicamente um marcador colorimétrico é utilizadode modo que a ligação seja determinada por uma mudança decor visível na superfície do teste.

Em outra modalidade, a invenção é um método parapreparar uma superfície sólida onde os antígenos de superfí-cie livres de um organismo, como um microorganismo, são ade-ridos. A superfície sólida pode ser usada para determinar apresença em uma amostra teste de anticorpos que se ligam aosantígenos de superfície livres e, assim, diagnosticar a in-fecção em um animal causada pelo organismo.

De acordo com esta modalidade da invenção, os an-tígenos de superfície livres de um organismo são obtidas pordeslocamento delicado do organismo conforme descrito acima.Deste modo, antígenos que são coletados do organismo sãosubstancialmente aqueles que previamente eram encontrados nasuperfície do antígeno e nenhum, ou substancialmente nenhum,antígeno interno do organismo é coletado. Se desejado, antí-genos de superfície livres obtidos por deslocamento delicadode múltiplos organismos podem ser utilizados.

Os antígenos de superfície livre são imobilizadosem uma superfície sólida. Se desejado, um tampão de ligaçãopode ser usado para aumentar a aderência dos antígenos à su-perfície .A superfície sólida pode ser uma superficie imper-meável como vidro ou plástico, como é utilizado em uma placade poços, um slide, uma placa de petri ou uma esfera. Alter-nativamente, a superfície sólida pode ser uma superfíciepermeável como papel ou nitrocelulose.

Em outra modalidade, a invenção é uma superfíciesólida a qual os antígenos de superfície livres de um orga-nismo, como um microorganismo, são aderidos. Preferivelmen-te, múltiplos antígenos de superfície livres diferentes sãoaderidos a uma superfície sólida. Preferivelmente, a super-fície sólida é livre de antígenos que não sejam os antígenosde superfície do organismo. Em uma modalidade mais preferi-da, os antígenos de superfície livres de um organismo queestão imobilizados na superfície são obtidos por deslocamen-to delicado conforme descrito acima.

Se desejado, múltiplos antígenos de superfície li-vres diferentes de múltiplos organismos diferentes, como mi-croorganismos, são aderidos ao superfície sólida. Deste mo-do, a superfície sólida pode ser utilizada para determinar apresença de infecção devido a um grupo de organismos.

A invenção é ilustrada nos seguintes exemplos nãolimitantes. Os exemplos utilizam amostras de Mycobacterium,especificamente Mycobacterium avium, e mais especificamenteMyeobaeterium avium subsp paratubereulosis (também conheci-da como Myeobaeterium paratubereulosis) , chamado aqui deMAP. Esta bactéria foi selecionada como exemplo para ilus-trar a invenção porque infecção por MAP, incluindo em indi-víduos sufrendo de doença de Johne em bovinos e doença deCrohn em humanos, é difícil de ser diagnosticada por métodosconvencionais devido ao fato do organismo estar freqüente-mente ausente de amostras obtidas de sujeitos infectados.

Portanto, como a infecção é um processo geral queé aplicável a qualquer microorganismo dos quais os antígenosde superfície podem ser obtidos sem o rompimento do microor-ganismo com a conseqüente obtenção dos antígenos internosjunto com os antígenos de superfície, a detecção da infecçãodevido a MAP é um teste difícil que ilustra a ampla aplica-bilidade da invenção.

Exemplo 1 - Preparação de antígenos de superfícielivres imobilizados

Antígenos de superfície livres de Mycobacteriumavium subsp paratuberculosis (MAP, linhagem Linda) forampreparados da seguinte maneira. Seis miligramas da bactériaforam retiradas de 900 μΐ, de cultura bacteriana por centri-fugação à 2200xg. A bactéria foi misturada com 300 μΙ1, de umagente extrator selecionado de água destilada, metanol, eta-nol, propanol, acetonitrila, acetona, clorofórmio, cloretode metileno, éter e hexano. As misturas foram então ressus-pendidas por vortex por 1 min, centrifugadas para formar umpellet, e 50 yL do sobrenadante foram adicionados em cadapoço de uma placa de plástico de 96 poços. As placas foramdeixadas secar em temperatura ambiente fazendo com que osmateriais (antígenos de superfície livres) aderissem na su-perfície do poço.

Exemplo 2 - Ligação de antígenos de superfície li-vres extraídos com vários solventes

Os poços preparados conforme descrito no Exemplo 1foram lavados com 100 yL do tampão A (salina fosfato tampo-nada (PBS) contendo 20% Superblock (Pierce Biotechnology,Inc., Rockford, IL, USA) e 0.05% Tween 80), incubado por umahora em temperatura ambiente com soro diluído 1:50 de vacasque sabidamente tinham ou não tinham a doença de Johne. Apóslavar quatro vezes com 100 μΐ, de PBS contendo Tween 20 0, 5%,os poços foram incubados com anticorpo biotinilado IgG anti-bovino policlonal (diluição 1:500 em tampão A, Jackson Immu-noResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) por umahora em temperatura ambiente. Após lavar quatro vezes com100 pL de PBS contendo Tween 20 0,5%, os poços foram incuba-dos com peroxidase de rábano conjugado com estreptoavidina(diluição de 1:1000 em tampão A) por 1 hora em temperaturaambiente. Após lavar quatro vezes com 100 pL de PBS contendoTween 20 0,5%, os anticorpos ligados foram quantificados pordensidade ótica com um leitor de microplacas (Bio-Rad Labo-ratories, Hercules, CA, USA) ajustado para 415 nm. Os resul-tados são mostrados graficamente na figura 1.

Conforme mostrado na figura 1, o método da inven-ção utilizando qualquer agente de extração foi capaz de de-tectar a presença de anticorpos específicos para MAP nas a-mostras de soro e que a ligação de anticorpos foi considera-velmente maior nas amostras de soro positivas para MAP doque nas amostras de soro negativas para MAP. Este resultadoestabelece que cada um dos agentes de extração foi capaz deextrair antígenos de superfície livres dos organismos MAP.Conforme mostrado, os álcoois (metanol, etanol e propanol)extraíram a maior quantidade de antígenos específicos para MAP.

Exemplo 3 - Ligação diferencial com várias concen-trações de etanol

Antígenos de superfície livre de MAP ou Mycobacte-rium avium subsp. avium (MAA) foram preparados conforme des-crito no Exemplo 1 usando várias concentrações de etanol co-mo agente de extração. A ligação dos anticorpos no soro deanimais que sabidamente tem a doença de Johne foi determina-da conforme descrito no Exemplo 2 para cada uma das váriasconcentrações usando antígenos de superfície livres MAA ouMAP. Os resultados são mostrados na Figura 2.

Conforme mostrado na figura 2, os poços contendoantígenos que foram extraídos em concentrações de etanol a-baixo de 40% mostraram níveis similares de ligação de anti-corpo quando colocados em contato com soro positivo para do-ença de Johne usando extratos de MAA ou MAP. Em uma concen-tração de etanol de 50% ou mais, foi observado o aumento daligação de anticorpo com extratos de MAP quando comparadocom os extratos de MAA. As diferenças mais significativas naligação do anticorpo entre os extratos de MAP e MAA foramobservados em concentrações de etanol superior a 60% e espe-cialmente entre 60% e 70%.

Exemplo 4 - Especificidade

Amostras de soro de vacas sabidamente infectadascom MAP e vacas sabidamente não infectadas com MAP foram a-nalisadas conforme descrito nos exemplos acima usando extra-tos MAA e MAP, respectivamente, que foram obtidos usando e-tanol na concentração de 70 %. Os resultados são mostradosgraficamente na Figura 3.

Conforme mostrado na Figura 3, o método da inven-ção identificou corretamente infecção por MAP nas amostras enão mostrou diagnósticos falso positivo assim como o métododa invenção não mostrou ligação quando os extratos de MAAforam usados como antígeno teste. Este estudo estabelece aalta especificidade do método da invenção, que é capaz dedistinguir entre organismos muito próximos, mesmo entre MAPe MAA que são atualmente classificadas como sub-espécies damesma espécie de bactéria.

Exemplo 5 - Preparação de antigenos de superfícielivres imobilizados

Quinhetos microgramas de MAP foram ressuspendidosem várias concentrações de solução de formaldeído contendometanol a .10% por 20 min em temperatura ambiente. A suspen-são foi sonificada por 2 segundo, centrifugada à 2200xg e osobrenadante foi usado como antígeno conforme o Exemplo 1.Cinqüenta μΐϋ de sobrenadante foi adicionado a cada poço deuma placa de 96 poços. As placas foram deixadas secar emtemperatura ambiente deixando os materiais (antigenos de su-perfície livres) imobilizados na superfície do poço.

Exemplo 6 - Ligação aos antigenos de superfícielivres extraídos com concentrações variadas de formaldeído

Os poços preparados conforme descrito no Exemplo 5foram lavados com 100μ]1 de tampão A (tampão salina fosfato(PBS) contendo 20% Superblock (Pierce Biotechnology, Inc.,Rockford, IL, USA) e 0.05% Tween 80), incubado por uma horaem temperatura ambiente com soro diluído 1:50 de vacas sabi-damente tendo ou não tendo a doença de Johne. Após lavar A-pós lavar quatro vezes com 100 μί de PBS contendo Tween 200,5%, os poços foram incubados com anticorpo biotinilado IgGanti-bovino policlonal (diluição 1:500 em tampão A, JacksonImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) poruma hora em temperatura ambiente. Após lavar quatro vezescom 100 μL de PBS contendo Tween 20 0,5%, os poços foram in-cubados com peroxidase de rábano conjugado com estreptoavi-dina (diluição de 1:1000 em tampão A) por 1 hora em tempera-tura ambiente. Após lavar quatro vezes com 100 μL de PBScontendo Tween 20 0,5%, os anticorpos ligados foram quanti-ficados por densidade ótica com um leitor de microplacas(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ajustado para 415nm. Os resultados são mostrados graficamente na figura 4.

Conforme mostrado na figura 4, os poços contendoantígeno MAP que foram extraídos em várias concentrações deformaldeído mostraram níveis similares de ligação de anti-corpo quando em contato com soro positivo para a doença deJohne. Entretanto, os níveis de ligação de anticorpo nos so-ros de vacas negativos para a doença de Johne diminuíramconforme a concentração de formaldeído aumentava. Os dadosda figura 4 indicam que níveis mais altos de especificidadesão obtidos para o diagnóstico de infecção por MAP quandoutilizamos concentrações mais altas de formaldeído como oagente extrator, até a concentração maior de formaldeído de37% .

Exemplo 7 - Ligação de antigenos de superfície li-vres extraídos com durações variáveis de sonicação

Os poços foram preparados conforme o Exemplo 6 u-sando 37% de formaldeído com 10% de metanol como o agente deextração e com durações variadas de sonicação. Os resultadossão mostrados graficamente na Figura 5.

Conforme mostrado na Figura 5, virtualmente qual-quer quantidade de sonicação é suficiente para detectar aligação de anticorpos de animais infectados com MAP, indi-cando que, baseado nesta medida, a sensibilidade da capaci-dade diagnostica da invenção não parece mudar em função dotempo de sonicação. Por outro lado, o aumento no tempo desonicação resultou no aumento da ligação de anticorpo obser-vado no soro de animais não infectados por MAP, indicandoque a especificidade do método diagnóstico diminui em funçãodo aumento do tempo de sonicação. Acredita-se que a diminui-ção na especificidade do método da invenção com o aumento notempo de sonicação é causado pela liberação de antigenos in-ternos de MAP, entre os quais estão antigenos que não sãoespecíficos para MAP.

Exemplo 8 - Especificidade e sensibilidadeAntigenos de superfície livres foram extraídos deorganismos MAP e foram imobilizados em poços conforme des-crito nos Exemplos 5 e 6. Formaldeído a uma concentração de37% com metanol a 10% foi usado como agente de extração esonicação foi aplicada por cerca de 2 segundos.

Duas populações de gado foram testadas para deter-minar a sensibilidade e especificidade do método da inven-ção. Amostras de soro de 35 bovinos negativos para a doençade Johne e de 23 bovinos positivos para a doença de Johneforam testadas. Um valor S/P de 0,3 foi estabelecido como umlimite para determinar um diagnóstico positivo usando a se-guinte fórmula: valor S/P = (S-NC) / (S-PC) , onde S é adensidade ótica (absorbância à 415 nm) de uma amostra con-trole, NC é a densidade ótica obtida usando soro de gado ne-gativo, e PC é a densidade ótica obtida usando soro de gadopositivo. Os resultados são mostrados na Figura 6.

Conforme mostrado na figura 6, cada um do 35 bovi-nos testaram negativo pelo método de diagnóstico da inven-ção, fornecendo uma especificidade para o teste a um valorde S/P de 0,3 de 100%. Dos 23 gados positivos, 22 testarampositivos pelo método de diagnóstico da invenção, gerandouma sensibilidade para o teste neste valor S/P de 95,6%. Afigura 6 mostra que, se um valor S/P é usado, por exemplo,25% que é usado no teste de ELISA comercial para a doença deJohne, a sensibilidade do teste da invenção seria medida em100%, embora a especificidade cairia para 94,3%. Os resulta-dos claramente mostram a extremamente alta combinação de es-pecificidade e sensibilidade obteniveis pelo método de diag-nóstico da invenção.

Exemplo 9 - Diagnósticos em fluidos corporais quenão sejam sangue

Antigenos de superfície livres foram obtidos deorganismos MAP e imobilizados em poços conforme descrito a-cima no Exemplo 8 . As amostras de soro e amostras de leitede 20 vacas, algumas das quais positivas para MAP e algumasdas quais negativas para MAP foram testadas de acordo com ainvenção. Os resultados são mostrados na Figura 7.

Conforme mostrado na figura 7, 12 das 20 vacas ti-veram resultado positivo para a infecção por MAP por testediagnóstico do soro. Das 12 vacas soro positivas, todas tes-taram positivo pelo teste diagnóstico do leite. Além disso,8 das 20 vacas MAP deram resultado negativo pelo teste diag-nóstico do soro. Destas 8 vacas soro negativas, 7 deram re-sultado negativo pelo teste diagnóstico do leite. Apenas umavaca mostrou uma discrepância entre os testes do soro e doleite, e esta vaca, que deu resultado negativo no soro, teveapenas um resultado positivo limítrofe quando feito no lei-te.

Exemplo 10 - Teste comparativo

Cento e cinco (105) vacas foram divididas em trêsgrupos com base em dois critérios, (1) resultado do teste decultura fecal para MAP e (2) desenvolvimento de sintomas dadoença de Johne. O Grupo I contendo 30 vacas que foram diag-nosticadas negativo para MAP pela cultura fecal e não mos-travam nenhuma sinal da doença de Johne. Para confirmar ostatus negativo deste grupo, cada vaca também foi testadapara infecção por MAP por teste ELISA convencional e testepara interferon gama com resultados negativos. Grupo II con-tendo 52 vacas que testaram negativo por cultura fecal eELISA convencional, mas que desenvolveram sinais da doençade Johne. Portanto, nestas vacas, os resultados de culturafecal e de ELISA convencional eram falso negativos. GrupoIII continha 23 vacas que testaram positivamente para a cul-tura fecal para a presença de MAP. A cultura fecal foi rea-lizada várias vezes em cada vaca, geralmente quatro vezes,antes que o resultado da cultura fecal fosse considerado ne-gativo. Por exemplo, das 23 vacas do grupo III, 9 tinham pe-lo menos um resultado negativo no teste de cultura fecal mastiveram testes positivos em pelo menos um outro teste.

As amostras de soro foram obtidas de cada uma das105 vacas e foram testadas pela presença de anticorpos con-tra MAP de duas maneiras. O soro foi testado misturando aamostra com uma população de organismos MAP intactos e de-tectando a ligação anticorpo/MAP por citometria de fluxo.

Este método é relatado em Eda, U.S. Patent Application No.10/832,761, depositado em 27 de abril de 2004, e mostrou-seum método mais sensível e mais especifico de diagnosticaruma infecção microbiana e que o teste de ELISA convencional.

Um valor de S/P de 0,23 ou superior foi determinado comosendo um teste positivo pelo método de citometria de fluxo.

O soro também foi testado pelo método da presente invençãoconforme descrito nos exemplos acima. Os antígenos de super-fície livres de MAP foram obtidos por deslocamento delicadopor um pulso curto de sonicação de uma suspensão de MAP em37% de formaldeído e 10% de metanol. Um valor S/P de 0,35 ousuperior foi determinado como sendo um teste positivo poreste método. Os resultados da testagem são mostrados abaixona Tabela 1.

Tabela 1

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Conforme mostrado na Tabela 1, das 30 vacas dogrupo I, com testes 100% negativos para cultura fecal, umdestes apresentou resultado positivo pelo teste "MAP intac-to" do pedido de patente depositado anteriormente. Entretan-to, o teste dos antigenos de superfície de MAP da presenteinvenção determinou que 3 das vacas do grupo I, incluindoaquela que testou positivo pelo teste de MAP intacto, forampositivas para a infecção por MAP.

A tabela 1 mostra também que, das 52 vacas do gru-po II, aquelas com resultados falso-negativo por cultura fe-cal e testes de ELISA convencionais, o teste do MAP intactodiagnosticou corretamente 37 destas 52 vacas (71%) como sen-do positivo. Isto mostra a considerável melhora no diagnós-tico que é conseguida com o teste do MAP intacto quando com-parado com os métodos de diagnósticos disponíveis atualmen-te. Entretanto, o teste do antigenos de superfície MAP dapresente invenção forneceu um diagnóstico ainda mais preci-so. Este teste diagnosticou corretamente 50 destas 52 vacas(96%) como sendo positivo. Estes resultados estabelecem asensibilidade extremamente alta do método da invenção, aindamais alta do que o do teste MAP intacto que por sua vez temuma sensibilidade maior do que os métodos de diagnósticodisponíveis atualmente.

Os dados da Tabela 1 mostram que 23 das vacas dogrupo III foram diagnosticadas positivamente pelo teste decultura fecal. Destas, 3 (13%) testaram negativamente peloteste do MAP intacto e 1 (4,3%) testou negativamente peloteste dos antigenos de superfície de MAP. À primeira vista,este dado pode sugerir que a cultura de fezes é mais sensí-vel que os outros dois testes. Entretanto, quando os dadosde teste de cada vaca individual é examinado, fica claro quea especificidade do teste MAP intacto e do teste antígeno desuperfície MAP da presente invenção são consideravelmentemaiores do que o teste da cultura fezes.

Os dados da testagem individual de vacas, que nãofoi mostrada na Tabela 1, mostrado na Figura 8. A figura 8mostra que o teste de cultura fecal foi feito 4 vezes em 14das vacas do grupo III, 3 vezes em 5 vacas do Grupo III eduas vezes ema vaca do grupo III, em um total de 88 testesde cultura fecal realizados. Destes testes, 21 foram negati-vos. Portanto, a sensibilidade do teste de cultura fecal écalculada para ser 76% (67/88). Por outro lado, a sensibili-dade do teste MAP intacto (20/23) foi de 87% e a do testeantígeno de superfície MAP da invenção (22/23) foi de 95,7%.Portanto, o dado estabelece a sensibilidade do teste da pre-sente invenção.

Outras modificações, uso e aplicações da invençãodescritas aqui serão aparentes para os profissionais da á-rea. Estas modificações estão englobadas nas reivindicaçõesque se seguem.

Claims (27)

1. Método para determinar a presença de anticorposde um organismo em uma amostra teste que foi removida deum animal, CARACTERIZADO por compreender expor a amostrateste aos antigenos de superfície livre do organismo, queforam obtidos pela remoção de antigenos da superfície do or-ganismo sem romper o organismo e remover antigenos internosdo organismo, pelo tempo suficiente para permitir que um an-ticorpo na amostra teste que se liga a um sítio de ligaçãoao anticorpo em um antígeno de superfície do organismo, seligue ao sítio de ligação ao anticorpo, e determinar se aamostra teste contém um anticorpo que se liga aos antigenosde superfície livre do organismo pela detecção da presençade um ou mais anticorpos na amostra teste que estão ligadosaos antigenos de superfície livre.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do organismo ser um microorganismo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato do microorganismo ser uma bactéria.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato da bactéria ser uma micobactéria.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato da micobactéria ser Mycobacteriumavium subsp. Paratuberculosis.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato da remoção dos antigenos da superfí-cie do organismo ser por tratamento mecânico do organismocombinado com tratamento do organismo com um agente de ex-tração.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,CARACTERIZADO pelo fato do tratamento mecânico ser sonicaçãoou vórtex.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do fluido ser sangue, soro ou plas-ma .

9. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato da exposição da amostra teste aosantigenos de superfície livre ser feita misturando a amostrateste e os antigenos de superfície livres em um frasco.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato da detecção da ligação ser por cito-metria de fluxo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato da detecção da ligação ser por aná-lise por blot.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato da exposição da amostra teste aosantigenos de superfície livre ser em uma superfície.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato dos antigenos de superfície livreestarem imobilizados na superfície de um ou mais poços e aligação dos anticorpos na amostra teste aos antigenos de su-perfície livres ser determinada pelas medidas de densidadeótica.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato dos antigenos de superfície livreestarem imobilizados em uma superfície teste e serem expos-tos à amostra teste mergulhando a superfície na qual os an-tígenos estão imobilizados em uma amostra de teste fluida.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14,CARACTERIZADO pelo fato de um marcador colorimétrico ser u-tilizado de modo que a ligação seja determinada por uma mu-dança de cor visível em uma superfície teste.

16. Método para obter antígenos de superfície deum organismo, CARACTERIZADO por compreender o tratamento rae-cânico do organismo enquanto o organismo está suspenso em umfluido contendo um agente de extração onde a quantidade detratamento é suficiente para remover os antígenos de super-fície do organismo mas é insuficiente para romper o organis-mo de modo a liberar antígenos internos do organismo, e, aseparação dos antígenos de superfície removidos do organismodas frações do organismo que não sejam os antígenos de su-perfície removidos.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato do tratamento mecânico ser sonicaçãoou vórtex.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato do organismo ser um microorganismo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADO pelo fato do microorganismo ser uma bactéria.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,CARACTERIZADO pelo fato da bactéria ser uma micobactéria.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato da micobactéria ser Mycobacteriumavium subsp. Paratuberculosis.

22. Método para obter uma superfície sólida naqual os antigenos de superfície livre de um organismo sãoaderidos, CARACTERIZADO por compreender a remoção de antíge-nos da superfície do organismo sem romper o organismo e li-berar antigenos internos do organismo, a separação dos anti-genos de superfície removidos das frações do organismo quenão sejam os antigenos de superfície removidos, obtendo as-sim antigenos de superfície livre do organismo, e a imobili-zação dos antigenos de superfície livre em uma superfíciesólida.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato da superfície sólida ser uma super-fície impermeável.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato dos antigenos de superfície seremremovidos por tratamento mecânico do organismo enquanto oorganismo está suspenso em um fluido contendo um agente deextração.

25. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato do organismo ser um microorganismo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25,CARACTERIZADO pelo fato do microorganismo ser uma bactéria.

27. Superfície sólida, CARACTERIZADA pelo fato deser preparada pelo método, conforme definido na reivindica-ção 22.