TARIFNAME BRUCELLA SP. SUSLARININ ANTIJENIK OMP16, OMP25, OMP2b VE OMP31 PROTEINLERININ HIZLI TANISINA VE TESHISINE IMKÂN VEREN KIT TEKNIK ALAN Bulus; saglik ve veterinerlik alaninda, besicilik sektöründe, et ve süt isletmelerinde kullanilmak üzere tasarlanmis, Brucella sp. cinsi bakterilerin sebep oldugu bruselloz hastaliginin erken ve hizli teshisi, çanlida Brucella sp. cinsi bakteri enfeksiyonun olup olmadigi ve hastaligin seyrinin anlasilabilmesi için, hastaliga neden olan üç Brucella sp. cinsinin (B. melitensis, B. abortus ve B. Canis) antijenik özellikteki OMP16, OMP25, OMP2b ve OMP31 proteinlerinin tanisina dayali antikorlarinin tespitini, immunokromatografik prensipler uyarinca tek bir kromatografik kaset içerisinde daha hassas ve dogrulukta gerçeklestirilen hizli tani kiti ile ilgilidir. ÖNCEKI TEKNIK Brucella Cinsi bakteriler; sigir, koyun, keçi, domuz ve köpek gibi hayvanlarin, genital organlari (testis, uterus) ile memelerine yerleserek, abort (yavru atimi), infertilite (kisirlik), mastitis (meme iltihabi), orsitis (testis iltihabi) ve artritis (eklem iltihabi) gibi komplikasyonlara neden olan, dünyanin büyük bir kesiminde ve özellikle de endemik yörelerde yaygin olarak görülen, ciddi ekonomik kayiplara yol açan önemli bir zoonozdur. Dünyada birçok ülkede Bruselloz ile mücadele kampanyalari baslatilmis ve birkaç ülke sigir Brusellozunu büyük ölçüde eradike etmeyi basarmis olmasina karsin, koyun ve keçi brusellozu ise basta gelismekte olan ülkeler olmak üzere dünyanin birçok yerinde halen yaygin bir sekilde devam etmektedir. Kuzey Avrupa, Kuzey Amerika, Avustralya ve Yeni Zelanda'da yillar süren yogun çabalarla Bruselloz büyük ölçüde eradike edilmistir. Buna karsin bazi Güney Avrupa ülkelerinde, özellikle Akdeniz Bölgesi, Orta Dogu, Bati Asya'nin gelismekte olan ülkelerinde yayginligini sürdürmektedir. Akdeniz ülkelerinde ise bu enfeksiyon birçok hastalik arasinda ön sirada yer almaktadir. Ülkemizde bugüne kadar koyun ve keçilerde görülen bakteriyel orjinli yavru atmalarin genellikle Bruselloz sonucu olustugu, farkli bölgelerimizde hastalik prevalansinin genelde hayvanlarda kontrol altina alindigi halde, yurt disi seyahatlerinde bulunan veya güvenli olmayan hayvan ürünlerini tüketen bireylerle, etkene maruz kalabilme olasiligi yüksek bazi meslek gruplarinda (çiftçiler, veteriner hekimler, laboratuvar ve mezbaha çalisanlarinda) görülmeye devam etmektedir. Dünya'da ve ülkemizde Bruselloz için temel bulas kaynagi pastörize edilmemis süt ve süt ürünlerinin tüketimidir. Yurdumuzda oldukça fazla miktarda üretilen süt ürünlerinin büyük çogunlugu hijyenik olmayan sartlarda, ilkel yöntemlerle çig sütten üretilmektedir. Anadoluida birçok yörede halkin hastaligi ve bulas yollarini bilmelerine karsin süt ve süt ürünlerini kaynatmadan tükettikleri, kaynatma ve pastörizasyon gibi islemlerden geçirilmis sütlerden tereyagi ve peynirlerin gerek yapiminin zor olmasi gerekse damak zevkine uygun olmamasi nedeniyle bu aliskanliklarini birakamadan üretime ve tüketime devam ettikleri ve her yil binlerce insanin bu hastaliga yakalandigi bildirilmektedir. Ayrica hastalikla birlikte insanlarda meydana gelen fiziki yetersizlik, is gücü kaybi ve tedavi için yapilan masraflar ülke ekonomisine büyük bir yük getirmektedir. Türkiye'deki Brusella sp. enfeksiyonlarindan kaynaklanan finansal kayiplar ve alternatif bruselloz kontrol stratejilerinin maliyet-fayda analizleri ile ilgili kapsamli çalisma, 2010 yilinda sunulmustur. Çalismada, hastalik senaryolari üzerinden olasi Brusellozun maliyet hesaplari yapilmistir. Meydana gelme olasiligi en yüksek olan yani beklenen senaryoya göre enfekte hayvanlar ile insanlarda Bruselloz kaynakli meydana gelen toplam finansal kayip tutari 62, olarak tahmin edilmektedir. Kayiplarin en düsük düzeyde hesaplandigi iyimser senaryonun gerçeklesmesi durumunda 30., kötümser senaryonun ortaya çikmasi durumunda ise 92, finansal kaybin meydana gelecegi tahmin edilmistir. Çalisma sonuçlarina göre, toplam kayiplar içindeki en büyük payin %51 ile %57 arasinda degismekte ve bu oranin %29 ile Brusellozun maliyeti hayvansal gida üretiminde ve hazirlanmasinda çalisanlar, kasaplar, et paketleyenler, süt ve süt ürünleri hazirlama isinde çalisanlar, hayvan çiftliklerinde çalisanlar, veterinerler, hayvancilik yapan aile bireyleri, yün ve deri ile ugrasanlar, laboratuvarlarda çalisan hekim ve teknisyenler gibi genis bir çerçevedeki çalisan insanlari etkilemesi nedeniyle ekonomik boyutta kayiplar daha da riskli olabilmektedir. Öte yandan hastaligin teshisinde kullanilan metotlarin maliyeti ve teshis ve taninin konma süresi dikkate alindiginda Brusellozun tanisi için hizli, maliyeti düsük pratik bir tanimlama metoduna ihtiyacin oldugu görülmektedir. Teshis ve tedavi anlaminda büyük ilerleme kaydedilmesine ragmen Bruselloz insan ve hayvanlar için sik görülen ciddi bir saglik sorunu olarak güncelligini korumaktadir (Heck, 1980). Mevcut teknikte piyasada kullanilan Bruselloz tani testleri direkt ve indirekt yöntemler olmak üzere iki farkli prensip ile çalismaktadir. 1. Direkt Tani Testleri 2. indirekt Tani Testleri 1.1.Kültür 2.1. Hizli aglütinasyon ve Tüp aglütinasyon testleri 1.2. Moleküler testler 2.2. ELISA 1.2.2. Restriction Fragment Length 2.4. Brucellacapt testi Polymorphism (RFLP) 2.5. Brusella dipsitik test 2.6. Floresan polarizasyon deneyi 2.7. Immünfloresan test (lFT) 2.8. Deri testleri 1. Direkt Tani Testleri 1.1 Kültür metodu Standart bir yöntemdir. Brusella süpheli örneklerden hastalik etkeni kan ve kemik iligi kültürlerinden izole edilir. Dalak, karaciger biyopsi materyalleri, apseler, eklem sivisi, BOS gibi örneklerden de etken izole edilebilir. Kültür için solid (kati) ve sivi besiyerleri kullanilir. Brucella sp. kanli agar, çikolata agar ve tripticase soy agarda ürer. Kan kültürleri sadece sivi ortamlarda ve bifazik ortamlarda yapilabilmektedir. Tüm ekimler çift yapilarak biri %5-10 CO2,II ortamda 37°C'de enkübe edilerek hastalik tespiti yapilmaktadir. Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Analizler uzun süre almakta, kültür örneklerinin alinma zorlugu ve laboratuvar ve teknik eleman gereksinimi bulunmakta ayrica pahali laboratuvar ekipmanlarina ihtiyaç duyulmakta ve gerçeklestirilen islemler pratik olmamaktadir. 1.2. Moleküler Testler PZR, Brusellozun tanisinda kültür ve serolojik testlerden daha duyarlidir. Bu metotta Brusella süpheli örneklerden hastalik etkeninin DNA'si izole edilerek bu DNA örneginden var-yok analizi yapilarak teshis saglanmaktadir. Bu yöntemle, klinik örneklerden Brusella bakterisinin direk tespit edilmesinde duyarlilik %50 ila Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Analizler uzun süre almakta, kültür örneklerinin alinma zorlugu ve laboratuvar ve teknik eleman gereksinimi bulunmakta ayrica pahali laboratuvar ekipmanlarina ihtiyaç duyulmakta ve gerçeklestirilen islemler pratik olmamaktadir. Testin özgünlük ve duyarlilik araliginin degiskenliginin yüksek olmasi diger bir dezavantajdir. Türe özel RFLP, genusun üyelerini ayirmada kullanilabilecek moleküler testlerden biridir. Bu yöntem çesitli organizmalarin DNA"larinin özel restriksiyon enzimleri (Restriksiyon Endonükleazlari: RE) kullanilarak kesilmesi sonucunda, türlere ve hatta bazen suslara özgü farkli uzunluklarda DNA parçalari olusmasi ile karakterize DNA modellerinin elde edilmesidir. Elde edilen modellere, belli bir popülasyona ya da bireye özgü oldugu için "DNA parmak izi" (DNA finger printing-DNA profiling) denir. Restriksiyon enzimleri DNA'yi 4-6 bp'lik özel tanima bölgelerinden keserler. Daha sonra ortaya çikan DNA parçalarinin uzunluklari jel elektroforezi yoluyla görüntülenir. Son yillarda Brusella suslarinin tür/biyovar tayini amaciyla RFLP analizi ve AMOS-PCR (abortus melitensis ovis suis) gibi çesitli teknikler denenmis, ancak karsilasilan sorunlar nedeniyle çok fazla kullanim alani bulamamistir. Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Analizler uzun süre almakta, kültür örneklerinin alinma zorlugu ve yüksek kontaminasyon riski bulunmaktadir. Laboratuvar ve teknik eleman ayrica pahali laboratuvar ekipman (PCR ve jel elektroforez cihazi, pahali kimyasal kullanimi) gereksinimi bulunmakta ve islemler pratik olmamaktadir. Testin özgünlük ve duyarlilik araliginin degiskenliginin yüksek olmasi diger bir dezavantajdir. 2. Indirekt Tani Testleri (Serolojik Testler) Bu yöntemler, hastaliga neden olan mikroorganizma ya da bu mikroorganizmanin antijenlerine organizmanin verdigi bagisik yanit sonucu olusan antikorlarin serolojik olarak belirlenmesine dayanan tani yöntemleridir. 2.1 .Aglütünasyon Testleri Hastalik süphelilerinden alinan örneklerden serum tüp aglütinasyon testi ile yapilan bir test yöntemidir. Bruselloz tanisinda kullanilan standart serolojik test Serum Tüp Aglütinasyon (STA) testidir. Brucella sp. kolonilerinden alinan bakterilerin isi ile öldürülmüs fenollü süspansiyonundan elde edilen antijenin, hasta serumunun ardisik dilüsyonlari ile karsilastirilmasi esasina dayanir. Bu antijen, lipopolisakkarit (LPS) benzerliginden dolayi B. abortus, B. Suis ve B. melitensis"e karsi olusmus antikorlar tarafindan aglütine edilir. Özgüllügün düsüklügünden sorumludur. Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Analizler uzun süre almakta ve uzun inkübasyon süresi gerekmektedir. Kültür örneklerinin alinmasi zordur. Laboratuvar ve teknik eleman ayrica pahali laboratuvar ekipman gereksinimi bulunmakta ve gerçeklestirilen islemler pratik olmamaktadir. Numunede yüksek antijen gereksinimi bulunmasi, kronik ve komplike vakalarda yanlis negatif sonuç verebilirliginin yüksek olmasi ve düsük özgünlük diger dezavantajlardir. Bu testin en büyük dezavantaji hastaliktan sonra uygun antibiyotik tedavisine karsin olgularin %5 ila 72"sinde anlamli STA testi titrasyonlari iki yila kadar yüksek kalabilmesidir. Bu nedenden dolayi hasta takibinde kullanilamamaktadir. Bu testin diger bir olumsuzlugu B. canis enfeksiyonu tanisinda kullanilamamasidir. ELlSA klinik olarak bruselloz düsünülen, ancak diger tanisal testlerin negatif oldugu, komplike, lokal ve kronik vakalarda seçilebilecek bir testtir. Total ve özgül immunglobulinleri (IgG, IgM, IgA), 4 ila 6 saat gibi hizli bir sürede, yüksek duyarlilik ve özgüllük ile saptayabilir. Özellikle nörobruselloz vakalarinda beyin omurilik sivisinda (BOS) antikor aramak için ELISA testi uygun bir yöntemdir. Ayrica nüksü ve kroniklesmeyi belirlemede ELlSA ile IgG titresinin ölçümü çok önem tasimaktadir. Çünkü nüks olgularinda IgM genellikle negatif iken, lgG artan titrelerde pozitif bulunmustur. ELISA duyarliligi ve özgüllügü ile çogu testten üstün olmasina ragmen pahali olusu en büyük dezavantajidir. Son zamanlarda gelistirilen 'Competitive Enzyme Immunoassay (CELlSA)' testinin özgüllügü brusellozunun tanisinda uygun bir test oldugu ve bir dogrulama testi olarak kullanilabilecegi bildirilmektedir. Bu yöntemin dezavantaji i' eksik yönleri Tek bir tür için spesifik olmasi, teshis süresinin 4 ila 6 saat ve10 ila 20 dk arasinda degiskenlik göstermesi, kit için kullanilacak antikor üretiminin pahali olmasi dezavantajlar arasinda siralanmaktadir. Bu test; serum tüp aglütinasyon (STA) testi sonuçlarinin yetersiz kaldigi veya negatif oldugu inkübasyon dönemi, geç kronik safha veya asilanmalarda önemli bir tani yöntemidir. Hastaligin ileri evrelerinde veya kronik hastalarda predominant olan lgG antikorlarinin tanisinda; 1/64 ve üzerindeki titreler kullanilir ve bu test aglütinasyon mantigi ile çalismaktadir. Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Analizler uzun süre almaktadir. Kültür örneklerinin alinmasi zordur. Laboratuvar ve teknik eleman ayrica pahali laboratuvar ekipman gereksinimi bulunmaktadir. Gerçeklestirilen islemler pratik degildir. Testin özgünlük ve duyarlilik araliginin degiskenliginin yüksek olmasi diger bir dezavantajdir. Bu yöntem; antikomplementer aktivitenin ortaya çikmasi, kompleman gibi kararsiz reaktiflerin kullanilmasi, hastaligin baslangiç dönemlerinde kompleman fiksasyonuna yanitin tespit edilmesindeki yetersizlik ve teknik gereksinimler gibi diger bazi dezavantajlara sahiptir. 2.4. Brucellacapt Testi Son zamanlarda gelistirilen bu test "Sandwich ELISA" sistemine dayali, mikro plaklarin kullanildigi, STA ve coombs bir arada yapildigi bir immünooapture aglütinasyon yöntemidir. Kuyuouklar insan kaynakli IgA, IgM ve IgG antikorlarina karsi coombs antikorlari ile kaplidir. Bu nedenle Brusellaya karsi olusan her Üç antikor da saptanabilir. Incelenen serumda Brusella antikorlari yoksa antijenler kuyuouk duvarindaki antikorlara baglanmamakta ve dibe çökmektedir. Kuyuouk dibinde mavi bir nokta görünümü olusur ve sonuç negatiftir. Ama serumda Brusella antikorlari varsa antijenler duvardaki antikorlar tarafindan tutularak homojen bir mavilik meydana gelmektedir. Bu durumda sonuç pozitif olarak degerlendirilir. Bruselloz için 1/320 ve üzeri titreler daha anlamli kabul edilir. Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Serum tüp aglütinasyon (STA) ve Rose-Bengal (RB), bu testlerdeki yalanci pozitiflik olusturabilecek durumlarin brucellacapt testinde de geçerli olmasi en büyük dezavantajidir. Ayrica analizler uzun süre almakta, laboratuvar ve teknik eleman gereksinimi bulunmakta, pahali laboratuvar ekipmanlarina ihtiyaç duyulmaktadir. Gerçeklestirilen islemlerin pratik olmamasi da ayri bir dezavantajdir. 2.5. Brucella Dipsitik Test Brucella spesifik IgM antikorlarinin arastirilmasi için basit dipsitik kiti gelistirilmistir. Dipsitik isiya dirençli antijen santrifügasyon ile hücre kalintilarinin kaldirilmasini takiben 95 °Cide isitilmis su ile yikanmis B. abortus 119-2 sivi kültürü bit nitroselluloz banda belli bir çizgi olarak uygulanmistir. Bir internal kontrol için anti- human IgM antikorlari ayri bir çizgi olarak nitroselluloza kaplayarak uygulanmaktadir. Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Birden fazla susu ayni anda tespit edememesi, sadece Brusella spesifik IgM antikorlari için yararli olmasi en büyük dezavantajlari arasindadir. 2.6. Floresan Polarizasyon Deneyi Bu metodun esasi florokrom isaretli çözelti içinde az miktardaki bir çözünür antijen ile antikorunun kompleks olusturmus antijen molekülü arasinda rotasyonal farkliliklarin belirlenmesine dayanmaktadir. Küçük molekül, hizli sekilde rastgele döner ve isik hizli depolariz olur. Daha büyük olan kompleks molekül ise daha yavas döner ve isigin depolarizasyonu yavaslar. Depolarizasyon hizi ölçümü ile bu test yapilmaktadir. Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Bu test sadece sigir, domuz, koyun, keçi ve bizon gibi hayvanlarda brusellozunun serolojik tanisinda uygundur. Pahali kimyasallara ihtiyaç duyulmaktadir. Birden fazla susun ayni anda tespit edilememesi ve test islemlerinin pratik olmamasi diger dezavantajlaridir. Floresan bilesikleriyle isaretlenmis antikorlar kullanilarak, süpheli antijen ya da diger etkenlerin varliginin arastirildigi bir testtir. Immünohistokimyasal yöntem seklinde siniflandirilabilir. Testin uygulanabilmesi için hücre kültürü, konjugat, virüs, serum ve floresan mikroskopa ihtiyaç duyulur. Antijen tespiti için direkt immünfloresan, antijen ya da antikor tespiti için indirekt immünfloresan ve antikor tespiti için nötralizasyon immün floresan testi yapilir. Sonucun pozitif çikmasi, hastalik tanisi için önemli bir ipucu olabilir. Bu yöntemin dezavantaji I eksik yönleri Birkaç saatte sonuç verebilen bir testtir. Sonuçlarin degerlendirilmesi görecelidir, reaksiyonlari görülebilir. Birden fazla susu ayni anda tespit edememesi, analizlerin uzun süre almasi, laboratuvar ve teknik eleman gerektirmesi, pahali laboratuvar ekipmanlarina ihtiyaç duymasi ve islemlerin pratik olmamasi bu testin dezavantajlari arasindadir. 2.8. Deri Testleri Brusellozda alerjik deri testleri, tamamlayici test olarak yararli olmaktadir. En sik kullanilan ise "Brucallergen" deri testidir. Brucallergen bir nükleoprotein kompleksi olup deri içine siringa edildikten sonra 24 saat içerisinde enjeksiyon yerinde kizariklik, ödem ve endurasyon olusmasi, kisinin Brusella bakterilerine karsi asiri duyarli oldugunu gösterir. 2.9. Radyolojik Tetkikler Bu metotta sintigrafi bilgisayarli tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) cihazlari kullanilmaktadir. Bu yöntemin dezavantaji i' eksik yönleri Laboratuvar ve teknik eleman gereksinimi, pahali laboratuvar ekipmanlarina (Sintigrafi bilgisayarli tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG)) ihtiyaç duyulmasi, islemlerin pratik olmamasi, radyasyon maruziyetine neden olmasi, birden fazla susun ayni anda tespit edilememesi, test islemlerinin pratik olmamasi, sinirli sayidaki sektörlerde kullanilabilmesi dezavantajlari arasindadir. Konuyla ilgili yapilan ön arastirma neticesinde bazi dokümanlara rastlanmistir. Bahsi geçen dokümanlara iliskin bilgiler su sekildedir: CN110028594A yayin numarali ve "Preparation method of brucella melitensis 16M LPS and screening and identifying method and application of monoclonal antibodies of brucella melitensis 16M LPS" baslikli Çin menseli dokümana konu olan bulus, monoklonal antikorlarin hazirlanmasinin teknik alaniyla, özellikle bir Brucella 16M LPS'nin hazirlama yöntemiyle ve bunun bir tarama ve tanimlama yöntemiyle ve bunun uygulanmasiyla ilgilidir. Ilgili bulus hizli, yüksek verimli, yüksek hassasiyetli, yüksek verimli bir bruselloz saptama yöntemi olusturmak için, bir Brucella 16M LPS'nin hazirlama yöntemini (Brucella 16M LPS'nin hazirlama yöntemi, esas olarak, Brucella 16M koyunun LPS'sini çikarmak için gelistirilmis fenol su yöntemini benimsemis) ve bunun bir tarama ve tanimlama yöntemini ve bunun uygulanmasini hakkinda yapilan bir çalismadir. Differentiating Species and Vaccine Strains of The Brucella Genus" baslikli PCT dokümanina konu olan bulus, Brucella'nm cinsini tespit etme, türleri ve asi suslarini tanimlama ve ayirt etme yöntemi, ilgili genomik bölgelere karsilik gelen seçilmis genomik DNA fragmanlarinin multipleks PCR vasitasiyla amplifikasyonuna dayanir. Bahsedilen yöntem, B. abortus, B. melitensis, B. ovis, B. suis, B. neotomae, B. canis suslarinin, deniz memelisi Brucella izolatlarinin ve asi suslari B. abortus S19'un saptanmasina, ayirt edilmesine ve tanimlanmasina olanak saglayan bir çalismadir. EP2508201A1 yayin numarali ve "Method for The Identifioation of Animals Vaccinated Against Brucella" baslikli Avrupa Patent dokümanina konu olan bulus, Koruyucu Hekimlik ve Halk Sagligi alanindadir ve hem genetik olarak modifiye edilmis canli asilarin gelistirilmesi hem de kullanimi ile ilgilidir. Brucella sp.'nin yani sira asilanmis ve virülent suslari ile enfekte olmus hayvanlarin tanimlanmasina izin veren dogrudan ve dolayli teshis tekniklerinin gelistirilmesi ve kullanilmasini içerir. Memelilerde brusellozun önlenmesine yönelik ilaçlarin, bruselloza karsi asilarin hazirlanmasinda yesil floresan proteinin (GFP) eksprese edilmesi ve adi geçen asilarin uygulandigi memelileri tanimlama yöntemidir. Bu yöntem immuno deneydir ve bir enzime-bagli imünosorban deneyi (ELISA)'dir. CN106556701A yayin numarali ve "Brucella melitensis indirect ELISA antibody detection kit" baslikli Çin menseli dokümana konu olan bulus, bir Brusella melitensis dolayli ELlSA antikor saptama kiti ile ilgilidir. Bulus tarafindan saglanan kit, 96 kuyulu ELlSA plakasini kaplamak için nicellestirilmis saflastirilmis Brusella sistemi saglikli koyunlari kullanir, negatif serum olarak saglikli immün olmayan koyun serumunu benimser ve bir HRP etiketli tavsan anti- keçi FC terminal antikoru, substrat solüsyonu, stop solüsyonu, numune seyreltioisi, HRP etiketli tavsan anti-keçi gG seyrelticisi, seyreltilmis yikama sivisi ve montaj için diger bilesenler ve koyun serumunda pürüzsüz Brusella antikorlarinin saptanmasi için kullanilir. Bulusa göre, geleneksel LPS ekstraksiyonunda, proteinaz K sindirimi, fenol ekstraksiyonu ve diger adimlar, LPS'nin safligini etkin bir sekilde gelistirmek için eklenir, keçilere ve koyunlara iyi afiniteye sahip monoklonal antikor, enzim etiketli ikincil enzim olarak hizmet etmesi için taranir. Ana reaktif formülünün iyilestirilmesi ve optimizasyonu sayesinde, kitin reaksiyon arka plani etkin bir sekilde kontrol edilir ve yüksek verim tespiti için gereken süre azaltilir. W09808951A1 yayin numarali ve "New Brucella Antigens, Recombinant Polypeptides, Nucleic Acids Coding for The Same and Use Thereof in Diagnostic and Prophylactic Methods and Kits" baslikli PCT dokümanina konu olan bulus, izole edilmis ve saf Brucella antijenleri, adi geçen antijenleri kodlayan nükleik asitler ve ayrica insan ve sigirlarda Brucella enfeksiyonunu saptamak için adi geçen antijenleri ve nükleik asitleri kullanan tani yöntemleri ve kitlerle ilgilidir. Bulus ayni zamanda rekombinant polipeptidler, bunlarin hazirlanmasi için bir islem ve bunlarin Brucella enfeksiyonunun teshisi için yöntemler ve kitlerde kullanimi ile ilgilidir. Bulus, ayni zamanda, bahsedilen izole edilmis antijenlerin veya adi geçen rekombinant polipeptitler kullanimina da iliskindir. Adi geçen antijen(ler)i kodlayan gen(ler) için spesifik olarak silinmis, rekombinant bir Brucella susu içeren bir asi kompozisyonu ile ilgilidir. CN103864928A yayin numarali ve "Preparation of common antigen monoclonal antibody of Brucella sLPS (lipopolysaccharides) and establishment of c-ELlSA (competitive enzyme-linked immuno sorbent assay) method" baslikli Çin menseli dokümana konu olan bulus, immünoloji alani ile ilgilidir. Spesifik olarak mevcut bulus, bir Brucella lipopolisakarit ortak antijenine karsi bir monoklonal antikor, monoklonal antikora dayali bir c-ELISA yöntemi, monoklonal antikoru içeren bir kit ve bir teshis saptama reaktifi ile ilgilidir. melitensis/abortus infection ELlSA (enzyme Iinked immunosorbent assay) detection reagent" baslikli Çin menseli dokümana konu olan bulus, genetik mühendisligi ve immünoloji alaniyla, özellikle çiftlik hayvanlari S2 asi bagisiklamasi için bir ELISA saptama reaktifi ve koyun/sigirlarin Brucella enfeksiyonu ile ilgilidir. Bulus, bir hayvancilik S2 asi bagisikligi ve Brucella melitensis/abortus enfeksiyonu ELISA (enzim baglantili immünosorbent tahlili) saptama reaktifi saglar. ELISA saptama reaktifinin aktif bilesenleri, bir Brucella 82 asi susu geni GL_0002189 kodlu antijen proteini ve bir Brucella BP26 proteinidir veya His etiketleriyle kaynastirilmis N terminalleri veya C terminalleri olan rekombinant proteinlerdir. Hayvancilik 82 asi bagisikligi ve Brucella melitensis/abortus enfeksiyonu ELISA saptama reaktifi, ana salgin suslari- Brusella melitensis/abortus'u ve genellikle böylece besi hayvani serumlarinda asi bagisikligi ve dogal Brucella melitensis/abortus enfeksiyon antikorlari kisa sürede belirlenebilir ve bagisiklik sürülerinde asi antikorlari tarafindan engellenen bruselloz tespiti ve sürü saflastirma sorunu çözülür. Hayvancilik S2 asi bagisikligi ve Brucella melitensis/abortus enfeksiyonu ELlSA tespit reaktifi, sosyal ve ekonomik faydalar saglayabilir ve sürülerde brusellozun saflastirilmasina büyük katkilar saglayabilir. RU2715333C1 yayin numarali ve "Kit of Reagents for Detection and identification of DNA of Brucellosis Agents by Real-Time Polymerase Chain Reaction Om- Screen-Brucellosis-Rv" baslikli Rus menseli dokümana konu olan bulus, tipla, özellikle tibbi teshisle ilgilidir ve tip ve saglik kurumlarinda, Hijyen ve Epidemiyoloji Merkezlerinin laboratuvarlarinda ve Federal Insan Refahini Denetleme Hizmetinin veba karsiti kurumlarinda, epidemiyolojik hizmetlerde, bir hastadan alinan materyali (süpheli abolevanie) ve endikasyon patojenik biyolojik ajanlari (PBA) incelerken spesifik patolojinin (bruselloz) teshisini desteklemek için Savunma Bakanligi da dahil olmak üzere diger bakanlik ve dairelerin uzmanlasmis kurumlarinin sabit ve mobil laboratuvarlarinda biyolojik bir arastirma ve tanimlama yöntemi gerçeklestirirken hizlandirilmis bir ön test olarak kullanilabilir. Burada açiklananlar, gerçek zamanli polimeraz zincir reaksiyonu ile bruselloza neden olan ajanlarin DNA'sinin saptanmasi ve tanimlanmasi kapsar. Teknigin bilinen durumunda karsilasilan dokümanlarda yer alan uygulamalarda ve piyasada bulunan ürünlerdeki sorun; Brucella sp.'nin tek bir susundan izole edilmis bakterinin degisken olan Iipopolisakkarit (LPS) bölgelerinden bir tanesi olan antijenik yapi kullanilarak monoklonal antikor üretimi ile yapildigindan kitlerin özgüllüklerinin ve duyarliliklarinin yetersiz olmasidir. Bruselloz için temel bulas kaynagi pastörize edilmemis süt ve süt ürünlerinin tüketimidir. Hastaligin teshisinde kullanilan metotlarin maliyeti ve teshis koyma süresi dikkate alindiginda Brusellozun tanisi için hizli, düsük maliyetli pratik bir tanimlama metoduna ihtiyacin oldugu görülmektedir. Sonuç olarak mevcut teknikte var olan ve günümüzde kullanilmakta olan yapilanmalara ve uygulamalara ait eksikliklerin ve dezavantajlarin ortadan kaldirilmasina olan gereksinim, ilgili teknik alanda bir gelistirme yapmayi zorunlu kilmaktadir. BULUSUN AMACI Mevcut bulus yukarida bahsedilen dezavantajlari ortadan kaldirmak ve ilgili teknik alana yeni avantajlar saglamak üzere gelistirilmis, Brucella sp. suslarinin antijenik OMP16, OMP25, OMP2b ve OMP31 proteinlerinin hizli tanisina ve teshisine imkân veren bir test kiti ile ilgilidir. Bulus amaci; Brucella sp. cinsi bakterilerin sebep oldugu bruselloz hastaliginin erken ve hizli teshisi ayrica canlida Brucella sp. cinsi bakteri enfeksiyonun olup olmadigi ve hastaligin seyrinin anlasilabilmesi için hastaliga neden olan üç Brucella sp. cinsinin (B. melitensis, B. abortus ve B. Canis) antijenik özellikteki OMP16, OMP25, OMP2b ve OMP31 proteinlerinin tanisina dayali antikorlarinin tespitini, immunokromatografik prensipler uyarinca tek bir kromatografik kaset içerisinde daha hassas ve dogrulukta gerçeklestirmesinin saglanmasidir. Bulusun yapisal ve karakteristik özellikleri ve tüm avantajlari asagida verilen sekiller ve bu sekillere atiflar yapilmak suretiyle yazilan detayli açiklama sayesinde daha net olarak anlasilacaktir ve bu nedenle degerlendirmenin de bu sekiller ve detayli açiklamanin göz önüne alinarak yapilmasi gerekmektedir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Yukarida kisaca özetlenen ve asagida daha detayli ele alinan bulusun uygulamalari, bulusun ekteki çizimlerde betimlenen örnek uygulamalarina basvurarak anlasilabilir. Ancak ekteki çizimlerin yalnizca bu bulusun tipik uygulamalarini betimledigini ve kapsamini sinirladiginin varsayilmayacagini belirtmek gerekir. Sekil-1: Bulus konusu ürüne ait temsili perspektif görünümdür. SEKILLERDEKI REFERANS NUMARALARI . nitroselüloz membran . konjugat ped . örnek ped . absorban ped . kontrol çizgisi . test çizgisi NGUIÄWNA . plastik tasiyici kart BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bulusun bu detayli açiklamadaki tercih edilen alternatifleri, sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik olarak ve hiçbir sinirlayici etki olusturmayacak sekilde açiklanmaktadir. Bulus; saglik ve veterinerlik alaninda, besicilik sektöründe, et ve süt isletmelerinde kullanilmak üzere tasarlanmis, Brucella sp. cinsi bakterilerin sebep oldugu bruselloz hastaliginin erken ve hizli teshisi, canlida Brucella sp. cinsi bakteri enfeksiyonun olup olmadigi ve hastaligin seyrinin anlasilabilmesi için, hastaliga neden olan üç Brucella sp. cinsinin (B. melitensis, B. abortus ve B. Canis) antijenik özellikteki OMP16, OMP25, OMP2b ve OMP31 proteinlerinin tanisina dayali antikorlarinin tespitini, immunokromatografik prensipler uyarinca tek bir kromatografik kaset içerisinde daha hassas ve dogrulukta gerçeklestirilen hizli tani kiti ile ilgilidir. Bulus, Brucella sp.(BruceIIa melitensis, Brucella abortus, Brucella canis)'nin antijenik (OMP16, OMP25, OMP2b ve OMP31) proteinlerini hizli teshisinde kullanilan, alt gövdesi adhezif tutucu tabakadan olusan bir hizli tani kiti olup özelligi; plastik tasiyici kart (7), tani kiti içerisinde antijenik yapilari barindiran seyreltilmis kan, salya, süt örneginin konuldugu örnek ped (3), üç farkli Brucella sp. suslarinin olusturdugu antijenleri yakalayacak olan kolloidal gold konjugati içeren konjugat ped (2), test (6) ve kontrol (5) çizgilerini bulunduran nitroselüloz membran (1), plastik tasiyici kart (7) üzerinde yer alan, tani kiti boyunca yatay akis yapan kan, salya, süt örneginin, islem sonunda kitin disina akmasini önleyen ve gözenekli yapisi sayesinde kan, salya, süt örneginin tutan bir absorban ped (4) içermektedir. Bulus konusu kitte; nitroselüloz membranin (1) bir tarafina, 0.2 mm'si nitroselüloz membranin (1) üzerinde konumlandirilan, AuNP- Brucella sp.(BruceIla melitensis, Brucella abortus, Brucella canis) 'ye spesifik antikorlar konjugatinin immobilize edildigi konjugat ped (2), ayni tarafa, 0.2 mm'si konjugat pedin (2) üzerinde konumlandirilan, analizi yapilmak istenen örnegin üzerine damlatildigi, analitin yüklendigi örnek ped (3), nitroselüloz membranin (1) diger tarafina, 0.2 mm"si nitroselüloz membranin (1) üzerinde konumlandirilan absorban ped (4), analit- spesifik Brucella sp. antikoru-altin nanopartikül (AuNP) konjugatindan olusan kompleksin üzerinde meydana geldigi konjugat ped (2), Brucella sp."nin üç türüne ait antijenlere özgü spesifik antikorlarinin immobilize edildigi ve nitroselüloz membran (1) üzerinde yürütülen bir test çizgisi (6) ve bir kontrol çizgisi (5) bulunmaktadir. Bulus, immünizasyon antijeni olarak, Brucella sp. (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella canis) suslarinda korunmus antijenik bölgeler kullanilarak üretilen, afinite kromatografisiyle de mono-spesifik olarak elde edilen antikorlarin immobilize edildigi test çizgisi (6) barindirmaktadir. Analiz edilmek istenen örnek (analit) örnek pedine (3) damlatilmakta, örnek pedine (3) damlatilan örnek yanal akis (lateral flow) prensibine göre, konjugat ped (2) kismina dogru ilerlemekte, örnegin Brucella sp. pozitif olmasi durumunda konjugat ped (2) kisminda antijen spesifik lg antikoru ile AuNP konjugatindan olusan kompleks meydana gelmekte ve nitroselüloz membran (1) üzerinde ilerlemeye devam etmekte, örnegin Brucella sp. negatif olmasi durumunda antijen spesifik lg antikoru ve AuNP konjugatindan olusan kompleks meydana gelmemekte ve nitroselüloz membran (1) üzerine ilerlemeye devam etmekte, örnegin Brucella sp. pozitif olmasi durumunda sürüklenen kompleks içindeki antijen nitroselüloz membran (1) üzerinde bulunan test çizgisindeki (6) spesifik antikoruna baglanmakta ve pozitif görüntü olusmakta, örnegin Brucella sp. negatif olmasi durumunda sürüklenen kompleks içerisinde antijen olmamasindan dolayi nitroselüloz membran (1) üzerinde bulunan test çizgisinde herhangi bir etkilesim ve baglanma gerçeklesmemekte ve dolayisi ile pozitif görüntü olusmamakta, pozitif örneklerde hem test çizgisi (6) hem kontrol çizgisin (5) ortaya çikmakta, negatif örneklerde sadece kontrol çizgisi (5) görünür olmakta, son kisimda bulunan absorban ped (4) tüm bilesenler üzerinde akis tamamlandiktan sonra antijen solüsyonunun kalan kismini emmekte ve seritten daha net bir görüntü alinmasini saglamaktadir. Bulus, uygun tüm Brucella sp. alt tiplerinin hizli teshisine imkan taniyan bir kit olup, immunokromatografi esasina dayanmaktadir. Bu bulusta daha önceki medikal sektöründe kullanim alani bulan metotlardan farkli olarak, bir damla kan, salya ya da sütten üç farkli Brucella sp. suslarinin (B. melitensis, B. abortus ve B. Canis) antijenik özellikteki rekombinant OMP16, OMP25, OMP2b ve OMP31 proteinlerinin hizli teshisini yapmaya imkân saglanmaktadir. Kitin çalisma mantigi yanal akis (lateral flow assay) prensibine dayali olup bulus konusu kit, basit kullanimiyla herhangi bir uzmanlik egitimi gerektirmez, kullanimi pratiktir, tasinabilir boyutta olmasi sayesinde her yerde kolaylikla kullanilabilir ve hizli bir test kitidir. Bulus konusu test kitinin test etme ve sonucu belirleme süresi 3 ila 5 dk arasinda olup bilinen diger sistemlerden daha hizlidir. Ayrica üç farkli Brucella sp. suslarinin (B. melitensis, B. abortus ve B. Canis) antijenik OMP16, OMP25, OMP2b ve OMP31 proteinlerinin belirlemesinin ayni anda gerçeklestirilmesine olanak tanimakta ve bu yönüyle bilinen diger sistemlerden farklilasmaktadir. Bilinen sistemlerden farkli olarak test için bir damla kari, salya ya da süt örneginden analizi gerçeklestirme özelligi bulunmaktadir. Bulusun fiziksel boyutu bir USB bellek kadar olup tasinmasi ve uygulanmasi oldukça basit olmasi nedeniyle is gücü ve zamandan tasarruf saglayarak, teshis için pahali cihazlara olan ihtiyaci ortadan kaldirmakta, düsük maliyeti ile ulasilabilir olmaktadir. TR TR TR TR TR TR