CN105044337A - 用于诊断肺炎链球菌的试验 - Google Patents
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Abstract
在此描述了用于诊断肺炎链球菌的试验,具体而言使用一种或更多链球菌抗原检测生物样品中的抗一链球菌抗体的试验。在试验中可使用抗原的多种组合。例如,可利用一种或更多的Ply、PhtD、PhtE、LytB和PcpA。也可使用另外的链球菌抗原。这些试验也可与检测链球菌核酸的试验组合使用。
Description
本申请是申请日为2009年2月2日的中国专利申请200980103761.7“用于诊断肺炎链球菌的试验”的分案申请。
相关申请
该申请要求于2008年2月1日提交的美国系列号61/063,376的优先权。
技术领域
在此描述了用于诊断细菌性感染的试剂和方法。
背景技术
社区获得性肺炎(CAP)是最常见的儿科感染之一,是工业化国家发病率的主要原因,是全世界五岁以下儿童发病率的最重要原因(MulhollandK,Lancet2007;370(9583):285-9);PioA,BWHO;2003;81(4):298-300)。CAP可由多重因子单独或组合引起,包括呼吸道病毒(respiratoryviruses)、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体(YinCCRespirology,2003;8(1):83-9;ChiangWCRespirology2007;12(2):254-61;JuvenTPIDJ2000;19(4):293-8)。在幼儿中病因诊断是特别具有挑战性的,在幼儿中血培养通常仍然是阴性的,支气管分泌物是罕见地可取得的,并且频繁的鼻咽部带菌(carriage)限制了微生物检测的有用性。尽管如此,越来越多的用于病原体检测的试验提高了鉴定致病因子的可能性(WangPediatrPulmonol2008feb43(2)150-9;NakayamaEJInfectChemother2007,13(5):305-13),并且使用现代诊断工具的最新研究已经重复地将肺炎链球菌鉴定为CAP的最重要原因,在初级保健和医院环境中均是如此(JuvenTPIDJ2000;19(4):293-8;MichelowIC;Pediatrics2004;113(4):701-7)。
防备肺炎球菌感染的保护基本上是由促进调理吞噬的抗体介导的。这样的抗体可指向肺炎球菌多糖(PPS)或肺炎球菌表面蛋白(PSP)。在不存在肺炎球菌免疫的情况中,这样的抗体是由肺炎球菌的暴露、定植和/或感染引出的。因此,对抗肺炎球菌抗原的保护性抗体的缺乏是婴儿和幼儿对肺炎球菌疾病易获病性的基础。尽管某些具有极好特异性和阳性预测价值的PSPs已经被用于肺炎球菌感染的血清学诊断,但这样的研究已经时常被儿童中的低灵敏度所限制。这在很大程度上归因于干扰血清学分析的更高定植传播(Scott,etal.Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005)。
肺炎球菌性肺炎的病因诊断仍然是具有挑战性的,特别是在幼儿中。基于血培养或DNA扩增的微生物诊断具有高的特异性但在罕见菌血症的儿童中具有低的灵敏度。相反,鼻咽定植的高比率限制了在鼻咽样品或尿样中检测细菌和/或其片断的试验的灵敏度(Dowell,S.F.,Clin.Infect.Dis.200032:824-825)。对肺炎球菌性肺炎血清学诊断的稳健方法学的探索已经遇到了许多困难{Kanclerski,JClinMicrobiol1988;KorppiM,EurJClinMicrobiolInfectDis2007)。
社区获得性肺炎(CAP)在幼儿中经由传统实验室方法的诊断是特别具有挑战性的。本领域需要用于准确和快速诊断CAP的试剂和方法,特别是在幼儿中。这种需要涉及个体诊断,它要求提供具有高灵敏度和阴性预测值的快速结果的试验以避免无用的抗生素给药,并且在流行病学研究中要求具有用于最佳诊断标准的高特异性和阳性预测值以及适当灵敏度的试验以正确地估计疾病负担。在此描述了用于准确和快速诊断CAP的试剂和方法。
附图说明
图1.入院时的抗-PSP血清IgG抗体。
图2.抗-PhtDIgG抗体在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童中的分布。
图3.抗-PhtEIgG抗体在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童中的分布。
图4.抗-PlyIgG抗体在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童中的分布。
图5.抗-PcPAIgG抗体在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童中的分布。
发明内容
在此描述了使用一种或更多链球菌抗原检测生物样品中的抗-链球菌抗体的试验。多种抗原单独或抗原的组合可用于这些试验中。例如,可进行该试验以检测与下列发生免疫反应的抗体:Ply和一种或更多的PhtD、PhtE、LytB和PcpA;PhtD和一种或更多的Ply、PhtE、LytB和PcpA;PhtE和一种或更多的Ply、PhtD、LytB和PcpA;LytB和一种或更多的Ply、PhtD、PhtE和PcpA;和/或PcpA和一种或更多的Ply、PhtD、PhtE和LytB。在此描述的这些试验也可与其他链球菌抗原相互和/或一种或更多的Ply、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA组合使用。以这种方式,增加了试验的灵敏度并改善了阴性预测值。
具体实施方式
在此描述了在此提供的用于准确和快速诊断社区获得性肺炎(CAP)的试剂和方法。在此描述的这些试验克服了在儿童中由只有一种或少数免疫原性肺炎球菌抗原的传统使用造成的基于肺炎球菌表面蛋白(PSP)的免疫测定的低灵敏度。通过检测患者的血清或其他生物液体中针对细菌抗原组合的抗体,可做出CAP诊断。如在此所显示的,多种PSPs被用作免疫学探针以评价因CAP住院的幼儿中由既往暴露和急性肺炎球菌感染驱动的体液免疫模式。在一个实施方式中,所述抗原可选自:肺炎球菌溶血素(pneumolysin)(Ply)、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA。这五种肺炎球菌表面蛋白的序列在肺炎球菌菌株之间在很大程度上是保守的(>95-98%),使得它们可用作暴露于肺炎链球菌的标志物以及疫苗候选者。
肺炎球菌溶血素(Ply)是细胞溶解激活的毒素,它牵涉于肺炎球菌发病机制的多个步骤,包括纤毛搏动的抑制和上皮细胞之间紧密连接部的断裂(Hirstetal.ClinicalandExperimentalImmunology(2004))。几种肺炎球菌溶血素是已知的,并适用于实践在此描述的试验,包括,其中例如GenBank登记号Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5和AB021381中的那些。在一个实施方式中,Ply具有SEQIDNO.:1中所显示的氨基酸序列。
适用于实践在此描述的试验的PhtD多肽包括,其中例如,GenBank登记号AAK06760、YP816370和NP358501中的那些。在一个实施方式中,PhtD具有SEQIDNO.:2中所显示的氨基酸序列。
适用于实践在此描述的试验的PhtE多肽包括,其中例如,GenBank登记号AAK06761、YP816371和NP358502中的那些。在一个实施方式中,PhtE具有SEQIDNO.:3中所显示的氨基酸序列。
适用于实践在此描述的试验的LytB多肽包括,其中例如,GenBank登记号CAA09078、YP816335、ABJ55408、AAK19156、NP358461和AAK75086中的那些。在一个实施方式中,LytB具有SEQIDNOS.:4、5或8中所显示的氨基酸序列。
PcpA在1998年被首次克隆并鉴定为具有推定的粘附角色的胆碱结合蛋白(Sanchez-BeatoAFEMSMicrobiologyLetters164(1998)207-214)。适用于实践在此描述的试验的PcpA多肽包括,其中例如,GenBank登记号CAB04758、YP817353、AAK76194、NP359536、ZP01835022和ZP01833419中的那些。在一个实施方式中,PcpA具有SEQIDNOS.:6或7中所显示的氨基酸序列。
抗原可单独或相互组合用于在此所描述的试验中。假如试验证明了期望的灵敏度和阴性预测值,则单个抗原或抗原的任何组合的用途可适合用于在此所描述的试验中。在某些实施方式中,使用抗原的组合可能导致大约0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1.0的灵敏度,具有大约0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1.0的阴性预测值。在一些实施方式中,所述数值是显著的。可进行比较,并使用可用的统计分析工具测定显著性,单独或相互组合,包括,例如,t检验、卡方检验、Fisher′s确切检验、方差分析(ANOVA)、单变量统计分析、对数回归分析以计算校正的比值比(oddsratio)(OR)和95%置信区间(CI)。也可利用针对可能充当混杂因素(confounders)(性别等)的任何统计学上显著的人口统计变异值的控制(Conrols)。数值之间的差异通常被认为在例如p<0.05或p<0.01下是显著的。也可使用其他统计分析工具。
例如,可进行这些试验以检测与Ply、PhtD、PhtE、LytB或PcpA中只有一种发生免疫反应的抗体,不测定与任何其他抗原发生反应的抗体。备选地,可进行该试验以检测与Ply、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA中超过一种发生免疫反应的抗体。例如,可进行该试验以检测与下列发生免疫反应的抗体:Ply和一种或更多的PhtD、PhtE、LytB和PcpA;PhtD和一种或更多的Ply、PhtE、LytB和PcpA;PhtE和一种或更多的Ply、PhtD、LytB和PcpA;LytB和一种或更多的Ply、PhtD、PhtE和PcpA;和/或PcpA和一种或更多的Ply、PhtD、PhtE和LytB。也可进行该试验以鉴定与抗原的组合发生免疫反应的抗体,所述抗原的组合诸如:PcpA和Ply;PcpA和PhtD;PcpA和PhtE;PcpA和LytB;PcpA、Ply和PhtD;PcpA、Ply、PhtD和PhtE;Ply、PhtD、PhtE和LytB;PcpA、PhtD和PhtE;PcpA、PhtD、PhtE和LytB;PcpA、PhtE和LytB;PcpA、Ply、PhtE和LytB;PcpA、PhtD和LytB;PcpA、Ply、和LytB;PcpA、Ply、PhtD和LytB;PcpA、Ply和PhtE;和/或PcpA、PhtD和PhtE。给定了该公开内容,则其他组合对本领域的技术人员而言将是显而易见的。在此所描述的试验也可与其他链球菌抗原相互和/或一种或更多的Ply、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA组合使用。
在某些实施方式中,可使用经分离和纯化的PcpA蛋白或其免疫反应性片段用于检测受试者中由肺炎链球菌引起的既往感染(pastinfection)或活动性感染(activeinfection),通过检测从受试者获得的样品中的抗体与所述经分离和纯化的PcpA抗原(例如,蛋白质或其免疫反应性片段)的结合。在其他实施方式中,经分离和纯化的PcpA抗原可与至少一种其他抗原(例如,PhtD、PhtE、LytB和/或Ply蛋白质或其免疫反应性片段)一起使用。因此,提供了检测受试者中肺炎链球菌的存在和/或诊断由肺炎链球菌引起的肺炎或感染的方法,其包括检测来自所述受试者的生物样品中对抗一种或更多PcpA、PhtD、PhtE、LytB和/或Ply抗原的抗体,其中与所述抗原结合的抗体的存在指示感染。在某些实施方式中,所述方法包括使来源于受试者的生物样品与经分离或纯化的肺炎链球菌的PcpA、PhtD、PhtE、LytB和/或Ply抗原接触一段时间,并且在对抗原-抗体复合物形成而言充分的条件下,然后检测抗原-抗体复合物的形成。抗原-抗体复合物的检测可通过检测复合物中的人免疫球蛋白而达到。在某些实施方式中,抗体的检测可通过使抗原-抗体复合物与“第二”抗体(与人免疫球蛋白有免疫反应性的抗体(例如,抗-人免疫球蛋白抗体))接触一段时间,并且在对所述第二抗体与复合物中的人免疫球蛋白结合而言充分的条件下,然后检测结合的抗-人免疫球蛋白。优选将所述第二抗体用标志物或报告分子标记。
同样提供了测定患有由肺炎链球菌引起的肺炎或感染的受试者对采用治疗学化合物治疗的响应的方法。该方法涉及检测治疗后受试者的生物样品中对抗PcpA抗原的抗体,其中所检测的抗体量是增加的、不变的或降低的,与在治疗之前所获得的受试者的生物样品中可检测到的抗体量或者在正常或健康的受试者的生物样品中可检测到的抗体量相比。在一个实施方式中,治疗后不变的或降低的抗体量可能指示所述受试者对治疗没有响应。在另一实施方式中,治疗后不变的或降低的抗体量可能指示所述受试者对治疗响应。在另一实施方式中,治疗后增加的抗体量可能指示所述受试者对治疗响应。然后可相应地调整治疗方案。
抗原可作为全长(full-length)多肽用于这些试验中。然而,抗原可为相关的抗原诸如,例如,片段、变体(variants)(例如,等位基因变体、剪接变体)、同源体、类似物和衍生物(例如,肽、融合物(fusions)),它们存在于生物样品中保持对抗体的反应性。片段、变体或衍生物可具有一个或更多序列置换、删除和/或添加,与主体序列(subjectsequence)相比。片段或变体可为天然存在的或人工构造的。在一个实施方式中,这样的相关抗原可从相应的核酸分子制备。在优选的实施方式中,相关抗原可具有从1至3、或从1至5、或从1至10、或从1至15、或从1至20、或从1至25、或从1至30、或从1至40、或从1至50、或超过50个氨基酸置换、插入、添加和/或删除。相关抗原可包括肽,它们通常为一系列连续的氨基酸残基,具有相应于得到它的多肽的至少一部分序列。在优选的实施方式中,肽可包括约5-10、10-15、15-20、30-20或30-50个氨基酸。
置换可为保守的,或非保守的,或其任何组合。对抗原序列的保守氨基酸修饰(和/或对编码核苷酸的相应修饰)可能产生具有与亲代抗原相似的功能特征和化学特征的相关抗原。例如,“保守的氨基酸置换”可能涉及先天的(native)氨基酸残基被非先天的残基置换,如此以致,对那个位置上氨基酸残基的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性几乎没有或没有影响,特别是,不导致抗原改变的功能(例如,不引起与生物样品中抗体的降低的免疫原性或反应性)。适宜的、示例性保守氨基酸置换如下所示:
最初的残基 | 示例性置换 | 优选的置换 |
Ala | Val,Leu,lie | Val |
Arg | Lys,Gin,Asn | Lys |
Asn | Gin | Gin |
Asp | Glu | Glu |
Cys | Ser,Ala | Ser |
Gin | Asn | Asn |
Glu | Asp | Asp |
Gly | Pro,Ala | Ala |
His | Asn,Gin,Lys,Arg | Arg |
He | Leu,Val,Met,Ala,Phe,正亮氨酸 | Leu |
Leu | 正亮氨酸,He,Val,Met,Ala,Phe | He |
Lys | Arg,1,4二氨基丁酸,Gin,Asn | Arg |
Met | Leu,Phe,He | Leu |
Phe | Leu,Val,He,Ala,Tyr | Leu |
Pro | Ala | Gly |
Ser | Thr,Ala,Cys | Thr |
Thr | Ser | Ser |
Tip | Tyr,Phe | Tyr |
Tyr | Trp,Phe,Thr,Ser | Phe |
Val | He,Met,Leu,Phe,Ala,正亮氨酸 | Leu |
片段可包括具有被删除的特殊区域或结构域的抗原。删除这样的区域或结构域可能是有益的,例如,这些区域或结构域的存在将干扰片段在在此所描述的试验中的应用。例如,当使用PcpA、Ply、PhtD、PhtE或LytB时,可删除胆碱能药物结合区域。PcpA蛋白的示例性片段在SEQIDNO.:7中显示。
在其他实施方式中,抗原可包括一种或更多辅助抗原的纯化和/或删除的融合多肽区段(fusionpolypeptidesegments)。融合物可在抗原的氨基端或羧基端制成。融合物可为无接头或衔接分子的直接的,或可为经由接头或衔接分子的。接头或衔接分子可为一个或更多氨基酸残基,通常为从约20至约50个氨基酸残基。接头或衔接分子也可被设计为具有针对DNA限制性内切酶或针对允许融合的部分分离的蛋白酶的切割位点。应当理解的是,一旦构造了,融合的部分可为衍生的或其他处理的,这是本领域已知的,或根据在此所描述的方法可知。适宜的融合物区段包括,其中,金属结合结构域(例如,多组氨酸区段),免疫球蛋白结合结构域(例如,蛋白A、蛋白G、T细胞、B细胞、Fc受体或补体蛋白抗体-结合的结构域),糖结合结构域(例如,麦芽糖结合结构域),和/或“标记(tag)”结构域(例如,α-半乳糖苷酶、链球菌属标志肽(tagpeptide)、T7标志肽、FLAG肽的至少一部分,或可使用与所述结构域结合的化合物诸如单克隆抗体来将其纯化的其他结构域)。这种标记通常在多肽表达时融合于多肽,并可充当用于目的多肽序列从宿主细胞亲和纯化的工具。例如,亲和纯化可通过柱色谱法使用对抗标记的抗体作为亲和基质而完成。任选地,随后可通过多种方式诸如使用某些用于切割的肽酶将标志从经纯化的目的多肽序列中除去。
在某些实施方式中,抗原可以使得它能够被删除的方式而被直接地或间接地(例如,使用抗体)标记。可通过将标签(label)连接于抗原本身而直接将抗原标记。可通过将标签连接于与抗原结合的试剂诸如抗体或其他部分而将抗原间接地标记。适宜的标签包括,例如,荧光染剂诸如荧光素、罗丹明(rhodamine)、藻红蛋白(phycoerythrin)、铕或德克萨斯红;生色的染料诸如二氨基联苯胺、放射性同位素;大分子胶体粒子材料诸如乳胶珠,它们是有色的、有磁性的或顺磁性的;结合剂诸如生物素和地高辛配基;以及生物学上或化学上的活性剂,它们可直接或间接地引起可被目视观察、电子检测或其他方式记录的可检测信号,例如在FACS、ELISA、蛋白质印迹、TRFIA、免疫组织化学、evanescence、Luminex微球阵列、浸渍片(dipstick)或其他侧流试验格式(lateralflowassayformat)中。用于这样的方法的适宜抗体-结合分子可包括免疫球蛋白-结合抗体,例如抗-人抗体(例如,对Ig同种型或亚类(例如,IgG的)特异的,或对葡萄球菌蛋白A或G特异的抗-人抗体)。
优选的荧光标记蛋白质(fluorescenttagproteins)包括来源于水母蛋白质被称作绿色荧光蛋白(GFP)的那些。关于GFP和其他荧光团(fluorophores)的更多信息在下列出版物中给出了:TsienRY,″TheGreenFluorescentProtein″AnnualReviewsofBiochemistry1998;67:509-544Verkhusha,VandLukyanov,K.″TheMolecularPropertiesandApplicationsofAnthozaFluorescentProteinsandChromophores″NatureBiotechnology2004;22:289-296。编码宽范围荧光标记蛋白质的质粒载体可从多个供应商商购,包括可从ClontechLaboratories,Inc商购的大量“LivingColours8482;FluorescentProteins”。相似的载体也可从其他供应商获得,包括InvitrogenandAmershamBiosciences。来源于GFP的适宜荧光蛋白是红移的变体EGFP、青移的(cyanshifted)变体ECFP和黄移的变体EYFP。优选将EGFP作为荧光标志物,因为它给出明亮的荧光并且对靶抗原的抗原性质具有最小影响。备选的荧光标志物蛋白质是可商购的。生物学或化学活性剂包括酶,它们催化显现颜色或改变颜色或者引起电性质变化的反应,例如,也可以被利用。它们可能为分子易激的,如此以致能级之间的电子跃迁导致特征性光谱吸收或发射。它们可能包括与生物传感器共同使用的化学个体。可使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/抗生蛋白链菌素以及碱性磷酸酶检测系统。更多的实例包括辣根过氧化物酶和化学发光试剂。在一些实施方式中,非固定的抗体-结合分子或多肽可使用与所述非固定的抗体-结合分子或多肽结合的抗体来检测。适宜的检测抗体可通过荧光标记。在一些实施方式中,标签可为用于直接标记靶抗原的荧光标志物(标记),如此以致抗原和荧光标志物形成融合蛋白质(fusionprotein)。
如果对抗靶抗原的抗体存在于生物样品中,则可将抗原或抗体用标记进行标记,所形成的抗原-抗体复合物可通过例如免疫沉淀法来检测。然后可将标记相关的荧光用于测定蛋白质是否已经被沉淀了(定性测定)或测定沉淀出的蛋白质的量(定量测定)。例如,可将荧光-标记的抗原的可溶解提取物与患者血清一起孵育适当的时间段诸如在4℃过夜(通常为10-15μl的血清对300-500μl的提取物或更少)以使得抗体与抗原结合。蛋白A或蛋白G琼脂糖微球,与低IgG胎牛血清(Sigma)一起预孵育以阻断非特异性结合,然后将它们加入到含靶抗原/抗体复合物的提取物/血清混合物中,并在室温采用轻柔的旋转混合1至2小时。血清里面的抗体(包括特异性结合靶抗原的那些抗体)被蛋白A/G微球结合了。然后在适宜的缓冲液(通常为10mMTris-HClpH7.4,100mMNaCl/ImMEDTA/1%TritonX-100)中洗涤蛋白A/G琼脂糖微球以除去任何未结合的靶抗原。这可通过多个(例如,2、3、4或5)轮离心、除去上清液并在缓冲液中再混悬来达到。然后将这些微球,其中一些连接有靶抗原,收集并置于荧光读数器中,例如来自MolecularDevices,Inc的SpectraMaxGeminiXS板读数器。然后可将样品中存在的抗体进行定量。关于GFP,可使用472nm波长的激发和512nm的发射来完成检测。荧光激发将取决于所使用的荧光团/标记,但所述荧光团/标记将可能同时结合几种不同的标记的蛋白质。例如,可将一种或更多的Ply、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA分别标记并且分别测定或同时测定。方法的灵敏度取决于检测装置并且可通过使用更灵敏的检测装置而被相当大地提高。也可利用这些方法的多种修改。其他标签是本领域可用的并且可能适合用于在此所描述的试验中。
在此所描述的用于检测与链球菌抗原发生免疫反应的抗体的试验也可与对检测链球菌感染有用的其他试验组合。例如,这些试验(即,ELISA)可与用于检测生物样品中的链球菌核酸的聚合酶链反应(PCR)试验组合。备选地,ELISA试验可与免疫沉淀试验组合。或者,基于PCR的试验可与免疫沉淀试验组合。在此所描述的多种试验的组合可能适合甚至进一步增加检测的灵敏度并进一步降低数据的阴性预测值。
在此还提供了用于检测患者中存在链球菌感染的试剂盒,通过检测患者生物样品中的抗体或核酸。在一个实施方式中,一种或更多肺炎球菌抗原(即,Ply、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA)可形成用于检测或诊断生物样品中的抗-链球菌抗体的试剂盒的一部分。这些抗原可在适宜的容器诸如小瓶中提供,在所述容器中,内容物被保护避开外部环境。因此,提供了用于检测样品中的抗-链球菌抗体的试剂盒,其可包括抗原(即,Ply、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA)以及用于测定样品中的一种或更多抗体与抗原的结合的一种或更多检测试剂。所述试剂盒优选包括:(i)肺炎链球菌的一种或更多经分离和纯化的PcpA、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA蛋白或其免疫反应性片段;以及(ii)用于检测抗原-抗体复合物形成的工具,任选包装有使用说明书。
抗原可游离于溶液中或可被固定于固体载体诸如磁性微球、管、微板孔或芯片中。在某些实施方式中,提供了固体基质,其包括经分离和纯化的PcpA、PhtD、PhtE、LytB和/或PcpA蛋白或其免疫反应性片段或者吸附于其中的融合蛋白质或蛋白质聚集体。在一些实施方式中,所述试剂盒可进一步包括抗体-结合分子作为检测试剂。抗体-结合分子可为捕获试剂或检测试剂,并且可游离于溶液中或可被固定于固体载体诸如磁性微球、管、微板孔或芯片中。可将抗体-结合分子或多肽用可检测的标签进行标记,所述标签例如荧光的或生色的标签或者结合部分诸如生物素。适宜的标签在上面进行了更详细的描述。所述试剂盒可进一步包括检测试剂诸如底物,例如生色的、荧光的或化学发光的底物,它与标签或与结合于标签的分子诸如酶缀合物反应,以产生信号和/或用于免疫沉淀的试剂(即,蛋白A或蛋白G沉淀)。所述检测试剂可进一步包括缓冲溶液、洗涤溶液和其他有用的试剂。所述试剂盒也可包括用于处理和/或储存从个体获得的样品的器械以及用于从个体获得样品的器械(即,针、柳叶刀和收集管或容器)中的一种或二者。所述试剂盒也可包括使用抗原的说明书,例如,用于在此所描述的检测供试样品中的抗-链球菌抗体的方法中。当该试验将要与另一种类型的试验诸如PCR组合时,也可包括这样的试验所要求的试剂(即,引物、缓冲液等等)以及任选其使用说明书。
从下面的以例证说明形式给出的实施例中可得到对本发明及其许多优点的更好理解。
实施例
实施例1
材料与方法
在2003年3月和2005年12月之间,将99例年龄为2个月至6岁的儿童纳入到前瞻性群组研究(prospectivecohortstudy)中,由于CAP而入院至洛桑和日内瓦(瑞士)的大学医院的小儿科病房。如果儿童呈现根据WHO分类法(参考)的肺炎临床症状,则他们是合格的,患有活跃的被治疗的哮喘、慢性疾病或基础疾病(underlyingdisease)、免疫抑制或呈现哮鸣(怀疑为细支气管炎)的儿童被排除。没有儿童被赋予了对抗肺炎链球菌的免疫性,根据瑞士2003-2005年的推荐。在签署由两个机构的伦理委员会批准的双亲同意(parentalcontent)后,将他们纳入。
在入院8小时之内培养血液、尿液和鼻咽样品并评价病毒或细菌的存在。鼻咽样品的PCR分析包括13种病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体,然而通过Ply-特异性PCR评价了血液样品。在入院时所取的所有胸片是由不知晓临床和实验室发现物的年长的放射线学者评论的。对之前未被赋予对抗肺炎链球菌的免疫性的75/99例儿童,在3周之后获得了恢复期血清样品。这75例儿童被纳入到这项关于CAP-相关的抗-肺炎球菌响应的研究中。
用于该研究的PhtD、PhtE、PcpA和LytB蛋白是在大肠杆菌中表达的重组蛋白质。所用的PhtD和PhtE是全长的蛋白质,所用的PcpA和LytB是除去了胆碱-结合结构域的截短的形式。所有的四种蛋白质是在大肠杆菌中作为可溶性蛋白质表达的,并采用离子交换色谱法的组合进行纯化。在纯化后,通过SDS-PAGE和RP-HPLC测定所有的蛋白质具有>90%的纯度。
将成对的急性的和恢复期血清样品储存在-20℃直至分析。在转移至实验室之前将样品进行编码,并由实验室人员在不知晓临床数据的情况下无分别地测量抗Ply、PhtD、PhtE、PcpA和LytB的IgG抗体。通过使用经纯化的蛋白质包被Immulon(ThermoLabsystem)板的间接ELISA,在相同的运行中测试成对的血清样品。对每一份血清样品进行八份系列稀释以便对抗体滴度进行定量。在37℃60分钟后,加入缀合于辣根过氧化物酶(Cappel)的抗-IgG抗体,随后加入ABTS作为底物。每一份血清的ELISA滴度是通过与用于每一次试验的参考人AB血清比较而确定的,对所述参考人AB血清而言,通过取它在OD=1.0处的稀释度的倒数而独断地指定其ELISA单位。结果以EU/ml形式表达。滴度低于5EU/ml的试验截止值(cut-off)的血清被赋予2.5EU/ml的滴度。对抗体滴度进行对数转化以便能进行平均几何学浓度(meangeometricconcentrations)(GMC)的比较。将抗体滴度的显著上升预定义为急性期和恢复期样品之间最小两倍(100%)的增加。
使用标准的描述统计学(频率、平均值、几何平均值和标准偏差)描述了参加者的Socio-人口统计学特征。使用t检验进行了不同血清学的比较,而适当时使用卡方检验或Fisher′s确切检验比较了分类数据。通过使用方差分析(ANOVA)比较了组间血清学。对每一个变量进行了单变量统计分析以测定它与因变量的关系,是个案患者或不是。使用Logistic回归分析以计算校正的比值比(OR)和95%置信区间(CI),控制可能充当混杂因素(性别,等)的任何统计学上显著的人口统计变异值。对所有的统计检验而言,p<0.05或当95%CI不包括1.0时,差异被认为是显著的。使用SPSS(版本15.0)统计软件程序用于分析。
实施例2
实验结果
A.患有CAP的儿童中急性肺炎球菌感染的证据
75例之前健康的儿童(平均年龄33.7个月,中位数35.4个月,范围为2.6至66个月,50%女性)在入院时被纳入并提供了急性的和恢复期血清用于这项CAP-相关的抗-肺炎球菌免疫的前瞻性研究。只有一例儿童具有阳性血培养,然而15/75(20%)例患者在他们的血液中具有肺炎球菌溶血素DNA(Ply+-30PCR)。使用针对Ply(急性的和恢复期血清之间>2-倍增加)的血清IgG血清响应(seroresponses)鉴定了具有急性肺炎球菌感染证据的16/75(21%)例儿童(表1)。当将Ply+-PCR和/或抗-Ply血清响应组合时,该比例增加至31%(23/75),这与最新的报告(由KorppiM,EurJClinMicrobiolInfectDis2007评审的)是一致的。
为了鉴定更多的具有急性肺炎球菌感染证据的儿童,我们使用了四种另外的PSP(PhtD、PhtE、LytB和PcpA)作为免疫学探针以对75份成对的急性的和恢复期血清样品中的抗体滴度进行定量。对LytB的响应是罕见的(表1)。相反,在21-32%的因CAP而住院的儿童中观察到了显著的(>2-倍)IgG响应(表1)。总共34/75(45%)例儿童具有对肺炎链球菌急性响应的证据。血清IgG抗体的平均倍数变化,对抗-PhtD(4.22)、抗-PhtE(6.88)和抗-PcpA(5.62)而言是显著的,对抗-Ply(2.15)而言是中等的,对抗-LytB(1.51)而言是弱的。年龄不影响血清抗-PSP抗体的倍数变化(对每一种PSP而言,R2<0.162),表明甚至幼小的婴儿也可能提高对急性肺炎球菌感染的抗-PSP响应。这被三例8-10个月大的婴儿具有对PhtD、PhtE和PcpA的显著血清响应(平均2.88-6.82倍变化)的观察结果证实了。晚期,血清响应频繁地指向对抗几种PSP(>2PSP:30%,>3PSP:25%,>4PSP:14%,>5PSP:1%),提供最近肺炎球菌暴露的强有力证据。
对>1种PSP具有急性血清响应的34/75(45%)例儿童包括86%(13/15)的Ply+-PCR患者。只有2例Ply+-PCR儿童缺乏抗-PSP响应:一例2.6个月大的男孩,推测为太幼小了以至于不能快速地提高感染-驱动的B细胞响应,和一例43个月大的女孩,具有17日咳嗽和7日发烧的病史,当最终患有大叶性肺炎时她已经具有了对抗5种PSP的高急性血清滴度。因此,将Ply+-PCR和对5种PSP专门小组的血清响应组合将36/75(48%)例因CAP而住院的儿童鉴定为具有急性肺炎球菌感染(P-CAP)的强有力证据。
B.用于在幼儿中诊断肺炎球菌CAP的免疫探针
研究了36例具有急性肺炎球菌响应(>2-倍上升)和/或感染(Ply+-PCR)的CAP儿童(P-CAP)对31例不具有最近的肺炎球菌暴露证据(阴性PlyPCR并且缺乏对任何PSP的IgG滴度的>2-倍上升)的儿童(NP-CAP)。将入院时具有非常高(>300EU/ml)的对抗>3种PSP的血清滴度的八例儿童从这些分析中排除了以避免属性错误(attributionerrors),因为高的抗-PSP在限制>2-倍响应的可能性的同时可能反映最近的暴露或感染。这样的方法将试验的特异性和阳性预测值设定为1.00,因为按照定义响应者是不被包含于对照组的。然而,它允许在充分对照的研究组中比较试验灵敏度和阴性预测值。单独依靠Ply+-PCR以诊断肺炎球菌CAP将错过19/36(53%)例患者,依据肺炎球菌性肺炎很少是菌血症的这样的事实。单独使用抗-PlyIgG响应将错过17/36(47%)例儿童,得到0.44的灵敏度和0.61的阴性预测值,同样是依据之前的报告(表1)。从单独使用抗-PhtE或抗-PcpA中得到较高的数值(表1)。如假定的,将几种PSPs组合进一步增加试验灵敏度(表2)。抗-PcpA和抗-PhtE响应的组合导致0.92的灵敏度,具有0.91的阴性预测值。这些数值可通过添加抗-Ply响应而进一步增加,抗-PcpA、PhtE和Ply响应的组合得到对灵敏度和阴性预测值而言0.94的最佳结果。重要的是,不包括PcpA的PSP任何组合的最大灵敏度仍然低于0.68。这证实增加抗原的数目提高鉴定CAP的病因的可能性,以及某些免疫探针较其他更加显著地贡献于儿科肺炎球菌CAP的诊断。
C.患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童的临床特征
当时令人感兴趣的是,测定具有急性肺炎球菌感染强有力证据的儿童(P-CAP,n=36)在他们的人口统计学特征或临床特征方面是否与没有最近的肺炎球菌暴露证据的儿童(n=31,NP-CAP)不同。单变量分析表明,因P-CAP或NP-CAP而住院的儿童中,在入院(9对8例儿童)的30日之内,年龄(33.5对32.7个月)、性别(50%对48%女性)、肺炎的临床严重性(WHO评分I:5对1,II:23对21,III:7对9)、咳嗽的持续时间(7对4日)、发烧的持续时间(4.2对3.2日)、抗生素使用方面均没有不同。这证实,单独的临床类型可能不能可靠地鉴定具有肺炎球菌起因的CAP的儿童。
D.因肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP而入院的儿童中不同的肺炎球菌免疫
给定了先前存在抗-肺炎球菌抗体在对抗肺炎链球菌感染的保护中的重要性,我们使用了普通的参考血清以比较入院时的PSP-特异性免疫并有可能鉴定P-CAP和NP-CAP儿童之间的差异。所有的75例患者具有对抗至少一种蛋白质的可检测的血清抗体,并且大多数是抗几种PSP(>2PSP:96%,>3PSP:92%,>4PSP:89%,>5PSP:86%)的抗体。最高的GMTs指向对抗PcpA、Ply和PhtE,而抗-LytB抗体显著地较低(表3)。入院时的抗体滴度明显地不同。因为肺炎球菌暴露和B细胞响应能力二者均随着年龄增加,我们探索年龄(月)和PSP-特异性GMTs(loglOEU/mL)之间的相互关系。这些相互关系对Ply(R2=0.63434)、PhtD(R2=0.63297)和PhtE(R2=0.59359)而言是强的,对LytB(R2=0.45824)和PcpA(R2=0.31625)而言尽管显著但是弱的。在被分配成四个平等(even)年龄组(<17,18-35,36-49和>50个月)的儿童中评价暴露驱动的抗-PSP抗体表明,抗-PcpA抗体已经以高滴度存在于<18个月的儿童中(图1),它们随着年龄的进一步增加是显著的(p=0.022)但较其他PSPs(p<0.001)不明显。抗-PcpA和抗-PhtE抗体已经存在于2.6个月龄的最小的婴儿中,推测为反映母体抗体的被动转移。
用于本研究的五种PSP在肺炎球菌菌株之间是很好地保守的(>95-98%)。抗-PSPIgG抗体应该在对抗肺炎球菌性性肺炎的保护中扮演角色,因此我们可能会期望在患有肺炎球菌CAP或非肺炎球菌CAP的儿童之间发现肺炎球菌免疫方面的差异。入院时,抗PhtD、PhtE和LytB的抗体在P-CAP和NP-CAP儿童中是相似的(表4和图2),表明相似的肺炎链球菌既往暴露和B细胞响应能力。入院时的抗-Ply在P-CAP(446EU/ml)儿童中显著地高于NP-CAP(169EU/ml,p=0.03)儿童中。这种差异基本上反映了较大比例的P-CAP儿童在入院时具有高的抗-Ply抗体(>200EU/ml;图2)。惊人相反的是,因P-CAP而住院的儿童在入院时的抗-PcpA抗体低于因NP-CAP而住院的儿童3倍(233对716EU/ml,p=0.001),反映较大比例的NP-CAP儿童具有>10EU/ml的任何值的抗-PcpA滴度(图2)。因此,先前存在的抗肺炎球菌免疫在因肺炎球菌和非肺炎球菌起因的CAP而住院儿童之间显著地不同。
然后比较了恢复期的抗体滴度,在因P-CAP或NP-CAP入院后3周采集。对Ply、PhtD、PhtE和Lyt-B的恢复期抗体滴度仍然显著地(p<0.01)受年龄影响,相反,年龄不影响抗-PcpA的恢复期滴度。抗-LytB抗体在所有的恢复期血清中未增加,表明该抗原的低感染诱导的免疫原性(表4;图2)。P-CAP患者中的抗四种其他PSP的恢复期抗体滴度较高于NP-CAP患者。对抗-Ply抗体而言,这些差异仅仅达到了统计学显著性(表2)。这可能基本反映了在相对小的研究组中血清响应的明显异质性,因为反相分布累加曲线清楚地显示P-CAP儿童中较高的中等比例或高的抗-PhtD和抗-PhtE滴度(图2)。有趣的是,抗-PcpA抗体(在P-CAP儿童入院时3-倍较低)在肺炎的单个发作后只有3周就达到了与NP-CAP儿童相似的滴度。
多元分析证实了入院时高的Ply抗体(p=0.014)和低的PcpA抗体(p=0.004)作为住院儿童中肺炎球菌性肺炎对非肺炎球菌性肺炎的唯一显著的预言者(predictors),而不论儿童的年龄和临床评分。
E.数据分析
数据表明,免疫原性PSPs专门小组的使用显著地改善具有肺炎临床体征的幼儿中肺炎球菌感染的诊断,如由世界卫生组织(WHO)所定义的。WHO已经将抗-PcpA抗体鉴定为肺炎球菌CAP的关键诊断标志物。在患有肺炎球菌性肺炎而不是非肺炎球菌性肺炎的儿童的急性期期间,这些抗体在非常较低的水平下是可检测的。
在该研究中,我们假设基于PSP的试验的灵敏度可通过使用最大免疫原性的蛋白质和/或它们的组合而得以改善。PSP免疫原性的重要性在很大程度上是通过下列灵敏度的实证而证实的,所述灵敏度范围为:从对LytB而言的0.14到对Ply而言的0.44、对PhtD而言的0.56以及对PhtE或PcpA蛋白而言的0.64。该等级直接反映PSP的相对免疫原性,如由抗体响应(LytB(1.51),Ply(2.15),PhtD(4.22),PcpA(5.62)和PhtE(6.88))平均倍数增加的相似梯度在很大程度上不依赖年龄所证明的。更令人印象深刻的是,几种PSP的组合明显地增加了试验灵敏度:将抗-PcpA和抗-PhtE响应组合对因CAP而住院的儿童中最近的肺炎球菌暴露/感染的诊断而言达到0.92的灵敏度,通过添加抗-Ply响应而增加至0.94。对这些改善的灵敏度和它们相关的阴性预测值而言,一个原因是既往定植或感染通常不引出对所有PSPs的抗体,如此以致对一种PSP的高的先前存在的抗体滴度可能不能阻止对其他抗原的响应。另一个原因是将PcpA蛋白鉴定为肺炎球菌CAP的关键诊断标志物:在它缺乏的时候,试验灵敏度达到0.67而不是0.92,不管所测试的PSP组合(表2)。
使用五种PSP的专门小组作为免疫探针鉴定了具有急性肺炎球菌响应证据的34/75(45%)例CAP儿童。这包括血液中具有肺炎球菌DNA(Ply+-PCR)的所有患者,有两个例外:在4日的发烧和咳嗽病史后住院的小于3月龄的婴儿中,抗-PSP响应仍然是阴性的。这表明,在经历初次暴露于肺炎链球菌的非常幼小的婴儿中在免疫不成熟的时候,血清诊断可能仍然是困难的。由于几乎没有幼小的婴儿被纳入本研究,所以该问题将不得不在随后的研究中发表。另一例缺乏抗-PSP响应的Ply+-PCR儿童是学龄前儿童,在因CAP住院之前具有延长病史的咳嗽(17日)和发烧(7日)。她的抗体滴度在入院时已经非常高了(抗-Ply:952EU/ml,抗-PhtD:192EU/ml,抗-PhtE:277EU/ml,抗-PcpA:462EU/ml),表明它们在入院之前的激活。需要注意的是,采用不如排他的使用抗体滴度的倍数增加严格的研究标准,已经认为该患者的血清诊断是阳性的。八例其他儿童(平均年龄44.5个月,范围为22-66个月)在入院时具有对>3种PSP的高的先前存在的免疫性(抗-Ply>380EU/ml,抗-PhtD>111EU/ml,抗-PhtE>393EU/ml和抗-PcpA>266EU/ml),他们不被认为是P-CAP患者也不被认为是NP-CAP患者以避免属性错误。在除一例外的所有八例中鉴定了呼吸道病毒(RSV、hMPV、副流感、鼻病毒、腺病毒、肠道病毒),所述一例具有肺炎支原体感染的证据,并且所有的Ply-PCR仍然是阴性的。将这8例患者包括于NP-CAP组将进一步增加每一种抗-PSP试验的阴性预测值。
不能得出这样的结论,即一些抗-PSP响应由鼻咽部带菌引起。入院时,在P-CAP患者的鼻咽中鉴定的肺炎链球菌比在NP-CAP患者的鼻咽中鉴定的更加频繁(44%对22%,p=0.06),符合鼻咽获得物(acquisition)在肺炎球菌疾病之前的事实。例如,已知新的肺炎球菌菌株的获得物引起对某些PSP诸如Ply、PhtB和PhtE的抗体的发展(HolmlundE,PIDJ2007)。相反,单独的肺炎球菌带菌不与急性血清响应相关。难以得到因CAP入院之前的鼻咽取样以鉴定最近的带菌获得物,并且没有理由相信抗-PcpA抗体不是经由鼻咽部带菌获得物轻易地引出的(参见下面)。在三例NP-CAP患者和四例P-CAP患者(NS)中在入院时诊断了AOM,两组中30日之内的抗生素处方是相似的。之前关于CAP病因学的前瞻性研究不包括健康儿童或患有其他疾病的患者的形式对照组。有趣的是,我们的38例年龄为24-60个月(平均年龄43.1个月,P-CAP:18,NP-CAP:18,不确定的:2)的CAP患者的入院抗体滴度显著地低于被选作对照的58例健康儿童(平均年龄43.6个月)的入院抗体滴度,所述健康儿童用于另一研究,没有之前下呼吸道感染的病史(分别为:Ply:460对745EU/ml,PhtD:150对300EU/ml,PhtE:382对679EU/ml,PcpA:580对1440EU/ml)。因此在前瞻性群组研究中评价带菌获得物、AOM和下呼吸道感染对PhtD、PhtE和PcpA免疫的影响将是有趣的。
在此提供的病因学数据很好地确证了其他研究者的发现物。在采用相似的设计、研究人群和广泛的诊断的病情检查(workup)的US研究中,的确在44%的病例中记录了肺炎链球菌的归属角色(attributedrole)(Michelow2004)。它同样符合7-价肺炎球菌联合疫苗20-30%的保护效能。这些基于PSP的免疫探针的高灵敏度和特异性应该在其他环境中被证实,因此能够证明它们对评价儿科肺炎球菌疾病负担而言是非常有用的。实际上,肺炎球菌病因学可能不是单独地来源于临床症状的,如在此再次证实的。增加肺炎球菌CAP诊断的灵敏度也将极大地降低为了在多个国家环境中证明肺炎球菌疫苗效能所要求的研究的大小。
同样观察到,在因肺炎球菌CAP对非肺炎球菌CAP而住院的儿童中,入院时的抗-肺炎球菌免疫是显著不同的。在所有儿童中发现了PSP-特异性抗体,浓度在反映年龄和既往的暴露的宽范围之内。对抗PhtD、PhtE和Lyt-B的入院抗体水平在两组中是相似的,支持这样的主张,即这些儿童是之前暴露于肺炎链球菌在其他方面健康儿童,最小的婴儿可能例外,它的抗体可能是母体起源的。入院时,在P-CAP儿童中,抗-PlyIgG抗体是>2-倍的更高。这种显著的差异基本上反映了较大比例的P-CAP儿童在入院时已经具有了高的抗-Ply抗体(>200EU/ml;图2)。因此,在患有P-CAP的儿童中,Ply-特异性响应较对其他PSP的响应被更加迅速地诱导了。
假设抗-Ply免疫之前已经在这些患者中诱导了,这是吸引人的,这使得在肺炎球菌感染时发生快速的既往响应(anamnesticresponses)。更高的入院抗-Ply抗体的观察结果与其他人的发现物一致,并且支持将“高的”抗-Ply滴度包括于肺炎球菌CAP的血清学诊断标准中。
惊人相反的是,在因肺炎球菌CAP入院的儿童中抗-PcpA抗体是3-倍较低的,这是非常显著的差异(p=0.001)。这是因为唾液具有最高的体内Mn2+浓度(36uM),如此以致PcpA表达被抑制的,除非肺炎球菌(pneumococci)侵入肺或血流,其中Mn2+的水平式1,000-倍较低的(20nM)。由于PcpA在鼻咽定植期间是不表达的,因此抗-PcpA响应肺炎球菌疾病而不是定植。这可能促成基于PcpA的试验的独特灵敏度(表3),避免与鼻咽引出的响应混淆。这种PcpA表达模式具有另一种含意:具有先前存在的抗-PcpA免疫的儿童是之前已经发生过肺炎球菌疾病的那些。相反,在因CAP而入院时的低抗-PcpA抗体滴度表示儿童可能遭受肺炎球菌疾病的初期发作——这可能与更高风险的下呼吸道疾病相关。PcpA抗体可能仅仅是由之前的疾病提高的保护性免疫的标志物。无论如何,PcpA看起来在确立肺炎球菌性肺炎中扮演关键的角色,因此,需要被作为潜在的疫苗或诊断组分而进一步评价。
总之,在因CAP而住院的75例幼儿(平均年龄33.7个月)的前瞻性研究中,使用了五种肺炎球菌表面蛋白(PSP)的专门小组以鉴定肺炎球菌感染。二十三(31%)例患者或者具有阳性的肺炎球菌溶血素(Ply)血液PCR(20%),或者具有抗-Ply抗体的>2-倍增加(21%)。添加PhtD、PhtE、LytB和PcpA作为免疫探针鉴定了具有急性肺炎球菌感染(P-CAP)的36/75(45%)例患者,将诊断的灵敏度从0.44(Ply单独的)增加至0.94。年龄、性别、临床严重性的WHO评分、咳嗽/发烧的持续时间或之前抗生素的使用均不能将这36例患者与不具有最近的肺炎球菌暴露(NP-CAP)证据的31例儿童区别开来。入院时,对抗PhtD、PhtE和Lyt-B的抗体在两组中是相似的,然而P-CAP患者中的抗-Ply抗体显著地高于NP-CAP患者中的抗-Ply抗体(分别为446对169EU/ml,p=0.031)。相反,P-CAP儿童具有三-倍较低的抗-PcpA抗体(233对716EU/ml,p=0.001)。多元分析证实入院时的低PcpA抗体为幼儿中P-CAP的最显著预言者(p=0.004),与PcpA在低Mn2+隔室诸如肺而不是鼻咽中的优先表达一致。
特此将在此所引用的所有参考文献整体并入本公开内容作为参考。虽然已经以优选实施方式的方式描述了本发明,但应理解的是,对本领域的技术人员将发生变更和修改。因此,意图追加权利要求书以覆盖落于本发明所要求保护的范围之内的所有这样等价的变更。
Claims (26)
1.PcpA抗原用于检测受试者中由肺炎链球菌引起的既往感染或活动性感染的用途,其中所述感染是通过使从受试者获得的样品中的抗体与所述PcpA抗原结合而测定的。
2.PcpA抗原和至少一种选自PhtD、PhtE、LytB和Ply的另外的抗原的用途。
3.根据权利要求2的用途,其中抗原的组合选自:PcpA和Ply;PcpA和PhtD;PcpA和PhtE;PcpA和LytB;PcpA、Ply和PhtD;PcpA、Ply、PhtD和PhtE;Ply、PhtD、PhtE和LytB;PcpA、PhtD和PhtE;PcpA、PhtD、PhtE和LytB;PcpA、PhtE和LytB;PcpA、Ply、PhtE和LytB;PcpA、PhtD、和LytB;PcpA、Ply和LytB;PcpA、Ply、PhtD和LytB;PcpA、Ply和PhtE;以及PcpA、PhtD和PhtE。
4.一种诊断受试者中由肺炎链球菌引起的肺炎或感染的方法,其包括检测来自所述受试者的生物样品中的抗PcpA抗原的抗体,其中所述抗体在样品中的存在是感染的指示。
5.根据权利要求4的方法,其又包括检测抗至少一种另外的抗原的抗体,其中所述另外的抗原选自PhtD、PhtE、LytB和Ply,或一种或更多其免疫反应性片段。
6.根据权利要求5的方法,其中所述抗原选自:PcpA和Ply;PcpA和PhtD;PcpA和PhtE;PcpA和LytB;PcpA、Ply和PhtD;PcpA、Ply、PhtD和PhtE;Ply、PhtD、PhtE和LytB;PcpA、PhtD和PhtE;PcpA、PhtD、PhtE和LytB;PcpA、PhtE和LytB;PcpA、Ply、PhtE和LytB;PcpA、PhtD和LytB;PcpA、Ply和LytB;PcpA、Ply、PhtD和LytB;PcpA、Ply和PhtE;以及PcpA、PhtD和PhtE。
7.根据权利要求4-6中任一项的方法,其包括使来源于受试者的生物样品与抗原接触一段时间,并且在对抗原-抗体复合物形成而言充分的条件下,然后检测抗原-抗体复合物的形成。
8.根据权利要求7的方法,其中检测抗原-抗体复合物的形成包括检测抗原-抗体复合物中的人免疫球蛋白。
9.根据权利要求8的方法,其中检测人免疫球蛋白包括使抗原-抗体复合物与结合人免疫球蛋白的第二抗体接触一段时间,并且在对所述第二抗体与复合物中的人免疫球蛋白结合而言充分的条件下,然后检测结合的抗-人免疫球蛋白。
10.根据权利要求8的方法,其中所述第二抗体标记有可检测的标志物或报告分子。
11.一种用于测定患有由肺炎链球菌引起的肺炎或感染的受试者对采用用于所述肺炎或感染的治疗学化合物治疗的响应的方法,所述方法包括检测治疗后受试者生物样品中的抗PcpA抗原的抗体,其中所检测的抗体量是增加的、不变的或降低的,与在治疗之前所获得的受试者的生物样品中可检测到的抗体量或者在正常或健康的受试者的生物样品中可检测到的抗体量相比,其中治疗后不变的或降低的抗体量指示所述受试者对治疗没有响应。
12.根据权利要求11的方法,其包括检测与至少一种选自PhtD、PhtE、LytB和Ply的抗原发生免疫反应的抗体。
13.根据权利要求11或12中任一项的方法,其包括使生物样品与抗原接触一段时间,并且在对抗原-抗体复合物形成而言充分的条件下,然后检测抗原-抗体复合物的形成。
14.根据权利要求13的方法,其中检测抗原-抗体复合物的形成包括检测抗原-抗体复合物中的人免疫球蛋白。
15.根据权利要求14的方法,其中检测人免疫球蛋白包括使抗原-抗体复合物与结合人免疫球蛋白的第二抗体接触一段时间,并且在对所述第二抗体与复合物中的人免疫球蛋白结合而言充分的条件下,然后检测结合的抗-人免疫球蛋白。
16.根据权利要求15的方法,其中所述第二抗体标记有可检测的标志物或报告分子。
17.根据权利要求7或13中一项的方法,其包括进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。
18.根据权利要求17的方法,其中所述ELISA是使用捕获抗体和检测抗体的夹心ELISA。
19.一种用于在生物样品中检测肺炎链球菌感染的试剂盒,所述试剂盒包括:(i)经分离和纯化的PcpA抗原,以及(ii)用于检测抗原-抗体复合物形成的试剂。
20.根据权利要求19的试剂盒,其还包括使用说明书。
21.根据权利要求4-18中任一项的方法,其还包括检测生物样品中的肺炎链球菌核酸。
22.根据权利要求21的方法,其中所述核酸相应于编码PcpA蛋白的核酸。
23.一种固体基质,其包括吸附于其中的选自PcpA、Ply、PhtD、PhtE和LytB的抗原。
24.一种固体基质,其包括吸附于其中的经分离和纯化的抗原的组合,所述组合选自:PcpA和Ply;PcpA和PhtD;PcpA和PhtE;PcpA和LytB;PcpA、Ply和PhtD;PcpA、Ply、PhtD和PhtE;Ply、PhtD、PhtE和LytB;PcpA、PhtD和PhtE;PcpA、PhtD、PhtE和LytB;PcpA、PhtE和LytB;PcpA、Ply、PhtE和LytB;PcpA、PhtD和LytB;PcpA、Ply和LytB;PcpA、Ply、PhtD和LytB;PcpA、Ply和PhtE;以及PcpA、PhtD和PhtE。
25.根据权利要求23或24的固体基质,其中所述固体基质选自微量滴定板或微阵列。
26.一种诊断由肺炎链球菌引起的感染的方法,其包括使生物样品与权利要求23、24或25中任一项的固体基质在适合于抗体与结合于固体基质的一种或更多抗原反应的条件下接触,并检测所述抗体与至少一种所述抗原结合,或者不与所述抗原结合。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002022167A2 (en) * | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine against streptococcus penumoniae |
WO2004020609A2 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-11 | Tufts University | Streptococcus pneumoniae antigens for diagnosis, treatment and prevention of active infection |
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---|---|---|---|---|
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JP2005110545A (ja) * | 2003-10-06 | 2005-04-28 | Meiji Seika Kaisha Ltd | 呼吸器感染症起因菌の迅速検出法およびそのキット |
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WO2002022167A2 (en) * | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine against streptococcus penumoniae |
CA2421998A1 (en) * | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine against streptococcus pneumoniae |
CN1477970A (zh) * | 2000-09-15 | 2004-02-25 | ʷ��˹���������������﹫˾ | 疫苗 |
WO2004020609A2 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-11 | Tufts University | Streptococcus pneumoniae antigens for diagnosis, treatment and prevention of active infection |
Non-Patent Citations (1)
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GLOVER, DAVID TAWAYNE: "Pneumococcal choline-binding protein A: Its role in virulence and its utility as a Streptococcus pneumoniae vaccine antigen", 《阿拉巴马大学伯明翰分校博士学位论文》 * |
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