TWI392735B - 口蹄疫融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的ｅｌｉｓａ檢測試劑及套組 - Google Patents

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Description

口蹄疫融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的ELISA檢測 試劑及套組
本發明係有關於一種生產抗口蹄疫病毒之單株抗體的融合瘤細胞、其單株抗體，及包含此單株抗體的免疫檢測試劑和套組，特別是關於一種可用於三明治酵素連接免疫吸附試驗之生產抗口蹄疫病毒非結構蛋白之單株抗體的融合瘤細胞株、其單株抗體，以及包含此單株抗體的免疫檢測試劑和套組。
口蹄疫(FMD；foot-and-mouth diease)為偶蹄類動物之高度傳染性疾病，主要感染的經濟動物如牛，豬和綿羊。口蹄疫常以發燒與嘴、舌頭、鼻孔、腳和乳頭的上皮水泡及腐爛等症狀為特徵。口蹄疫病毒是一個正股RNA病毒，隸屬於Picornaviridae科之Aphthovirus屬，為小的無封套病毒，含有8.5 kbp基因可轉譯出結構與非結構蛋白(NSPs)。本病毒含有7種血清型，包括O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2和SAT 3等分佈在全世界，而每個血清型無交叉保護作用，FMDV在各個血清型之間由於具有高的突變速率因此演化的過程也是即為快速，其中於病毒的表面如VP1結構蛋白為主要的中和部位是極具有可塑性(Plasticity)及高抗原性變異。在1997年，台灣爆發嚴重的口蹄疫疫情，由血清型O型病毒引起的(命名為O/TAW/97)。此株為非典型的嗜感染豬原型。經試驗研究發現該株之非結構蛋白區3A之一段(即93-102)密碼子缺損，此片段為決定病毒是否能於試管內牛上皮細胞增殖之主要限制生長因素，故此缺損片段之病毒株証實是造成O/YUN/TAW/97病毒株在牛隻體內毒力減弱的原因。在1997年爆發當時，由於控制和貿易限制等而造成國家經濟受到嚴重的影響(估計總值超過60億美元)。另一病毒株，在金門發現自亞臨床感染的動物，病毒基因含有全長的3A非結構蛋白 轉譯區，証實為牛型之強毒株(O/TAW/2/99)。O/TAW/2/99口蹄疫病毒為南亞血清O型的地理型(Topotype)，自1999年入侵臺灣。當時疾病爆發後，立即採取檢疫措施，且在感染牧場中進行篩除，並儘快銷毀處置感染的畜體。而預防性篩檢疑似感染牧場也同時列入防堵措施。
若以傳統不活化病毒生產方法之缺點為：(1)由於口蹄疫為高度傳染性疾病，藉由空氣傳染，製備不活化病毒需使用到病毒，不僅實驗室必須符合生物安全等級之三級負壓實驗室，而且實驗過程中病毒有可能發生再活化，危險性高。(2)不活化病毒無法產生寄主於活體感染狀態下自然產生的非結構蛋白，因此檢測效能欠佳。
本案係利用大腸桿菌細胞(E.coli.)來表現口蹄疫病毒之非結構蛋白(Non-Structural Protein,NSP)，利用一親代細胞與一骨髓瘤細胞融合而製成融合瘤細胞株。將O/TWA/99病毒株之3ABC基因應用pRSET、pET 32、pET43及pBlueBacHis2等載體系統進行選殖，再應用大腸桿菌及桿狀病毒進行蛋白質之表現，以純化後之NSP作為抗原進行酵素結合免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay；ELISA)。特徵在於能夠專一性辨識動物感染口蹄疫病毒後所產生的NSP抗體，本案所保護之技術標的，包含針對FMDV NSP的融合瘤細胞株及其單株抗體，以及包含有該單株抗體之Sandwich ELISA檢測試劑或其套組等。
而本案因應安全性及有效性考慮，不使用病毒而係利用分子生物學技術，以非結構重組蛋白的抗原決定位開發融合瘤來生產單株抗體，此法不需用到病毒，可在二級實驗室進行，安全性高，而且該方法可以檢測NSP抗體，以正確分辨出活體感染口蹄疫病毒之個體。且經實驗發現，其敏感性及特異性皆高於95%以上，顯示本案發明對於感染口蹄疫病毒之檢體有專一性，並可區別自然感染及疫苗免疫動物產生之抗 體。
本發明係提供一種融合瘤細胞，係由親代細胞與骨髓瘤細胞融合而製成，其特徵如寄存編號為BRBC 960397之細胞株所示，親代細胞係由原核細胞所表現之口蹄疫病毒之由3ABC基因片段所編碼之NSP作為抗原免疫至小鼠，並將小鼠體內之脾臟細胞取出而製成，且融合瘤細胞株所生產之單株抗體能夠專一性辨識口蹄疫病毒之3ABC胜肽片段，且不會與豬水疱病(Swine vesicular disease；SVD)抗血清產生非特異性反應。
因此，本發明之主要目的為提供一種融合瘤細胞株，由於其所生產之單株抗體對口蹄疫病毒之NSP具有專一性辨識能力，且不會與其它水疱性疾病抗體產生交叉反應，故可用於發展免疫快速檢測試劑之用途。
此外，本發明亦提供一種單株抗體，其特徵在於其係由寄存編號BRBC 960397所產生，且可專一性辨識口蹄疫病毒之NSP 3ABC胜肽片段，且對於豬水疱病抗體無交叉反應。
因此，本發明之主要目的為提供一種單株抗體，由於其對口蹄疫病毒之NSP具有專一性辨識能力，且不會與其它水疱性疾病抗體產生交叉反應，故可用於發展免疫快速檢測試劑之用途。
又，本發明尚提供一種包含有上述單株抗體的免疫檢測試劑、免疫檢測套組，以及利用上述抗體之免疫檢測方法，由於所使用的單株抗體對口蹄疫病毒之3ABC胜肽具有專一性辨識能力，且不會與其它水疱性疾病抗體產生交叉反應，故可用於發展免疫快速檢測試劑之用途。
由於本發明係揭露一種融合瘤細胞株、其單株抗體、利用前述單株抗體所製作之免疫檢測試劑及套組，其中所利用之免疫學原理、細胞培養、染色及蛋白質偵測等相關技術，已為相關技術領域具有通常知識者 所能明瞭，故以下文中之說明，不再作完整描述。同時，以下文中所對照之圖式，係表達與本發明特徵有關之示意，並未亦不需要依據實際情形完整繪製，合先敘明。
本發明第一實施例係提供一種融合瘤細胞株，可生產抗口蹄疫病毒之單株抗體，其流程如第1圖所示，係以Sp2/0骨髓瘤細胞株與自BALB/c小鼠取得之親代細胞進行製備，此融合瘤細胞株之寄存編號為BRBC 960397，且其所生產之單株抗體可專一性辨識口蹄疫O/TAW/99病毒株之NSP。
本發明所提供之寄存編號BRBC 960397所示之融合瘤細胞株，其親代細胞係依下列步驟所製備而得：
步驟一：首先，設計適當引子，利用反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)，針對口蹄疫O/TAW/99病毒株之NSP 3ABC基因進行增幅。其中，增幅之目標基因片段又以3ABC基因片段中的高度保留區域(Highly conserved region)為佳，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示，而其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
步驟二：將步驟一中藉由反轉錄-聚合酶連鎖反應所得之3ABC基因片段構築至pET載體。完成序列確認後，利用限制酶裁切，將所得之目標基因片段再構築至pTH 162-B載體，將構築完成後的pTH質體轉殖到原核細胞中，並使其表現pTH 162-B中3ABC基因片段所編碼的重組蛋白。此步驟所使用的原核細胞以大腸桿菌為佳。
步驟三：將步驟二中利用原核細胞所表現而得的重組蛋白進行純化後當作免疫抗原，對BALB/c小鼠重複進行注射，使其產生針對3ABC重組蛋白的免疫反應。再將免疫後的BALB/c小鼠脾臟細胞取出，作為製備可生產抗口蹄疫病毒NSP單株抗體的融合瘤細胞株之親代細胞。
將上述步驟所製備而得的親代細胞與骨髓瘤細胞株進行融合而得到融合瘤細胞。利用間接酵素結合免疫吸附試驗(Indirect ELISA)及 西方墨點法(Western blotting)篩選出其培養之上清液對於O/TAW/99病毒株之3ABC重組蛋白具有特異性反應的融合瘤細胞株。
經由上述步驟篩選後所得之融合瘤細胞株，其生產出的單株抗體對於口蹄疫O/TAW/99病毒株之NSP具有專一性辨識能力，前述之NSP包含有3ABC基因片段的高度保留區域所編碼之胜肽片段。
本發明之第二較佳實施例為單株抗體，具有寄存於食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 960397之融合瘤細胞株所生產的單株抗體之特徵。由寄存編號BRBC 960397之融合瘤細胞株所生產的單株抗體，對於口蹄疫病毒中屬於血清型O型的O/TAW/99病毒株的NSP具有專一性辨識能力，特別是對於NSP中3ABC基因中高度保留區域所編碼之胜肽片段具有專一性辨識能力，且對於豬水疱病(SVD)抗體無交叉反應。
此外，由於製備本較佳實施例單株抗體之抗原係衍生自口蹄疫病毒O/TAW/99病毒株中NSP之3ABC基因片段高度保留區域所編碼的重組蛋白，因此，經由後續實驗結果可得知，本較佳實施例所提供之單株抗體，亦可辨識屬於血清型如A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型及SAT 3型等的口蹄疫病毒。
又，為了得到高濃度及高純度的單株抗體，除了藉由活體外(In vitro)細胞培養技術以大量培養第一較佳實施例所提供的融合瘤細胞株並收集其培養上清液之外，亦可將第一較佳實施例所提供的融合瘤細胞株注入小鼠腹腔內，收集所產生的腹水。無論藉由活體外細胞培養所收集而之上清液，或是自小鼠體內收集而得的腹水，均可藉由適當之純化過程(例如利用protein A管柱層析法)，純化出本較佳實施例之單株抗體。
本發明之第三較佳實施例係為一種免疫檢測試劑，用於酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)中，藉以檢測待測抗體，其中包含有如第二較佳 實施例中所描述的單株抗體。由於本較佳實施例之免疫檢測試劑中所含有的單株抗體係以小鼠脾臟細胞作為親代細胞而製得，屬於小鼠品系之IgG免疫球蛋白，故可配合其他適當的試劑，藉由Sandwich ELISA以偵測待測之豬隻檢體中是否含有抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體。
本發明之第四較佳實施例為一種免疫檢測套組，藉由Sandwich ELISA以檢測豬隻檢體中是否帶有抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體。本較佳實施例之免疫檢測套組，包含有：
(1)單株抗體，其特徵如同第二較佳實施例所提供之單株抗體，對於口蹄疫O/TAW/99病毒株NSP中3ABC基因片段所編碼之胜肽片段具有專一性辨識能力。此外，單株抗體11係以適當濃度塗布於固相載體上。固相載體可以是微孔盤、微球體、雜交膜、或是試紙。
(2)偵測試劑，包含有偵測抗體及訊號產生物質，偵測抗體可直接與訊號產生物質共軛結合。前述的訊號產生物質可以是放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物(化學冷光標記物或生物冷光標記物)、螢光標記物，或是酵素；適合本較佳實施例的酵素可以是：過氧化氫酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase；HRP)、鹼性磷酸酶(Alkaline phospatase；AP)、以及beta-半乳糖苷酸酶(Beta-galactosidase)。而在訊號產生物質是酵素的狀況下，偵測抗體是與生物素(Biotin)共軛結合，另外訊號偵測物質則以酵素形式與抗生物素蛋白連接。
(3)樣本抗原，係衍生自口蹄疫O/TWA/99病毒株之NSP中3ABC基因高度保留區域所編碼之重組蛋白。
此外，本較佳實施例所提供之免疫檢測套組，可進一步包含有受質，受質可與酵素反應而發生呈色反應。受質的種類與套組中所選用的酵素系統有關，例如：酵素為HRP時，受質以ABTS(2,2'-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate))為佳；而當酵素為AP 時，選用的受質則以溶解於DEA(Diethanolamine)緩衝溶液中的PNPP(Para-nitrophenylphosphate)為佳。
又，本較佳實施例之免疫檢測套組亦可進一步包含有沖洗試劑(Wash reagent)，沖洗未附著於固相載體的單株抗體，或是將未與單株抗體產生專一性結合的樣本抗原、待測樣本之雜質、偵測抗體及訊號產生物質沖洗出來，避免上述物質殘留而造成檢測結果之誤差甚至是偽陽性結果的發生。沖洗試劑的組成則可為磷酸鹽緩衝溶液(PBS)、三烴甲基胺基甲烷緩衝溶液(TBS)、Tween 20，或是上述溶液的任意組合。
本較佳實施例之免疫檢測套組亦可進一步包含有阻隔試劑(Blocking reagent)，將固相載體中未結合單株抗體之位置加以阻隔，以避免後續添加之樣本抗原、待測樣本、偵測抗體及訊號產生物質附著所造成的偽陽性訊號。阻隔試劑則以包含有蛋白質為佳，蛋白質可以是牛血清白蛋白(Bovine serum albumin；BSA)、酪蛋白(Casein)、動物明膠(Gelatin)，或是前述蛋白質的任意組合。此外，亦可直接使用脫脂牛乳做為本較佳實施例之阻隔試劑。
本發明亦提供一種免疫檢測方法，如下述第四較佳實施例所示，係利用ELISA來檢測待測抗體。請參閱第1圖，為本實施例所利用之Sandwich ELISA方法之解析圖。免疫檢測方法包含有下列步驟：
步驟一：提供固相載體10。
步驟二：提供單株抗體11，具有如第二較佳實施例所提供之單株抗體的特徵，為寄存於食品工業發展研究所寄存編號為BCRC 960397之融合瘤細胞株所生產，且對於口蹄疫病毒中屬於血清型O型的O/TAW/99病毒株的NSP具有專一性辨識能力，特別是對於NSP中3ABC基因中高度保留區域所編碼之胜肽片段具有專一性辨識能力。
步驟三：將步驟二所提供單株抗體11施加(Applying)至固相載體10上。
步驟四：提供樣本抗原12，樣本抗原12係與步驟二所提供之單株抗體11進行專一性結合。樣本抗原12則以衍生自口蹄疫O/TWA/99病毒株的NSP為佳，又以衍生自口蹄疫O/TWA/99病毒株的3ABC基因之重組蛋白為更佳。
步驟五：提供待測檢體13。將待測檢體13施加於固相載體10上，且待測檢體13可操作性地與步驟四所提供的樣本抗原12進行免疫反應，藉以於固相載體10上與單株抗體11及樣本抗原12共同形成免疫複合物。
步驟六：提供偵測試劑，偵測試劑可操作性地與於步驟五中所形成的免疫複合物進行免疫反應，藉以產生訊號。
步驟七：偵測由步驟6中所產生的訊號。
此外，本較佳實施例中，步驟六所提供的偵測試劑，可進一步包含有偵測抗體14與訊號產生物質15；偵測抗體14與訊號產生物質15之特徵、相互連結關係，以及選用種類與第四較佳實施例中所述大致相同，在此不再贅述。
本較佳實施例亦可進一步包含提供沖洗試劑之步驟，將步驟三中未附著於固相載體10上的單株抗體11，或是將步驟四中未與單株抗體11產生專一性結合的樣本抗原12、步驟六中待測檢體13所帶有之雜質，步驟六中未與形成於步驟五中的免疫複合物進行免疫反應的偵測抗體14及訊號產生物質15沖洗出來，避免上述物質殘留而造成檢測結果之誤差甚至是偽陽性結果的發生。而沖洗試劑可為PBS、TBS、Tween 20，或是上述溶液的任意組合。
此外，若是步驟六所提供的偵測試劑包含有以酵素作為其訊號產生物質15，則需要另外加入與所提供酵素產生免疫反應的受質16。例如：當使用HRP需使用ABTS作為其受質，而當使用AP時，其受質則以溶於DEA溶劑的PNPP為佳；此外，依據步驟六所使用的酵素與受質 的種類，需要有不同的偵測方法來偵測這些由不同系統所產生的訊號。例如：當使用HRP作為酵素及ABTS作為受質的呈色系統時，檢測結果係利用各待測樣本在波長為450nm或460nm下的吸收光譜加以判定；而當使用AP作為酵素及PNPP及DEA作為受質的呈色系統時，檢測結果則利用各待測樣本在波長為430nm下的吸收光譜加以判定。
本較佳實施例亦可進一步包含提供阻隔試劑之步驟，此步驟之目的在於將固相載體在步驟三之後未結合單株抗體之位置加以阻隔，以避免後續於步驟四、五及六中添加之樣本抗原、待測檢體、偵測抗體及訊號產生物質直接附著於固相載體上所造成的偽陽性訊號。阻隔試劑則以包含有蛋白質為佳，蛋白質可以是BSA、酪蛋白、動物明膠，或是前述蛋白質的任意組合。此外，亦可直接使用脫脂牛乳作為本較佳實施例所提供的阻隔試劑。
本發明另提供下列實驗例作為本發明之進一步說明，但並非作為本發明之限制。
實驗例1：材料與方法 1.1：血清
為測試檢測之靈敏度，自年齡為8週的豬隻且經過口蹄疫病毒O/TAW/97病毒株試驗攻毒感染後34天的豬隻採集32個口蹄疫陽性(FMD-positive)豬隻血清樣本。
為比較本發明所提供之三明治ELISA檢測套組與其他三種商售之ELISA檢測套組，係自32頭不帶特定致病原(Specific-pathogen-free；SPF)且經實驗性感染口蹄疫病毒O/TAW/97病毒株的豬隻採集其血清樣本，共計320個。前述320個血清樣本的採集時間點為感染病毒後第0、2、4、6、8、10、14、21、28，以及第34天。此外，30個血清樣 本採集自以口蹄疫O/TAW/97病毒株進行實驗性感染後28天的豬隻亦併同測試。
為測試專一性，自未感染之豬隻採集255個血清樣本，以及自施打過疫苗的豬隻中採集了165個血清樣本。自未感染之豬隻所採集到的255個血清樣本其中有96個係自SPF豬隻體內採集而得，其餘159個則採集自1997年口蹄疫疫情爆發前未感染之豬隻。自施打過疫苗的豬隻中所採集到的165個血清樣本，係自165未經感染且施打過2次市售O血清型口蹄疫病毒疫苗的豬隻體內所採集而得。
此外，為評估本發明所提供的Sandwich ELISA檢測套組對豬水疱病毒(Swine vesicular disease virus；SVDV)可能發生的交叉反應(Cross-reactivity)，以及為了要證實本發明所提供的Sandwich ELISA檢測套組對不同血清型口蹄疫病毒之間的交叉反應，使用6個抗SVDV的抗血清(Antiserum)(UKG/27/72 strain EU SVD reference serum batch 2002)以及6個牛隻的抗不同血清型(血清型A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT3)口蹄疫病毒的抗血清係來自英國動物衛生研究所(Institute for Animal Health，Pirbright，United Kingdom)產製。
恢復期中的豬隻血清是由實驗性感染O/TAW/97及O/TAW/99病毒株的豬隻，在感染28天後分別取得，其血清中和抗體力價(SN titer)分別為1：256與1：512，作為西方墨點法(Western blotting)及Sandwich ELISA中所使用的陽性對照組，另陰性對照組係為SPF豬隻血清。
1.2：反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)引子設計
一引子對(Primer pair)係設計用來自口蹄疫病毒O/TAW/99病毒株基因體增幅其3ABC基因區域的核酸片段(GenBank accession No.AJ539137之第5595號至第6119號核苷酸區域，其詳細序列如SEQ ID NO：1所示，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示)。其正向引子(Forward primer)其序列為：5'-CACCGGATCCTGTCGCGAGACTCGCAAGAGACAGCAG-3'，其中包含有BamHI限制酶之切位；而其反向引子(Reverse-primer)之序列為：5'-CCCGAATTCGCACGTCTTCCCGTCGAGGATGAGCTC-3'，其中包含有EcoRI限制酶之切位。
1.3：反轉錄-聚合酶連鎖反應(RT-PCR)
反轉錄-聚合酶連鎖反應混合物係利用SuperscriptTM One-Step RT-PCR System以及Platinum® Pfx DNA Polymerase製備而得，而反應係利用Gene Amp PCR system 2400 thermocycler熱循環機中進行；而反應進行溫度及時程如下：首先將反應樣本培育於42℃中40分鐘，接著再於90~95℃中進行50秒的預加熱變性(Pre-denaturation)，接著再重複進行30~40次的下列熱循環：於90~95℃中加熱變性(Denaturation)30秒，於50~55℃中黏合(Annealing)30秒，於68~72℃中延展(Extension)一分鐘。最後再於72℃中延展七分鐘，並設定將樣本保持於4℃。經上述反轉錄-聚合酶連鎖反應所得之產物係保存於-20℃中，直至後續實驗所需。其中10微升(μL)的反轉錄-聚合酶連鎖反應產物係經由2%的瓊脂電泳分析，並且利用SYBR SafeTM DNA gel stain染劑，於一倍的TAE緩衝溶液中染色，並於UV光中進行顯色。
1.4：口蹄疫病毒3ABC基因之選殖(Cloning)
首先，利用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit實驗套組將瓊脂凝膠中的產物純化取出，再利用適當的限制酶(BamH1與EcoR1)進行處理後，與pET vector進行黏接，以製得一完整之表現載體。將前述表現載體轉殖入BL21(DE3)勝任細胞，並培養於添加100微克/毫升(μg/mL)氨苄西林(Ampicillin)的Luria-Bertani瓊脂培養皿中。將生 長出的陽性菌落挑選出來，並利用Miniprep Kit試驗套組萃取各菌落的質體，且篩選出帶有3ABC基因片段的質體樣本。最後，將篩選出的樣本進行DNA定序，以確認該質體樣本所帶有的3ABC基因片段之核酸序列。
1.5：口蹄疫病毒3ABC多胜肽於大腸桿菌中之表現與純化
將大腸桿菌以所製得的pTH 162-B質體進行轉形，於添加100微克/毫升(μg/mL)Ampicillin的Luria-Bertani培養液在37℃中劇烈搖晃進行培養。當培養至中對數期(Mid-logarithmic phase)時，於培養液中添加異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside；IPTG)，使其最終濃度為一毫莫耳濃度(mM)，並將培養液繼續培育4小時，以誘導3ABC多胜肽之表現。接著利用離心方式收集將大腸桿菌菌體，並加入細菌蛋白萃取試劑或超音波震盪法將菌體裂解。在裂解物中的可溶性的3ABC多胜肽係利用His-Tag親和性層析管柱(Affinity chromatography column)加以純化，最後定量純化所得之產物。
1.6：SDS膠體電泳與西方墨點分析
經上述實驗例1.5純化所得之3ABC多胜肽，係經由12% SDS膠體電泳加以分析；經過12% SDS膠體電泳之後，再將蛋白質轉印於PVDF硝化纖維濾紙之上，利用西方墨點法分析其對於強陽性豬隻血清之血清反應性。西方墨點法之步驟係使用的第一抗體為適當稀釋之陽性豬隻血清，而第二抗體為適當稀釋之帶有鹼性磷酸酶的山羊抗豬(Goat anti-swine)IgG抗體。最後利用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)與氮藍四唑(Nitro blue tetrazolium)作為鹼性磷酸酶之受質及呈色物質。
1.7：病毒中和測試
為確認用來作為陽性血清組經實驗性感染豬隻的感染情形，感染病毒株的豬隻，其血清收集後均依照國際動物衛生組織(Office International Des Epizooties；OIE)-陸生動物診斷試驗及疫苗手冊(Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals)之方法進行病毒中和測試。
1.8：小鼠免疫與抗3ABC單株抗體之製備
生產抗3ABC重組蛋白單株抗體的融合瘤細胞株係經由下列方法製備：以皮下注射的方式將200微克經由實驗例1.5所製備而得的3ABC重組蛋白作為抗原來免疫BALB/c小鼠，免疫間隔為4週。在進行細胞融合之前的3至4天，再將同量的抗原放入磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate-buffered saline)中以皮下注射方式對小鼠進行補強注射(Boost)。將免疫後之BALB/c小鼠犧牲後取出其脾臟，並將取得之脾臟細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合以製得融合瘤細胞。經過兩週後，利用含有口蹄疫病毒O/TAW/97或O/TAW/99重組蛋白的間接酵素連結免疫吸附試驗(Indirect ELISA)，針對融合瘤細胞的培養上清液進行篩選；此外，亦利用西方墨點法針對融合瘤細胞的培養上清液進行篩選，其方法與實驗例1.6中所述相同。經間接酵素連結免疫吸附試驗分析後，將測試結果陽性/陰性比例(Positive/negative(P/N)ratio)大於2的融合瘤細胞株挑選出進行放大培養。經判定為會生產抗3ABC抗體之融合瘤細胞株，將其注射入BALB/c小鼠腹腔，收及其產生之腹水。最後利用Affi-Gel protein A管柱層析法自收集之腹水中純化出抗體，而純化所得之抗體濃度最高可至10毫克/毫升(mg/mL)。
1.9：三明治酵素連結免疫吸附試驗(Sandwich ELISA)
針對口蹄疫病毒株血清型O型的Sandwich ELISA(如圖一所示)係建立來對口蹄疫NSP之抗血清進行定量。一般來說，係先在微孔盤(Nunc Maxisorb)上塗布單株抗體，並以酸鹼值9.6且0.06莫耳濃度(M)的碳酸/碳酸氫鹽緩衝溶液作為塗布緩衝液，塗布後培育於4℃下直至隔夜；單株抗體並依棋盤式滴定方式塗布於微孔盤，以決定單株抗體(CmA40)對口蹄疫病毒O型NSP之最佳濃度。塗布完成後，將以稀釋液進行最佳稀釋之口蹄疫病毒O型非結構重組蛋白加入微孔盤中，在37℃中培育一小時。之後，將以阻隔緩衝液適當稀釋後的豬隻血清取100微升加入微孔盤中，在37℃中培育一小時。將連接有HRP的山羊抗豬IgG抗體(HRP conjugated-goat anti-swine IgG)以阻隔緩衝液稀釋後，在微孔盤中各反應孔中加入100微升。之後，使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine；TMB)作為受質，並在室溫中反應呈色10至15分鐘。最後，在各反應孔中加入50微升，1.0莫耳濃度的硫酸以停止呈色反應，測量各反應孔中波長450nm的OD值。上述各步驟中有在37℃中培育一小時者，之後再以清洗液清洗6次。
1.10：偵測抗口蹄疫病毒NSP抗體的ELISA套組之比較
本發明亦比較三種市售酵素連結免疫吸附試驗套組與本發明所提供之免疫檢測套組，對於抗口蹄疫病毒NSP之抗體偵測能力的差異。Ceditest FMDV-NS檢測套組(Cedi-Diagnostics B.V.,Lelystad,Netherlands)為阻隔型(Blocking)酵素連接免疫吸附試驗套組，UBI FMD NS EIA檢測套組(United Biomedical Inc.,Hauppauge,New York,USA)係為利用人工合成之3B胜肽的間接酵素連結免疫吸附試驗套組，CHEKIT FMD-3ABC檢測套組(IDEXX Laboratories Inc.,Westbrook,Maine,USA)係為利用大腸桿菌表現3ABC多胜肽的間接酵素連結免疫 吸附試驗套組。上述檢測套組之使用係依照各套組製造商之使用說明。
實驗例2：大腸桿菌表現3ABC重組蛋白
口蹄疫病毒O/TAW/99 3ABC基因序列係取自美國國家生技資訊中心(NCBI)GenBank資料庫中，GenBank accession No.AJ539137，第5595號至第6119號核苷酸區域，其詳細序列如SEQ ID NO：1所示，其中包含有525個核苷酸長度的編碼區域(Coding region)，故其編碼之重組蛋白為175個胺基酸長(序列如SEQ ID NO：2所示)。比較近來自亞洲、非洲與歐洲所分離出的泛亞洲(Pan-Asia)口蹄疫病毒株血清型O型的基因組序列，其基因一致性約在97%至99%。
將上述經由反轉錄-聚合酶連鎖反應所增幅而得之DNA片段，插入pET vector表現載體。將前述表現載體轉殖入大腸桿菌BL21DE3株系勝任細胞，並培養於添加100微克/毫升Ampicillin的Luria-Bertani瓊脂培養皿中，挑選出陽性菌落，並萃取出帶有3ABC基因插入片段的質體。
將帶有3ABC基因插入片段的質體送入大腸桿菌BL21DE3菌株進行轉形，並於添加100微克/毫升Ampicillin的Luria-Bertani培養液在37℃中劇烈搖晃進行培養。當培養至中對數期時，於培養液中添加異丙基硫代半乳糖苷，使其最終濃度為一毫莫耳濃度，並將培養液繼續培育4小時，以誘導3ABC重組蛋白之表現。表現出的3ABC重組蛋白係利用親合性層析管柱加以純化，純化所得之3ABC重組蛋白經由12% SDS膠體電泳及西方墨點法加以分析。西方墨點分析之結果顯示，經由上述方法表現之蛋白其大小為40kDa，且證實會與抗口蹄疫病毒之抗血清產生反應(結果未示)。經定量後，純化所得之3ABC之重組蛋白濃度約為11.2毫克/毫升。
實驗例3：小鼠免疫與抗3ABC單株抗體之製備
生產抗3ABC重組蛋白單株抗體的融合瘤細胞株係經由下列方法製備：以皮下注射的方式將200微克經由實驗例1.5所製備而得的3ABC重組蛋白作為抗原來免疫BALB/c小鼠，免疫間隔為4周。在進行細胞融合之前的3至4天，再將同量的抗原放入磷酸鹽緩衝溶液中以皮下注射方式對小鼠進行補強注射。將免疫後之BALB/c小鼠犧牲後取出其脾臟，並將取得之脾臟細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合以製得融合瘤細胞。經過兩週後，利用含有口蹄疫病毒O/TAW/97或O/TAW/99重組蛋白的間接酵素結合免疫吸附試驗，針對融合瘤細胞的培養上清液進行篩選；此外，亦利用西方墨點法針對融合瘤細胞的培養上清液進行篩選，其步驟方法與實驗例2中所述相同。經間接酵素連結免疫吸附試驗分析後，將測試結果陽性/陰性比值(Positive/negative(P/N)ratio)大於2的融合瘤細胞株挑選出進行放大培養。經判定為會生產抗3ABC抗體之融合瘤細胞株，將其注射入BALB/c小鼠腹腔，收及其產生之腹水。最後利用Affi-Gel protein A(Millipore)管柱層析法自收集之腹水中純化出抗體，而純化所得之抗體濃度最高可至10毫克/毫升。
實驗例4：Sandwich ELISA之判讀
為確保各測試間品質控制血清測試結果的穩定，各Sandwich ELISA的96孔測試盤中無論陽性血清與陰性血清均做二重複。經統計18個測試之結果，陽性血清測試結果為0.90±0.09，變異係數指標為9.78%；陰性血清之測試結果為0.09±0.02，變異係數指標為24.33%。共有770個測試血清OD450nm之測試結果皆以標準化呈現。陰性豬隻血清共計287個，其中包含有255件樣本由未感染之豬隻所採集，而有32件樣本由感染後第0天之豬隻所採集；前述287件陰性血清樣本與62頭實驗性感染的豬隻共同用來決定本發明所提供之Sandwich ELISA結果的決定值(Cut-off value)。
本發明所提供之免疫檢測套組的專一性確定測試係測試了96頭SPF豬隻體內採集之血清。所有測試樣本的OD450nm讀值最大頻度分佈均小於0.15，其中部份測試樣本的OD450nm讀值最大頻度分佈高於0.06至0.11。此外，自經疫苗接種免疫之豬隻所採集而得之血清樣本，其測試結果的OD450nm讀值均小於0.22。因此，決定值係定於OD450nm讀值為0.22。亦即，當待測樣本測試結果的OD450nm讀值小於0.22時，則該測試結果判定為為陰性；而當待測樣本測試結果的OD450nm讀值大於或等於0.22時，則該測試結果判定為陽性。測試結果如表一所示。
a讀值<OD450 0.22視為陰性
b讀值≧OD450 0.22視為陽性
c係採樣自30頭感染後第14天之豬隻血清組
實驗例5：本發明所提供之抗體對3ABC抗原決定位置的反應動力學測試
連續採樣之豬隻陽性血清組係經由本發明所提供之免疫檢測套組及其他上述三種市售酵素連接免疫吸附試驗套組所測試。經本發明所提供之免疫檢測套組之測試，結果顯示自32頭豬隻感染後第8天所採得之血清中可測出抗3ABC抗體；而所有在感染後第10天所採得的豬隻血清，本發明所提供之免疫檢測套組均可測出抗3ABC抗體之陽性反應；且整個動物實驗過程中，其陽性比率大於90%。所有經實驗性感後的豬隻，在感染14天之後，其血清中的中和抗體力價均大於1：16，甚至到達1：1024，測試結果如表二所示。
經上表之結果顯示，證實本實驗用之豬隻確為已感染。市售之Ceditest檢測套組及UBI檢測套組，對相同血清的樣本檢測結果與本實驗相近，但CHEKIT檢測套組之結果則否。CHEKIT檢測套組之檢測結果顯示，在感染第14天的血清中可測出NSP抗體反應，而實驗過程中的陽性比率最多為80%。本發明所提供之免疫檢測套組與Ceditest FMDV-NS檢測套組兩者針對同樣血清樣本的檢測結果如表三所示，兩種檢測套組的檢測結果一致性之比值為97.2%(311/320)，Kappa統計結果為0.94。
Kappa：0.943，一致性(Aggrement)：0.972，標準差：0.019
95%信賴區間：底限值(Lower Limit)：0.906，頂限值(Upper Limit)：0.98
實驗例6：本發明所提供之免疫檢測套組與商售之酵素連接免疫吸附試驗檢測套組之比較
本發明所提供之免疫檢測套組經實驗後顯示其敏感性(Sensitivity)為98.4%，對未感染及經免疫接種之豬隻的特異性(Specificty)為100%。本發明所提供之免疫檢測套組與市售之酵素連接免疫吸附試驗檢測套組之比較結果如表四所示。
a敏感性係測試32頭感染後第14天之豬隻血清組.
本發明所提供之免疫檢測套組，其實驗之結果與Ceditest FMDV-NS檢測套組結果相近，此外，本發明所提供之免疫檢測套組對經疫苗接種之豬隻的特異性為100%，比UBI檢測套組(85.3%)具有更高的專一性；而本發明所提供之免疫檢測套組對經已感染豬隻的敏感性(98.4%)則比CHEKIT檢測套組(35.5%)更高。
實驗例7：本發明之免疫檢測套組對牛抗血清中口蹄疫病毒其他血清型之測試
本實驗係利用Sandwich ELISA，測試本發明所提供之抗體是否可辨識包含有口蹄疫病毒血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型或SAT 3型病毒株的牛隻血清。結果顯示本發明所提供之抗口蹄疫病毒NSP對於包含有口蹄疫病毒血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型或SAT 3型病毒株的牛隻血清均呈現陽性反應，而其中血清型C型、Asia 1型、SAT 1型，或SAT 3型的實驗結果，其OD450nm之讀值均大於0.5。
實驗例8：本發明之免疫檢測套組對豬水疱病毒抗體之特異性測試
六個抗豬水疱病毒UKG/27/72病毒株的豬隻血清，經本發明之免疫檢測套組檢測後，其結果呈現陰性反應。其結果顯示，本發明之檢測試劑套組對於豬水疱病抗血清不會產生非特異性反應，故對其不具特異性辨識能力，即具有抗體區別診斷的效果。
以上所述僅為本發明較佳實施例而已，並非用以限定本發明申請專利權利；同時以上的描述對於熟知本技術領域之專門人士應可明瞭與實施，因此其他未脫離本發明所揭示之精神下所完成的等效改變或修飾，均應包含於下述之申請專利範圍。
10‧‧‧固相載體
11‧‧‧單株抗體
12‧‧‧樣本抗原
13‧‧‧待測檢體
14‧‧‧偵測抗體
15‧‧‧訊號產生物質
16‧‧‧受質
第1圖，為Sandwich ELISA方法之解析圖。
<110> 行政院農業委員會家畜衛生試驗所
<120> 口蹄疫融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的ELISA檢測試劑及套組
<160> 2
<210> 1
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經聚合酶連鎖反應自口蹄疫病毒O/TAW/99病毒株基因體其3ABC基因區域增幅所得之的核酸片段，相當於GenBank accession No.AJ539137之第5595號至第6119號核苷酸區域
<400> 1
<210> 2
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：1經pET vector載體表現所得之多胜肽
<400> 2
10‧‧‧固相載體
11‧‧‧單株抗體
12‧‧‧樣本抗原
13‧‧‧待測檢體
14‧‧‧偵測抗體
15‧‧‧訊號產生物質
16‧‧‧受質

Claims (40)

  1. 一種融合瘤細胞株，其寄存編號為BRBC 960397，係由一親代細胞與一骨髓瘤細胞融合而製成，該親代細胞係由一原核細胞所表現之一口蹄疫病毒O/TAW/99病毒株之一由3ABC基因片段所編碼之非結構蛋白作為抗原免疫至一小鼠，並將該小鼠體內之一脾臟細胞取出而製成，且該融合瘤細胞株所生產之單株抗體能夠專一性辨識一口蹄疫病毒之該3ABC胜肽，且對於豬水疱病抗血清不會產生非特異性反應。
  2. 如申請範圍第1項之融合瘤細胞株，其生產之該單株抗體同時對O/TAW/97病毒株會產生專一性的結合。
  3. 如申請範圍第2項之融合瘤細胞株，該非結構蛋白3ABC基因片段具有如SEQ ID NO：1之核酸序列。
  4. 如申請範圍第1項之融合瘤細胞株，該小鼠係為一Balb/c品系小鼠。
  5. 如申請範圍第1項之融合瘤細胞株，該原核細胞係為一大腸桿菌。
  6. 如申請範圍第1項之融合瘤細胞株，該單株抗體同時對於O型以外的口蹄疫病毒如血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型及SAT 3型等皆有專一性反應。
  7. 一種單株抗體，其特徵在於該單株抗體係由申請專利範圍第1至6項中任一項之融合瘤細胞株所產生，且對於一口蹄疫病毒之3ABC胜肽具有專一性辨識能力，而對於豬水疱病之抗血清不會產生非特異性反應。
  8. 如申請範圍第7項之單株抗體，其特徵在於該口蹄疫病毒係為血清型O型(O serotype)。
  9. 如申請範圍第8項之單株抗體，其特徵在於該口蹄疫病毒係為O/TWA/99病毒株。
  10. 如申請範圍第7項之單株抗體，其特徵在於該單株抗體對於口蹄疫病毒血清型A型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型或SAT 3型 有交叉反應，即可辨識口蹄疫七種血清型。
  11. 一種免疫檢測試劑，係用於酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)，藉以檢測一待測抗原，其特徵在於該免疫檢測試劑包含有申請專利範圍第8項所述之單株抗體。
  12. 如申請專利範圍第11項之免疫檢測試劑，該待測抗原係為一抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體(anti-3ABC antibody)。
  13. 一種免疫檢測套組，係利用三明治酵素連結免疫吸附試驗檢測待測檢體中的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白之抗體(anti-3ABC antibody)，其特徵在於該免疫檢測套組包含有如申請專利範圍第8項所述之單株抗體及一偵測試劑。
  14. 如申請專利範圍第13項之免疫檢測套組，進一步包含有一樣本抗原，該樣本抗原係衍生自口蹄疫病毒之3ABC胜肽。
  15. 如申請專利範圍第13項之免疫檢測套組，該偵測試劑包含有一偵測抗體及一訊號產生物質。
  16. 如申請專利範圍第15項之免疫檢測套組，該偵測抗體與該訊號產生物質係為共軛結合。
  17. 如申請專利範圍第15項之免疫檢測套組，該訊號產生物質係選自下列所構成的群組之一：放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物、螢光標記物及酵素。
  18. 如申請專利範圍第17項之免疫檢測套組，該冷光標記物係為一化學冷光標記物或一生物冷光標記物。
  19. 如申請專利範圍第17項之免疫檢測套組，該酵素係選自下列所構成的群組之一：過氧化氫酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase；HRP)、鹼性磷酸酶(Alkaline Phospatase；AP)、以及Beta-半乳糖苷酸酶(Beta-galactosidase)。
  20. 如申請專利範圍第19項之免疫檢測套組，進一步包含有一生物素及 一抗生物素蛋白，該生物素係與該偵測抗體連接，且該抗生物素蛋白係與該酵素連接。
  21. 如申請專利範圍第20項之免疫檢測套組，進一步包含有一受質，該受質可與該酵素反應而發生呈色反應。
  22. 如申請專利範圍第13項之免疫檢測套組，進一步包含有一沖洗試劑，該沖洗試劑係選自下列所構成的群組之試劑及其組合：磷酸鹽緩衝溶液(PBS)、三烴甲基胺基甲烷緩衝溶液(TBS)以及Tween 20。
  23. 如申請專利範圍第13項之免疫檢測套組，進一步包含一阻隔試劑，藉以阻隔一固相載體上未結合該單株抗體之位置。
  24. 如申請專利範圍第23項之免疫檢測套組，該固相載體係選自下列所構成的群組之一：微孔盤、微球體、雜交膜、及試紙。
  25. 如申請專利範圍第23項之免疫檢測套組，該阻隔試劑係包含有一蛋白質，該蛋白質係選自下列所組成的群組之試劑及其組合：牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin；BSA)、酪蛋白(Casein)以及動物明膠(Gelatin)。
  26. 如申請專利範圍第23項之免疫檢測套組，該阻隔試劑係為一脫脂牛乳。
  27. 一種免疫檢測方法，係利用一酵素連結免疫吸附試驗法(ELISA)進行檢測，包含有下列步驟：提供一固相載體(Solid phase carrier)；提供一單株抗體，該單株抗體具有申請專利範圍第7項所述之特徵；將該單株抗體施加(Applying)至該固相載體；提供一樣本抗原，該樣本抗原係與該單株抗體進行專一性結合；提供一待測檢體，該待測檢體可操作性地與該樣本抗原進行免疫反應，藉以於該固相載體上形成一免疫複合物；提供一偵測試劑，該偵測試劑可操作性地與該免疫複合物進行免疫 反應，並產生一訊號；以及偵測該訊號。
  28. 如申請專利範圍第27項之免疫檢測方法，該樣本抗原係衍生自口蹄疫病毒之3ABC基因。
  29. 如申請專利範圍第27項之免疫檢測方法，該偵測試劑包含有一偵測抗體與一訊號產生物質。
  30. 如申請專利範圍第29項之免疫檢測方法，該偵測抗體係與該訊號產生物質共軛結合。
  31. 如申請專利範圍第29項之免疫檢測方法，該訊號產生物質係選自下列所構成的群組之一：放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物、螢光標記物及酵素。
  32. 如申請專利範圍第31項之免疫檢測方法，該冷光標記物係為一化學冷光標記物或一生物冷光標記物。
  33. 如申請專利範圍第31項之免疫檢測方法，該酵素係選自下列所構成的群組之一：過氧化氫酶(Hydrogen peroxidase)、辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase；HRP)、鹼性磷酸酶(Alkaline phospatase；AP)、以及Beta-半乳糖苷酸酶(Beta-galactosidase)。
  34. 如申請專利範圍第31項之免疫檢測方法，該訊號產生物質進一步包含有一生物素及一抗生物素蛋白，該生物素係與該偵測抗體連接，請該抗生物素蛋白係與該酵素連接。
  35. 如申請專利範圍第34項之免疫檢測方法，進一步包含有提供一受質之步驟，該受質可與該酵素反應而發生呈色反應。
  36. 如申請專利範圍第27項之免疫檢測方法，進一步包含有提供一沖洗試劑之步驟，該沖洗試劑係選自下列所構成的群組之試劑及其組合：磷酸鹽緩衝溶液(PBS)、三烴甲基胺基甲烷緩衝溶液(TBS)以及Tween 20。
  37. 如申請專利範圍第27項之免疫檢測方法，該固相載體係選自下列所構成的群組之一：微孔盤、微球體、雜交膜、及試紙。
  38. 如申請專利範圍第27項之免疫檢測方法，進一步包含有提供一阻隔試劑(Blocking reagent)之步驟，藉以阻隔該固相載體上未結合該單株抗體之位置。
  39. 如申請專利範圍第38項之免疫檢測方法，該阻隔試劑係包含有一蛋白質，該蛋白質係選自下列所組成的群組之試劑及其組合：牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin；BSA)、酪蛋白(Casein)以及動物明膠。
  40. 如申請專利範圍第38項之免疫檢測方法，該阻隔試劑係為一脫脂牛乳。
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