CN112358544B

CN112358544B - Fmdv a型牛源广谱中和单抗w145及中和抗体竞争elisa检测试剂盒

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Publication number: CN112358544B
Application number: CN202011285447.XA
Authority: CN
Inventors: 曹轶梅; 李坤; 卢曾军; 刘在新; 黄娜娜; 朱国强; 刑向川; 白兴文; 包慧芳; 孙普; 付元芳; 李平花; 马雪青; 张婧; 李冬
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112358544A

Abstract

本发明提供了FMDV A型牛源广谱中和单抗W145及其制备的中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，属于病毒抗体检测技术领域。FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示轻链可变区。单克隆抗体W145在制备中和FMDV A型病毒的试剂中的应用。FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体组合物，包括单克隆抗体W145和单克隆抗体E32，在制备基于直接竞争法检测FMDV A型中和抗体的免疫试剂盒中的应用。该试剂盒的检测结果与病毒微量中和试验结果显著相关，说明该试剂盒可用于血清中和抗体的检测。

Description

FMDV A型牛源广谱中和单抗W145及中和抗体竞争ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于病毒抗体检测技术领域，具体涉及FMDV A型牛源广谱中和单抗W145及中和抗体竞争ELISA检测试剂盒。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以传播迅速、感染率高而著称。该病一旦暴发将会造成巨大的经济损失和社会政治负面影响，国际动物卫生组织(OIE)将该病列为法定上报动物传染病之首，中国政府也将其排在一类动物传染病的首位(谢庆阁,2004)。FMDV有7个血清型，分别为O、A、C、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3。每个血清型中又包含有多个具有地域特征的拓扑型，每个拓扑型中还可分为多个病毒谱系[Samuel AR,Knowles NJ.Foot-and-mouth disease type O viruses exhibitgenetically and geographically distinct evolutionary lineages(topotypes).Journal of General Virology,2001,82(3)：609-621.]。目前我国流行的血清型主要有O型和A型。不同血清型之间不能提供交叉免疫保护，同一血清型内不同拓扑型病毒之间也存在抗原结构的差异，不能对异源毒株提供很好的交叉免疫保护。A型血清型是抗原性变异最大的一个血清型，不同谱系A型FMDV的抗原性变异较大，交叉免疫保护作用较差，给疫苗和诊断制剂研究带来了很大困难。

依据VP1序列差异，FMDV A型分为3个拓扑型，分别是欧洲－南美拓扑型(Euro-SA)、亚洲拓扑型(ASIA)和非洲拓扑型(AFRIC)。我国主要流行亚洲拓扑型(ASIA)东南亚97谱系(SEA97)，包括G1(代表毒株A/WH/CHA/09 FMDV)和G2(代表毒株A/GDMM/CHA/2013FMDV)两个分支。同时，东南亚地区国家还存在A/IRAN/05等较多谱系的A型FMDV，疫情形势复杂，时刻威胁着我国畜牧养殖业的健康发展。目前我国对FMD的预防和控制主要以免疫预防为主的综合防控措施，同时结合免疫抗体检测来评估免疫效果。

OIE推荐体外评估FMD疫苗免疫效果的方法包括病毒中和试验(VNT)、固相竞争ELISA(SPC-ELISA)和液湘阻断ELISA(LPB-ELISA)。病毒中和抗体效价(VN)与攻毒保护能力之间有很好的相关性(

et al,1980,1984；Pay et al,1986；Ahl et al,1990；Pay et al,1992)，比SPC-ELISA与LPB-ELISA更可靠和精确，但需要使用活病毒，因此不能被广泛使用。LPB-ELISA与SPC-ELISA应用灭活的抗原，无需在高安全性实验室内操作。另外，ELISA检测方法灵敏、简单、易于自动化，可检测多种血清样品，且结果具有显著的重复性(Van Maanen et al,1989；Amadori et al,1991)。但是传统的基于兔子和豚鼠多克隆抗体的ELISA特异性较低，假阳性率可高达18％(Haas B.1994.Application of the FMDliquid-phase blocking sandwich ELISA.Problems encountered in import/exportserology and possible solutions.Report of the Session of the Research Groupof the Standing Technical Committee of the European Commission for theControl of Foot-and-Mouth Disease,Vienna,19–22 September 1994,pp.124–127；Mackay DK,Bulut AN,Rendle T,Davidson F,Ferris NP.2001.A solid-phasecompetition ELISA for measuring antibody to foot-and-mouth disease virus.JVirol Methods 97(1-2):33-48.)，且LPB-ELISA耗时较长。目前尚未有关于针对FMDV A型病毒具有广谱中和能力的单克隆抗体内容的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种A型牛源广谱中和单克隆抗体W145，针对FMDV A型内多种病毒株具有中和作用。

本发明的目的还在于提供一种FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，用于疫苗免疫效力的评估。

本发明提供了一种FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145，包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145在制备中和FMDV A型病毒的试剂中的应用。

优选的，所述FMDV A型病毒包括SEA97谱系中G1、G2和AF72疫苗毒株。

本发明提供了一种FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体组合物，包括所述单克隆抗体W145和单克隆抗体E32。

本发明提供了所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体组合物在制备基于直接竞争法检测FMDV A型中和抗体的免疫试剂盒中的应用。

本发明提供了一种FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，以所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145作为检测抗体。

优选的，包被有单克隆抗体E32的酶标板。

优选的，所述检测抗体为生物素标记的单克隆抗体W145时，所述试剂盒还包括100×浓缩辣根过氧化物酶标记的亲和素。

优选的，还包括以下试剂：25倍浓缩洗涤液、1×PBS、TMB底物溶液、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清。

本发明提供的FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145，为FMDV A型型内广谱中和抗体，能够中和SEA97谱系中G1(代表毒株A/WH/CHA/09 FMDV)和G2(代表毒株A/GDMM/CHA/2013 FMDV)两个分支的病毒，也能中和AF72疫苗毒株(A22亚型毒株)。病毒中和试验结果显示，单克隆抗体W145对代表毒株A/WH/CHA/09 FMDV、A/GDMM/CHA/2013 FMDV以及AF72都有中和活性，其IC₅₀分别为0.5μg/mL、1.3μg/mL和3μg/mL。

本发明提供了一种FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，以所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145作为检测抗体，并进一步限定包被有单克隆抗体E32的酶标板。本发明采用的单克隆抗体W145和E32均通过单个B细胞抗体技术获得，该技术获得抗体具有基因多样性好、效率高，全宿主来源等优势，且避免了传统鼠杂交瘤技术复杂的细胞融合筛选流程，可以通过流式细胞仪直接分选抗原特异性单个B细胞，体外表达获得基因工程抗体，克服了杂交瘤细胞不稳定，抗体易丢失的缺点。所获得牛源单克隆抗体E32能与FMDV O型、Asia1型、A型146S抗原反应。单克隆抗体W145为FMDV A型型内广谱中和抗体，能够中和SEA97谱系中G1(代表毒株A/WH/CHA/09 FMDV)和G2(代表毒株A/GDMM/CHA/2013 FMDV)两个分支的病毒，也能中和AF72疫苗毒株(A22亚型毒株)。检测血清中针对不同毒株的中和抗体时，只需更换与毒株相对应的146S抗原，无需更换抗体，应用范围更广。采用本发明提供的检测试剂盒的检测结果与病毒微量中和试验结果显著相关，说明本发明建立的检测中和抗体的竞争ELISA方法可用于血清中和抗体的检测。该试剂盒检测血清操作简单、耗时短，只需1.5小时就可得到结果，具有广泛的开发应用前景。

附图说明

图1为感染动物血清NAC-ELISA与VNT检测结果。

具体实施方式

所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1(QAQLRESGPSLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSTCAVVWVRQTPGKALEWIGRLARDGTTYYNPALKSRLSITKDNSKTRVSLSLSSVTPEDTATYYCGKDVPDYIGYAEEIDVDVWGQGLLVTVSS)所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2(WAQAVLTQPSSVSGSLGQRVSITCSGSSSNVGQGDYVSWFQQIPGSAPRTLIYAATSRASGVPDRFSGSRSGNTATLTIRSFQAEDEADYFCSSPDNSGNAYFGSGTTLTVLG)所示。

在本发明中，所述重链可变区的编码序列的核苷酸序列优选如序列表中SEQ IDNO:3(CAAGCCCAGCTGAGGGAAAGCGGCCCTTCTCTGGTGAAGCCAAGCCAGACTCTCTCTCTGACATGTACAGTCAGCGGCTTTTCTCTGAGCACTTGTGCCGTGGTCTGGGTGAGGCAGACACCCGGCAAGGCTCTGGAATGGATCGGAAGGCTGGCCAGAGATGGCACTACATACTACAACCCAGCCCTCAAGTCTAGGCTGTCCATCACAAAGGACAACTCCAAGACTAGGGTGTCTCTGTCTCTGAGCAGCGTGACACCAGAGGACACTGCCACTTACTACTGCGGCAAGGACGTGCCAGATTATATCGGCTACGCCGAGGAGATCGACGTGGATGTGTGGGGCCAAGGACTGCTGGTCACTGTGAGCTCC)所示；

所述轻链可变区的编码序列的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO:4(TGGGCCCAAGCCGTGCTGACTCAGCCTTCCAGCGTGTCCGGATCTCTGGGACAGAGGGTCTCCATCACTTGTTCCGGCAGCAGCAGCAACGTGGGACAAGGCGATTATGTGAGCTGGTTCCAGCAGATCCCCGGCAGCGCTCCTAGGACTCTGATCTATGCCGCTACTTCTAGGGCCAGCGGAGTGCCAGATAGGTTCAGCGGATCTAGGTCCGGCAACACAGCCACTCTCACTATTAGGAGCTTCCAAGCCGAGGACGAGGCCGACTACTTCTGCAGCAGCCCAGATAATAGCGGCAACGCCTATTTCGGCAGCGGCACAACTCTGACTGTGCTGGGC)所示。

在本发明中，所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145的制备方法，优选包括以下步骤：

①以牛外周血单个核细胞总cDNA为模板，扩增牛抗体重链和轻链的全长序列，得到牛抗体重链和轻链的恒定区序列；

②将单克隆抗体W145重链可变区的编码序列与获得的牛抗体重链恒定区编码序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长重链载体；

③将单克隆抗体W145轻链可变区的编码基因与获得的牛抗体轻链恒定区编码序列构建入表达载体中，得到全牛源单抗的全长轻链载体；

④将所述全牛源单抗的全长重链载体和全牛源单抗的全长轻链载体以1：(1～3)的质量比混合，共转染细胞，取转染细胞培养后取上清，纯化得到全牛源O型口蹄疫病毒广谱中和抗体。本发明对所述制备方法的具体操作均参见公开号CN 108997493 A的专利记载制备方法。

在本发明中，所述单克隆抗体W145能中和多种FMDV A型抗体，例如SEA97谱系中G1(代表毒株A/WH/CHA/09 FMDV)和G2(代表毒株A/GDMM/CHA/2013 FMDV)两个分支的病毒和AF72疫苗毒株。

本发明提供了所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145在制备中和FMDV A型病毒的试剂中的应用。所述FMDV A型病毒优选包括SEA97谱系中G1、G2和AF72疫苗毒株。本发明对所述试剂的种类不做具体限制，采用本领域所熟知的检测病毒用试剂即可。所述试剂中，单克隆抗体W145的浓度针对不同病毒株的IC₅₀值而有所差异，根据单克隆抗体W145对代表毒株A/WH/CHA/09 FMDV、A/GDMM/CHA/2013 FMDV以及AF72的IC₅₀值分别为0.5μg/mL、1.3μg/mL和3μg/mL。

本发明提供了所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体组合物，包括单克隆抗体W145和单克隆抗体E32。所述单克隆抗体W145和单克隆抗体E32的质量比优选为1～10:2～25，更优选为2～7:5～20。

本发明提供了所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体组合物在制备基于直接竞争法检测FMDV A型中和抗体免疫试剂盒中的应用。所述免疫试剂盒采用的免疫技术优选包括免疫层析技术、ELISA技术等。

在本发明中，所述单克隆抗体W145可以作为检测抗体或包被抗体制备竞争ELISA检测试剂盒。本发明对所述试剂盒的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的试剂盒的制备方法即可。

本发明提供了一种FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，以所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145作为检测抗体。生物素标记W145的工作浓度优选为1：3000。所述试剂盒包括优选包被有单克隆抗体E32的酶标板。所述单克隆抗体E32的包被浓度优选为0.5μg/ml。本发明对所述包被单克隆抗体E32的酶标板的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知酶标板包被方法即可。单克隆抗体E32的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列见公开号CN 110642945 A的专利中记载，所述单克隆抗体E32的制备方法参见公开号CN 108997493 A的专利。

在本发明中，当所述检测抗体为生物素标记的单克隆抗体W145时，所述试剂盒优选还包括100×浓缩辣根过氧化物酶标记的亲和素。本发明对所述生物素标记的单克隆抗体W145的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制备方法即可。所述辣根过氧化物酶标记的亲和素的工作浓度优选为1：30000。

在本发明中，所述试剂盒优选还包括以下试剂：25倍浓缩洗涤液、1×PBS、TMB底物溶液、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清。本发明对所述试剂的组分没有特殊限制，采用本领域所熟知的检测试剂盒中试剂的种类即可。

在本发明中，所述FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒的施用方法，优选包括以下步骤：

1)将稀释后的阳性、阴性对照血清及待测血清样品分别加入稀释板的孔中，设4个孔不加血清作为146S抗原对照，每孔60μL；

2)向每孔中加入工作浓度的生物素标记单克隆抗体W145 60μL，轻振混匀；吸取血清稀释板上混合液每孔取100μL加入酶标板，37℃反应1h，用洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；

3)；向每孔加入工作浓度的辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液，37℃作用15min，洗涤5次，最后一次拍干；

4)每孔加入100μL的底物溶液，室温37℃作用10～15min；

5)每孔加终止液100μL，轻振混匀，于10min内用酶标仪读450nm吸光值(OD_450nm)。

在本发明中，血清样本抗体效价判定方法优选如下：146S抗原对照4孔，弃去最高和最低OD_450nm值，计算剩余2孔的平均OD_450nm值，再除以2，即为临界值，表示抑制50％反应的对照OD_450nm值。检测孔OD_450nm值大于临界值为阴性孔，小于为阳性孔。以被检样本阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价。

下面结合实施例对本发明提供的FMDV A型牛源广谱中和单抗W145及其制备的中和抗体竞争ELISA检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

材料说明

碳酸盐缓冲液(Na₂CO₃/NaHCO₃)及BSA购自SIGMA公司。EZ-Link Plus ActivatedPeroxidase试剂盒购自Thermo公司。辣根过氧化物酶标记亲和素为Genscript产品。

对照血清与FMDV A型灭活抗原均由国家口蹄疫参考实验室制备保存。

实施例1

将单克隆抗体W145的重链可变区的编码序列(SEQ ID No.3)和轻链可变区的编码序列(SEQ ID No.4)分别与牛IgG2重链和轻链的恒定区序列连接后分别插入pcDNA3.4真核表达载体中，重链和轻链表达质粒按1:3比例混合转染CHO悬浮培养细胞，表达获得完整IgG2亚型抗体，抗体经亲合层析纯化后得到单克隆抗体W145。

实施例2

将单克隆抗体E32的重链可变区的编码序列(SEQ ID No.5：CAGGTGCAGCTGCGCGAGTCGGGCCCCAGCCTGGTGAAGCCCTCACAGACCCTCTCCCTCACCTGCACGGTCTCTGGATTCTCATTGAGCAACTATGCTCTAAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGCGCTGGAGTGCCTCGGTGGTATAGGCCCTAGCGGACACACGGATTATAATCCGGCCCTGAAATCGCGACTCATTATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAAGTCTCTCTGTCAGTGAGCAGCGTAACACCTGAGGACACGGCCACATACATCTGTGCGAGGGATAGTGGCATTTATGGTACTTCCGGTTGGGGTTGTATTGGTGGTTTTGATGACAACTACATCGATGCCTGGGGCCATGGACTCCTGGTCACCGTCTCCTCA)和轻链可变区的编码序列(SEQ ID No.6：TGGGCCCAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTCCTCCGTGTCCGGCTCCCTGGGCCAGAGGGTCTCCATCACCTGCTCTGGAAGCAGCAACAACATCGGTGCCCATGGTGTGGGCTGGTACCAACAGATCCCAGGATCGGGCCTCAGAACCATCATTTATAACAACAGTAAGCGACCCTCGGGGGTCCCCGACCGATTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACAGCCACCCTGACCATCAGCTCGCTCCAGGCTGGGGACGAGGCGGATTATTTCTGTGCAACTAGTGACTACAGTACTCGTAGTTCTGCTTTCGGCAGCGG GACCACACTGACCGTCCTGGGT)分别与牛IgG2重链和轻链的恒定区序列连接后分别插入pcDNA3.4真核表达载体中，重链和轻链表达质粒按1:3比例混合转染CHO悬浮培养细胞，表达获得完整IgG2亚型抗体，抗体经亲合层析纯化后得到单克隆抗体E32。

实施例3

病毒中和试验检测抗体的中和活性

为了测定全牛源FMDV A型单克隆抗体W145的中和活性，针对FMDV A型SEA97谱系中G1(代表毒株A/WH/CHA/09 FMDV)和G2(代表毒株A/GDMM/CHA/2013 FMDV)两个分支的病毒，以及AF72疫苗毒株(A22亚型毒株)进行了中和试验。具体操作步骤如下：

①在96孔细胞培养板内，以50μL/孔的量用细胞维持液倍比稀释单克隆抗体W145，从1：4稀释至1：512。然后，每孔加入100μL含100 TCID₅₀的FMDV，37℃作用1h。同时设置含有0.1、1、10、以及100个TCID₅₀的对照孔(不加抗体)。

②每孔加入100μL含5×10⁴个BHK21细胞的完全培养基，放入37℃含5％CO₂的培养箱作用48h。

③弃去上清细胞液，加入预冷的固定液(甲醇:丙酮＝1:1)，-20℃固定20 min。

④弃去固定液，每孔加入100μL结晶紫溶液进行染色。30min后，冲洗96孔板，观察50％细胞未病变的抗体浓度(IC₅₀)。使用50μg/mL的IC₅₀值作为中和作用的临界值，将>50μg/mL确定为非中和活性。

病毒中和试验结果显示，单克隆抗体W145对代表毒株A/WH/CHA/09 FMDV)、A/GDMM/CHA/2013 FMDV)，以及AF72都有中和活性，其IC₅₀分别为0.5μg/mL、1.3μg/mL和3μg/mL。

实施例4

包被有捕获抗体的酶标板的制备方法

用包被缓冲液(0.05mol/L pH值9.6碳酸盐缓冲液)稀释单颗粒抗体E32，以0.5μg/mL包被酶标板，4℃过夜，将此酶标板用PBST洗涤3遍，拍干；室温捕获FMDV A型146S抗原2h，用PBST洗涤3遍；用封闭液(含1％BSA和5％蔗糖的PBS溶液)37℃封闭1h，吸弃封闭液，吹干酶标板后，密封2～8℃冷藏保存。

实施例5

生物素标记单克隆抗体W145的制备方法如下：

A1、首先使用截留量100kDa超滤管把单克隆抗体W145置换至PBS缓冲液中。4000rpm离心10min。

A2、取180μL超纯水加入到1mg生物素中，稀释至10mM；分别按1：32、1：64和1：128比例加入生物素，即分别添加1μL、2μL和4μL。

A3、4℃冰上放置2h。

A4、用截留分子量为100kDa的超滤管4000rpm离心10min，用抗体存储缓冲液重悬抗体。

A5、加入等体积100％甘油，-70℃保存。

实施例6

竞争ELISA检测试剂盒的组成及其使用方法

1.试剂盒中组分的组成：

1)每个试剂盒包括5块包被抗体的酶标板，真空密封保存，保存期可达1年；

2)每个试剂盒包括1管(600μL)100×生物素标记单克隆抗体W145；

3)100×浓缩辣根过氧化物酶标记的亲和素(Strep-HRP)：1管(600μL)，为辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素，为购买的商品化试剂(Genscript)，通过将酶标链霉亲和素稀释于抗体保存液(Sigma)中制备，保存期可达1.5年。

4)25倍浓缩洗涤液：2瓶(50mL)，向500mL超纯水中加NaCl 200g、KCl 5g、Na₂HPO₄·12H₂O 72.5g、KH₂PO₄ 5g和12.5mL吐温20，补超纯水定容至1000mL，pH值为7.4，高压灭菌(10pa，15min)，室温存放备用。

5)1×PBS：1瓶(60mL)，向500mL超纯水中加NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O2.9g、KH₂PO₄ 0.2g，补超纯水定容至1000mL，pH值为7.4，高压灭菌(10pa，15min)，室温存放备用。

6)底物溶液：1瓶(60mL)，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液为购买的商品化试剂(BioFX，Freiburg,Germany)，直接分装使用，保存期4年。

7)终止液：1瓶(60mL)，配制0.3M H₂SO₄水溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制得到。

8)阳性对照血清：1管(500μL)，采自FMDV A型感染后1～3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备得到。

9)阴性对照血清：1管(500μL)，采自非免疫健康牛、羊或猪，经检测口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。

10)其他物品：包括一次性封板膜10片与使用说明书1份。

2.检测试剂盒的检测步骤如下：

S1、用PBS将阳性、阴性对照血清及待测血清样品系列稀释(1:4～1:512)于血清稀释板，每孔60μL，设4个孔不加血清作为146S抗原对照。每孔再加入用PBS稀释至工作浓度的生物素标记单抗W145 60μL，轻振混匀。吸取血清稀释板上混合液每孔取100μL加入酶标板，37℃反应1h；

S2、用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；

S3、将100×Strep-HRP 1：100稀释至1×PBST中，加入酶标板，每孔加入100μL，37℃作用15min；

S4、同上洗涤，最后一次拍干；

S5、每孔加入100μL的底物溶液，室温37℃作用10～15min；

S6、加终止液，每孔100μL，轻振混匀，于10min内用酶标仪读450nm吸光值(OD_450nm)；

S7、血清样本抗体效价判定：146S抗原对照4孔，弃去最高和最低OD_450nm值，计算剩余2孔的平均OD_450nm值，再除以2，即为临界值，表示抑制50％反应的对照OD_450nm值。检测孔OD_450nm值大于临界值为阴性孔，小于为阳性孔。以被检样本阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价。

以上试验结果成立需满足以下标准：146S抗原对照OD_450nm值应为1.5±0.5；强阳性对照血清效价应≥1:128；弱阳性对照血清效价应≥1:32；阴性对照血清抗体效价应≤1:16。

实施例7

1.血清样本

健康非免疫牛血清：共102份，经检测O、A、Asia 1型结构蛋白抗体均为阴性，非结构蛋白3ABC抗体阴性。免疫猪血清：共52份，为实验室自制FMDV A型灭活疫苗免疫猪后第21天采血。感染动物血清样品：共36份，为A、B、C三批猪(动物编号分别以1、4和3开头)用不同剂量A型FMDV感染，A组共12份血清为第14天采集，B(10份)和C组(14份)为第10天采集。其中A组和B组大多数动物出现临床症状，而C组只有个别动物出现临床症状。

2.FMDV A型NAC-ELISA方法最佳反应条件的确定

用方阵滴定法测定E32、生物素标记W145、146S抗原、Strep-HRP的工作浓度分别为0.5μg/ml、1：3000、1μg/ml、1：30000。

3.FMDV A型NAC-ELISA操作流程

①包被：用包被缓冲液(0.05mol/LpH值9.6的碳酸盐缓冲液)稀释单抗E32至0.5μg/mL，加入酶标板，每孔加100μL，4℃过夜。将此酶标板用PBST洗涤3遍，拍干。

②抗原捕获：用单抗E32捕获FMDV A型146S抗原，将抗原用PBS稀释至工作浓度(1μg/ml)，每孔100μL加入酶标板，室温反应2h，PBST洗涤3遍，拍干。

③封闭：每孔加封闭液(含1％BSA和5％蔗糖的PBS溶液)100μL，37℃温封闭1h，弃液，吹干保存。

⑤竞争反应：用PBS将阳性、阴性对照血清及待测血清样品系列稀释(1:4～1:512)于血清稀释板，每孔60μL，设4个孔不加血清作为146S抗原对照。每孔再加入用PBS稀释至工作浓度(1：3000)的生物素标记单抗W14560μL，轻振混匀。吸取血清稀释板上混合液每孔取100μL加入酶标板，37℃反应1h，用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干。

⑥加酶标链霉亲和素：用1×PBST将Strep-HRP稀释至工作浓度(1：30000)，每孔100μL加入酶标板，室温反应15min，PBST洗涤5遍，拍干。

⑦加底物显色：每孔100μL加入TMB底物溶液，室温避光反应10～15min。

⑧终止：每孔加入0.3mol/L H₂SO₄使反应终止；用酶标仪测定450nm波长OD值。

⑨计算血清样品抗体效价：146S抗原对照4孔，弃去最高和最低OD_450nm值，计算剩余2孔的平均OD_450nm值，再除以2，即为临界值，表示抑制50％反应的对照OD_450nm值。检测孔OD_450nm值大于临界值为阴性孔，小于为阳性孔。以被检样本阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价。

4.病毒微量中和试验(VNT)

使用FMDV A型对血清样本进行病毒中和实验。具体实验步骤如下：

①在96孔细胞培养板内，以50μL/孔的量用细胞维持液倍比稀释待检血清，从1:4稀释至512。然后，每孔加入100μL含100 TCID₅₀的FMDV，37℃作用1h。同时设置含有0.1、1、10、以及100个TCID₅₀的对照孔(不加血清样本)。

②每孔加入100μL含5×10⁴个BHK₂₁细胞的完全培养基，放入37℃含5％CO₂的培养箱作用48h。

③弃去上清细胞液，加入预冷的固定液(甲醇:丙酮＝1:1)，-20℃固定20min。

④弃去固定液，每孔加入100μL结晶紫溶液进行染色。30min后，冲洗96孔板，观察50％细胞未病变的血清最大稀释度。以血清最大稀释度来代表病毒中和抗体滴度值。

5.结果

5.1健康非免疫动物血清检测结果

用本发明建立的NAC-ELISA操作方法对102份非免疫健康动物血清进行检测，结果93份血清抗体效价＜1:8，4份血清抗体效价为1:8，3份血清抗体效价为1:16，2份血清抗体效价＞1:32。若以1:32为阴阳性检测的临界值，该方法的特异性为98％。

5.2免疫动物血清检测结果

用NAC-ELISA操作流程对52份实验室自制FMDV A型灭活疫苗免疫一次的猪血清进行检测，并用病毒中和试验对该血清进行检测，结果见表1。免疫一次只有个别猪产生了较低水平的中和抗体，两种方法检测结果基本一致。采用Pearson系数检验确定VNT与本发明中所述的NAC-ELISA结果之间的相关性，当p<0.05时，认为有统计学意义。相关系数计算采用GraphPad Prism 6.0(San Diego,CA,USA)软件。统计结果表明，NAC-ELISA检测结果与VNT结果显著相关(p＜0.0001，R²＝0.3619)，r值为0.6016。

表1免疫动物血清NAC-ELISA与VNT检测结果

5.3 FMDV A型感染动物血清检测结果

用本发明建立的NAC-ELISA方法对36份A型FMDV感染猪血清进行检测，同时用VNT对该血清进行检测验证，结果见图1。A组动物中除了2头(120和176)未发病的猪以外，其余猪均产生了较高水平的中和抗体，NAC-ELISA效价均≥64(第14天采血)；B组猪NAC-ELISA效价均≥32(第10天采血)；而C组中只有发病的几头猪产生了抗体，未发病的猪用NAC-ELISA检测未检测到抗体。用VNT对上述血清进行检测验证，将2种方法检测结果进行相关性分析，分析表明，NAC-ELISA检测结果与VNT检测结果显著相关(p＜0.0001，R²＝0.6623)，r＝0.8138。

综上所述，免疫和感染动物血清检测结果均表明，NAC-ELISA检测结果与中和试验结果显著相关(p＜0.0001，R²＞0.3)，说明本发明建立的检测中和抗体的竞争ELISA方法可用于血清中和抗体的检测。该试剂盒检测血清操作简单、耗时短，只需1.5小时就可得到结果，具有广泛的开发应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> FMDV A型牛源广谱中和单抗W145及中和抗体竞争ELISA检测试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Ala Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Cys

20 25 30

Ala Val Val Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Leu Ala Arg Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Thr Arg Val Ser Leu

65 70 75 80

Ser Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly

85 90 95

Lys Asp Val Pro Asp Tyr Ile Gly Tyr Ala Glu Glu Ile Asp Val Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Leu Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Ala Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu

1 5 10 15

Gly Gln Arg Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly

20 25 30

Gln Gly Asp Tyr Val Ser Trp Phe Gln Gln Ile Pro Gly Ser Ala Pro

35 40 45

Arg Thr Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Arg

65 70 75 80

Ser Phe Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Pro Asp

85 90 95

Asn Ser Gly Asn Ala Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly

<210> 3

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagcccagc tgagggaaag cggcccttct ctggtgaagc caagccagac tctctctctg 60

acatgtacag tcagcggctt ttctctgagc acttgtgccg tggtctgggt gaggcagaca 120

cccggcaagg ctctggaatg gatcggaagg ctggccagag atggcactac atactacaac 180

ccagccctca agtctaggct gtccatcaca aaggacaact ccaagactag ggtgtctctg 240

tctctgagca gcgtgacacc agaggacact gccacttact actgcggcaa ggacgtgcca 300

gattatatcg gctacgccga ggagatcgac gtggatgtgt ggggccaagg actgctggtc 360

actgtgagct cc 372

<210> 4

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgggcccaag ccgtgctgac tcagccttcc agcgtgtccg gatctctggg acagagggtc 60

tccatcactt gttccggcag cagcagcaac gtgggacaag gcgattatgt gagctggttc 120

cagcagatcc ccggcagcgc tcctaggact ctgatctatg ccgctacttc tagggccagc 180

ggagtgccag ataggttcag cggatctagg tccggcaaca cagccactct cactattagg 240

agcttccaag ccgaggacga ggccgactac ttctgcagca gcccagataa tagcggcaac 300

gcctatttcg gcagcggcac aactctgact gtgctgggc 339

<210> 5

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggtgcagc tgcgcgagtc gggccccagc ctggtgaagc cctcacagac cctctccctc 60

acctgcacgg tctctggatt ctcattgagc aactatgctc taaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg cgctggagtg cctcggtggt ataggcccta gcggacacac ggattataat 180

ccggccctga aatcgcgact cattatcacc aaggacaact ccaagaacca agtctctctg 240

tcagtgagca gcgtaacacc tgaggacacg gccacataca tctgtgcgag ggatagtggc 300

atttatggta cttccggttg gggttgtatt ggtggttttg atgacaacta catcgatgcc 360

tggggccatg gactcctggt caccgtctcc tca 393

<210> 6

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggcccagg ctgtgctgac tcagccgtcc tccgtgtccg gctccctggg ccagagggtc 60

tccatcacct gctctggaag cagcaacaac atcggtgccc atggtgtggg ctggtaccaa 120

cagatcccag gatcgggcct cagaaccatc atttataaca acagtaagcg accctcgggg 180

gtccccgacc gattctccgg ctccaagtct ggcaacacag ccaccctgac catcagctcg 240

ctccaggctg gggacgaggc ggattatttc tgtgcaacta gtgactacag tactcgtagt 300

tctgctttcg gcagcgggac cacactgacc gtcctgggt 339

Claims

1.一种FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体W145在制备中和FMDV A型病毒的试剂中的应用，所述FMDV A型病毒包括SEA97谱系中G1和G2以及AF72疫苗毒株。

3.一种FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体组合物，其特征在于，包括权利要求1所述单克隆抗体W145和单克隆抗体E32，

所述单克隆抗体E32包括重链可变区HV1和轻链可变区LV1，所述重链可变区HV1的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述轻链可变区LV1的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

4.权利要求3所述FMDV A型牛源广谱中和单克隆抗体组合物在制备基于直接竞争法检测FMDV A型中和抗体的免疫试剂盒中的应用。

5.一种FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，以权利要求1所述FMDVA型牛源广谱中和单克隆抗体W145作为检测抗体。

6.根据权利要求5所述FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括包被有单克隆抗体E32的酶标板；

所述轻链可变区LV1的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

7.根据权利要求5或6所述FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体由生物素标记时，所述试剂盒还包括100×浓缩辣根过氧化物酶标记的亲和素。

8.根据权利要求7所述FMDV A型中和抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂：25倍浓缩洗涤液、1×PBS、TMB底物溶液、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清。