CN109682980B - 一种检测口蹄疫病毒o型保护性抗体的试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种检测口蹄疫病毒o型保护性抗体的试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测口蹄疫病毒O型保护性抗体的试剂盒和检测方法，属于免疫学技术领域，所述试剂盒包括以下组分：捕获抗体；检测抗体；生物素；FMDV O型146S抗原；Strep‑HRP；TMB底物；包被缓冲液和封闭液；所述捕获抗体和检测抗体为口蹄疫病毒O型牛源广谱中和抗体。本发明提供的检测试剂盒和方法结合了病毒中和试验和液湘阻断ELISA两种方法的优点，检测方法操作简单，检测结果可靠精确。

Description

一种检测口蹄疫病毒O型保护性抗体的试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及一种检测口蹄疫病毒O型保护性抗体的试剂盒和检测方法。
背景技术
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以传播迅速、感染率高而著称，该病一旦暴发将会造成巨大的经济损失和社会政治负面影响，国际动物卫生组织(OIE)将该病列为法定上报动物传染病之首，中国政府也将其排在一类动物传染病的首位(谢庆阁.口蹄疫.北京：中国农业出版社，2004:1-15.)。FMDV有7个血清型，分别为O、A、C、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3。其中FMDV O型在全球范围内广泛存在，世界FMD参考实验室根据FMDV VP1基因核苷酸序列的差异和流行地域将FMDV O型分为10个拓扑型。我国流行的是中国古典型(Cathay)、中东-南亚型(ME-SA)和东南亚型(SEA)这3个拓扑型。FMDV各血清型间无交叉免疫，同型内的不同亚型间也仅有部分交叉免疫。病后康复或免疫动物仍会感染其它血清型病毒而发病。而同一个地区内不同血清型、不同遗传谱系、不同进化阶段的病毒混杂存在，这严重威胁着我国畜牧业的健康发展。
FMD防控措施主要包括扑杀患病及感染动物、疫苗免疫易感动物、限制动物及其染毒物品移动、消毒灭源、流行病学监测和预警风险分析。在FMD流行的国家，疫情的控制主要依赖于现有的传统灭活疫苗，通过强制性高强度的免疫，逐步减少疫情的发生。口蹄疫(FMD)疫苗效力检测的“金标准”是在靶动物中进行的体内攻毒试验，以确定疫苗的效力。口蹄疫疫苗效力检测每年涉及数以百计的动物，且需要高级别生物安全防范设施(WorldOrganisation for Animal Health.Foot-and-mouth disease.OIE StandardsCommission.Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrialanimals.6th ed.Paris,France:Office International des Epizooties；2008[chapter2.1.5].)。研制一种体外评估疫苗效力的有效方法来替代体内攻毒试验，对FMD的防控、动物福利和生物安全具有重要意义。OIE推荐体外评估FMD疫苗效力的方法包括病毒中和试验和液湘阻断ELISA(LPB-ELISA)。病毒中和抗体效价(VN)与攻毒保护能力之间有很好的相关性(
Figure BDA0001985397980000021
P,VieiraA.Relación de títulos de anticuerposneutralizantes y la protección de bovinos frente al virus de la fiebreaftosa.Bol Cent Panamer Fiebre Aftosa 1980；39–40:51–6.；
Figure BDA0001985397980000022
P,Gomes I,Astudillo VM.Estimación de potencia de vacunas contra la fiebre aftosa deacuerdo con los resultados de pruebas de anticuerpos.Bol CentPanamerFiebreAftosa 1984；49–50:27–30.)，比LPB-ELISA更可靠和精确。LPB-ELISA应用灭活的抗原，无需在高安全性实验室内操作。另外，ELISA检测方法灵敏、简单、易于自动化，可检测多种血清样品，且结果具有显著的重复性(Van Maanen C,Terpstra C.Comparison of aliquid-phase blocking sandwich ELISA and serum neutralization test toevaluate immunity in potency tests of FMDV vaccines.J Immunol Methods 1989；124(1):111–9；Amadori M,Archetti IL,Tollis M,Buonavoglia C,Panina GF.Potencyassessment of foot and mouth disease vaccines in cattle by means of antibodyassays.Biologicals 1991；19:191–6.)。
但是目前对于口蹄疫病毒O型保护性抗体的检测尚没有一种既相关度高，又操作简单、灵敏度和稳定性好的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测口蹄疫病毒O型保护性抗体的试剂盒、检测方法；所述方法结合了病毒中和试验和液湘阻断ELISA两种方法的优点，检测方法操作简单，检测结果可靠精确。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种检测血清中口蹄疫病毒O型保护性抗体的试剂盒，包括以下组分：捕获抗体；检测抗体；生物素；FMDV O型146S抗原；Strep-HRP；TMB底物；包被缓冲液和封闭液；所述捕获抗体和检测抗体为口蹄疫病毒O型牛源广谱中和抗体。
优选的，所述捕获抗体和检测抗体对FMDV O/Mya/98(SEA)、FMDV O/ZK/93(Cathay)和FMDV O/HK/99(ME-SA)的中和效价＞128；液相阻断ELISA效价＜4。
优选的，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液。
优选的，所述封闭液为包括0.8～1.2wt％牛血清白蛋白和4.5～5.5wt％蔗糖的PBS溶液。
优选的，所述试剂盒还包括阴性对照血清和阳性对照血清。
本发明提供了利用所述试剂盒检测血清中口蹄疫病毒O型保护性抗体效价的方法，包括以下步骤：
1)用包被液稀释所述捕获抗体后，进行包被获得包被后的捕获抗体；
2)将所述FMDV O型146S抗原和待检血清结合后与步骤1)中所述包被后的捕获抗体反应获得第一反应复合物；
3)将生物素标记的检测抗体与步骤2)中所述的第一反应复合物进行反应获得第二反应混合物；
4)向所述第二反应混合物中依次添加Strep-HRP和TMB底物后，终止反应，测定反应液的OD450值；若反应液的OD450值大于阻断50％反应的对照OD450值，则待检血清为口蹄疫病毒O型保护性抗体阴性；若反应液的OD450值小于阻断50％反应的对照OD450值，则待检血清为口蹄疫病毒O型保护性抗体阳性。
优选的，所述捕获抗体的包被浓度为1.8～2.2μg/mL；所述生物素标记的检测抗体的使用浓度为0.8～1.2μg/mL。
优选的，所述FMDV O型146S抗原的使用浓度为0.8～1.2μg/mL。
优选的，所述待检血清包括不同比例梯度稀释后的待检血清样品，以呈阳性的待检血清样品的最高稀释倍数作为所述待检血清中抗体的效价。
优选的，所述阻断50％反应的对照OD450值为对照OD450值的平均数的1/2。
本发明的有益效果：本发明提供的检测口蹄疫病毒O型保护性抗体的试剂盒、检测方法以及应用；其中所述捕获抗体和检测抗体均为口蹄疫病毒O型牛源广谱中和抗体，所述捕获抗体和检测抗体能够中和中国流行的Cathay、ME-SA和SEA3个拓扑型中的病毒，因此，本发明所述试剂盒在检测血清中针对不同毒株的中和抗体时，只需更换与毒株相对应的FMDV O型146S抗原，无需更换抗体，操作简单方便。
本发明中，所述检测方法以阻断50％反应的对照OD450值为临界值，检测孔OD450值大于临界值为阴性，小于临界值为阳性。进一步的，本发明以呈阳性的待检血清样品的最高稀释倍数作为所述待检血清中抗体的效价。根据此标准检测健康牛血清，其效价均低于1:8；对免疫牛血清检测，其一免血清效价均大于1:32，二免血清效价均大于1:90，且检测结果与微量细胞中和试验结果显著相关(p＜0.05)。由此可见本发明所述的检测方法的检测结果可靠精确。
综上所述，本发明提供的检测试剂盒和方法结合了病毒中和试验和液湘阻断ELISA两种方法的优点，检测方法操作简单，检测结果可靠精确。
附图说明
图1为实施例1中一免血清不同方法检测结果相关性分析；
图2为实施例1中二免血清不同方法检测结果相关性分析。
具体实施方式
本发明提供了一种检测血清中口蹄疫病毒O型保护性抗体的试剂盒，包括以下组分：捕获抗体；检测抗体；生物素；FMDV O型146S抗原；Strep-HRP；TMB底物；包被缓冲液和封闭液；所述捕获抗体和检测抗体为口蹄疫病毒O型牛源广谱中和抗体。
在本发明中，所述试剂盒包括捕获抗体和检测抗体；所述捕获抗体和检测抗体为口蹄疫病毒O型牛源广谱中和抗体；所述捕获抗体和检测抗体识别不同的抗原表位。在本发明中，所述所述捕获抗体和检测抗体对FMDV O/Mya/98(SEA)、FMDV O/ZK/93(Cathay)和FMDV O/HK/99(ME-SA)的中和效价优选的＞128；所述捕获抗体和检测抗体对FMDV O/Mya/98(SEA)、FMDV O/ZK/93(Cathay)和FMDV O/HK/99(ME-SA)的液相阻断ELISA效价优选的＜4。本发明中，所述捕获抗体和检测抗体能够中和中国流行的Cathay、ME-SA和SEA 3个拓扑型中的病毒，因此，本发明所述试剂盒在检测血清中针对不同毒株的中和抗体时，只需更换与毒株相对应的FMDV O型146S抗原，无需更换抗体，操作简单方便。本发明中，所述捕获抗体和检测抗体具体的制备方法参见中国专利201810929067.1：一种全牛源O型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法。
本发明中，所述试剂盒包括生物素；本发明对所述生物素的来源没有特殊限定采用本领域常规市售生物素即可，在本发明的具体实施例中，所述生物素来源于EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin生物素标记试剂盒；本发明所述生物素用来标记检测抗体，所述标记的方法采用本领域常规生物素标记方法即可，具体的可参见生物素标记试剂盒说明书。
本发明中，所述试剂盒包括FMDV O型146S抗原，本发明对所述FMDV O型146S抗原的具体中药没有特殊限定，根据要检测待检血清中具体毒株的中和抗体而定，例如要检测待检血清中A毒株的中和抗体，此处的FMDV O型146S抗原即为A毒株的146S抗原。
本发明中，所述试剂盒还包括Strep-HRP和TMB底物；本发明对所述Strep-HRP和TMB底物的来源没有特殊要求，采用常规市售的Strep-HRP和TMB底物即可；本发明中，所述Strep-HRP在使用时，优选的进行稀释；所述稀释的比例优选为1：30000；所述稀释用的试剂优选为PBS缓冲液。
本发明中，所述试剂盒还包被缓冲液和封闭液；本发明中，所述包被液优选为碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液的浓度优选为0.05mol/L；所述碳酸盐缓冲液的pH值优选为9.6；本发明中，所述封闭液优选为包括0.8～1.2wt％牛血清白蛋白和4.5～5.5wt％蔗糖的PBS溶液，更优选为包括1.0wt％牛血清白蛋白和5.0wt％蔗糖的PBS溶液。
本发明中，所述试剂盒优选的还包括阴性对照血清和阳性对照血清；所述阳性对照血清抗体效价优选的≧1:32；阴性对照血清抗体效价优选的＜1:8。
本发明提供了利用所述试剂盒检测血清中口蹄疫病毒O型保护性抗体效价的方法，包括以下步骤：1)用包被液稀释所述捕获抗体后，进行包被获得包被后的捕获抗体；2)将所述FMDV O型146S抗原和待检血清结合后与步骤1)中所述包被后的捕获抗体反应获得第一反应复合物；3)将生物素标记的检测抗体与步骤2)中所述的第一反应复合物进行反应获得第二反应混合物；4)向所述第二反应混合物中依次添加Strep-HRP和TMB底物后，终止反应，测定反应液的OD450值；若反应液的OD450值大于阻断50％反应的对照OD450值，则待检血清为口蹄疫病毒O型保护性抗体阴性；若反应液的OD450值小于阻断50％反应的对照OD450值，则待检血清为口蹄疫病毒O型保护性抗体阳性。
在本发明中，用包被液稀释所述捕获抗体后，进行包被获得包被后的捕获抗体。本发明中，所述捕获抗体的包被浓度优选为1.8～2.2μg/mL，更优选为2.0μg/mL；本发明中，所述捕获抗体优选的包被于酶标板上，本发明对所述酶标板的来源和规格没有特殊要求，采用本领域常规市售酶标板即可。本发明中，所述包被的具体操作优选为将稀释后的捕获抗体加入酶标板进行包被；所述加入的量优选为100μL/孔；所述包被的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述包被的时间优选为10～14h，更优选为12h。本发明在所述包被后，优选的包括洗涤步骤；所述洗涤优选的使用PBST溶液洗涤所述酶标板；所述洗涤的次数优选为3～8次，更优选为5次；所述洗涤结束后，优选的将酶标板进行拍干。本发明在所述包被后，还包括封闭步骤；所述封闭具体为将封闭液加入酶标板中进行封闭；所述封闭的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述封闭的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1.0h；所述封闭液的加入量优选为100μL/孔；所述封闭结束后，优选的还包括洗涤步骤；所述洗涤步骤与前述洗涤步骤一致，在此不再赘述。
本发明在所述捕获抗体包被后，将所述FMDV O型146S抗原和待检血清结合后与所述包被后的捕获抗体反应获得第一反应复合液。在本发明中，所述FMDV O型146S抗原和待检血清的结合优选的在血清结合板中进行；所述待检血清优选的包括不同比例梯度稀释后的待检血清样品；所述不同比例梯度稀释优选的为倍比稀释。本发明具体的将所述待检血清以及待检血清稀释液、FMDV O型146S抗原依次添加至血清稀释板中，待检血清以及待检血清稀释液所述添加量优选为60μL/孔，所述FMDV O型146S抗原的添加量优选为60μL/孔；所述FMDV O型146S抗原的使用浓度优选为0.8～1.2μg/mL，更优选为1.0μg/mL；所述结合的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述结合的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1.0h。
本发明在获得所述第一反应复合液后，将所述第一反应复合液与包被后的捕获抗体进行反应获得第一反应混合物。本发明具体实施过程中，将所述第一反应复合液加入上述封闭后的酶标板中；所述第一反应复合液的加入量优选为100μL/孔；所述反应的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述反应的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1.0h。本发明所述反应结束后优选的还包括洗涤步骤；所述洗涤步骤与前述洗涤步骤一致，在此不再赘述。
本发明在获得所述第一反应混合物后，将生物素标记的检测抗体与所述的第一反应复合液进行反应获得第二反应混合物。在本发明中，所述生物素标记的检测抗体的制备优选的采用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素标记试剂盒，具体步骤按照试剂盒说明书记载进行。本发明中，所述生物素标记的检测抗体的使用浓度优选为0.8～1.2μg/mL，更优选为1.0μg/mL。在本发明具体实施过程中，将所述生物素标记的检测抗体添加到酶标板中，所述生物素标记的检测抗体的添加量优选为100μL/孔；所述反应的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述反应的时间优选为10～20min，更优选为15min。本发明在所述反应结束后优选的还包括洗涤步骤；所述洗涤步骤与前述洗涤步骤一致，在此不再赘述。
本发明在获得所述第二反应混合物后，向所述第二反应混合物中依次添加Strep-HRP和TMB底物后，终止反应。本发明中，所述Strep-HRP的添加量优选为100μL/孔；所述Strep-HRP在使用过程中优选的利用PBS进行稀释，所述释浓度的比例优选为1:30000；所述Strep-HRP的反应温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述Strep-HRP的反应时间优选为10～20min，更优选为15min。本发明在所述Strep-HRP反应结束后优选的还包括洗涤步骤；所述洗涤步骤与前述洗涤步骤一致，在此不再赘述。本发明在所述Strep-HRP反应结束后，向酶标板中加入TMB底物进行显色。本发明中，所述TMB底物的加入量优选为100μL/孔；所述显色的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述显色的时间优选为10～15min；所述显色的过程避光。本发明在所述显色结束后，终止反应。所述终止反应优选的采用硫酸溶液；所述硫酸溶液的浓度优选为0.2～0.4mol/L，更优选为0.3mol/L；所述硫酸溶液的加入量优选为100μL/孔。
本发明在所述反应终止后，测定反应液的OD450值；若反应液的OD450值大于阻断50％反应的对照OD450值，则待检血清为口蹄疫病毒O型保护性抗体阴性；若反应液的OD450值小于阻断50％反应的对照OD450值，则待检血清为口蹄疫病毒O型保护性抗体阳性。在本发明中，所述阻断50％反应的对照OD450值优选为对照OD450值的平均数的1/2，在本发明具体实施过程中，对照优选的设置4个平行，所述阻断50％反应的对照OD450值优选的根据以下方法计算获得：弃去4个平行中最高和最低OD450值，计算剩余2个平行的平均OD450值，再除以2。进一步的，本发明还提供了检测呈阳性的待检血清中中和抗体效价的计算方法，具体为：以呈阳性的待检血清样品的最高稀释倍数作为所述待检血清中抗体的效价。在本发明中，所述检测方法获得的检测结果成立需满足以下条件：阴性对照OD450值大于1.0；阳性对照血清效价≥1:32；阴性对照血清抗体效价＜1:8。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1材料与方法
1.1材料
碳酸盐缓冲液(Na2CO3/NaHCO3)、BSA购自SIGMA公司。口蹄疫病毒O型牛源广谱中和抗体捕获抗体和检测抗体为本实验室制备保存(其制备方法参考专利：一种全牛源O型口蹄疫病毒广谱中和抗体的制备方法，申请号：201810929067.1，其中捕获抗体为专利文件中记载的全牛源单抗11，检测抗体为全牛源单抗14)，捕获抗体和检测抗体对FMDV O/Mya/98(SEA)、FMDV O/ZK/93(Cathay)和FMDV O/HK/99(ME-SA)的中和效价均＞128；LPBE效价＜4。FMDV O型146S抗原(O/Mya/98毒株)为本实验室制备保存。
1.2血清样本
健康非免疫牛血清：共126份，经检测O、A、Asia 1型结构蛋白抗体均为阴性，非结构蛋白3ABC抗体阴性。
免疫牛血清：共48份，其中一免血清和二免血清各24份，分别为24头牛每头免疫1ml口蹄疫O型、亚洲1型、A型三价灭活疫苗(金宇保灵生物药品有限公司)后第28天采集，间隔21天用同种疫苗1ml加强免疫后第15天采集。
标准血清：共3份，强阳性血清1份(编号2334)，弱阳性血清1份(编号1217)，阴性血清1份。
1.3全牛源单抗14的生物素标记(Bio-全牛源单抗14)
使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin生物素标记试剂盒(Thermo ScientificTM，产品编号:21335)标记广谱中和抗体全牛源单抗14。操作按试剂盒说明书进行，具体步骤如下：
①首先使用超滤管把表达纯化的全牛源单抗14抗体置换至PBS缓冲液中。
②取180μL超纯水加入到1mg生物素中，稀释至10mM。分别按1：32、1：64和1：128比例加入生物素,即分别添加1μL、2μL和4μL。
③4℃冰上作用2h。
④用截留分子量为50kDa的超滤管4000rpm离心10min，用抗体存储缓冲液重悬抗体。
⑤加入等体积100％甘油，-70℃保存。
1.4检测中和抗体的阻断ELISA最佳反应条件的确定
用方阵滴定法测定全牛源单抗11、Bio-全牛源单抗14、146S抗原、Strep-HRP的工作浓度分别为2μg/ml、1μg/ml、1μg/ml、1：30000。
1.5检测中和抗体的阻断ELISA操作流程
①包被：用包被缓冲液(0.05mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液)稀释全牛源单抗11至工作浓度2μg/ml，加入酶标板，每孔加100μL，4℃过夜。将此酶标板用PBST洗涤5遍，拍干。
②封闭：每孔加封闭液(含1wt％BSA和5wt％蔗糖的PBS溶液)100μL，37℃封闭1h，用PBST洗涤3遍，拍干。
③146S抗原和待测血清结合：用PBS将阳性、阴性对照血清及待测血清样品系列稀释(1:4～1:1024)于血清稀释板，每孔60μL，设4个孔不加血清作为146S抗原对照。每孔再加入用PBS稀释至工作浓度的146S抗原60μL(1μg/ml)，37℃作用1h。
④将③中血清稀释板上混合液每孔取100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBST洗涤5遍，拍干。
⑤与Bio-全牛源单抗14结合：将Bio-全牛源单抗14用PBS稀释至工作浓度1μg/ml，每孔加100μL，37℃反应15min，PBST洗涤5遍，拍干。
⑥加酶：将Strep-HRP用PBS稀释至工作浓度1：30000，每孔加100μL，37℃反应15min，PBST洗涤5遍，拍干。
⑦加底物显色：每孔100μL加入TMB底物溶液，37℃避光反应10～15min。
⑧终止：每孔加入0.3mol/LH2SO4使反应终止。
⑨测定OD值：用酶标仪测定450nm波长OD值。
⑩血清样本抗体效价判定：146S抗原对照4孔，弃去最高和最低OD450nm值，计算剩余2孔的平均OD450值，再除以2，即为临界值，表示阻断50％反应的对照OD450值。检测孔OD450值大于临界值为阴性孔，小于为阳性孔。以被检样本阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价。
以上试验结果成立需满足以下标准：146S抗原对照OD450nm值应大于1.0；强阳性对照血清2334效价应≧1:128；弱阳性对照血清1217效价应≧1:32；阴性对照血清抗体效价应＜1:8。
1.6液相阻断ELISA血清抗体效价
使用FMDV O型液相阻断ELISA(LPB-ELISA)试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所，中国)检测免疫牛血清中总的抗FMDV的IgG抗体，具体操作步骤如下：
①在U型反应板上，以50μL/孔的量用PBST倍比稀释待检血清；在第11列稀释阳性对照血清，从1:2稀释至1:256；同时设置阴性对照血清，从1:2稀释至1:4；设置4孔全病毒对照孔。
②将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL/孔的量加至各孔。封板，振荡37℃温育1.5h。
③将抗原抗体混合物从U型反应板上按次序转移至已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，振荡37℃温育1h。
④用PBST洗板5次，拍干，按50μL/孔加入口蹄疫O型豚鼠抗体工作液(红色)，封板，振荡37℃温育30min。
⑤同上洗板5次，拍干，按50μL/孔加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液(蓝色)，封板，振荡37℃温育30min。
⑥同上洗板5次，拍干。将TMB底物A溶液和B溶液以1:1比例混匀，加入混匀后底物溶液50μL/孔，置37℃显示15min。
⑦显示反应结束后，加入终止液50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。
⑧抗体效价判定：病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低OD450nm值，计算剩余2孔的平均OD450nm值，再除以2，即为临界值，表示阻断50％反应的对照OD450nm值。检测孔OD450nm值大于临界值为阴性孔，小于为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD450nm值相同，则以被检样本阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀释孔OD450nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值，如处于1:64(反对数值为1.8)与1:128(反对数值为2.1)之间，则判定该份样本的抗体效价为1:90(反对数值为1.94)。以上试验结果成立需满足以下标准：病毒抗原对照OD450nm值应大于1.0；阳性对照抗体效价应在1024±1滴度以内；阴性对照血清抗体效价应小于1:8。
1.7病毒微量中和试验
使用FMDV O型(O/Mya/98毒株)对免疫牛血清样本进行病毒中和实验。具体实验步骤如下：
①每孔加入50μL待检血清，在96孔板内进行倍比稀释。然后，每孔加入100μL含100TCID50的FMDV，37℃作用1h。同时设置含有10、100以及1000个TCID50的对照孔(不加血清样本)。
②每孔加入100μL含5×104个BHK21细胞的完全培养基，放入37℃含5％CO2的培养箱作用72h。
③弃去上清细胞液，加入预冷的固定液(甲醇:丙酮＝1:1)，-20℃固定20min。
④弃去固定液，每孔加入100μL结晶紫溶液进行染色。30min后，冲洗96孔板，观察50％细胞未病变的血清最大稀释度。以血清最大稀释度来代表病毒中和抗体(VNA)滴度值。
2结果
2.1健康非免疫牛血清检测结果
用本发明建立的检测中和抗体的阻断ELISA操作方法对126份非免疫健康牛血清进行检测，结果126份血清抗体效价均＜1:8。说明该方法有很高的特异性。
2.2一免牛血清检测结果
用检测中和抗体的阻断ELISA操作流程对24份FMDV灭活疫苗免疫一次牛血清进行检测，并用病毒中和试验、LPB-ELISA对该血清进行检测，结果见表1。采用Pearson系数检验确定病毒中和试验、本发明中所述的检测中和抗体的阻断ELISA方法NA-ELISA与LPB-ELISA结果之间的相关性，p<0.05为有统计学意义。相关系数计算采用GraphPad Prism 6.0(SanDiego,CA,USA)软件。结果见图1。NA-ELISA检测结果与中和试验结果显著相关(p＜0.05)，与LPB-ELISA检测结果无显著相关性(p＞0.05)；另外中和试验结果与LPB-ELISA检测结果也无显著相关性(p＞0.05)。
表1 一免血清抗体检测结果
Figure BDA0001985397980000121
Figure BDA0001985397980000131
2.3二免牛血清检测结果
用本发明建立的检测中和抗体的阻断ELISA操作方法对24份FMDV灭活疫苗免疫二次牛血清进行检测，同时用病毒中和试验、LPB-ELISA对该血清进行检测，结果见表2。将3种方法检测结果进行相关性分析，结果见图2。检测中和抗体的阻断ELISA方法NA-ELISA检测结果与中和试验结果显著相关(p＜0.05)，与LPB-ELISA检测结果也显著相关性(p＜0.05)；但中和试验结果与LPB-ELISA检测结果无显著相关性(p＞0.05)。
表2 二免血清抗体检测结果
Figure BDA0001985397980000132
Figure BDA0001985397980000141
综上所述，一免和二免牛血清检测结果均表明，NA-ELISA检测结果与中和试验结果显著相关(p＜0.05)，说明本发明建立的检测中和抗体的阻断ELISA方法可用于血清中和抗体的检测，具有广泛的开发应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种检测血清中口蹄疫病毒O型保护性抗体的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：捕获抗体；检测抗体；生物素；FMDV O型146S抗原；Strep-HRP；TMB底物；包被缓冲液和封闭液；所述捕获抗体和检测抗体为口蹄疫病毒O型牛源广谱中和抗体；
所述捕获抗体和检测抗体对SEA拓扑型毒株FMDV O/Mya/98、Cathay拓扑型毒株FMDVO/ZK/93和ME-SA拓扑型毒株FMDV O/HK/99的中和效价＞128；液相阻断ELISA效价＜4。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为包括0.8～1.2wt％牛血清白蛋白和4.5～5.5wt％蔗糖的PBS溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照血清和阳性对照血清。
5.利用权利要求1～4任意一项所述的试剂盒检测血清中口蹄疫病毒O型保护性抗体效价的方法，包括以下步骤：
1)用包被液稀释所述捕获抗体后，进行包被获得包被后的捕获抗体；
2)将所述FMDV O型146S抗原和待检血清结合后与步骤1)中所述包被后的捕获抗体反应获得第一反应复合物；
3)将生物素标记的检测抗体与步骤2)中所述的第一反应复合物进行反应获得第二反应混合物；
4)向所述第二反应混合物中依次添加Strep-HRP和TMB底物后，终止反应，测定反应液的OD450值；若反应液的OD450值大于阻断50％反应的对照OD450值，则待检血清为口蹄疫病毒O型保护性抗体阴性；若反应液的OD450值小于阻断50％反应的对照OD450值，则待检血清为口蹄疫病毒O型保护性抗体阳性。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述捕获抗体的包被浓度为1.8～2.2μg/mL；所述生物素标记的检测抗体的使用浓度为0.8～1.2μg/mL。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述FMDV O型146S抗原的使用浓度为0.8～1.2μg/mL。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待检血清包括不同比例梯度稀释后的待检血清样品，以呈阳性的待检血清样品的最高稀释倍数作为所述待检血清中抗体的效价。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述阻断50％反应的对照OD450值为对照OD450值的平均数的1/2。
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