CN101644709A - 快速检测病毒中和抗体的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效的肠道病毒中和抗体的检测方法和试剂盒，该方法可适用于对肠道病毒中和抗体的高通量检测。本发明方法的特征在于用酶联免疫斑点法结合斑点检测仪器来检测被肠道病毒感染的细胞。本发明同时还公开了上述方法在中和性肠道病毒单克隆抗体、检测肠道病毒单克隆抗体的中和效价等方面的用途。

Description

快速检测病毒中和抗体的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒抗体检测领域。更具体地，本发明涉及通过酶联免疫斑点显色和自动扫描仪器，对人肠道病毒中和抗体进行检测的方法和试剂盒。

背景技术

人肠道病毒(Human Enterovirus，EV)包括脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、埃可病毒(entericcytopathogenic human orphan virus，ECHO)和新肠道病毒(Enterovirus 68-71型及73-102型)，其引发的由呼吸系统疾病到中枢神经系统的多种疾病给人类健康带来极大威胁和严重危害，尤其是新肠道病毒EV71引起的手足口病，发病率和死亡率近年呈逐年上升趋势。因此，开发快速的诊断试剂与安全有效的预防或治疗性疫苗具有重大意义。人肠道病毒疫苗研究开发的最重要的指标是人肠道病毒的中和抗体水平，因此建立准确和简便的中和抗体检测方法非常重要。EV大多具有严格的宿主特异性，在体外对EV进行快速高效的组织培养比较困难，并且缺乏合适的动物模型。因此亟待探索开发可及时鉴定或筛选中和抗体和评价疫苗有效性的方法。

到目前为止，已有多种EV中和抗体检测方法，如基于补体结合试验(CFT)的检测方法(Kraft，LM等，实验医学杂志，1950年，92卷：483-497页)、基于间接免疫荧光(IFA)的检测方法(Macwilliam，KM等，临床病理学杂志，1974年，27卷，825-827页)、基于传统中和实验(NT)的检测方法(Melnick，JL等，美国公共卫生协会，1979年，5卷，471-534页)、基于酶联免疫吸附法(ELISA)的检测方法(Bidwell，DE等，Bull.WHO，1976年，54卷，129-139页)等。其中，CFT操作繁杂，影响结果判定的因素较多，且补体结合抗体的特异性较低，因此现在很少使用；IFA虽然特异性较高，但敏感性较低且结果判定受主观因素影响，分析自动化困难，难以满足快速高效筛选中和抗体的需求。

当前检测EV中和抗体的方法主要有两种：(一)NT：是将抗体样品与病毒作用后感染细胞，连续7至10天观察细胞病变情况，再通过肉眼观察并采用CCID50或TCID50方法计算病毒效价，进而评估EV中和抗体对病毒感染的阻断能力；(二)ELISA：一般采用间接ELISA，利用包被的病毒或重组抗原，与为中和抗体的抗体样品结合，再结合生物素标记的第二抗体，然后用酶标亲和素与生物素结合，进行化学酶联显色，再用酶标分析仪获得结果，进而评估EV中和抗体的中和效果。但在实际应用中，上述方法前者实验周期较长，工作量大，人工判定也存在主观误差问题，难于满足快速、高通量的筛选需求；后者敏感性较高，可用于自动化分析，结果判断比较客观，但其特异性取决于抗原制备，不能用于准确检测中和抗体。

因而，本领域迫切需要建立改进的中和抗体检测方法。本发明满足了这一需要和其它需要。

发明概述

本发明的一个目的是提供改进的病毒中和抗体检测方法。优选地，本发明方法具有简单、有效、和/或快速的特点，更优选本发明方法适于进行高通量的检测病毒(特别是肠道病毒)中和抗体。在一个优选实施方案中，本发明结合了酶联免疫斑点显色和斑点扫描仪器，使被病毒特别是人肠道病毒感染的细胞带有区别于正常细胞的标记信号(如颜色信号)，并应用斑点扫描仪器扫描检测斑点的数量来实现对被人肠道病毒感染的细胞的检测，从而构建一种新型高效的用于检测人肠道病毒中和抗体的模式，并将这种模式应用于检测人肠道病毒中和抗体的方法。

常规的酶联免疫斑点法(ELISPOT)(Sedgwick JD，分子生物学方法杂志，2005年，302卷，3-14页)是通过显微镜或ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点进行分析获得结果的一种方法。它是从单细胞水平检测分泌细胞因子(CK)的细胞或分泌抗体的细胞(ASC)，而本发明(即新酶联免疫斑点法)则是从单细胞水平检测感染病毒的细胞，从而间接反映单克隆抗体对病毒感染的阻断能力，最终评判中和抗体的中和效果。

优选地，本发明的肠道病毒中和抗体检测方法简便，快速，避免了传统的CCID₅₀方法实验周期长的问题，因此更适于进行高通量检测。在一个实施方案中，应用本发明的方法和传统的CCID₅₀方法对同一样品进行了对比检测，结果显示二者具有高度的相关性。本发明采用的斑点检测法，优选是一种原位检测的方式。在检测中采用自动化连续检测的斑点检测仪器，可减少传统的CCID₅₀方法检测中肉眼判断细胞病变产生的主观误差，并且能够提高检测的效率。

具体地，本发明涉及了应用酶联免疫反应使被病毒特别是肠道病毒感染的细胞产生颜色标记的方法，和将斑点检测仪器应用于被感染细胞颜色信号标记的识别和检测的方法。本发明还涉及检测病毒中和抗体的方法，包括：应用酶联免疫反应使被病毒特别是肠道病毒感染的细胞产生颜色标记，和将斑点检测仪器应用于被感染细胞颜色信号标记的识别和检测。

一方面，本发明涉及了应用酶联免疫斑点反应使被病毒特别是肠道病毒感染的细胞带有信号标记(如颜色信号)的方法。在一个具体实施方案中，本发明方法包括：通过标记的(如HRP标记的)抗人肠道病毒单克隆抗体与人肠道病毒反应，使被人肠道病毒感染的细胞结合了标记的抗体如酶标抗体，而后者可直接作为信号产生体或间接(如通过催化作用等)导致另外的信号产生体产生可被本发明所述的斑点检测仪器所识别、检测的信号。本发明还提供了另一种可以使被人肠道病毒感染的细胞产生颜色标记的方法，该方法包括：通过抗人肠道病毒单克隆抗体与被人肠道病毒感染的细胞中的人肠道病毒结合，而后再与标记的(如HRP标记的)第二抗体(如GAM-HRP)结合，后者可直接作为信号产生体或间接(如通过催化作用等)导致另外的信号产生体产生可被本发明所述的斑点检测仪器所识别、检测的信号。

另一方面，本发明涉及了将斑点检测仪器应用于检测病毒特别是人肠道病毒中和抗体的方法。斑点检测仪器能够从细胞群体中分辨和测算出具有与正常细胞不同的颜色信号的细胞，并且对该信号进行快速自动的检测。在一个实施方案中，本发明以目前广泛应用于细胞免疫检测实验的仪器Elispot为示例。Elispot具备本发明提出的斑点检测仪器的性能，能够有效地满足本发明的检测方法的需要。目前，还尚未有Elispot用于人肠道病毒中和实验的报道。

本发明还涉及本发明的人肠道病毒中和抗体检测方法在筛选人肠道病毒中和性单克隆抗体中的用途。

本发明还涉及本发明的人肠道病毒中和抗体检测方法在检测人肠道病毒中和抗体效价中的用途。

本发明还涉及本发明的人肠道病毒中和抗体检测方法在制备人肠道病毒中和抗体诊断试剂盒中的用途。

本发明还涉及本发明的人肠道病毒中和抗体检测方法在人肠道病毒疫苗开发和质控中的用途。

本发明还涉及本发明的人肠道病毒中和抗体检测方法在筛选或制备抗人肠道病毒或其相关疾病药物中的用途。

本发明还涉及本发明的人肠道病毒中和抗体检测方法在治疗人肠道病毒感染中的用途。

下面结合附图对本发明进行更详细的说明。从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。

附图说明

图1显示了对EV71病毒感染后的RD细胞进行酶联免疫斑点检测后的显微镜观察结果，被病毒感染的细胞可显示出区别于未被病毒感染的细胞的颜色，未被感染细胞则没有颜色显示出来。

图2显示了应用斑点检测仪器Elispot对被EV71病毒感染并进行酶联免疫斑点反应的细胞的检测结果，被病毒感染的细胞可显示出区别于未被感染的细胞的可被Elispot仪器识别和检测的蓝色斑点，孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数量可显示于图像的左上方。

图3显示了分别应用本发明的方法与传统的TCID₅₀方法对同样的EV71病毒滴度的检测结果的相关性比较。

图4显示了本发明的肠道病毒中和抗体检测方法的示例简图。

图5显示了分别应用本发明的EV71中和抗体检测方法与传统的CCID₅₀中和抗体检测方法对同一经梯度稀释的EV71中和性单克隆抗体12C3的中和效价的检测结果的相关性比较。图6显示了分别应用本发明的EV71中和抗体检测方法与传统的CCID₅₀中和抗体检测方法对同样的肠道病毒患者的急性期血清进行EV71中和抗体效价检测的对比结果。

具体实施方式

除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子生物学、生物化学、免疫学实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规命名和步骤。

一方面，本发明提供检测被病毒(例如人肠道病毒，特别是EV71病毒)感染的细胞(优选培养细胞或细胞系)的方法，该方法包括：(1)使得被病毒感染的细胞带有可检测的信号，而未被病毒感染的细胞不带有该信号；和(2)优选通过应用斑点检测仪器或通过以斑点检测法，检测细胞是否带有该信号。

所述信号优选是能被斑点检测仪器检测到的信号或者适合于斑点检测法检测的信号，例如正常细胞不具有的颜色、荧光、或发光等。所述信号由信号产生体或者标记产生，所述信号产生体或者标记可以是例如酶、蛋白质、荧光物质、化学发光物质、同位素、或稀土元素。

使被病毒感染的细胞带有可检测的信号可以采用多种方法来进行。在一个优选方案中，通过如下方法实现：使检测用病毒抗体(优选标记的如酶标记的检测用病毒抗体)与被感染细胞中的病毒或病毒蛋白特异结合，检测用病毒抗体能够直接产生或间接产生(例如通过显色反应)能够被斑点检测仪器检测的信号。优选采用酶联免疫方法。

在一个优选实施方案中，本发明所述检测被病毒感染的细胞的方法用于检测被病毒感染的细胞的数量，或者用于病毒滴度的确定。

优选地，本发明方法还进一步包括：通过测算带有所述信号的细胞的数量来确定被病毒感染的细胞的数量。

另一方面，本发明还提供检测被病毒(例如人肠道病毒)感染的细胞(优选培养细胞或细胞系)的方法，包括：

(i)使病毒和靶细胞在适合病毒感染靶细胞的条件下接触，之后任选地进行洗涤，之后使所得产物和检测用病毒抗体在适合检测用病毒抗体与病毒或病毒蛋白结合的条件下接触，或者

(ii)使病毒和检测用病毒抗体在适合检测用病毒抗体与病毒或病毒蛋白结合的条件下接触，之后任选地进行洗涤，之后使所得产物和靶细胞在适合病毒感染靶细胞的条件下接触，或者

(iii)使病毒、检测用病毒抗体和靶细胞同时在适合病毒感染靶细胞且适合检测用病毒抗体与病毒或病毒蛋白结合的条件下接触；

所述方法优选还进一步包括：检测靶细胞中特异性结合的检测用病毒抗体，或者检测靶细胞中包含特异性结合的检测用病毒抗体的细胞或其数量。

本发明所述检测用病毒抗体优选是特异结合病毒或者病毒蛋白(特别是病毒表面蛋白)的抗体，优选是单克隆抗体，也优选是在病毒感染靶细胞后在靶细胞中表达的病毒蛋白的特异性抗体。所述检测用病毒抗体可以带有标记的或者未带有标记的，优选是酶标记的。所述检测用病毒抗体可以直接产生或间接产生(例如通过显色反应)能够被斑点检测仪器检测的信号。优选地，本发明方法还进一步包括：通过测算带有所述信号的细胞的数量来确定被病毒感染的细胞的数量。

在本发明方法的优选实施方案中，斑点检测法获得的检测数据通过斑点检测仪器获得。所用斑点检测仪器优选能够用于分辨和测算细胞群中产生特定信号(例如颜色)的细胞的数量，优选是Elispot。

在本发明中，优选地，所述检测用病毒抗体是酶标抗体，此时，本发明方法还包括：通过检测酶的存在来检测被感染细胞或其数量。

在另一个实施方案中，本发明所述检测用病毒抗体是未标记的，本发明方法还包括：使第二抗体和靶细胞中可能存在的、特异结合的检测用病毒抗体结合，第二抗体是标记的(优选酶标记的)，并检测包含特异性结合的第二抗体的细胞或其数量。

优选地，作为标记的酶是可以直接或间接产生能够被斑点检测仪器检测的信号的酶。

另一方面，本发明还提供一种检测样品中的病毒(例如人肠道病毒)中和抗体的方法，包括：使样品中可能存在的病毒中和抗体与病毒结合以阻断病毒对靶细胞的感染，并应用本发明检测被病毒感染的细胞的方法检测被病毒感染的细胞，由此检测样品中的病毒中和抗体。

在一个具体实施方案中，检测样品中的病毒中和抗体的方法用于检测样品中病毒中和抗体的存在与否和/或其效价。

在本发明方法的优选实施方案中，斑点检测法获得的检测数据通过斑点检测仪器获得。所用斑点检测仪器优选能够用于分辨和测算细胞群中产生特定信号(例如颜色)的细胞的数量，优选是Elispot。

在本发明中，优选地，所述检测用病毒抗体是酶标抗体，此时，本发明方法还包括：通过检测酶的存在来检测被感染细胞或其数量。

在另一个实施方案中，本发明所述检测用病毒抗体是未标记的，本发明方法还包括：使第二抗体和靶细胞中可能存在的、特异结合的检测用病毒抗体结合，第二抗体是标记的(优选酶标记的)，并检测包含特异性结合的第二抗体的细胞或其数量。

优选地，作为标记的酶是可以直接或间接产生能够被斑点检测仪器检测的信号的酶。

另一方面，本发明提供一种通过酶联免疫斑点反应高通量检测被病毒特别是肠道病毒感染的细胞或其数量的方法。

在一个实施方案中，可以通过应用斑点检测仪器检测被病毒如EV71病毒感染的细胞所具有，而未被感染的细胞不具有的信号来检测被病毒如EV71病毒感染的细胞或其数量。

本发明还提供一种高通量检测被肠道病毒例如EV71病毒或其他肠道病毒感染的细胞及其数量的方法，包括：(1)使被EV71病毒或其他肠道病毒感染的细胞带有可被斑点检测仪器检测的信号，而未被感染的细胞不具有此信号；和(2)通过应用斑点检测仪器检测此信号(或带有此信号的细胞)来检测被EV71病毒或其他肠道病毒感染的细胞及其数量。

在一个具体实施方案中，使被EV71病毒或其他肠道病毒感染的细胞带有可被斑点检测仪器检测的信号是通过如下方法获得的：通过酶标抗体与病毒蛋白结合，该酶标抗体可以直接或间接产生(例如通过显色反应)能够被斑点检测仪器检测的信号。

在一个具体实施方案中，其中可用于间接产生信号的酶标抗体可以是标记的(如HRP标记的)的第一抗体(肠道病毒单克隆抗体)或与第一抗体特异结合的标记的第二抗体(例如GAM-HRP)，优选酶标记的第一抗肠道病毒抗体。其中所述的酶包括可以直接或间接产生能够被斑点检测仪器检测的信号的酶(如HRP)。

优选地，本发明检测被感染细胞的方法用于被EV71病毒或其他肠道病毒感染的细胞的计数。因此，本发明还提供一种高通量检测被EV71病毒或其他肠道病毒感染的细胞的数量的方法。

所述细胞通常是培养细胞。

本发明还提供一种采用斑点检测法检测样品中的肠道病毒中和抗体的方法。

本发明还提供一种通过使样品中可能存在的肠道病毒中和抗体与肠道病毒接触以阻止肠道病毒感染细胞(通常是培养细胞)，并通过检测被肠道病毒感染的细胞，来检测样品中的肠道病毒中和抗体的方法，其特征在于：应用酶联免疫斑点法结合斑点检测法高通量检测被肠道病毒感染的细胞或其数量，或者应用本发明检测被病毒感染的细胞的方法来检测被肠道病毒感染的细胞或其数量。

在一个实施方案中，可以通过应用斑点检测仪器检测被感染的细胞所具有(未被感染的细胞不具有)的颜色信号来检测被肠道病毒(如EV71)感染的细胞及其数量。

在一个具体实施方案中，所述的高通量检测被肠道病毒感染的细胞及其数量应用如下方法来进行，所述方法包括：(1)使被肠道病毒(如EV71)感染的细胞带有适于斑点检测仪器检测的信号，但未被感染的细胞不带有该信号；和(2)通过使用斑点检测仪器检测该信号(或带有该信号的细胞)来检测被肠道病毒(如EV71)感染的细胞。

另一方面，本发明涉及一种快速、高效、更适用于进行高通量检测的肠道病毒中和抗体检测方法，可用于检测样品中是否存在肠道病毒中和抗体，也可用于评价样品中肠道病毒中和抗体的效价。在本发明的具体实施方案中，作为示例，本发明的肠道病毒中和抗体检测方法被应用于检测EV71中和抗体，也可以应用于检测其他肠道病毒的中和抗体，所述肠道病毒的例子是如CA16，CB3，CA6，或CA4等。

在本发明所述方法中，所述样品为来自待检个体的分离的生物学样品，优选所述样品为血清；或来自组织培养的生物学样品。

所述肠道病毒中和抗体检测方法可用于检测样品中肠道病毒中和抗体的存在与否和/或其效价。

在本发明中，所述的斑点检测法中的检测数据优选是通过使用斑点检测仪器获得的。斑点检测仪器能够从细胞群体中分辨和测算产生特定信号(例如颜色)的细胞的数量，优选Elispot。斑点检测仪器(如Elispot)可以通过检测带有由信号产生体直接或间接产生的信号的细胞来检测被病毒感染的细胞的数量。

在一个具体实施方案中，使被病毒感染的细胞产生能够被斑点检测仪器检测的信号是通过如下方法获得的：通过酶标抗体与病毒蛋白结合，该酶标抗体可以直接产生或间接产生(例如显色反应)能够被斑点检测仪器检测的信号。

另一方面，本发明还涉及检测样品中的病毒(例如人肠道病毒)中和抗体的方法，其包括以下步骤：

(a)提供病毒和作为病毒感染靶细胞的培养于固相培养载体(例如细胞培养皿、细胞培养板等，优选多孔细胞培养板，更优选96孔细胞培养板)上的细胞；所述细胞一般为动物细胞，优选哺乳动物细胞，其能在病毒感染后表达病毒的蛋白；所述病毒根据待检测的病毒中和抗体所属的病毒型别来选择，一般是待检病毒中和抗体所针对的病毒；

(b)将待检样品与步骤(a)中所述的病毒接触，使得样品中可能存在的病毒中和抗体与病毒结合，以致能够阻止病毒对步骤(a)中所述的靶细胞的感染；其中该接触在允许样品中的中和抗体与病毒结合的条件下进行，

(c)使步骤(b)的产物(样品与病毒的混合液)与步骤(a)中所述的培养于固相培养载体上的靶细胞接触，该接触在允许细胞正常生长的条件下进行；之后任选地进行洗涤；

(d)用固定液固定步骤(c)所获得的细胞，固定条件应使细胞保持原有的形态；固定液可为多聚甲醛和/或戊二醛等，优选0.2％戊二醛；之后任选地进行洗涤；

(e)用通透液透化处理步骤(d)所获得的细胞，以便加强细胞膜的通透性，使得以下操作中所加入的抗体能够进入细胞；所述通透液优选1％Triton X-100；之后优选地(使用例如PBST)进行洗涤；

(f)使步骤(e)所获得的细胞和能与病毒或病毒蛋白特异性结合的检测用病毒抗体接触，使得可能存在的被病毒吸附和/或感染的细胞中的病毒颗粒或者病毒蛋白与检测用病毒抗体结合；检测用病毒抗体可以带有标记(优选酶)或者不带有标记；之后优选地(使用例如PBST)进行洗涤；

(g)检测步骤(f)获得的细胞中可能存在的、特异性结合的检测用病毒抗体，或者检测步骤(f)获得的细胞中可能存在的、包含特异性结合的检测用病毒抗体的细胞或其数量。所述检测优选通过斑点检测仪器(如Elispot)来进行。更优选的是，所述检测包括：通过应用斑点检测仪器，检测步骤(f)获得的细胞中带有由特异性结合的检测用病毒抗体直接或者间接产生的信号的细胞，来检测被感染细胞的数量。

在一个优选实施方案中，所述检测用病毒抗体是酶标记的。在该实施方案中，优选地，步骤(g)中所述的检测包括：将步骤(f)获得的细胞和酶的底物接触，由此直接或者间接产生可被优选斑点检测仪器检测的信号，并优选通过斑点检测仪器检测存在该信号的细胞或其数量。

在另一个优选实施方案中，所述检测用病毒抗体是未标记的。在该实施方案中，优选地，步骤(g)中所述的检测包括：将步骤(f)获得的细胞和带有标记(优选酶标记的)的第二抗体在允许第二抗体和检测用病毒抗体特异结合的条件下接触，并检测获得的细胞中可能存在的、特异性结合的第二抗体，或者可能存在的、包含特异性结合的第二抗体的细胞或其数量。

在一个优选实施方案中，所述第二抗体是酶标记的。在该实施方案中，优选地，特异性结合的第二抗体或者包含特异性结合的第二抗体的细胞的检测包括：将获得的细胞和酶的底物接触，由此直接或者间接产生可被优选斑点检测仪器检测的信号，并优选通过斑点检测仪器检测存在该信号的细胞或其数量。

在一个优选实施方案中，本发明方法所用的检测用病毒抗体或者第二抗体是酶标记的。在该实施方案中，优选地，与靶细胞中病毒或者病毒蛋白特异性结合的检测用病毒抗体或者包含特异性结合的检测用病毒抗体的细胞，或者与检测用病毒抗体特异性结合的第二抗体或者包含特异性结合的第二抗体的细胞，通过如下方法来检测：使所述酶与该酶的底物接触，发生酶促颜色反应，由此产生颜色，并优选应用斑点检测仪器确定带有该颜色的细胞的数量。细胞是否被病毒感染的判断标准是细胞是否带有该颜色。而且，优选地，本发明方法还进一步包括：通过测算带有颜色的细胞的数量来确定被病毒感染的细胞的数量。

在一个优选实施方案中，所述检测用病毒抗体或者第二抗体所带的标记是酶、荧光物质、化学发光物质、同位素、或稀土元素。

在一个具体实施方案中，本发明提供一种病毒如肠道病毒中和抗体检测方法，该方法包括以下步骤：

a)将细胞培养于固相培养载体(例如细胞培养皿、细胞培养板等，优选细胞培养板，更优选96孔细胞培养板)上，作为肠道病毒感染的靶细胞，所述细胞为动物细胞，优选哺乳动物细胞，其可在肠道病毒感染后表达肠道病毒的蛋白；

b)根据所需要检测的肠道病毒中和抗体的肠道病毒型别，准备需要的肠道病毒；

c)将待检测样品与步骤b)中所述的肠道病毒接触，使得其中的肠道病毒中和抗体，如果存在的话，与肠道病毒结合，从而阻止肠道病毒对步骤a)中所述的靶细胞的感染。该接触在允许中和抗体与肠道病毒结合的条件下进行，如37℃放置1小时；

d)使步骤c)的产物(样品与肠道病毒的混合液)与步骤a)中所述的靶细胞接触，该接触条件在允许细胞的正常生长的条件下进行，如37℃，CO2培养箱中培养14小时；

e)应用斑点检测仪器(如Elispot)检测带有特定信号(例如颜色)的细胞，来检测被感染细胞的数量，其包括以下步骤：

i.固定液处理步骤d)的待检测细胞，固定液可为多聚甲醛，和/或戊二醛等，固定条件应使细胞在以下操作中保持原有的形态，并保护病毒颗粒的蛋白构象不被破坏，优选0.2％戊二醛；

ii.通透液处理步骤i)中的待检测细胞，通透条件应加强细胞膜的通透性，使得以下操作中的所加入的抗体可以进入细胞，优选1％Triton X-100；

iii.提供带有标记(优选酶)的可以与肠道病毒特异性结合的第一抗体；或者可以与肠道病毒特异性结合的第一抗体和可以与第一抗体结合的带有标记(优选酶)的第二抗体(例如GAM-HRP)。优选带有标记优选酶的肠道病毒特异性抗体；

iv.使步骤ii)的待检测细胞与带有标记的肠道病毒特异性抗体/肠道病毒特异性抗体接触，使得被病毒吸附、感染的细胞上的病毒颗粒捕获带有标记的肠道病毒特异性抗体/肠道病毒特异性抗体，形成肠道病毒-带有标记的第一抗体/肠道病毒-第一抗体结合物。待检测细胞与带有标记的第一抗体/第一抗体的接触在允许其形成结合物的条件下进行，如37℃放置1小时；

v.若被结合的为肠道病毒特异性抗体(未标记的)，则将步骤iv)中的肠道病毒-第一抗体结合物与带有标记的第二抗体接触，使形成肠道病毒-第一抗体-带有标记的第二抗体结合物，该接触在允许肠道病毒-第一抗体和带有标记的第二抗体形成结合物的条件下进行，如37℃放置0.5小时；

vi.检测被结合的带有标记的肠道病毒特异性抗体或者带有标记的第二抗体或其量，优选包括如下步骤：通过显色液(如TMB显色液)使标记(优选酶例如HRP)(直接或间接)产生能够被斑点检测仪器识别及检测的信号例如颜色信号。细胞是否被病毒感染的判断标准是细胞是否有由标记产生的信号。通过测算产生信号的细胞的数量来判断被病毒感染的细胞的数量；

vii.应用斑点检测仪器(如Elispot)，通过检测带有由标记(优选酶例如HRP)直接或间接产生的信号优选颜色信号的细胞，检测被感染细胞的数量。细胞是否被病毒感染的判断标准是细胞是否有由标记产生的信号。通过测算产生信号的细胞的数量来判断被病毒感染的细胞的数量。

f)根据步骤e)所得的结果测算样品中是否含有肠道病毒中和抗体和/或其效价。

在一个优选实施方案中，a)中所述的细胞在被b)中所述的肠道病毒感染后，通过酶联免疫反应可以使酶直接产生或间接(例如通过显色反应)产生能够被斑点检测仪器检测的信号。

步骤a)中所述的细胞为动物细胞，优选哺乳动物细胞。该细胞可以被肠道病毒感染，并表达肠道病毒蛋白。

步骤e)应用斑点检测仪器(如Elispot)检测被病毒感染的细胞的数量通过如下方法进行：细胞被如肠道病毒感染后，通过酶联免疫斑点法使肠道病毒与标记(如带有标记的抗体)结合，标记通过直接反应或间接反应(如显色反应)产生可以被斑点检测仪器所识别并检测的信号。细胞是否被感染的判定标准是细胞是否具有由标记产生的信号；检测具有由标记产生的信号的细胞的数量。

本发明的方法中，标记产生的信号可为颜色信号，可使细胞产生与正常细胞不同的颜色，该颜色信号可被斑点检测仪器(如Elispot)所检测。

本发明的方法中，标记可以是任何能够使细胞产生可被斑点检测仪器(如Elispot)检测的信号的物质，例如可以是酶、蛋白质、化学发光物质、同位素、或稀土元素。

在本发明所述的方法的一个具体实施方案中，涉及了对病毒例如肠道病毒的效价进行鉴定的方法。在一个具体实施方案中，本发明还涉及应用本发明的肠道病毒中和抗体检测方法筛选肠道病毒中和性单克隆抗体的方法。在一个具体实施方案中，本发明还涉及应用本发明的肠道病毒中和抗体检测方法检测肠道病毒中和抗体效价的方法。本发明的肠道病毒中和抗体检测方法可用于制备肠道病毒中和抗体诊断试剂盒。

本发明还提供筛选病毒例如人肠道病毒中和性单克隆抗体的方法，该方法包括：根据本发明检测病毒中和抗体的方法，检测候选抗体是否是病毒中和抗体。

本发明还提供检测病毒中和抗体效价的方法，包括：根据本发明的病毒中和抗体检测方法，确定病毒中和抗体效价。

本发明还提供确定病毒疫苗的有效性或效价的方法，包括：根据本发明检测病毒中和抗体的方法，确定所述疫苗免疫动物后获得的抗血清或者抗体中病毒中和抗体存在与否或其效价。

本发明还提供诊断患者是否感染病毒的方法，包括：根据本发明的病毒中和抗体检测方法，确定来自患者的样品例如血清中病毒中和抗体存在与否或其效价。

本发明还提供诊断患者是否患有所述病毒感染引起的疾病(例如手足口病)的方法，包括：根据本发明的病毒中和抗体检测方法，测定来自患者的样品例如血清中病毒中和抗体存在与否或其效价。

另一方面，本发明提供试剂盒，所述试剂盒优选可以用于以下任何一种或者多种用途：可以用于检测被病毒感染的细胞，或者可以用于检测样品中的病毒(例如人肠道病毒，例如肠道病毒EV71)中和抗体或其效价，可以用于筛选病毒例如人肠道病毒中和性单克隆抗体，可以用于确定病毒疫苗的有效性或效价，或者可以用于诊断患者是否感染病毒，或者可以用于诊断患者是否患有病毒感染引起的疾病(例如手足口病)，例如可以用于实施任何本发明检测被病毒感染的细胞的方法或者检测病毒中和抗体的方法，或者实施任何本发明的其它方法。所述试剂盒包含下列项目中的任何一种或多种：

(1)能与病毒或病毒蛋白特异性结合的检测用病毒抗体，其可以是标记的或者未标记的，例如酶标记的，

(2)第二抗体，是能够与抗体如检测用病毒抗体特异结合的抗体，可以是标记的或者未标记的，例如是酶标记的，

(3)病毒，所述病毒一般根据待检测的病毒中和抗体所属的病毒型别来选择，优选是待检病毒中和抗体所针对的病毒；

(4)病毒中和抗体标准品，和/或

(5)细胞，作为病毒感染靶细胞。所述细胞优选培养于固相培养载体(例如细胞培养皿、细胞培养板等，优选多孔细胞培养板，更优选96孔细胞培养板)上。所述细胞一般为动物细胞，优选哺乳动物细胞。所述细胞优选能在病毒感染后表达病毒的蛋白。

在一个实施方案中，所述试剂盒包含：

项目(1)，(2)，(3)，(4)和(5)；或者，

项目(1)，(3)，(4)和(5)和任选的(2)；或者，

项目(1)，(4)和(5)和任选的(2)；或者，

项目(1)，(3)和(5)和任选的(2)；或者，

项目(1)，(3)和(4)和任选的(2)；或者，

项目(3)，(4)和(5)和任选的(2)；或者，

项目(1)和(3)和任选的(2)；或者，

项目(1)和(4)和任选的(2)；或者，

项目(1)和(5)和任选的(2)；或者，

项目(3)和(4)和任选的(2)；或者，

项目(3)和(5)和任选的(2)；或者，

项目(4)和(5)和任选的(2)，

项目(1)，(2)，(3)，(4)和(5)定义同上文在试剂盒中的定义。

上述试剂盒任选地还可以包含：用于固定细胞的固定液；和/或，用于使细胞通透性增加的通透液。

优选地，检测用病毒抗体或者第二抗体是标记的，所述试剂盒优选还包含：使标记显色的试剂。

优选地，检测用病毒抗体或者第二抗体是酶标记的，所述试剂盒优选还包含：酶的底物，或者酶的显色试剂，如显色液。

在一个具体实施方案中，所述试剂盒包含：

(1)能与病毒或病毒蛋白特异性结合的检测用病毒抗体。

在一个优选实施方案中，所述检测用病毒抗体是标记的，例如酶标记的。在另一个实施方案中，所述检测用病毒抗体是未标记的，所述试剂盒优选还包含：

(2)第二抗体，其是能够与抗体如检测用病毒抗体特异结合的抗体，该抗体是标记的，例如是酶标记的。

本发明还提供斑点检测仪器或斑点检测法或本发明感染细胞或抗体检测方法在检测肠道病毒中和抗体中的用途、在筛选肠道病毒中和性单克隆抗体中的用途、在检测肠道病毒中和抗体效价中的用途、在制备肠道病毒中和抗体诊断试剂盒中的用途、在肠道病毒疫苗开发和质控中的用途、在筛选或制备抗肠道病毒或其相关疾病药物中的用途、或在治疗肠道病毒感染中的用途。

在本发明任何方面，本发明所述病毒中和抗体的检测包括检测所述抗体的存在和/或效价。

在本发明任何方面，本发明所述的检测用病毒抗体优选是特异结合病毒或者病毒蛋白(特别是病毒表面蛋白)的抗体，优选是单克隆抗体，也优选是在病毒感染靶细胞后在靶细胞中表达的病毒蛋白的特异性抗体。所述检测用病毒抗体可以带有标记的或者未带有标记的，优选是酶标记的。所述检测用病毒抗体可以通过所带有的标记或者通过与它特异结合的第二抗体所带有的标记来检测。该标记可以是例如酶、荧光物质、化学发光物质、同位素、或稀土元素。所述检测用病毒抗体或者第二抗体所带有的标记能够直接产生或间接产生能够被斑点检测仪器检测的信号。优选地，本发明方法还进一步包括：通过测算带有所述信号的细胞的数量来确定被病毒感染的细胞的数量。

在本发明任何方面，所述的第二抗体是能够与抗体例如检测用病毒抗体特异结合的抗体，该抗体是未标记的或者标记的，例如是酶标记的。第二抗体可以采用本领域的任何技术制备，也可以使用市售的产品。

在本发明任何方面，待检病毒中和抗体可以是针对任何病毒的中和抗体。优选的，待检病毒中和抗体是肠道病毒中和抗体，特别是EV71中和抗体，也可以是其他肠道病毒的中和抗体，所述肠道病毒的例子是CA16，CB3，CA6，或CA4等。

在本发明任何方面，本发明所用的病毒一般根据待检测的病毒中和抗体所属的病毒型别来选择，优选地是待检病毒中和抗体所针对的病毒。在一个优选实施方案中，所述病毒是肠道病毒，特别是EV71病毒，也可以是其他肠道病毒，例如CA16，CB3，CA6，或CA4等。

在本发明任何方面，用作病毒感染的靶细胞的细胞一般为动物细胞，优选哺乳动物细胞。所述优选能在病毒感染后表达病毒的蛋白。通常是培养细胞或者是细胞系。

在本发明任何方面，本发明待检的样品可以是但不限于任何如下一种或者多种的组合：疫苗或者候选疫苗免疫实验动物或者人之后获得的抗血清、体外培养的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体样品、或者从待检个体分离的生物学样品(如血清)，如怀疑携带病毒的患者的血清，候选的病毒中和抗体，或者是来自组织培养的生物学样品，或者，所述样品不是从有生命的人体或者动物体获得的样品。在一个具体实施方案中，本发明的任何方法都不是专利法意义上的诊断方法。

下面结合具体实施例与所附图表，对本发明进一步加以描述。所述实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。试剂、试剂的浓度、温度和其他变量的值以及载体和细胞的选择只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。

实施例

一.本发明涉及的肠道病毒的培养和鉴定

实施例1.肠道病毒的培养

本实施例中作为示例的肠道病毒株为JS06-52-3(国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存)，通过RT-PCR得到接近全长的7312bp的序列(Genbank No：FJ 600325)，属EV71C4亚型，与EU703814病毒株的核苷酸序列同源性为97.7％，氨基酸序列同源性为97.6％。也可以使用其它肠道病毒。

本发明通过感染细胞的方式在RD细胞(ATCC，CCL-136^TM)(ATCC即是供应商)中生产EV71病毒。

实验方法：

将RD细胞培养于10cm细胞培养皿中，培养基为MEM培养基(添加10％FBS，2mML-glutamine，0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids及1％penicillin-streptomycin)，汇合率约为80％。

10小时后每皿细胞进行换液，换成无血清MEM培养基(添加2mML-glutamine，0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids及1％penicillin-streptomycin)。EV71病毒感染RD细胞，每皿感染的病毒用量为1000TCID₅₀。

感染48小时后，收集细胞及上清，液氮反复冻融三次裂解细胞，后4℃，5000rpm，30min离心去除细胞碎片。上清分装成200μL一份，-80℃保存。

实施例2.肠道病毒感染细胞

将收获的肠道病毒感染RD细胞，检测其对RD细胞的感染。本实施例中以EV71病毒的感染作为示例，也可以包括检测其他肠道病毒的感染。

实验方法：

RD细胞培养于96孔细胞培养板中，约2×10⁴/孔，培养基为MEM培养基(添加10％FBS，2mM L-glutamine，0.1mM MEM Non-EssentialAmino Acids及1％penicillin-streptomycin)，汇合率约为80％。培养10h后每孔分别加入50μL梯度稀释的EV71病毒(分别稀释0，10，100，1000，10000倍)。继续培养14小时后，吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液(PBST：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/LNa₂HPO₄，0.24g/L KH₂PO₄，2ml/L Tween-20，调pH至7.2)洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标记的EV71单克隆抗体H5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System forMembranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。实验对照为未进行感染实验的RD细胞。

将显色反应后的细胞置于倒置显微镜在可见光条件下进行观察，结果如图1所示，EV71病毒感染后的RD细胞可显示出明显区别于未被病毒感染的细胞的颜色。

本实施例中EV71单克隆抗体H5D6制备方法：将灭活的EV71病毒免疫Balb/c小鼠，初免(剂量为100μg/只)与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫(剂量为50μg/只)则与等量福氏不完全佐剂混合，进行肌肉注射，初免后分别于4、8周各加强一次。加强免疫3次后进行单克隆抗体的筛选和制备，细胞融合、克隆化、腹水制备及纯化参见单克隆抗体的常规方法(Harlow E等，抗体：实验室手册，1998年，139-312页)；HRP标记的H5D6-HRP制备方法：HRP 40mg加入0.2M pH5.6醋酸盐缓冲液2ml，溶解后加入0.06M NaIO₄溶液2ml，室温反应20分钟；加入0.16M乙二醇-10％NaCl溶液2ml，室温反应20分钟，将酶液装入透析袋中，对0.001M pH4.0醋酸盐缓冲液透析过夜；加入2M pH9.6碳酸盐缓冲溶液0.8ml，加入H5D6单抗20mg，4℃搅拌反应2小时；加入新配制的NaBH₄溶液(5mg/ml)0.4ml，4℃搅拌反应2小时；滴加饱和(NH₄)₂SO₄溶液9.2mL；4℃搅拌反应30分钟，4℃3500rpm离心20分钟；弃上清，将沉淀溶于2ml 0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液中，用0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，加2ml甘油，混匀后-20℃保存。

实施例3.应用斑点检测仪器Elispot检测肠道病毒对细胞的感染

本发明中以EV71病毒为示例，将EV71病毒感染RD细胞，感染后通过酶联免疫斑点法检测可以使被病毒感染的细胞产生区别于未被感染的细胞的信号。这种信号在可见光下即可被观察，可以不需要特殊光源(如激光、限定波长范围的汞灯光源等)的激发，适合于用斑点检测仪器Elispot进行检测。目前，传统的TCID₅₀方法是对病变的细胞主要是进行肉眼观察，费力耗时，不适于进行高通量检测实验；且缺乏客观性，存在一定的主观误差，容易影响实验结果的重复性。应用斑点检测仪器Elispot进行检测，具有灵酶度高、特别是能够进行连续自动的快速扫描检测，短时间内即可获得大量样品的检测结果，可满足高通量检测的要求。

斑点检测仪器(如Elispot)是目前细胞免疫研究最常用的检测仪器之一，其检测原理是通过高灵敏度的摄像头采集样品板(可以是细胞培养板、专用显色板、显色用膜等)上的细胞显色图像，通过软件分析测算显色细胞的数量或空斑数量，具有很好的精确度和灵敏度，其灵敏度可以分辨出显色的单细胞。Elispot的检测自动化水平高，可适用于包括96孔细胞培养板在内的多种常用的细胞培养容器，可进行全板范围的快速连续自动扫描检测。目前，尚未有将Elispot应用于肠道病毒中和抗体检测实验的报道。

本发明应用斑点检测仪器Elispot对EV71病毒感染并进行显色后的RD细胞进行了检测。

实验方法：

RD细胞培养于96孔细胞培养板中，约2×10⁴/孔，培养基为MEM培养基(添加10％FBS，2mM L-glutamine，0.1mM MEM Non-EssentialAmino Acids及1％penicillin-streptomycin)，汇合率约为80％。培养10h后每孔分别加入50μL梯度稀释的EV71病毒(分别稀释0，10，100，1000，10000倍)。继续培养14小时后，吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％TritonX-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标记的EV71单克隆抗体H5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid SubstrateSystem for Membranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。实验对照为未进行感染实验的RD细胞。启动斑点检测仪器Elispot(型号：Series3B)，将进行显色反应后的细胞培养板放在仪器的取样板上，用仪器检测每个孔中的显色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。实验对照为未进行感染实验的RD细胞。

通过自动连续扫描检测，可迅速获得所检测细胞板上各个孔的显色细胞数量即被感染细胞数量，结果如图2所示。各个孔中显色细胞数量即被EV71病毒感染的细胞数量标于各孔图像的左上方，未进行感染实验的细胞孔未检测到显色细胞。这说明了本发明的设计思路的可行性，被EV71病毒感染后的细胞可产生能够被斑点检测仪器Elispot识别的标记信号，同时使整个检测过程十分的迅速。

实施例4.肠道病毒感染效价的测定

根据病毒效价空斑测定法的原理，在稀释度足够的情况下，肠道病毒感染细胞后通过酶联免疫斑点法可以使被感染细胞带有能够被Elispot检测的信号，带有信号的阳性细胞数即被感染细胞数可以认为是在该次感染实验中使用了多少感染单位的肠道病毒。我们以梯度稀释斑点计数方法检测所构建的肠道病毒的效价。本实施例中我们以EV71病毒的效价作为示例，也可以包括检测其他肠道病毒的效价。

效价测定方法：将RD细胞铺于96孔细胞培养板中，2×10⁴个/孔，培养基为MEM培养基，37℃培养10小时。取EV71病毒原液一份，用无血清MEM培养基10倍连续稀释4个梯度，最终使每100μL培养基中分别含有100μL、10μL、1μL、0.1μL、0.01μL 5个浓度梯度的病毒稀释液。将各梯度的病毒稀释液取50μL加入预铺于96孔细胞培养板中的RD细胞中，每个梯度采取4孔重复。将96孔板放入37℃培养。培养14小时后，吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标记的EV71单克隆抗体H5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System forMembranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。实验对照为未进行感染实验的RD细胞。启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在仪器的取样板上，用仪器检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。实验对照为未进行感染实验的RD细胞(阴性孔)。结果如表1所示，与不同的EV71病毒原液用量对应的为被感染细胞的数量(为4孔平均值)。

EV71病毒效价计算方法：

感染效价(IU/mL)＝检测孔被感染细胞数/检测孔病毒原液用量(mL)。

其中，检测孔被感染细胞数＝检测孔平均显色细胞数-阴性孔平均显色细胞数。其中，上述公式中“检测孔被感染细胞数”和“检测孔病毒原液用量”选择被感染细胞数最接近于50且不低于50的检测孔的被感染细胞数与其对应的EV71病毒原液的用量。

例如，本实施例中，EV71病毒效价检测实验中，被感染细胞数最接近于50且不低于50的检测孔的被感染细胞数为188(表1)，与其对应的EV71病毒原液用量为0.005mL，代入上述公式即可计算获得该EV71病毒效价为3.76×10⁴(IU/mL)。

表1EV71病毒的感染用量与对应孔被感染细胞数的关系

实施例5.与传统的TCID₅₀病毒效价检测方法的对比

本实施例中，我们将本发明的肠道病毒效价检测方法与传统的肠道病毒效价检测方法进行了对比实验。本实施例中，我们应用两种方法同时对不同的EV71病毒株的效价进行检测，对两种方法的应用效果进行对比。

实验方法：

(1)应用本发明的肠道病毒效价检测方法：将RD细胞铺于96孔细胞培养板中(2×10⁴/孔)。10小时后将不同的EV71病毒株用无血清MEM进行连续稀释(以原倍病毒为起点，进行10倍比稀释，稀释5个梯度)，然后各取50μL EV71病毒加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中，每个梯度4孔重复。培养14小时后进行酶联免疫斑点反应，吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标记的EV71单克隆抗体H5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)LiquidSubstrate System for Membranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。实验对照为未进行感染实验的RD细胞(称为阴性孔，4个孔)。启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在仪器的取样板上，用仪器检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。实验对照为未进行感染实验的RD细胞(阴性孔)。

启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在取样板上，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。

病毒效价判定方法：

病毒效价(IU/mL)＝检测孔被感染细胞数/检测孔病毒原液用量(mL)。

其中，检测孔被感染细胞数＝检测孔平均显色细胞数-阴性孔平均显色细胞数。

其中，上述公式中“检测孔被感染细胞数”和“检测孔病毒原液用量”选择被感染细胞数最接近于50且不低于50的检测孔的被感染细胞数与其对应的EV71病毒原液的用量。

(2)应用传统的TCID₅₀病毒效价检测方法：将RD细胞铺于96孔细胞培养板中(2×10⁴/孔)。10小时后将不同的EV71病毒株用无血清MEM进行连续稀释(以原倍病毒为起点，进行10倍比稀释，稀释5个梯度)，然后各取50μL EV71病毒加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中，每个梯度4孔重复。培养6天，连续观察细胞病变，统计细胞完全病变的孔数。

病毒效价判定方法：

按Behrens-

公式计算出分离病毒株的TCID₅₀；

log TCID₅₀＝L-d(S-0.5)，其中：

L＝实验中使用的最低稀释度的log值；

d＝稀释梯度的log值；

S＝终判时阳性部分的总和(即出现CPE的细胞孔所占的比例之和)。

检测结果：

在本实施例中，我们分别应用上述两种方法分别对不同的EV71病毒株的效价进行了检测，结果如图3显示，应用本发明的肠道病毒效价检测方法获得的检测结果与传统的TCID₅₀检测病毒效价检测方法的检测结果，具有高度的相关性。

二.本发明的肠道病毒中和抗体检测方法的建立

实施例6.一种新的肠道病毒中和抗体检测方法

本发明应用前面所述的酶联免疫斑点法和斑点检测仪器(如Elispot)建立了一种新的肠道病毒中和抗体检测方法。该方法既具有高效、准确的优点，同时更有利于提高工作效率，更适于进行高通量检测。该方法的流程示意简图可见图4。

方法流程描述：

(1)RD铺于96孔细胞培养板中，2×10⁴个/孔，培养基为DMEM培养基(添加10％FBS，2mM L-glutamine，0.1mM MEM Non-EssentialAmino Acids及1％penicillin-streptomycin)，37℃培养10h；

(2)取EV71病毒原液，用无血清MEM培养基(也可以根据需要选择其它合适的细胞培养基或缓冲液)进行稀释，稀释比例根据如下方法计算：稀释后EV71病毒的用量为96孔细胞培养板每个孔加50μL EV71病毒稀释液，每孔EV71病毒的用量为100TCID₅₀，以此用量计算EV71病毒原液的稀释比例；

(3)将待检测的样品(如单克隆抗体样品、血清样品、腹水样品、细胞培养上清液样品、细胞裂解液样品等)用无血清MEM培养基(也可以根据需要选择其它合适的细胞培养基或缓冲液)进行稀释(可以根据需要选择合适的稀释倍数)；

注：实验对照设置为未进行感染实验的RD细胞(称为阴性孔，每个96孔板设置5孔)和只进行EV71病毒感染的RD细胞(称为阳性孔，每个96孔板设置5孔)。

(4)稀释后的待检测的样品各取50μL分别与50μL稀释后的EV71病毒(100TCID₅₀)混合，37℃孵育2h；

(5)将孵育后的样品-病毒混合液分别加入上述(1)预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养14小时；

(6)酶联免疫斑点反应：吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标记的EV71单克隆抗体H5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100L显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System forMembranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。实验对照为未进行感染实验的RD细胞。

(7)结果检测：启动斑点检测仪器Elispot，将显色反应后的细胞培养板放在取样板上，扫描检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤可见该仪器的操作说明书。

(8)结果判定：

中和抗体效价的定义为：以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该样品的中和效价。

感染抑制率的计算方法：各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/5-阴性孔显色细胞数总和/5))×100％。

其中，样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/5。

实施例7.与传统的TCID₅₀中和抗体检测方法的对比

本实施例中，我们将本发明的肠道病毒中和抗体检测方法与传统的TCID₅₀中和抗体检测方法进行了对比实验。本实施例中，我们应用两种方法同时对中和性EV71单克隆抗体12C3(也可以采用其它抗体，例如市售抗体)的中和效价进行检测，对两种方法的应用效果进行对比。

实验方法：

(1)应用本发明的肠道病毒中和抗体检测方法：将RD细胞铺于96孔细胞培养板中(2×10⁴/孔)。10小时后将单克隆抗体样品12C3(1mg/mL)用无血清MEM进行连续稀释(以病毒原液为起点，进行10倍比稀释，稀释5个梯度)，然后各取50μL分别与50μL稀释于无血清MEM的EV71病毒(100TCID₅₀)混合。37℃混合孵育2小时后分别加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中。培养14小时后进行酶联免疫斑点反应，吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100uL酶标记的EV71单克隆抗体H5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System for Membranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。实验对照为未进行感染实验的RD细胞。

启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在取样板上，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。实验对照设置为未进行感染实验的RD细胞(称为阴性孔，每个96孔板设置5个孔)和只进行EV71病毒感染的RD细胞(称为阳性孔，每个96孔板设置5个孔)。

中和效价的判定方法：

抗体中和效价的定义为：以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该单克隆抗体样品的中和效价。

感染抑制率的计算方法：各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/5-阴性孔显色细胞数总和/5))×100％。

其中，样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/5。

(2)应用传统的TCID₅₀中和抗体检测方法：将RD细胞铺于96孔细胞培养板中(2×10⁴/孔)。10小时后将单克隆抗体样品12C3(1mg/mL)用无血清MEM进行连续倍比稀释(以病毒原野为起点，进行10倍比稀释，稀释5个梯度)，然后各取50μL分别与50μL稀释于无血清MEM的EV71病毒(100TCID₅₀)混合。37℃混合孵育2小时后分别加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中。37℃培养6天，连续观察并记录细胞病变。实验对照设置为未进行感染实验的RD细胞(称为阴性孔，每个96孔板设置5个孔)和只进行EV71病毒感染的RD细胞(称为阳性孔，每个96孔板设置5个孔)。

中和效价的判定方法：

抗体中和效价的定义为：以细胞达到50％完全病变的最大稀释倍数作为该单克隆抗体样品的中和效价。

检测结果：

在本实施例中，我们分别应用上述两种方法分别对同样的中和性EV71单克隆抗体12C 3的中和效价进行了检测，结果如图5所示，应用本发明的肠道病毒中和抗体检测方法获得的检测结果与传统的TCID₅₀中和抗体检测方法的结果，具有高度的相关性。

三.本发明的肠道病毒中和抗体检测方法的应用

实施例8.在筛选中和性肠道病毒单克隆抗体中的应用

本发明建立的肠道病毒中和抗体检测方法可应用于筛选中和性肠道病毒单克隆抗体。本实施例中我们以筛选中和性EV71单克隆抗体作为示例，也可以包括筛选其他肠道病毒中和性单克隆抗体。

实验方法：将RD细胞铺于96孔细胞培养板中(2×10⁴/孔)。10h后取50μL杂交瘤细胞的培养上清，与50μL稀释于无血清MEM的EV71病毒(100TCID₅₀)混合，37℃混合孵育2h后分别加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中。37℃培养14小时后，吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标记的EV71单克隆抗体H5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System forMembranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。

启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在取样板上，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。实验对照设置为未进行感染实验的RD细胞(称为阴性孔，每个96孔板设置5个孔)和只进行HPV假病毒感染的RD细胞(称为阳性孔，每个96孔板设置5个孔)。

样品是否具有中和能力的判断标准为：对应样品孔样品的感染抑制率达到50％感染抑制率以上。

感染抑制率的计算方法：各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/5-阴性孔显色细胞数总和/5))×100％。

其中，样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/5。在本实施例中，我们应用上述方法分别对杂交瘤细胞上清进行了中和单克隆抗体筛选，结果分别如表2所示。

本实施例中杂交瘤细胞的制备方法：将灭活的EV71病毒免疫Balb/c小鼠，初免(剂量为100μg/只)与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫(剂量为50μg/只)则与等量福氏不完全佐剂混合，进行肌肉注射，初免后分别于4、8周各加强一次。加强免疫3次后进行单克隆抗体的筛选和制备程序，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP20融合获得杂交瘤细胞，详细过程可参见单克隆抗体的常规方法(Harlow E等，抗体：实验室手册，1998年，139-312页)。

表2：筛选获得的EV71中和性单克隆抗体

实施例9.在检测中和性肠道病毒单克隆抗体中和效价中的应用

本发明建立的肠道病毒中和抗体检测方法可应用于检测中和性肠道病毒单克隆抗体的中和效价。本实施例中我们以检测中和性EV71单克隆抗体的中和效价作为示例，也可以包括检测其他肠道病毒中和性单克隆抗体的中和效价。

实验方法：将RD细胞铺于96孔细胞培养板中(2×10⁴/孔)。10h后将待检测的单克隆抗体样品用无血清MEM进行连续稀释(以病毒原液为起点，进行10倍比稀释，稀释5个梯度)，然后各取50μL分别与50μL稀释于无血清MEM的EV71病毒(100TCID₅₀)混合。37℃混合孵育2小时后分别加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中。37℃培养14小时后，吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标记的EV71单克隆抗体H5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System for Membranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。

启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在取样板上，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。Elispot的详细操作步骤见该仪器的操作说明书。实验对照设置为未进行感染实验的RD细胞(称为阴性孔，每个96孔板设置5个孔)和只进行EV71病毒感染的RD细胞(称为阳性孔，每个96孔板设置5个孔)。

中和效价的判定方法：

抗体中和效价的定义为：以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该单克隆抗体样品的中和效价。

感染抑制率的计算方法：各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/5-阴性孔显色细胞数总和/5))×100％。

其中，样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/5。在本实施例中，我们应用上述方法分别检测了多个EV71中和性单克隆抗体的中和效价，结果分别如表3所示。

同时，我们也应用传统的TCID₅₀中和抗体检测方法对上述单克隆抗体的中和效价进行了检测，TCID₅₀中和抗体检测方法参见实施例7，检测结果如表3所示。结果显示，应用本发明的肠道病毒中和抗体检测方法获得的检测结果与传统的TCID₅₀中和抗体检测方法的结果，具有很好的一致性。

表3：EV71中和性单克隆抗体的中和效价

实施例10.在检测血清样品的肠道病毒中和抗体效价中的应用

本发明建立的肠道病毒中和抗体检测方法可应用于检测血清样品中的肠道病毒中和抗体效价，中和实验即检测患者急性期和恢复期血清的中和抗体效价是肠道病毒感染的血清学诊断方法，该方法精确且具有型特异性(李兰娟等，手足口病，2008年，221页)。本实施例中我们检测血清样品中EV71中和抗体作为示例，也可以包括检测血清样品中其他肠道病毒中和抗体。

待检测血清样品：为肠道病毒患者的急性期血清。

中和实验方法：将RD细胞铺于96孔细胞培养板中(2×10⁴/孔)。10小时后将待检测的血清样品用无血清MEM进行连续稀释(以1∶8稀释为起点，进行4倍比稀释，稀释5个梯度)，然后各取50μL分别与50μL稀释于无血清MEM的EV1病毒(100TCID₅₀)混合。37℃混合孵育2h后分别加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养板中。37℃培养14小时后，吸去各孔中的培养基，每孔中加入100μL固定液(含有0.2％戊二醛的PBS溶液)，室温避光静置1h；1h后吸去固定液，每孔中加入100μL 1％Triton X-100溶液通透细胞，室温静置0.5h；0.5h后吸去通透液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL酶标记的EV71单克隆抗体H 5D6-HRP，酶标抗体H5D6-HRP(1.9mg/mL)用酶稀(1×PB，0.1％casein，5％蔗糖，0.1％氨基比林，0.5％Tween-20，1％BSA，0.15M氯化钠，10％甘露醇)稀释10000倍使用，放置于37℃中反应1h；1h后吸去反应液，每孔中加入PBST溶液洗细胞三次，再将PBST溶液吸弃；在每个孔中加入100μL显色液(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine(TMB)LiquidSubstrate System for Membranes，sigma，T0565)，放置在37℃中显色15min，15min后吸弃板中的显色液终止显色。

启动斑点检测仪器Elispot，将进行显色反应后的细胞培养板放在取样板上，检测每个孔中的蓝色细胞数即被感染细胞数。实验对照设置为未进行感染实验的RD细胞(称为阴性孔，每个96孔板设置5个孔)和只进行EV71病毒感染的RD细胞(称为阳性孔，每个96孔板设置5个孔)。

抗体中和效价的定义为：以达到50％感染抑制率以上的最大稀释倍数作为该血清样品的中和效价。

感染抑制率的计算方法：各样品的感染抑制率＝(1-样品孔被感染细胞数/(阳性孔显色细胞数总和/5-阴性孔显色细胞数中和/5))×100％。

其中，样品孔被感染细胞数＝样品孔平均显色细胞数-阴性孔显色细胞数总和/5。

在本实施例中，我们应用上述方法分别检测了不同肠道病毒患者血清中的EV71中和抗体效价，结果分别如图6所示。

同时，我们也应用传统的TCID₅₀中和抗体检测方法对上述血清样品进行了EV71中和抗体检测，TCID₅₀中和抗体检测方法见实施例7，检测结果如图6所示。结果显示，应用本发明的肠道病毒中和抗体检测方法获得的检测结果与传统的TCID₅₀中和抗体检测方法的结果，具有很好的一致性。

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的本文描述了本发明的具体实施方案，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方案和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。

Claims (21)

1、检测被病毒(例如人肠道病毒)感染的细胞(优选培养细胞或细胞系)的方法，包括：(1)优选应用酶联免疫方法，使得被病毒感染的细胞带有可检测的信号，优选是能被斑点检测仪器检测到的信号或者适合于斑点检测法检测的信号，而未被病毒感染的细胞不带有该信号；和(2)优选通过应用斑点检测仪器或通过以斑点检测法，检测细胞是否带有该信号；

其中，使被病毒感染的细胞带有可检测的信号优选通过如下方法实现：使检测用病毒抗体(优选酶标检测用病毒抗体)与被感染细胞中的病毒或病毒蛋白特异结合，检测用病毒抗体(优选酶标检测用病毒抗体)能够直接产生或间接产生(例如通过显色反应)能够被斑点检测仪器检测的信号。

2、权利要求1所述的方法，用于检测被病毒感染的细胞的数量，或者用于病毒滴度的确定。

3、检测被病毒(例如人肠道病毒)感染的细胞(优选培养细胞或细胞系)的方法，包括：

(a)使病毒和靶细胞在适合病毒感染靶细胞的条件下接触，之后使所得产物和检测用病毒抗体在适合检测用病毒抗体与病毒或病毒蛋白结合的条件下接触，或者

(b)使病毒和检测用病毒抗体在适合检测用病毒抗体与病毒或病毒蛋白结合的条件下接触，之后使所得产物和靶细胞在适合病毒感染靶细胞的条件下接触，或者

(c)使病毒、检测用病毒抗体和靶细胞同时在适合病毒感染靶细胞且适合检测用病毒抗体与病毒或病毒蛋白结合的条件下接触；

所述方法优选还包括：检测靶细胞中特异性结合的检测用病毒抗体，或者检测靶细胞中包含特异性结合的检测用病毒抗体的细胞或其数量；

其中，所述检测用病毒抗体优选是特异结合病毒或者病毒蛋白(特别是病毒表面蛋白)的抗体，优选是单克隆抗体，也优选是在病毒感染靶细胞后在靶细胞中表达的病毒蛋白的特异性抗体；所述检测用病毒抗体可以带有标记的(优选酶标记的)或者未带有标记的；或者，所述检测用病毒抗体可以直接产生或间接产生(例如通过显色反应)能够被斑点检测仪器检测的信号。

4、一种检测样品中的病毒(例如人肠道病毒)中和抗体的方法，包括：使样品中可能存在的病毒中和抗体与病毒结合以阻断病毒对靶细胞的感染，并应用权利要求1-3任一项的方法检测被病毒感染的细胞，由此检测样品中的病毒中和抗体。

5、权利要求4的方法，其中所述方法用于检测样品中病毒中和抗体的存在与否和/或其效价。

6、权利要求1-5之任一项所述的方法，其中所述的斑点检测法获得的检测数据通过斑点检测仪器获得，斑点检测仪器优选能够用于分辨和测算细胞群中产生特定信号(例如颜色)的细胞的数量，优选Elispot。

7、权利要求1-6之任一项所述的方法，其中所述检测用病毒抗体是酶标抗体；或者，所述检测用病毒抗体是未标记的，所述方法还包括：使第二抗体和靶细胞中可能存在的、特异结合的检测用病毒抗体结合，第二抗体是标记的(优选酶标记的)，并检测包含特异性结合的第二抗体的细胞或其数量，其中优选地，所述的酶是可以直接或间接产生能够被斑点检测仪器检测的信号的酶。

8、检测样品中的病毒(例如人肠道病毒)中和抗体的方法，其包括以下步骤：

(a)提供病毒和作为病毒感染靶细胞的培养于固相培养载体(例如细胞培养皿、细胞培养板等，优选多孔细胞培养板，更优选96孔细胞培养板)上的细胞；所述细胞一般为动物细胞，优选哺乳动物细胞，其能在病毒感染后表达病毒的蛋白；所述病毒根据待检测的病毒中和抗体所属的病毒型别来选择，一般是待检病毒中和抗体所针对的病毒；

(b)将待检样品与步骤(a)中所述的病毒接触，使得样品中可能存在的病毒中和抗体与病毒结合，以致能够阻止病毒对步骤(a)中所述的靶细胞的感染；

(c)使步骤(b)的产物(样品与病毒的混合液)与步骤(a)中所述的培养于固相培养载体上的靶细胞接触，该接触在允许细胞正常生长的条件下进行；

(d)用固定液固定步骤(c)所获得的细胞，固定条件应使细胞保持原有的形态；固定液可为多聚甲醛和/或戊二醛等，优选0.2％戊二醛；

(e)用通透液透化处理步骤(d)所获得的细胞，以便加强细胞膜的通透性，使得以下操作中所加入的抗体能够进入细胞；所述通透液优选1％Triton X-100；优选(以例如但不限于PBST)进行洗涤；

(f)使步骤(e)所获得的细胞和能与病毒或病毒蛋白特异性结合的检测用病毒抗体接触，使得可能存在的被病毒吸附和/或感染的细胞中的病毒颗粒或者病毒蛋白与检测用病毒抗体结合；检测用病毒抗体可以带有标记(优选酶)或者不带有标记；优选(以例如但不限于PBST)进行洗涤；

(g)检测步骤(f)获得的细胞中可能存在的、特异性结合的检测用病毒抗体，或者检测步骤(f)获得的细胞中可能存在的、包含特异性结合的检测用病毒抗体的细胞或其数量；所述检测优选通过斑点检测仪器(如Elispot)来进行，更优选的是，所述检测包括：通过应用斑点检测仪器，检测步骤(f)获得的细胞中带有由特异性结合的检测用病毒抗体直接或者间接产生的信号的细胞，来检测被感染细胞的数量。

9、权利要求8的方法，其中所述检测用病毒抗体是酶标记的；优选地，步骤(g)中所述的检测包括：将步骤(f)获得的细胞和酶的底物接触，由此直接或者间接产生可被优选斑点检测仪器检测的信号，并优选通过斑点检测仪器检测存在该信号的细胞或其数量。

10、权利要求8的方法，其中所述检测用病毒抗体是未标记的；优选地，步骤(g)中所述的检测包括：将步骤(f)获得的细胞和带有标记(优选酶标记的)的第二抗体在允许第二抗体和检测用病毒抗体特异结合的条件下接触，并检测获得的细胞中可能存在的、特异性结合的第二抗体，或者可能存在的、包含特异性结合的第二抗体的细胞或其数量。

11、权利要求10的方法，其中所述第二抗体是酶标记的；优选地，特异性结合的第二抗体或者包含特异性结合的第二抗体的细胞的检测包括：将获得的细胞和酶的底物接触，由此直接或者间接产生可被优选斑点检测仪器检测的信号，并优选通过斑点检测仪器检测存在该信号的细胞或其数量。

12、权利要求9或者11的方法，其中所述特异性结合的检测用病毒抗体或者包含特异性结合的检测用病毒抗体的细胞，或者所述特异性结合的第二抗体或者包含特异性结合的第二抗体的细胞，通过如下方法来检测：使所述酶与该酶的底物接触，发生酶促颜色反应，由此产生颜色，并优选应用斑点检测仪器确定带有该颜色的细胞的数量。

13、权利要求11或者12的方法，其中所述检测用病毒抗体或者第二抗体所带的标记是酶、荧光物质、化学发光物质、同位素、或稀土元素。

14、上述权利要求任一项的方法，其中所述样品是疫苗或者候选疫苗免疫实验动物之后获得的抗血清、体外培养的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体样品、或者从待检个体分离的生物学样品(如血清)，如怀疑携带病毒的患者的血清，或者是来自组织培养的生物学样品，或者，所述样品不是从有生命的人体或者动物体获得的样品，或者，所述方法不是专利法意义上的诊断方法。

15、试剂盒，其包含下列项目中的一种或多种：

(1)能与病毒或病毒蛋白特异性结合的检测用病毒抗体，其可以是标记的或者未标记的，例如酶标记的，

(2)任选的第二抗体，是能够与抗体如检测用病毒抗体特异结合的抗体，可以是标记的或者未标记的，例如是酶标记的，

(3)任选的病毒，所述病毒一般根据待检测的病毒中和抗体所属的病毒型别来选择，优选是待检病毒中和抗体所针对的病毒；

(4)任选的病毒中和抗体标准品，和

(5)任选的细胞，作为病毒感染靶细胞，培养于固相培养载体(例如细胞培养皿、细胞培养板等，优选多孔细胞培养板，更优选96孔细胞培养板)上，所述细胞一般为动物细胞，优选哺乳动物细胞，其能在病毒感染后表达病毒的蛋白；

所述试剂盒任选地还包含：用于固定细胞的固定液；和/或，用于使细胞通透性增加的通透液；

优选地，检测用病毒抗体或者第二抗体是酶标记的，所述试剂盒优选还包含：酶的底物，或者酶的显色试剂，如显色液，

所述试剂盒可以用于检测样品中的病毒(例如人肠道病毒，例如肠道病毒EV71)中和抗体，或者可以用于诊断患者是否感染该病毒，或者可以用于诊断患者是否患有所述病毒感染引起的疾病(例如手足口病)，例如可以用于实施前述权利要求任一项的方法。

16、斑点检测仪器或斑点检测法或权利要求1-14任一项的方法在检测病毒中和抗体中的用途、在筛选病毒中和性单克隆抗体中的用途、在检测病毒中和抗体效价中的用途、在制备病毒中和抗体诊断试剂盒中的用途、在病毒疫苗开发和质控中的用途、在筛选或制备抗病毒或其相关疾病药物中的用途、或在治疗病毒感染中的用途。

17、筛选病毒例如人肠道病毒中和性单克隆抗体的方法，该方法包括：根据权利要求1-14任一项的方法，检测候选抗体是否是病毒中和抗体。

18、检测病毒中和抗体效价的方法，包括：根据权利要求1-14任一项的方法，确定病毒中和抗体效价。

19、确定病毒疫苗的有效性或效价的方法，包括：根据权利要求1-14任一项的方法，确定所述疫苗免疫动物后获得的抗血清或者抗体中病毒中和抗体存在与否或其效价。

20、诊断患者是否感染病毒的方法，包括：根据权利要求1-14任一项的方法，确定来自患者的样品例如血清中病毒中和抗体存在与否或其效价。

21、前述权利要求任一项的方法或者试剂盒，其中所述病毒是人肠道病毒，特别是EV71病毒，所述病毒中和抗体是人肠道病毒，特别是EV71病毒的中和抗体。

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