CN113495157A - 一种酶结合物稀释液、一种总甲状腺素定量检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酶结合物稀释液、一种总甲状腺素定量检测试剂盒及其使用方法，本申请提供的酶结合物稀释液可以增强酶结合物的稳定性，同时抑制解离剂对酶结合物的破坏作用，实现两者可以共存于同一试剂组分中，在总甲状腺素检测中可以同时满足总甲状腺素解离、降低新旧样本干扰和HAMA干扰，从而使本申请提供的总甲状腺素定量检测试剂盒达到更快速更便捷的操作和获取更准确的检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域，尤其是涉及一种酶结合物稀释液、一种总甲状腺素定量检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
T4(L—甲状腺素)是一种在甲状腺中合成并储存分泌的激素。蛋白酶水解滤泡甲状腺球蛋白，将T4释放入血。人血中99.97％的T4可逆结合于三种血浆蛋白—甲状腺结合球蛋白(TBG)结合约70％的T4，其余大约30％T4结合于甲状腺结合前白蛋白(TBPA)和白蛋白上，任何时候都约有0.03％的T4在血液中处于游离未结合状态。
针对总甲状腺素(TT4)现有的检测方法有液相色谱-串联质谱法、免疫学方法。其中免疫学方法因其检测快捷，成本低廉是目前临床应用的主流方法。平台上又形成了化学发光、酶联免疫、免疫荧光、免疫比浊、荧光免疫等产品形式。
应用免疫学方法的产品中，目前应用较多的方法是：固相化抗甲状腺素(T4)抗体，酶标记甲状腺素(T4)抗原，对样本进行前处理使总甲状腺素(TT4)从结合蛋白上解离为游离态。然后酶标记的甲状腺素(T4)抗原和样本处理后呈现游离态的甲状腺素(T4)抗原，竞争结合固相化的抗甲状腺素(T4)抗体，进行竞争法检测。例如：北京科美东雅公司、北京源德生物、北京美康生物、郑州安图生物等公司使用的都是这种方法，这种方法需要单独进行一步样本前处理，重要的是该方法容易造成一定比例的结合蛋白异常的样品检测结果错误。原因是这些样本的结合蛋白解离后有机会与酶标记的甲状腺素(T4)抗原形成新的结合，从而造成干扰竞争反应的后果。或者只能使用两步法操作，避免结合蛋白与酶标记抗原发生结合。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种酶结合物稀释液、一种总甲状腺素定量检测试剂盒及其使用方法，本申请提供的酶结合物稀释液可以增强酶结合物的稳定性，同时抑制解离剂对酶结合物的破坏作用，实现两者可以共存于同一试剂组分中，在总甲状腺素检测中可以同时满足总甲状腺素解离、降低新旧样本干扰和HAMA干扰，从而使本申请提供的总甲状腺素定量检测试剂盒达到更快速更便捷的操作和获取更准确的检测结果。
本发明的目的是以下述方式实现的：一种酶结合物稀释液，包括BSA、胰蛋白胨、氨基比林。
具体的，一种酶结合物稀释液，包括巴比妥钠缓冲液、ANS、BSA、胰蛋白胨、氨基比林、IPBC、HBR、Proclin300。
巴比妥钠缓冲液为PH值为6.8-8的巴比妥钠缓冲液。
一种酶结合物稀释液，每升中含有BSA 25-35g、胰蛋白胨7-12g、氨基比林0.8-1.2g。
一种酶结合物稀释液，每升中含有巴比妥钠缓冲液978ml、ANS 3g、BSA 30g、胰蛋白胨10g、氨基比林1g、IPBC 1g、HBR 50mg、Proclin300 1ml，巴比妥钠缓冲液为每10.3g巴比妥钠配制成1L的巴比妥钠水溶液，然后加入6M的盐酸配制成PH值为7.4的巴比妥钠缓冲液。
一种总甲状腺素定量检测试剂盒，包括包被有甲状腺素的包被板、酶标记抗甲状腺素单抗的酶结合物、和甲状腺素校准品，其中酶结合物为通过在酶结合物稀释液中加入酶标记甲状腺素单克隆抗体制备而成。
酶结合物稀释液与酶标记甲状腺素单克隆抗体的体积比为4500-5500：1。
酶结合物稀释液与酶标记甲状腺素单克隆抗体的体积比为5000：1。
包被有甲状腺素的包被板的制备方法，包括以下步骤：(1)将T4-BSA加入到tris-HCl缓冲液中配制成包被液，充分混匀；
(2)将配制好的包被液加入空白酶标板内，在2～8℃下放置16-24hr；
(3)甩去酶标板中的包被液，酶标板表面无液体后，用洗液洗板至少2次；
(4)洗板后2分钟内封闭，然后每个孔内加入封闭液，然后在2～8℃下放置16～24hr；
(5)将酶标板的封闭液甩出，然后将酶标板放置在烘干装置中干燥(湿度≤30％)4-8hr。
甲状腺素校准品的的制备方法，包括以下步骤：(1)使用PH为6.8-7.5的HEPES缓冲液、BSA、制霉菌素、Proclin300配制校准品稀释液；
(2)使用校准品稀释液对甲状腺素进行稀释，分别配制成不同浓度的甲状腺素校准品。
所述的总甲状腺素定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤，(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，用微量移液器依次加入50μl校准品及待测样本，再加入酶结合物50μl；
(2)、温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)、洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)、显色：每包被孔加底物液100μl，室温(18～23℃)避光反应20分钟；
(5)、终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
本试剂盒基于酶免免疫法制备而成，配合酶标仪使用，操作简便，检测速度快。与市场上在售的总甲状腺素(TT4)检测试剂盒相比，本试剂盒采用固相化甲状腺素抗原，酶标记抗甲状腺素抗体的反应方式；并优化酶结合物配方，添加了氨基比林、胰蛋白胨、BSA，有效的保护了酶标抗体不受解离剂的影响。该反应原理因参与竞争的甲状腺素抗原固相化，可以不受样本解离后结合蛋白的影响。另外，在酶结合物中添加上述有效物质，可以同时满足样品中总甲状腺素的解离、降低新旧样本干扰和HAMA干扰，酶结合物可以直接使用，不必现用现配。
作用原理如下：
总甲状腺素自然状态下通过化学键与结合蛋白相结合，其结合力稳固且有相对应结合比例。当使用解离剂将总甲状腺素与结合蛋白解离后，结合蛋白因其理化性质决定了其会与基质环境形成新的游离结合关系。以往采用固相化抗体，酶标记抗原的反应原理，如果使用解离与竞争同步反应的方法，则样本中的结合蛋白会对酶标抗原造成一定的结合干扰。或者为了规避这一风险，已上市产品往往采用一种两步操作的方式，第一步进行样本解离，解离后的抗原与固相化抗体结合，然后清洗掉未参与反应的抗原和基质液(包含结合蛋白)，第二步加入酶结合抗原在与未参与参与第一步结合反应的固相化抗体结合。通过两步反应避免结合蛋白与酶标记抗原的接触来解决上述问题。
本发明将抗原与抗体的位置进行互换，将抗原进行固相化，抗体进行标记。抗原进行固相化以后失去了再与结合蛋白相结合的条件，同时所对应的抗原决定簇还得以完整保留，在与样品中的抗原进行竞争时具有天然抗原的特性，竞争反应效果良好，梯度显著。
酶结合物中的阻断剂为消除HAMA样本干扰的有效成分，其主要作用原理为主动亲和HAMA样本嗜异性抗体的Fc表位，使其失去与甲状腺素抗体相结合的能力；酶结合物中的氨基比林、胰蛋白胨、BSA的加入，有效的保护了酶标抗体不受解离剂的影响。
附图说明
图1是回归曲线图。
图2是本申请试剂盒与现有产品的相关性参考图。
具体实施方式
一种酶结合物稀释液，包括BSA、胰蛋白胨、氨基比林。
具体的，一种酶结合物稀释液，包括巴比妥钠缓冲液、ANS、BSA、胰蛋白胨、氨基比林、IPBC、HBR、Proclin300。
巴比妥钠缓冲液可以为PH值为6.8-8的巴比妥钠缓冲液。
一种酶结合物稀释液，每升中含有BSA 25-35g、胰蛋白胨7-12g、氨基比林0.8-1.2g。
具体的，一种酶结合物稀释液，可以每升中含有巴比妥钠缓冲液978ml、ANS 3g、BSA30g、胰蛋白胨10g、氨基比林1g、IPBC 1g、HBR 50mg、Proclin300 1ml，巴比妥钠缓冲液为每10.3g巴比妥钠配制成1L的巴比妥钠水溶液，然后加入6M的盐酸配制成PH值为7.4的巴比妥钠缓冲液。
一种总甲状腺素检测试剂盒，包括包被有甲状腺素的包被板、酶标记抗甲状腺素单抗的酶结合物、和甲状腺素校准品，其中酶结合物为通过在酶结合物稀释液中加入酶标记甲状腺素单克隆抗体制备而成。酶标记抗甲状腺素单抗可以为含有HRP标记的抗甲状腺素单克隆抗体。
酶结合物稀释液与酶标记甲状腺素单克隆抗体的体积比可以为4500-5500：1。
具体地，酶结合物稀释液与酶标记甲状腺素单克隆抗体的体积比为5000：1。
包被有甲状腺素的包被板的制备方法，包括以下步骤：(1)将T4-BSA加入到tris-HCl缓冲液中配制成包被液，充分混匀；
(2)将配制好的包被液加入空白酶标板内，在2～8℃下放置16-24hr；
(3)甩去酶标板中的包被液，酶标板表面无液体后，用洗液洗板至少2次；
(4)洗板后2分钟内封闭，然后每个孔内加入封闭液，然后在2～8℃下放置16～24hr；
(5)将酶标板的封闭液甩出，然后将酶标板放置在烘干装置中干燥(湿度≤30％)4-8hr。
甲状腺素校准品的的制备方法，包括以下步骤：(1)使用PH为6.8-7.5的HEPES缓冲液、BSA、制霉菌素、Proclin300配制校准品稀释液；
(2)使用校准品稀释液对甲状腺素进行稀释，分别配制成不同浓度的甲状腺素校准品。
所述的总甲状腺素检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤，(1)加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，用微量移液器依次加入50μl校准品及待测样本，再加入酶结合物50μl；
(2)、温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
(3)、洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
(4)、显色：每包被孔加底物液100μl，室温(18～23℃)避光反应20分钟；
(5)、终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所使用的物料和检测仪器均为本行业常规物料产品，均为市场上普通所售产品。所使用的检测方法为本行业常规使用方法。
制备的总甲状腺素(TT4)定量检测试剂盒
1、制备包被板
①将T4-BSA(采购自达诺生物，型号为D1002)按照2.5ug/ml加入到0.1M PH7.4的tris-HCl缓冲液中配制成包被液，室温18-23℃下条件充分混匀。
②将配制好的包被液按100μl/孔加入空白酶标板(采购自厦门云鹏生物)内，在冰箱中2～8℃下放置16-24hr。
③甩去酶标板中的包被液，拍干后用洗液洗板2次。
④洗板后2分钟内封闭，按150μl/孔加入封闭液—1％明胶，在冰箱中2～8℃下放置16～24hr。
⑤将酶标板的封闭液甩出，然后将酶标板放置在烘干箱干燥(湿度≤30％)4～8hr。
制备完成。
2、本发明酶结合物的配制
第一步配制巴比妥钠缓冲液，采用下表表1中的原料混合制成巴比妥钠水溶液；
表1
| 品名 | 含量 | 原料要求 |
| 纯化水 | 996ml | 分析纯 |
| 巴比妥钠 | 10.3g | 分析纯 |
然后使用6M的盐酸调整巴比妥钠水溶液PH值为7.4，制备成巴比妥钠缓冲液。
第二步配制酶稀释液
采用下表表2中的原料混合配制成酶稀释液。
表2
制得的酶稀释液与加入含有HRP标记的甲状腺素(T4)单克隆抗体(采购自bioventix，型号为1C4)按5000：1体积比进行混合制得酶结合物。
3、本发明校准品的配制
第一步配制HEPES缓冲液，采用下表表3中的原料混合配制成HEPES溶液；
表3
然后使用1M的氢氧化钠调整HEPES溶液PH值为7.2，制备成HEPES缓冲液；
第二步配制校准品稀释液，采用下表表4中的原料混合配制成校准品稀释液；
表4
| 品名 | 含量 | 原料要求 |
| HEPES缓冲液 | 983ml | |
| BSA | 30g | 分析纯 |
| 制霉菌素 | 0.05g | |
| Proclin300 | 1ml | 分析纯 |
将甲状腺素(T4)(厂家和型号分别为sigma-T2376)用该稀释液进行稀释，分别配制成0ug/dl、2.5ug/dl、5ug/dl、10ug/dl、15ug/dl、30ug/dl六个浓度的校准品。制霉菌素的厂家和型号分别为源叶生物-S17029。
4、其他通用试剂组分：底物、终止液、洗液采购自郑州达诺生物。
5、试验过程
(一)【主要组成成份】如下表表5
表5
(二)【检验方法】
实验前准备
1、将所有试剂及样本恢复至室温18～25℃至少30分钟。
2、将恒温箱或水浴锅调至反应温度37℃。
3、每瓶洗涤液用1000ml纯化水稀释，摇匀后备用。
实验步骤
1、加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔。用微量移液器依次加入50μl校准品及待测样本，再加入酶结合物50μl。
2、温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟。
3、洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次(每次均需甩净液体)，最后在吸水纸上拍干。
4、显色：每包被孔加底物液100μl，室温18～23℃下避光反应20分钟。
5、终止：每包被孔加终止液50μl，终止反应。
(三)结果计算
(1).酶标仪检测：选择酶标仪波长450nm，参考波长630nm。在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。
(2).计算：本试剂盒推荐采用点到点回归拟和方式，即以系列校准品浓度值为横坐标(X轴)，以标准品OD值为纵坐标(Y轴)，建立点到点标准曲线，计算待测样本总甲状腺素(TT4)的含量。正常人参考区间(这个范围是试剂盒测试正常人群根据统计学方法计算的)：4.50-13.80ug/dl。计算示例数据如下表表6，从而建立的点到点标准曲线如曲线参考图1。
表6
| 品名 | 浓度(ug/dl) | OD值 |
| 标准品1 | 0 | 2.843 |
| 标准品2 | 2.5 | 2.064 |
| 标准品3 | 5 | 1.561 |
| 标准品4 | 10 | 0.911 |
| 标准品5 | 15 | 0.565 |
| 标准品6 | 30 | 0.275 |
| 样本1 | 5.14 | 1.543 |
| 样本2 | 11.88 | 0.781 |
6、本发明试剂盒的临床性能评价及发明优点
采用本发明试剂盒与roche公司生产的总甲状腺素(TT4)测定试剂盒通过电化学发光法平行考核177份体检人群样本，浓度范围为1.5～26.7ug/dl，检测结果进行临床相关性分析，检测结果如下表表7，根据表中数据制得相关性参考图如图2。
表7
根据图2相关性参考图可知，本发明制得的试剂盒与现有产品相关性良好，从而说明本发明解决了已上市现有产品两步法反应的操作复杂性，同时也保持了良好的检测效果。国内企业大多数商品化产品都是两步反应，第一步单独完成解离过程，第二步实现竞争反应，需经过两次洗板，且反应时间较长。本发明提供的检测试剂盒得以实现一步反应，提高检测效率，降低操作错误率,同时缩减了一种试剂组分。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。根据图2相关性参考图可知，本发明制得的试剂盒与现有产品相关性良好，从而说明本发明解决了已上市现有产品两步法反应的操作复杂性，同时也保持了良好的检测效果。国内企业大多数商品化产品都是两步反应，第一步单独完成解离过程，第二步实现竞争反应，需经过两次洗板，且反应时间较长。本发明提供的检测试剂盒得以实现一步反应，提高检测效率，降低操作错误率,同时缩减了一种试剂组分。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种酶结合物稀释液，其特征在于：包括BSA、胰蛋白胨、氨基比林。
2.根据权利要求1所述的酶结合物稀释液，其特征在于：包括巴比妥钠缓冲液、ANS、BSA、胰蛋白胨、氨基比林、IPBC、HBR、Proclin300。
3.根据权利要求1或2所述的酶结合物稀释液，其特征在于：巴比妥钠缓冲液为PH值为6.8-8的巴比妥钠缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的酶结合物稀释液，其特征在于：每升中含有BSA 25-35g、胰蛋白胨7-12g、氨基比林0.8-1.2g。
5.根据权利要求1或2所述的酶结合物稀释液，其特征在于：每升中含有巴比妥钠缓冲液978ml、ANS 3g、BSA 30g、胰蛋白胨 10g、氨基比林1g、IPBC 1g、HBR 50mg、Proclin3001ml，巴比妥钠缓冲液为每10.3g巴比妥钠配制成1L的巴比妥钠水溶液，然后加入6M的盐酸配制成PH值为7.4的巴比妥钠缓冲液。
6.一种总甲状腺素定量检测试剂盒，其特征在于：包括包被有甲状腺素的包被板、酶标记抗甲状腺素单抗的酶结合物、和甲状腺素校准品，其中酶结合物为通过在酶结合物稀释液中加入酶标记甲状腺素单克隆抗体制备而成。
7.根据权利要求1所述的总甲状腺素定量检测试剂盒，其特征在于：酶结合物稀释液与酶标记甲状腺素单克隆抗体的体积比为4500-5500：1。
8.根据权利要求6所述的总甲状腺素定量检测试剂盒，其特征在于：包被有甲状腺素的包被板的制备方法，包括以下步骤：（1）将T4-BSA加入到tris-HCl缓冲液中配制成包被液，充分混匀；
（2）将配制好的包被液加入空白酶标板内，在2～8℃下放置16-24hr；
（3）甩去酶标板中的包被液，酶标板表面无液体后，用洗液洗板至少2次；
（4）洗板后2分钟内封闭，然后每个孔内加入封闭液，然后在2～8℃下放置16～24hr；
（5）将酶标板的封闭液甩出，然后将酶标板放置在烘干装置中干燥4-8hr，湿度≤30%。
9.根据权利要求6所述的总甲状腺素定量检测试剂盒，其特征在于：甲状腺素校准品的的制备方法，包括以下步骤：（1）使用PH为6.8-7.5的HEPES缓冲液、BSA、制霉菌素、Proclin300配制校准品稀释液；
（2）使用校准品稀释液对甲状腺素进行稀释，分别配制成不同浓度的甲状腺素校准品。
10.根据权利要求6-9任一权利要求所述的总甲状腺素定量检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤，（1）加样：取出一定量的包被板上编号的包被孔，用微量移液器依次加入50µl校准品及待测样本，再加入酶结合物50µl；
（2）、温育：将加样后的包被板置37℃环境温度下60分钟；
（3）、洗涤：甩去包被孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各包被孔，静置20秒，甩掉，如此反复洗涤5次，每次均需甩净液体，最后在吸水纸上拍干；
（4）、显色：每包被孔加底物液100µl，室温（18~23℃）避光反应20分钟；
（5）、终止：每包被孔加终止液50µl，终止反应。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211012 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |