JPH0261561A - 免疫反応の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫反応の測定方法に関し、更に詳細には分析
装置の流路切シ換え弁等の試薬、検体等と接触する部分
が主としてアルミナ等の親水性材料で構成されたものを
用い、免疫学的方法によシ抗原、抗体等を測定する免疫
反応の測定方法に関する。

〔従来の技術〕

血清や尿中の種々の因子、蛋白質、ホルモン、薬物など
の測定が種々の疾患の診断治療法の決定などに重要な意
義を持つようになってきている。

これらの特定の物質の測定法としては、物理化学的方法
、生化学的方法、免疫学的方法などがあるが、この中で
も免疫学的方法は特異性、感度に優れていることから蛋
白質、ホルモン等の測定に広く用いられつつある。

免疫学的測定法には、グル内免疫拡散法、−免疫比濁法
、免疫比ろう法、酵素免疫測定法、ケイ光免疫測定法、
放射性免疫測定法など種々の方法があるが、゛近年、臨
床化学分析の分野における、一般に生化学自動分析装置
と呼ばれる自動分析装置の普及に伴い、前述の免疫学的
測定法の中でも免疫比濁法が、これら分析装置への適応
の容易さから注目され、この方法によシ種々の物質の測
定が試みられてきている。

免疫比濁法、に用いる試薬は、抗血清又はその精製物の
適量を適当な緩衝液中、例えばリン酸緩衝液、トリス緩
衝液、グツド緩衝液などに溶解したものと、反応促進剤
として？リエチレングリコール等を適当な緩衝液中に溶
解したものとを組み合わせるか又は、抗血清又はその精
製物と反応促進剤を適当な緩衝液中に溶解することによ
って作られる。

また、これらの免疫比濁法用試薬を適用する自動分析装
置としては、種々のタイプの装置が市販されているが、
その中でも、特開昭５９−２２９０５号に記載されてい
るタイプの自動分析装置は、各試薬に対し独立した分注
装置を有することから、多数検体−多数項目の測定に適
した自動分析装置とされている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、このタイプの分析装置においては、分注
装置の流路切シ換え弁にアルミナを主成分とする親水性
材料を用いていること、又、検体の測定の依頼の無い場
合、この流路切９換え弁中に試薬が留まっていることに
起因し、前述の抗血清及びその精製物又は抗体標識物を
試薬中に含む免疫比濁法試薬、ラテックス免疫凝集比濁
法を試薬などを適用した場合、非特異的な凝集・沈澱を
生じるという現象が起こることが判明し、従って測定の
基準となる試薬ブランク値が変動するため測定に重大な
影響を及ぼすという問題を有していた。

従って、流踏切り換え弁等、試薬が直接接触する部分に
アルミナ等の親水性材料を用いている自動分析装置に適
用しても、非特異的な沈澱（濁り）や凝集を生じること
により測定精度に影響を及ぼさない、抗原−抗体反応に
よる測定法の開発が求められていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、免疫測定法における上記の問題を解決す
るために種々の検討を行った結果、非特異反応は抗血清
の種類、抗血清の対象抗原の種類に無関係に生じ、正常
動物血清でも生じることが判明した。更に、非特異沈澱
物の組成の分析を行った結果、非特異沈澱物は免疫グロ
ブリンであシ、抗血清をそのまま用いても、種々の方法
によシ免疫グロブリンを精製又は加工しても本現象に対
し効果がなかつたことから、本現象はアルミナなどから
なるセラミック等の親水性材料の表面に免疫グロブリン
分子が吸着、濃縮されることにより非特異的な凝集・沈
澱が生じるものであると判断された。

非特異沈澱物が免疫グロブリン、すなわち、抗体である
ことから、免疫グロブリン類を含む溶液中の免疫グロブ
リン類濃度を低くすることによシ、見かけ上は非特異沈
澱物又は非特異凝集物の量は減−少するが、当然のこと
ながらこれは本質的な問題を解決する手段とはならなか
った。

そこで本発明者らは、アルミナなどからなるセラミック
等の親水性材料の表面に抗体分子が吸着することを防ぐ
ことによシ問題が解決できると考え、免疫グロブリン類
を含む溶液の組成と本現象との関係につき詳細な検討を
行った結果、免疫グロブリン類を含む溶液の塩濃度をた
だ単に増加させたり界面活性剤等を添加することでは免
疫グロブリン類の吸着を防ぐことはできないが、試薬や
検体中に多塩基酸を配合すれば免疫グロブリン類の、ア
ルミナなどからなるセラミック等親水性材料表面への吸
着を防ぐことができ、従って非。

特異的な凝集・沈澱を抑えることができるとの知見を得
、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は試薬又は／及び検体と直接接触する
部分が親水性材料で構成されている分析装置を使用し、
抗原−抗体反応によシ検体中の目的物質を検出する免疫
学的測定法において、免疫グロブリン類を含む試薬又は
検体に多塩基酸を添加することを特徴とする免疫反応の
測定方法を提供するものである。

本発明方法で用いる多塩基酸としては、２塩基酸以上の
ものであれば特に限定されるものではないが、水溶性、
毒性、蛋白に対する変性作用の有無などを考慮するとリ
ン酸及びグリ七ロリン酸、ピ゛ロリン酸、フィチン酸な
どのリン酸誘導体、ホウ酸、シュウ酸、クエン酸、フタ
ル酸、酒″石酸、マロン酸などのジカルボン酸以上の多
カルボン酸及びその誘導体、？リアネトールスルホン酸
、デキストラン硫酸などのスルホン酸誘導体及び硫酸誘
導体や？リアニオン等が適当である。

この多塩基酸は、そのまま試薬又は検体に添加しても良
いが、■多塩基酸の塩として、■多塩基酸と塩基の組み
合せとして、■多塩基酸の塩と他の塩の組み合せとして
又は■多塩基酸と他の塩の組み合せとしてのいずれかの
方法で添加することが好ましい。

上記において、塩の形成又は組み合せて配合するために
用いる塩基としては金属やアンモニウム化合物が使用で
きるが、多塩基酸と組み合わせた場合の、溶解性や血清
蛋白質等との反応性等を考慮した場合Ｌ１％　Ｎａ、Ｋ
。

Ｒｈ、Ｃｓなどの一価の金属及びアンモニウム塩が特に
優れている。多塩基酸と他の塩を組み合わせて使用する
場合の他の塩としては、金属やアンモニウムの塩が使用
できるが、Ｌｉ　。

Ｎａ＜　　Ｋ、Ｒｈ％　Ｃｍなどの一価の金属及びアン
モニウムとハロゲン原子の塩が好ましい。

本発明における多塩基酸及び／又は他の塩の配合の効果
は、使用する免疫グロブリン類の濃度、使用する多塩基
酸と他の塩の種類及び組み合わせを選択すれば比較的低
濃度の添加でも十分に得ることができる。したがって、
添加する多塩基酸及び／又は他の塩の濃度を一概に規定
することは不可能であるが、例えば■多塩基酸の塩、■
多塩基酸と塩基を１ｍ又は２種以上で用いる場合、一般
的には酸基のモル濃度として０．１Ｍ以上で十分な効果
が得られ、よシ好ましくはα２Ｍ以上である。

■多塩基酸の塩と他の塩又は■多塩基酸と他の塩を組み
合わせ使用する場合、多塩基酸の塩又は多塩基酸を低濃
度で使用する場合には他の塩を高濃度で使用すれば良く
、多塩基酸の塩又は多塩基酸を高濃度で使用する場合に
は他の塩を低濃度で使用すれば良い。一般的には、前者
の場合、例えば多塩基酸の塩又は多塩基酸を１０　ｒｎ
Ｍ以上、他の塩を（Ｌ２Ｍ以上、後者の場合例えば多塩
基酸の塩又は多塩基酸を１００　ｍＭ以上、他の塩ｔ−
５０ｒｎＭで使用すれば良く、好ましくは何れの場合で
も多塩基酸の塩又は多塩基酸を５０　ｍＭ以上、他の塩
を０２Ｍ以上用いれば良い。フィチン酸などに代表され
る様な一分子中に多数の酸基を含む化合物では効果が大
きく通常の酸に比較し酸基の濃度としてもよシ低濃度で
十分な効果が得られる。

本発明における多塩基酸及び他の塩の濃度の上限につい
ても、使用する免疫グロブリン類の種類、濃度にも依存
することがら、−概に規定することは出来ないが、一般
的には多塩基酸又はその塩と塩基又は他の塩とを共存さ
せた時の溶解性を考慮し、塩析効果などの生じない濃度
及び濃度の組み合わせで使用すれば良い。

例えば抗血清をそのまま用い多塩基酸の塩として例えば
、リン酸ナトリウムを、例えばｐＨ７，０で用いる場合
、には、リン酸ナトリウムとしてはα９Ｍ以下、より好
ましくは０８Ｍ以下で使用すれば良い。例えば、免疫グ
ロブリン類として抗血清を用い、例えば、多塩基酸の塩
としてリン酸ナトリウム、他の塩として塩化ナトリウム
を用いた場合、リン酸ナトリウムをα１Ｍ以下で用いる
場合には、塩化ナトリウムとしては４Ｍ程度まで用いる
ことが出来る。リン酸ナトリウムをα２５Ｍとした場合
には塩化す）　ＩＪウムは３Ｍ以下が望ましい。また、
リン酸ナトリウムをα５Ｍで用いる場合には、塩化ナト
リウムとしては２Ｍ以下が望ましい。また、例えば、免
疫グロブリン類として抗血清または硫安分画法によるガ
ンマ−グロブリン分画を用い、例えば、多塩基酸の塩と
してデキストラン硫酸ナトリウム（分子量１５０００）
を用いた場合には、デキストラン硫酸ナトリウムとして
は２２　ｍＭできれば２０　ｒａＭ以下で使用すること
が望ましい。

本発明方法においては、上記の如く、多塩基酸単独のみ
ならずその塩又はこれと塩基若しくは他の塩と組み合せ
て使用することもできる。これらの場合試薬又は検体中
のｐＨは、使用する多塩基酸の電離定数によシ異なるが
、多塩基酸が第一電離でき、少なくとも第二電離が部分
的にでも起こるｐＨ以上であることが好ましい。

本発明の免疫反応の測定方法としては免疫比濁法やラテ
ックスなどの不溶性担体に抗体を結合させて用いるラテ
ックス免疫比濁法などが代表的であシ、免疫グロブリン
を含む試薬又は検体に多塩基酸を配合する以外は公知の
方法に従って実施することができる。

すなわち、本発明の方法は、試薬又は検体中の抗血清及
び抗体の種類、抗体の対象抗原の種類に関係無く、免疫
グロブリンをそのまま用いた場合でも、免疫グロブリン
を種々の方法により精製又は加工して用いた°場合でも
、免疫グロブリンを化学的又は物理的な方法で他の物質
と結合させて用いた場合でも適用することが可能であり
、十分な効果を得ることができる。

〔作用及び発明の効果〕

本発明方法により、非特異反応が抑制される理由は、ア
ルミナなどのセラミック親水性材料の表面において多塩
基酸がマトリックスを形成し、免疫グロブリンの吸着を
防げるためと解される。

したがって、流路切り換え弁等試薬又は検体が直接接触
する部分にアルミナ等の親水性材料を用いている分析装
置を使用し、免疫比濁法やラテックス免疫比濁法の試薬
を適用しても非特異的な凝集・沈澱の生成を抑えること
ができ、この結果、試薬ブランク値の変動を抑えること
ができ、各種免疫反応を精度良く測定することが可能で
ある。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明の効果をさらに詳細に説明す
るが、本発明は、これら実施例によって限定されるもの
ではない。

実施例１ 装置として流路切シ換え弁等、試薬が直接接触する部分
にアルミナ等の親水性材料が使用されている分析装置、
日立７３６型自動分析装置を用い、また、免疫グロブリ
ンを含む試薬として抗血清（抗ヒ）　ＣＲＰ血清）又は
正常ヤギ血清（以下ＮＧＳと略す）を用い、非特異的反
応の発生を調べた。試験において本現象が明確に捕えら
れるように、検体として生理食塩水を用い、試薬と親水
性材料の接触時間を２時間として、以下に示す分析条件
にて非特異的な凝集・沈澱による吸光度の変化を測定し
た。すなわち、第一試薬として非特異的な凝集によって
生じた沈澱にほとんど影響しない生理食塩水を２００μ
ｌ用い、検体として生理食塩水を１０μを添加し、さら
に第二試薬として上で調製した各試薬を１００μを注入
後、濁りに対して本分析装置において、最も高感度な波
長である３　４０　ｎｍでの吸光度を測定した。

多塩基酸又はその塩とその他の塩を用いて試験した結果
を第１表に、多塩基酸と塩基を用いて試験した結果を第
２表に、比較例を第３表にそれぞれ示す。なお、各表中
、効果は次の基準に従い示した。

効果ランク　効果の程度 １　　　顕著な効果があシ、吸光度の上昇が全く見られ
ない。実際の使用に問題ない。

２　　　顕著な効果があり、吸光度の上昇がわずかであ
る。実際の使用に問題ない。

３　　　効果があシ、吸光度の上昇が比較例に比べ少な
い。

５　　　効果がない。

また、抗ヒ）　ＣＲＰ血清（１０％）を用いた場合の、
リン酸ナトリウム添加による吸光度プロフィールの変化
を示す図面を第１図に示す。図中のグラフは、それぞれ
第１表の試料Ｎｎ１．３．４及び第３表の試料階１２５
に対応するものである。

（測定操作） ■試薬分注のための流路をしようする試薬で洗浄後、同
試薬を吸入する。

■この状態で２時間放置する。

■上記測定条件にて検体測定を行い、３４０ｎｍでの吸
光度を測定した。

（結果） 以下余白 多塩基酸の塩、多塩基酸又はその塩と他の塩又は多塩基
酸と、塩基を組み合わせて添加したものは、すべてほぼ
完全に非特異的凝集・沈澱による吸光度の上昇を抑えた
。これに対し、ただ単に塩を添加したものは、はとんど
効果が見られなかった。

実施例２ 抗血清として抗ヒ）ＩｇＧ血清、抗ヒ）ＩｇＡ血清、ヒ
ト抗１ｇＭ血清、抗と）Ｃ３血清、抗ヒ）Ｃ４血清を用
い、実施例１と同一条件にて非特異反応の発生を調べた
。

本発明の結果を第４表に、比較方法の結果を第５表に示
す。

以下余白 この結果から明らかなように、本発明方法は抗血清の種
類によらず、優れた効果を得ることができる。。

実施例３ 抗血清として抗ヒ）　ＩｇＧ血清を用い、実施例１と同
様にして非特異反応の発生を調べた。

本発明の結果を第６表に、比較方法の結果を第７表に示
す。

以下余白 実施例４ 試薬のｐＨを変化させ、実施例１と同様にして非特異反
応の発生を調べた。ｐＨＯ調製は、水酸化ナトリウムを
用いておこなった。

本発明の結果を第８表に、比較方法の結果を第９表に示
す。

以下余白

【図面の簡単な説明】

第１ 図は、 ン酸ナト ラムの添加による 吸光度プロフィ ールの変化を示す図面である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、試薬又は／及び検体と直接接触する部分が親水性材
   料で構成されている分析装置を使用し、抗原−抗体反応
   により検体中の目的物質を検出する免疫学的測定法にお
   いて、免疫グロブリン類を含む試薬又は検体に多塩基酸
   を添加することを特徴とする免疫反応の測定方法。