JP2000074921A - メチルオレンジを使った特異的結合アッセイ - Google Patents
メチルオレンジを使った特異的結合アッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、特異的結合アッセイの特異性を向
上させる方法、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体
を検出するためのアッセイ用マイクロウエルの製造に使
用される色素が固相上にコーティングされたタンパク質
の生物学的性質を妨害しない、ＨＣＶ抗体の検出方法を
提供する。 【解決手段】 前者の方法は、特異性を向上させるのに
十分な量でメチルオレンジをコーティング溶液に添加す
ることにより行われる。後者の方法は、i)メチルオレン
ジおよびＨＣＶ抗体のための少なくとも１つの第一の結
合性リガンドを含有するコーティング溶液を含んで成る
固相を提供し；ii) 前記固相をＨＣＶ抗体を含む可能性
のある試料と接触させ；iii)前記固相をＨＣＶ抗体のた
めの少なくとも１つの第二の検出可能な基により標識さ
れた結合性リガンドと接触させ；そしてiv) 前記固相に
結合した検出可能な基の量を測定することを含んで成
る。
上させる方法、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体
を検出するためのアッセイ用マイクロウエルの製造に使
用される色素が固相上にコーティングされたタンパク質
の生物学的性質を妨害しない、ＨＣＶ抗体の検出方法を
提供する。 【解決手段】 前者の方法は、特異性を向上させるのに
十分な量でメチルオレンジをコーティング溶液に添加す
ることにより行われる。後者の方法は、i)メチルオレン
ジおよびＨＣＶ抗体のための少なくとも１つの第一の結
合性リガンドを含有するコーティング溶液を含んで成る
固相を提供し；ii) 前記固相をＨＣＶ抗体を含む可能性
のある試料と接触させ；iii)前記固相をＨＣＶ抗体のた
めの少なくとも１つの第二の検出可能な基により標識さ
れた結合性リガンドと接触させ；そしてiv) 前記固相に
結合した検出可能な基の量を測定することを含んで成
る。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、特異的結合アッセ
イ用の固相の調製方法において、および容器中に計量分
配されたコーティング溶液の容量をモニタリングするた
めに、使用するコーティング溶液に色素、特にメチルオ
レンジ、を添加することに関する。
イ用の固相の調製方法において、および容器中に計量分
配されたコーティング溶液の容量をモニタリングするた
めに、使用するコーティング溶液に色素、特にメチルオ
レンジ、を添加することに関する。
【０００２】
【従来の技術】自然の結合反応を利用する特異的結合ア
ッセイ、特にイムノアッセイは、臨床化学における分析
技術として広範な用途が見出されている。反応の特異性
のために、それらは生物学的液体中に非常に低い濃度で
存在する生物学的分析物（analyte ）を定量するのに特
に有利である。そのような分析物としては、例えば、抗
原、抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、タンパク
質などが挙げられる。
ッセイ、特にイムノアッセイは、臨床化学における分析
技術として広範な用途が見出されている。反応の特異性
のために、それらは生物学的液体中に非常に低い濃度で
存在する生物学的分析物（analyte ）を定量するのに特
に有利である。そのような分析物としては、例えば、抗
原、抗体、治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、タンパク
質などが挙げられる。
【０００３】様々な色素または着色剤（以下、「色素」
と総称する）が、試薬の計量分配（dispensing）のモニ
タリングまたは試薬の計量分配の分光光度的モニタリン
グを助ける商業的なイムノアッセイコーティング方法に
おいて使われている。そのような色素の多くは市販され
ている。基本的に、色素は可視検出に備える。これは、
例えば生物学的物質をマイクロウエルの表面上にコーテ
ィングするための製造方法の際に、容器、例えばマイク
ロウエル中への溶液の計量分配をモニタリングするのに
特に有用となり得る。次いでコーティングされた容器が
イムノアッセイ用の固相として使われる。使用する色素
が固相支持体上にコーティングされたタンパク質の生物
学的性質を妨害しないことが望ましい。
と総称する）が、試薬の計量分配（dispensing）のモニ
タリングまたは試薬の計量分配の分光光度的モニタリン
グを助ける商業的なイムノアッセイコーティング方法に
おいて使われている。そのような色素の多くは市販され
ている。基本的に、色素は可視検出に備える。これは、
例えば生物学的物質をマイクロウエルの表面上にコーテ
ィングするための製造方法の際に、容器、例えばマイク
ロウエル中への溶液の計量分配をモニタリングするのに
特に有用となり得る。次いでコーティングされた容器が
イムノアッセイ用の固相として使われる。使用する色素
が固相支持体上にコーティングされたタンパク質の生物
学的性質を妨害しないことが望ましい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、タンパ
ク質の中には色素と相互作用するものがあり、その結果
として、この相互作用がアッセイ性能を低下させてしま
うことがある。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に
対する抗体を検出するためのアッセイに使われるマイク
ロウエルの製造の際にこのような問題が認められてい
る。
ク質の中には色素と相互作用するものがあり、その結果
として、この相互作用がアッセイ性能を低下させてしま
うことがある。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に
対する抗体を検出するためのアッセイに使われるマイク
ロウエルの製造の際にこのような問題が認められてい
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の１つの
目的は、抗ＨＣＶアッセイに存在するＨＣＶ抗原タンパ
ク質に対して有害な影響を与えない、ＨＣＶ抗原を含ん
で成る固相コーティングを使用できる色素を提供するこ
と、およびマイクロウエル充填容量のモニタリングを助
けることである。本発明の別の目的は、アッセイ性能を
実際に向上させるであろう色素を提供することである。
目的は、抗ＨＣＶアッセイに存在するＨＣＶ抗原タンパ
ク質に対して有害な影響を与えない、ＨＣＶ抗原を含ん
で成る固相コーティングを使用できる色素を提供するこ
と、およびマイクロウエル充填容量のモニタリングを助
けることである。本発明の別の目的は、アッセイ性能を
実際に向上させるであろう色素を提供することである。
【０００６】本発明は、特異的結合アッセイ用の固相の
調製方法において、および容器中に計量分配されたコー
ティング溶液の容量をモニタリングするために、使用す
るコーティング溶液に色素、特にメチルオレンジ、を添
加することに関する。比色モニタリングを可能にするた
めの抗Ｃ型肝炎ウイルスイムノアッセイ用コーティング
組成物および固相に計量分配されるコーティング液容量
の制御方法に使われる多数の色素が研究されている。そ
れらの色素の多くはＨＣＶ組換えコーティングタンパク
質の活性を低下させた。意外にも、本出願人らは、メチ
ルオレンジの添加によって、コーティング溶液の容量を
モニタリングできるだけでなく、色素としてのメチルオ
レンジの使用がタンパク質（特にＨＣＶ抗原）と正の相
互作用をすることにより、アッセイ結果の特異性を向上
させることができることを発見した。従って、図１と図
２の比較に示されるように、メチルオレンジを含有する
固相のコーティング溶液が、陽性試料と陰性試料とのよ
り明確な区別を可能にする。
調製方法において、および容器中に計量分配されたコー
ティング溶液の容量をモニタリングするために、使用す
るコーティング溶液に色素、特にメチルオレンジ、を添
加することに関する。比色モニタリングを可能にするた
めの抗Ｃ型肝炎ウイルスイムノアッセイ用コーティング
組成物および固相に計量分配されるコーティング液容量
の制御方法に使われる多数の色素が研究されている。そ
れらの色素の多くはＨＣＶ組換えコーティングタンパク
質の活性を低下させた。意外にも、本出願人らは、メチ
ルオレンジの添加によって、コーティング溶液の容量を
モニタリングできるだけでなく、色素としてのメチルオ
レンジの使用がタンパク質（特にＨＣＶ抗原）と正の相
互作用をすることにより、アッセイ結果の特異性を向上
させることができることを発見した。従って、図１と図
２の比較に示されるように、メチルオレンジを含有する
固相のコーティング溶液が、陽性試料と陰性試料とのよ
り明確な区別を可能にする。
【０００７】従って、本発明の一態様は、メチルオレン
ジで処理された少なくとも１つの固定化ＨＣＶ抗原を含
んで成るイムノアッセイ用固相を提供することである。
本発明の好ましい態様は、ＨＣＶ抗原がウイルスゲノム
のＮＳ３および／またはＮＳ４領域から発現される場合
である。より好ましい態様は、ＨＣＶ抗原がｃ２００で
ある場合である。
ジで処理された少なくとも１つの固定化ＨＣＶ抗原を含
んで成るイムノアッセイ用固相を提供することである。
本発明の好ましい態様は、ＨＣＶ抗原がウイルスゲノム
のＮＳ３および／またはＮＳ４領域から発現される場合
である。より好ましい態様は、ＨＣＶ抗原がｃ２００で
ある場合である。
【０００８】本発明の別の目的は、コーティングを使っ
て実施されるイムノアッセイの特異性を向上させるのに
十分な量でメチルオレンジをコーティング溶液に添加す
ることにより、抗ＨＣＶイムノアッセイの特異性を向上
させる方法を提供することである。
て実施されるイムノアッセイの特異性を向上させるのに
十分な量でメチルオレンジをコーティング溶液に添加す
ることにより、抗ＨＣＶイムノアッセイの特異性を向上
させる方法を提供することである。
【０００９】本発明のこの観点の好ましい態様では、 i) メチルオレンジおよびＣ型肝炎ウイルスに対する抗
体のための少なくとも１つの第一の結合性リガンドを含
有するコーティング溶液を含んで成る固相を提供し； ii) 前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を含む可
能性のある試料と接触させ； iii)前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体のための
少なくとも１つの第二の結合性リガンドと接触させ、こ
こで前記第二の結合性リガンドは直接的にまたは間接的
に検出可能な基により標識されており；そして iv) 前記固相に結合した検出可能な基の量を測定するこ
とにより、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出方法が
実施される。あるいは、ＨＣＶに対する抗体の存否の指
標として、固相に結合しなかった検出可能な基の量を測
定することができる。検出可能な基は、例えば、酵素、
放射性元素、蛍光性分子、または発光性分子であること
ができる。当業者は、i)〜iv) の段階が連続してまたは
同時に実施できることを理解するだろう。また、第一の
結合性リガンドと第二の結合性リガンドが同一であって
もまたは異なってもよいことを理解するだろう。更に、
測定された検出可能な基の量を、試料中に存在する抗Ｈ
ＣＶ抗体の量に関連づけることができる。
体のための少なくとも１つの第一の結合性リガンドを含
有するコーティング溶液を含んで成る固相を提供し； ii) 前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を含む可
能性のある試料と接触させ； iii)前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体のための
少なくとも１つの第二の結合性リガンドと接触させ、こ
こで前記第二の結合性リガンドは直接的にまたは間接的
に検出可能な基により標識されており；そして iv) 前記固相に結合した検出可能な基の量を測定するこ
とにより、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出方法が
実施される。あるいは、ＨＣＶに対する抗体の存否の指
標として、固相に結合しなかった検出可能な基の量を測
定することができる。検出可能な基は、例えば、酵素、
放射性元素、蛍光性分子、または発光性分子であること
ができる。当業者は、i)〜iv) の段階が連続してまたは
同時に実施できることを理解するだろう。また、第一の
結合性リガンドと第二の結合性リガンドが同一であって
もまたは異なってもよいことを理解するだろう。更に、
測定された検出可能な基の量を、試料中に存在する抗Ｈ
ＣＶ抗体の量に関連づけることができる。
【００１０】最後に、本発明の別の態様は、特異的結合
アッセイ用の固相をコーティングするための改良方法で
あって、特異的結合アッセイの特異性を向上させるのに
十分な量でメチルオレンジをコーティング溶液に添加す
ることを含んで成る方法を提供する。
アッセイ用の固相をコーティングするための改良方法で
あって、特異的結合アッセイの特異性を向上させるのに
十分な量でメチルオレンジをコーティング溶液に添加す
ることを含んで成る方法を提供する。
【００１１】本発明の他の利点は、次の発明の実施形態
および実施例から明らかになるであろう。
および実施例から明らかになるであろう。
【００１２】
【発明の実施の形態】メチルオレンジ色素は、両性であ
り、水に微溶性であり、且つモノアゾ色素である（Reag
ent Chemicals,第７版, Amer. Chem. Society, Washing
ton, DC, 1986 年, 第434 〜435 頁）。メチルオレンジ
の実験式は (CH3)2NC6H4N=NC6H4SO3Naである。それの主
な一般用途は、繊維産業においてであり、通常は酸性浴
からの毛および絹を染めること、並びに無機酸を中和す
ること（Analytical Chemistry(II) , 第９版, John Wi
ley & Sons, 1942 年, 第467 〜469 頁）、強塩基を指
示することおよび水のアルカリ性を評価すること（Merc
k Index,第11版, 6019）である。メチルオレンジの生物
学的用途は、下垂体の好酸性細胞を染色すること（Krey
berg染色）および植物材料を染色すること（Flemmings
染色）である。
り、水に微溶性であり、且つモノアゾ色素である（Reag
ent Chemicals,第７版, Amer. Chem. Society, Washing
ton, DC, 1986 年, 第434 〜435 頁）。メチルオレンジ
の実験式は (CH3)2NC6H4N=NC6H4SO3Naである。それの主
な一般用途は、繊維産業においてであり、通常は酸性浴
からの毛および絹を染めること、並びに無機酸を中和す
ること（Analytical Chemistry(II) , 第９版, John Wi
ley & Sons, 1942 年, 第467 〜469 頁）、強塩基を指
示することおよび水のアルカリ性を評価すること（Merc
k Index,第11版, 6019）である。メチルオレンジの生物
学的用途は、下垂体の好酸性細胞を染色すること（Krey
berg染色）および植物材料を染色すること（Flemmings
染色）である。
【００１３】結合ペアを用いる「特異的結合アッセイ」
では、「結合性リガンド」は一対の結合ペアのどちらの
成分であってもよい。最も汎用される結合ペアは抗体と
抗原または抗体とハプテンであるが、特異的結合反応に
参加できる他の結合タンパク質レセプターおよび生物学
的分子も使用できる。抗体と抗原との結合反応の場合、
抗体か抗原のいずれかが結合性リガンドであることがで
きる。
では、「結合性リガンド」は一対の結合ペアのどちらの
成分であってもよい。最も汎用される結合ペアは抗体と
抗原または抗体とハプテンであるが、特異的結合反応に
参加できる他の結合タンパク質レセプターおよび生物学
的分子も使用できる。抗体と抗原との結合反応の場合、
抗体か抗原のいずれかが結合性リガンドであることがで
きる。
【００１４】本明細書中で用いる「固相」は、不溶性で
あり、且つ特異的結合アッセイにおいて用いられる結合
性リガンドをそれに直接的にまたは間接的に取り付ける
ことができる、任意の材料を指す。この固相は、結合性
リガンドを引きつけそして固定化する固有特性のために
選択することができる。あるいは、固相はアビジンまた
はストレプトアビジンとビオチンとを使った特異的結合
反応を通して結合性リガンドを固定化する能力を保持す
ることができる。天然材料、合成材料、または合成的に
改変された天然材料を固相として用いることができる。
固相に好ましい材料はポリスチレンである。所望によ
り、固相は粒子、ディップスティック、または特異的反
応を実施する容器の形であることができる。
あり、且つ特異的結合アッセイにおいて用いられる結合
性リガンドをそれに直接的にまたは間接的に取り付ける
ことができる、任意の材料を指す。この固相は、結合性
リガンドを引きつけそして固定化する固有特性のために
選択することができる。あるいは、固相はアビジンまた
はストレプトアビジンとビオチンとを使った特異的結合
反応を通して結合性リガンドを固定化する能力を保持す
ることができる。天然材料、合成材料、または合成的に
改変された天然材料を固相として用いることができる。
固相に好ましい材料はポリスチレンである。所望によ
り、固相は粒子、ディップスティック、または特異的反
応を実施する容器の形であることができる。
【００１５】本明細書中で用いる「コーティング溶液」
は、特異的結合アッセイを実施する前に固相と接触され
る任意の溶液または試薬のことを言う。コーティング溶
液はタンパク質および／または緩衝液を含んでもよい
が、それらに限定されない。当業者は、適当なコーティ
ング溶液を製造しそして適当な固相に適当なコーティン
グ溶液を適用する方法を知っているだろう。
は、特異的結合アッセイを実施する前に固相と接触され
る任意の溶液または試薬のことを言う。コーティング溶
液はタンパク質および／または緩衝液を含んでもよい
が、それらに限定されない。当業者は、適当なコーティ
ング溶液を製造しそして適当な固相に適当なコーティン
グ溶液を適用する方法を知っているだろう。
【００１６】本明細書中で用いる「試料」は、着目の分
析物を含む可能性のある任意の物質を言う。試料は生物
学的液体、例えば全血；赤血球、白血球、血小板、血清
および血漿をはじめとする全血成分；腹水、尿、脳脊髄
液；並びに着目の分析物を含み得る他の体成分であるこ
とができる。所望により、試料は水、土壌および植物か
ら得られてもよい。
析物を含む可能性のある任意の物質を言う。試料は生物
学的液体、例えば全血；赤血球、白血球、血小板、血清
および血漿をはじめとする全血成分；腹水、尿、脳脊髄
液；並びに着目の分析物を含み得る他の体成分であるこ
とができる。所望により、試料は水、土壌および植物か
ら得られてもよい。
【００１７】ＮＳ３／ＮＳ４領域から発現されるＨＣＶ
抗原、特にｃ２００は、例えば、既知の組換えＤＮＡ技
術を使って調製することができる。ＨＣＶ配列（「ＨＣ
Ｖ−１」）はGENBANK の受入れ番号M62321から入手可能
である〔Nucleic Acid Res.,22:3441-3444 (1984)〕。
また、組換えＨＣＶタンパク質の調製も米国特許第5,70
5,330 号明細書に記載されている。
抗原、特にｃ２００は、例えば、既知の組換えＤＮＡ技
術を使って調製することができる。ＨＣＶ配列（「ＨＣ
Ｖ−１」）はGENBANK の受入れ番号M62321から入手可能
である〔Nucleic Acid Res.,22:3441-3444 (1984)〕。
また、組換えＨＣＶタンパク質の調製も米国特許第5,70
5,330 号明細書に記載されている。
【００１８】ＨＣＶゲノムおよび推定組換えタンパク質
は、Uyttendaele 他によりVox Sang. 66:122-129 (199
4) 中に示されている。特に、ｃ２００のアミノ酸配列
はＡＡ1192〜1931である。ＨＣＶゲノム組織の更なる考
察は、Cees, L. Van der Poel他によるThe Lancet, 33
4:1475-1479 (1994)中に見つけることができる。
は、Uyttendaele 他によりVox Sang. 66:122-129 (199
4) 中に示されている。特に、ｃ２００のアミノ酸配列
はＡＡ1192〜1931である。ＨＣＶゲノム組織の更なる考
察は、Cees, L. Van der Poel他によるThe Lancet, 33
4:1475-1479 (1994)中に見つけることができる。
【００１９】本発明は固相コーティング溶液中にメチル
オレンジを使用することにより、比色プロセス制御を可
能にし且つ意外にもアッセイ性能を向上させる。コーテ
ィング溶液へのメチルオレンジの添加は、ＨＣＶ組換え
タンパク質と陽性に相互作用して比色プロセス制御を可
能にし且つアッセイの特異性を向上させた。
オレンジを使用することにより、比色プロセス制御を可
能にし且つ意外にもアッセイ性能を向上させる。コーテ
ィング溶液へのメチルオレンジの添加は、ＨＣＶ組換え
タンパク質と陽性に相互作用して比色プロセス制御を可
能にし且つアッセイの特異性を向上させた。
【００２０】本発明の有効性および利点を下記の実施例
により更に説明する。この実施例は例示するためのもの
であって、本発明の範囲および精神を限定するためのも
のではない。
により更に説明する。この実施例は例示するためのもの
であって、本発明の範囲および精神を限定するためのも
のではない。
【００２１】
【実施例】実施例１：ＨＣＶ抗原コーティング工程中の
メチルオレンジの適用： AMERLITEポリスチレン製マイクロウエル（Ortho-Clinic
al Diagnostics, U.K.）を200 μL のコーティング緩衝
液１またはコーティング緩衝液２（その組成は下記に記
載する）のいずれかと共にインキュベートすることによ
り、該マイクロウエルにＨＣＶ抗原（Chiron Corporati
on, Emeryville, CA, USA から入手した、ｃ２２−３，
ｃ２００およびＮＳ−５）をコーティングした。該ウエ
ルを室温で16時間インキュベートした。ショ糖、塩類お
よびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するTRIS緩衝
液, pH 8.5で洗浄した後、マイクロウエルを乾燥し、そ
して２〜８℃で乾燥保存した。
メチルオレンジの適用： AMERLITEポリスチレン製マイクロウエル（Ortho-Clinic
al Diagnostics, U.K.）を200 μL のコーティング緩衝
液１またはコーティング緩衝液２（その組成は下記に記
載する）のいずれかと共にインキュベートすることによ
り、該マイクロウエルにＨＣＶ抗原（Chiron Corporati
on, Emeryville, CA, USA から入手した、ｃ２２−３，
ｃ２００およびＮＳ−５）をコーティングした。該ウエ
ルを室温で16時間インキュベートした。ショ糖、塩類お
よびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するTRIS緩衝
液, pH 8.5で洗浄した後、マイクロウエルを乾燥し、そ
して２〜８℃で乾燥保存した。
【００２２】コーティング緩衝液１ ，pH 6.95-7.05 第二リン酸ナトリウム 5.45 g／L 第一リン酸カリウム 1.55 g／L ２−クロロアセトアミド 1.00 g／L ＥＤＴＡ 0.744 g／L ＢＳＡ（プロテアーゼ不含有） 0.004 g／L ｃ２２−３ 0.6 mg／L ｃ２００ 1.0 mg／L ＮＳ−５ 0.25 mg／L 脱イオン水 1 L までコーティング緩衝液２ ，pH 6.95-7.05 コーティング緩衝液１中のメチルオレンジ 0.003 g／L
【００２３】ＨＣＶに対する抗体を測定するのに次のア
ッセイプロトコールを使って、コーティングされたマイ
クロウエルの性能を評価した。20μL の試料（既知抗Ｈ
ＣＶ活性を有するヒト血漿プール）と160 μL の試料希
釈剤（リン酸塩緩衝化塩溶液, pH 7.4）をＨＣＶコーテ
ィングしたマイクロウエルに添加し、そしてAMERLITEイ
ンキュベーター中で37℃にて30分間マイクロウエルをイ
ンキュベートした。マイクロウエルをAMERLITE洗浄器上
で洗浄した後、180 μL の西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）標識抗ヒトIgＧモノクローナル抗体を加え、
マイクロウエルを更に15分間インキュベートした。再び
マイクロウエルをAMERLITE洗浄器上で洗浄した後、増強
発光反応〔Whitehead 他(1983), Nature 305, 1158-115
9 〕によりＨＲＰ活性を測定した。発光性基質（ルミノ
ール誘導体および過酸塩）並びにエンハンサー（置換フ
ェノール）を含有するAMERLITEシグナル試薬をマイクロ
ウエルに添加して、発光反応を開始させた。AMERLITEア
ナライザー中で光シグナルを読み取った。
ッセイプロトコールを使って、コーティングされたマイ
クロウエルの性能を評価した。20μL の試料（既知抗Ｈ
ＣＶ活性を有するヒト血漿プール）と160 μL の試料希
釈剤（リン酸塩緩衝化塩溶液, pH 7.4）をＨＣＶコーテ
ィングしたマイクロウエルに添加し、そしてAMERLITEイ
ンキュベーター中で37℃にて30分間マイクロウエルをイ
ンキュベートした。マイクロウエルをAMERLITE洗浄器上
で洗浄した後、180 μL の西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）標識抗ヒトIgＧモノクローナル抗体を加え、
マイクロウエルを更に15分間インキュベートした。再び
マイクロウエルをAMERLITE洗浄器上で洗浄した後、増強
発光反応〔Whitehead 他(1983), Nature 305, 1158-115
9 〕によりＨＲＰ活性を測定した。発光性基質（ルミノ
ール誘導体および過酸塩）並びにエンハンサー（置換フ
ェノール）を含有するAMERLITEシグナル試薬をマイクロ
ウエルに添加して、発光反応を開始させた。AMERLITEア
ナライザー中で光シグナルを読み取った。
【００２４】未知の試料についての≧１のシグナル対カ
ットオフ比（Ｓ／Ｃ）値が反応性試料および抗ＨＣＶの
存在可能性を示すように、アッセイにおける既知の陽性
試料（抗ＨＣＶ活性を含む）について得られた光シグナ
ルに換算係数を掛けたものをカットオフ値として設定し
た。＜0.9 の結果は抗ＨＣＶが陰性である非反応性試料
を示す。≧0.9 〜＜１の結果は、グレーゾーン試料（ど
ちらとも言えない試料）を示す。
ットオフ比（Ｓ／Ｃ）値が反応性試料および抗ＨＣＶの
存在可能性を示すように、アッセイにおける既知の陽性
試料（抗ＨＣＶ活性を含む）について得られた光シグナ
ルに換算係数を掛けたものをカットオフ値として設定し
た。＜0.9 の結果は抗ＨＣＶが陰性である非反応性試料
を示す。≧0.9 〜＜１の結果は、グレーゾーン試料（ど
ちらとも言えない試料）を示す。
【００２５】コーティング溶液中にメチルオレンジを使
って調製したマイクロウエル（ＭＯウエル）は、抗ＨＣ
Ｖアッセイにおいて、色素を含まないコーティング溶液
を使って調製したマイクロウエル（対照ウエル）に比較
して、より低い光シグナルを与えた。陽性対照について
のカットオフを設定するための換算係数は0.25に設定し
た。Ｓ／Ｃに関する対照の性能は比較的変わらずに保持
され（第１表）、このことは、コーティング緩衝液への
メチルオレンジの添加がアッセイの感度、即ち弱陽性の
試料を検出するアッセイ能力、に有害な影響を与えなか
ったことを示す。
って調製したマイクロウエル（ＭＯウエル）は、抗ＨＣ
Ｖアッセイにおいて、色素を含まないコーティング溶液
を使って調製したマイクロウエル（対照ウエル）に比較
して、より低い光シグナルを与えた。陽性対照について
のカットオフを設定するための換算係数は0.25に設定し
た。Ｓ／Ｃに関する対照の性能は比較的変わらずに保持
され（第１表）、このことは、コーティング緩衝液への
メチルオレンジの添加がアッセイの感度、即ち弱陽性の
試料を検出するアッセイ能力、に有害な影響を与えなか
ったことを示す。
【００２６】実施例２：特異性研究 実施例１に記載の通りにマイクロウエルをＨＣＶ抗原に
よりコーティングした。ＨＣＶに対する抗体が陰性であ
ると推定された430 人のヒト血液提供者の血清を、実施
例１の抗ＨＣＶアッセイプロトコールに従って、マイク
ロウエルを使って試験した。陰性血清についてのＳ／Ｃ
値は、対照ウエルに比較してＭＯウエルを使った時、一
般に低かった（平均Ｓ／Ｃ値＝それぞれ0.13および0.1
6）（図１）。≦0.1 のＳＣ値は、ＭＯウエルを使った
時は提供者の42％に得られたのに対し、対照ウエルを使
った時は17％に得られた。これらの値は、個々の提供者
血清について得られた結果に関するものであるので、実
施例１の血清プールの対照に対する結果と直接比較する
ことはできないだろう。陰性試料について得られたＳ／
Ｃの低下結果は、特異性の改善と陰性試料とカットオフ
の良好な区別をもたらす。この改善された分布を用い
て、カットオフを適切にポジショニングすることによ
り、アッセイの感度と特異性を最適化することができ
る。例えば、アッセイの性能を最適化するために、実施
例３では陽性対照についてのカットオフを設定する換算
係数を0.33に設定した。
よりコーティングした。ＨＣＶに対する抗体が陰性であ
ると推定された430 人のヒト血液提供者の血清を、実施
例１の抗ＨＣＶアッセイプロトコールに従って、マイク
ロウエルを使って試験した。陰性血清についてのＳ／Ｃ
値は、対照ウエルに比較してＭＯウエルを使った時、一
般に低かった（平均Ｓ／Ｃ値＝それぞれ0.13および0.1
6）（図１）。≦0.1 のＳＣ値は、ＭＯウエルを使った
時は提供者の42％に得られたのに対し、対照ウエルを使
った時は17％に得られた。これらの値は、個々の提供者
血清について得られた結果に関するものであるので、実
施例１の血清プールの対照に対する結果と直接比較する
ことはできないだろう。陰性試料について得られたＳ／
Ｃの低下結果は、特異性の改善と陰性試料とカットオフ
の良好な区別をもたらす。この改善された分布を用い
て、カットオフを適切にポジショニングすることによ
り、アッセイの感度と特異性を最適化することができ
る。例えば、アッセイの性能を最適化するために、実施
例３では陽性対照についてのカットオフを設定する換算
係数を0.33に設定した。
【００２７】実施例３：感度研究 実施例１に記載の通りにマイクロウエルをＨＣＶ抗原に
よりコーティングした。Boston Biomedica Inc., West
Bridgewater, MA, USAから得られた、市販のセロコンバ
ージョンパネルを使って、実施例１のアッセイプロトコ
ールに従って、抗ＨＣＶアッセイの臨床感度を評価し
た。Ｓ／Ｃ比は、0.33の換算係数を掛けた陽性対照シグ
ナルのカットオフ値を使って算出した。このアッセイに
よるセロコンバージョンパネルの結果は、ＭＯウエルと
対照ウエルを使った時同じであった（第２ａ〜ｅ表）。
試料の陰性または陽性状態に全く変化がなかったことか
ら、コーティング組成物へのメチルオレンジの添加はア
ッセイ感度に何ら有害な結果を与えなかった。
よりコーティングした。Boston Biomedica Inc., West
Bridgewater, MA, USAから得られた、市販のセロコンバ
ージョンパネルを使って、実施例１のアッセイプロトコ
ールに従って、抗ＨＣＶアッセイの臨床感度を評価し
た。Ｓ／Ｃ比は、0.33の換算係数を掛けた陽性対照シグ
ナルのカットオフ値を使って算出した。このアッセイに
よるセロコンバージョンパネルの結果は、ＭＯウエルと
対照ウエルを使った時同じであった（第２ａ〜ｅ表）。
試料の陰性または陽性状態に全く変化がなかったことか
ら、コーティング組成物へのメチルオレンジの添加はア
ッセイ感度に何ら有害な結果を与えなかった。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】
【表４】
【００３２】当業者は、計量分配操作の間に間隔をあけ
て光学的に透明なマイクロウエル中に計量分配されるコ
ーティング溶液の容量測定を可能にすることにより、色
素の濃度を450 nmでの分光光度測定によりモニタリング
することができ、よってウエルのコーティングのプロセ
ス制御を助けるものとして利用できることを理解するだ
ろう。
て光学的に透明なマイクロウエル中に計量分配されるコ
ーティング溶液の容量測定を可能にすることにより、色
素の濃度を450 nmでの分光光度測定によりモニタリング
することができ、よってウエルのコーティングのプロセ
ス制御を助けるものとして利用できることを理解するだ
ろう。
【図１】図１はマイクロウエルコーティング溶液中にメ
チルオレンジを含まない試料のヒストグラムを表す。
チルオレンジを含まない試料のヒストグラムを表す。
【図２】図２はマイクロウエルコーティング溶液中にメ
チルオレンジを含む試料のヒストグラムを表す。
チルオレンジを含む試料のヒストグラムを表す。
Claims (10)
- 【請求項１】 メチルオレンジで処理された固定化Ｃ型
肝炎ウイルス抗原を含んで成る特異的結合アッセイ用固
相。 - 【請求項２】 前記Ｃ型肝炎ウイルス抗原がＣ型肝炎ウ
イルスゲノムのＮＳ３またはＮＳ４領域から発現され
る、請求項１に記載の固相。 - 【請求項３】 前記Ｃ型肝炎ウイルス抗原がｃ２００で
ある、請求項２に記載の固相。 - 【請求項４】 抗Ｃ型肝炎ウイルスイムノアッセイの特
異性を向上させる方法であって、メチルオレンジにＨＣ
Ｖ抗原を暴露し、前記ＨＣＶ抗原を固相に結合させ、そ
して前記固相を使ってイムノアッセイを実施することを
含んで成る方法。 - 【請求項５】 Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体の検出方
法であって、 i) メチルオレンジおよびＣ型肝炎ウイルスに対する抗
体のための少なくとも１つの第一の結合性リガンドを含
有するコーティング溶液を含んで成る固相を提供し； ii) 前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を含む可
能性のある試料と接触させ； iii)前記固相をＣ型肝炎ウイルスに対する抗体のための
少なくとも１つの第二の結合性リガンドと接触させ、こ
こで前記第二の結合性リガンドは検出可能な基により標
識されており；そして iv) 前記固相に結合したまたは前記固相に結合しなかっ
た検出可能な基の量を測定することを含んで成る方法。 - 【請求項６】 前記検出可能な基が、酵素、放射性原
子、蛍光性分子および発光性分子から成る群より選ばれ
る、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記第一の結合性リガンドがｃ２００、
ｃ２２−３およびＮＳ５であり、そして前記第二の結合
性リガンドがヒトＩｇＧに対する抗体である、請求項５
に記載の方法。 - 【請求項８】 前記第一の結合性リガンドがｃ２００、
ｃ２２−３およびＮＳ５である、請求項５に記載の方
法。 - 【請求項９】 前記第二の結合性リガンドがヒトＩｇＧ
に対する抗体である、請求項５に記載の方法。 - 【請求項１０】 特異的結合アッセイ用固相をコーティ
ングする改良方法であって、特異的結合アッセイの特異
性を向上させるのに十分な量でメチルオレンジをコーテ
ィング溶液に添加することを含んで成る改良方法。
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|---|---|---|---|
| GB9813450:5 | 1998-06-22 | ||
| GB9813450A GB2339018B (en) | 1998-06-22 | 1998-06-22 | Specific binding assays using methyl orange |
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|---|---|
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| ES (1) | ES2220006T3 (ja) |
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| US5447838A (en) * | 1992-08-05 | 1995-09-05 | Hybritech Incorporated | Protein-dye conjugate for confirmation of correct dilution of calibrators |
| US5705330A (en) | 1995-04-14 | 1998-01-06 | Abbott Laboratories | Chemiluminescent immunoassay for antibody detection |
| ZA97248B (en) | 1996-01-18 | 1997-07-18 | Rohm & Haas | Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques |
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- 1998-06-22 GB GB9813450A patent/GB2339018B/en not_active Revoked
-
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- 1999-06-08 US US09/327,809 patent/US6251584B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-21 ES ES99304848T patent/ES2220006T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-21 DE DE69917378T patent/DE69917378T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-21 CA CA002275844A patent/CA2275844C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-21 AT AT99304848T patent/ATE267400T1/de active
- 1999-06-21 JP JP17402399A patent/JP3540675B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-21 EP EP99304848A patent/EP0967485B1/en not_active Expired - Lifetime
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| GB9813450D0 (en) | 1998-08-19 |
| CA2275844A1 (en) | 1999-12-22 |
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| DE69917378T2 (de) | 2005-07-14 |
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