FI78181B - Foerfarande, testfoerpackning och reagens foer immunokemisk bestaemning av hepatitis b kaernantigener. - Google Patents

Description

Menetelmä, testipakkaus ja reagenssi hepatiitti B:n ydin- antigeenien immunokemiallista määritystä varten 1 78181 Tämä keksintö koskee menetelmää hepatiitti B:n ydin-5 antigeenien (HBcAg) kvalitatiivista ja/tai kvantitatiivista immunokemiallista määritystä varten sekä tässä menetelmässä käytettävää testipakkausta ja immunokemiallista reagens-sia.

Läheistä tekniikkaa esitetään US-patenttijulkaisussa 10 4 157 280, julkaisussa Chemical Abstracts 99 (1983) 3880s ja EP-hakemusjulkaisussa 12 699.

Virussyntyisessä hepatiittitartunnassa on tärkeätä tarkan diagnoosin tekemistä ja oikean hoitomenetelmän valintaa varten saada selville taudin aiheuttajan luonne ja 15 mikäli mahdollista selvittää paljonko sitä on läsnä. Lähinnä mikrobiologisia menetelmiä ovat tähän tarkoitukseen sopivimpia immunokemialliset menetelmät; nämä viimemainitut menetelmät ovat erityisen sopivia nopeita rutiinimäärityksiä varten, jotka haluttaessa voidaan suorittaa yksinker-20 taisesti ja huomattavan lukuisina.

Käyttämällä immunokemiallisia menetelmiä, voidaan antigeenit, jotka ovat tunnusomaisia kysymyksessä olevalle hepatiittivirukselle, selvittää kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti. Vain ne virussyntyiset antigeenit, jotka 25 ovat tutkittavassa näytteessä läsnä vapaina tai jotka ovat läsnä viruksen pinnalla, saadaan tällä tavalla selville.

Usein kuitenkin tieto, joka koskee tällaisen antigeenin läsnäoloa tai konsentraatiota, ei toistaiseksi anna mitään tarkkaa ilmoitusta siitä kehitysasteesta, jonka tar-30 tunta on saavuttanut. Erityisesti kysymyksen ollessa hepatiitti B viruksesta (HBV) syntyy hankaluutta sen johdos-• ; ta, että näin paljastuneiden antigeenien läsnäolo tai kon- sentraatio ei ole yksiselitteinen osoitus vahingoittumattomien, tartuntaa aiheuttavien HB-virusten läsnäolosta tai 35 konsentraatiosta. On tunnettua, että HBV-infektiossa sen ollessa edistyneessä vaiheessa ja HBV:n pitkäaikaisissa kantajissa, on läsnä suuria määriä vapaita viruksen pääl- 2 78181 lyste- eli pinta-antigeenejä (HBsAg) verenkierrossa, mutta toisaalta läsnä on hyvin harvoja tai ei lainkaan vahingoittumattomia HB-viruksia (niin kutsuttuja Dane-osasia). HBV-tartunnan varhaisemmassa vaiheessa on toisaalta läsnä huo-5 mättäviä määriä vahingoittumattomia viruksia. Nämä vahingoittumattomat virukset voidaan erottaa elektronimikros-kooppimenetelmien avulla HBsAg:stä, joka on vapaana ja suuressa määrin aggregoitunut erilaisiin muotoihin, mutta tällainen erottaminen ei ole mahdollista tunnetuilla immunoke-10 miallisilla menetelmillä. Morfologisesti on vahingoittumattomille HB-viruksille tunnusomaista geneettisen materiaalin ja muiden antigeenien (nimittäin ydin-antigeenin (HBcAg) läsnäolo pinta-antigeenien päällysteen sisässä. Peitteistä HBcAg ei voida saada selville tavanomaisten immunokemiallis-15 ten menetelmien avulla. Menetelmä, jonka avulla voidaan HBcAg:n paljastamisen kautta selvittää tartunnan (varhai nen) vaihe, on kuitenkin äärimmäisen tärkeä.

Nyt on keksitty menetelmä, jonka avulla on yllättäen toteutettavissa tutkittavassa näytteessä olevissa vahingoit-. . 20 tumattomissa HBV-osasissa läsnä olevan HBcAgsn tarkka ja * / herkkä määrittäminen.

Tämän aikaansaamiseksi on keksinnön mukaiselle mene-··: : telmälle tunnusomaista se, että näytettä inkuboidaan kanta- : jaan sidottujen immunoglobuliinien kanssa, jotka on kohdis ti' 25 tettu hepatiitti B:n pinta-antigeenejä (HBsAg) vastaan, : : : kantajaan sidottu ja nestemäinen faasi erotetaan toisistaan, kantajaan sidottua faasia inkuboidaan detergentin kanssa ja, samanaikaisesti tai sen jälkeen, inkuboidaan saatua liuosta immunoglobuliinien kanssa, jotka on kohdistettu 30 HBcAg:ä vastaan, jonka jälkeen määritetään HBcAg:n sitoutu-I I minen immunoglobuliineihin, jotka on kohdistettu mainittua antigeeniä vastaan, jolloin saadaan HBcAg:n kvalitatiivi-nen ja/tai kvantitatiivinen mittaustulos näytteessä.

:*·: HBcAg:n mahdollinen sitoutuminen immunoglobuliinei- -j ’ 35 hin, jotka on kohdistettu sitä vastaan, voidaan saada sel ville jollakin menetelmällä, jota tavanomaisesti käytetään 3 781 81 tähän tarkoitukseen inununokemiassa. On esimerkiksi mahdollista käyttää hyväksi agglutinaatioreaktiota tai niin kutsuttua "sandwich"-reaktiota.

Jos käytetään agglutinaatioreaktiota, käytetään im-5 munoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan, yleensä sidottuna osasiin. Antigeenin mahdollinen läsnäolo johtaa silloin osasten agglutinoitumiseen, mikä voidaan saada selville kvalitatiivisesti tai kvantitatiivisesti.

Siinä tapauksessa, että keksinnön mukaisessa menetel-10 mässä antigeeni paljastetaan "sandwich"-reaktion avulla, voidaan antigeeniä inkuboida sekä kantajaan sidotun että merkkiaineeseen sidotun immunoglobuliinin kanssa, joka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan. Molempien immunoglobuliinijohdannaisten yhdistetty sitominen HBcAg:iin aikaansaa merkki-15 aineen sitoutumisen kantajaan, ja kantajaan sidotun tai vapaan merkkiaineen paljastaminen antaa mittaustuloksen immunoglobuliinin sitoutumisesta antigeeniin ja sen johdosta läsnä olevan HBcAg:n määrän näytteessä.

Kantajaan sidotut immunoglobuliinit, jotka on kohdis-. . 20 tettu HBcAg:ä vastaan, voidaan vastaavasti sitoa kumpikin eri kantajiin ja ne voidaan saattaa samanaikaisesti tai toisistaan riippumatta kosketukseen koenesteen kanssa, tai ne voidaan yhdessä sitoa yhteen ja samaan kantajaan. Tämä viimeksi mainittu suoritusmuoto antaa yleensä määritysmenetel-25 män, jonka suoritustapa on yksinkertaisin.

Keksintö koskee myös testipakkausta, johon kuuluu ainakin muutamia komponentteja, jotka tarvitaan keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseen. Tällaisiin koestustar-vikkeisiin kuuluu tällöin myös ainakin immunoglobuliineja, 30 jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan samoin kuin kantajaan sidottuja immunoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBsAg:ä vastaan. Immunoglobuliinit, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan voivat testipakkauksessa olla sidotut esimerkiksi osasiin tai kantajaan. Tämä kantaja voi olla sama kuin se, 35 jolle immunoglobuliinit, jotka on kohdistettu HBsAg:ä vastaan, on sijoitettu tai se voi olla siitä erillinen. Haluttaessa voi testipakkaukseen sisältyä myös apuyhdisteitä 4 78181 keksinnön mukaisen määrityksen suorittamiseen, kuten yhdisteitä merkkiaineiden paljastamiseksi, pesupuskuriliuoksia ja/tai ainetta, joka särkee pinta-antigeenin päällysteen.

HBsAg:ä vastaan kohdistettujen immunoglobuliinien 5 kantajana on keksinnön mukaan mahdollista käyttää muodoltaan tai kooltaan mitä tahansa ainetta, joka tekee mahdolliseksi erottaa kantajaan sidotun ja kantajaan ei-sitoutu-neen faasin toisistaan.

Immunoglobuliinit voivat olla sidottuja kantajaan 10 suoraan tai epäsuorasti. Sitoutuminen kantajaan voi tapahtua kovalenttisidoksilla, ionisidoksilla tai vetysiltojen avulla tai ne voivat perustua esimerkiksi van der Waals'in vuorovaikutuksiin. Esimerkkejä sopivista kantajista ovat koeputket, mikrotitrauslevyjen tai suikaleiden syvennykset, 15 tai tangot, helmet tai levyt, jotka on valmistettu esimerkiksi lasista, muoveista tai luonnossa esiintyvistä aineista.

Sopivia detergenttejä ovat natriumdodekyylisulfaatti, natriumdodekyyli-N-sarkosinaatti, ketyylitrimetyyliammonium-20 bromidi, dodekyylipyrimidiniumkloridi, palmitoyylilysolesi-tiini, dodekyyli-N-betaiini, polyoksietyleenialkoholit, polyoksietyleeni-isoalkoholit, polyoksietyleeni-p-t-oktyy-lifenolit, polyoksietyleeninonyylifenolit, rasvahappojen polyoksietyleeniesterit, polyoksietyleenisorbitoliesterit, 25 natrium-dodekyylisulfonaatti, tetradekyyliammoniumbromidi ja saponiinit. Näistä ei-ionisoituvat detergentit ovat edullisia. Hyvin sopivia ei-ionisoituvia detergenttejä ovat polyoksietyleenijohdannaiset, joita ovat mm. Brij^, Triton , Nonidet P4(f^ ja Tweeii^.

30 Keksinnössä käytettäväksi soveltuvia osasia ovat esimerkiksi erytrosyytit, lateksihelmet, väriainesoliosa-set tai metallien tai metalliyhdisteiden osaset.

Kaikkia tavanomaisia merkkiaineita voidaan käyttää keksinnön yhteydessä: näitä ovat entsyymit, radioaktiiviset 35 atomit tai yhdisteet, fluorisoivat aineet, värilliset yh-disteet, väriainesolit, metallien tai metalliyhdisteiden solit ja niiden tapaiset.

5 78181

Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavan esimerkin avulla.

Esimerkki 1 HBcAqtn paljastaminen seerumissa 5 Tutkittiin kahta ryhmää seerumeja kasvavissa laimen nuksissa; nämä seerumit olivat anti-HBc-positiivisia ja johdetut HBsAg:n kantajista, mutta yhdessä seerumissa paljastui Dane-osasia elektronimikroskoopin avulla, kun taas toisessa ei näitä osasia ollut.

10 A. Reagenssit: 1. Päällystetyt mikrotitrauslevyt

Polystyreeniä olevien mikrotitrauslevyjen syvennykset päällystettiin sisäpuolelta immunoglobuliinien seoksella, jotka olivat kohdistetut HBsAg:ä ja HBcAg:ä vastaan, 15 inkuboimalla tätä seosta bikarbonaattipuskuriliuoksessa (pH 9,0) syvennyksissä 24 tuntia 20°C:ssa. Tämän jälkeen syvennykset pestiin käyttäen 0,15 moolia/litra fosfaatti-puskuria (pH 7,2).

2. Konjugaatti 20 Immunoglobuliinien, jotka oli kohdistettu HBcAg:ä ja piparjuuriperoksidaasia (HRP) vastaan, konjugaattia valmistettiin Nakane'n ja Kaeaoi'N menetelmän mukaan (J. Histochem., 1974, 22, 1084 - 1091).

B. Menetelmä 25 Päällystettyjä mikrotitrauslevyjä haudottiin 2 tun tia 37°C:ssa, jolloin kussakin syvennyksessä oli 0,1 ml tutkittavaa seerumia laimennussarjana 0,15 molaarisessa fosfaattipuskurissa (pH 7,2). Tämän jälkeen syvennykset imettiin tyhjiksi pestiin 3 kertaa 0,3 ml s 11a 0,15 molaa-30 rista fosfaattipuskuria (pH 7,2) ja imettiin tyhjiksi. Tämän jälkeen syvennyksiä inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa 0,1 ml:n kanssa Nonidet Ρ4(ί®:η liuosta 0,15 molaarisessa fosfaattipuskurissa (pH 7,2), pestiin 3 kertaa 0,3 ml:lla 0,15 molaarista fosfaattipuskuria (pH 7,2) ja imettiin 35 tyhjiksi.

6 78181 Tämän jälkeen pipetoitiin jokaiseen syvennykseen 0,1 ml konjugaattia (A2), laimennettuna 0,15 molaariseen fosfaattipuskuriin (pH 7,2). Sen jälkeen, kun oli inkuboi-tu 1 tunti 37°C:ssa, imettiin syvennykset tyhjiksi, pestiin 5 3 kertaa 0,3 ml:11a molaarista fosfaattipuskuria (pH 7,2) ja imettiin tyhjiksi. Jokaiseen syvennykseen lisättiin sen jälkeen 0,1 ml seosta, jossa oli 0,4 mg/ml o-fenyleenidi-amiinia ja 0,4 mg/ml ureaperoksidia 0,15 molaarisessa ase-taattipuskurissa (pH 5,0). 30 minuuttia kestäneen inkuboin-10 nin jälkeen reaktio keskeytettiin lisäämällä 0,1 ml liuosta, joka sisälsi 0,2 moolia rikkihappoa litraa kohti.

Näin saatujen liuosten absorptio mitattiin fotometrissä aaltopituudella 492 nm.

C. Tulokset 15 Absorptiomittauksien tulokset on esitetty taulukossa

Laimen- Laimenta- 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 nukset maton

Seerumi HBsAg 2q positiivinen >2,000 >,2000 1,150 0,638 0,401 0,276 ja Dane-as- tia_______ HBsAg positiivinen 0,150 0,153 0,147 0,158 0,142 0,151 eikä lainkaan Dane- 25 osasia_______ HBsAg negatiivinen 0,149 0,143 0,150 0,161 0,149 0,152 (kontrolli) _|_

Voidaan päätellä, että on olemassa positiivinen kor-30 relaatio seerumissa olevien Dane-osasten läsnäolon ja keksinnön menetelmän mukaisesti saadun konsentraatiosta riippuvan vasteen välillä.

7 78181

Patenttivaatimukset 1. Menetelmä hepatiitti B:n ydin-antigeenien (HBcAg) kvalitatiivista ja/tai kvantitatiivista immunokemiallista 5 määritystä varten, tunnettu siitä, että näytettä in-kuboidaan kantajaan sidottujen immunoglobuliinien kanssa, jotka on kohdistettu hepatiitti B:n pinta-antigeenejä (HBsAg) vastaan, kantajaan sidottu ja nestemäinen faasi erotetaan toisistaan, kantajaan sidottua faasia inkuboidaan 10 detergentin kanssa ja, samanaikaisesti tai sen jälkeen, in-kuooidaan saatua liuosta immunoglobuliinien kanssa, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan, jonka jälkeen määritetään HBcAg:n sitoutuminen immunoglobuliineihin, jotka on kohdistettu mainittua antigeeniä vastaan, jolloin saadaan 15 HBcAg:n kavalitatiivinen ja/tai kvantitatiivinen mittaustulos näytteessä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inkuboiminen immunoglobuliinien kanssa, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan, suoritetaan kan- 20 tajaan sidotun ja merkkiaineeseen sidottujen immunoglobuliinien kanssa, jonka jälkeen määritetään mahdollinen HBcAg:n sitoutuminen immunoglobuliineihin määrittämällä kantajaan sidottu ja/tai vapaa merkkiaine.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n-25 n e t t u siitä, että käytetään kantajaa, johon immunoglo- buliinit, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan ja HBsAg:ä vastaan, on yhdessä sidottu.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkiaineena käytetään entsyy- 30 miä.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inkuboiminen immunoglobuliinien kanssa, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan, suoritetaan immunoglobuliinien kanssa, jotka on sidottu osasiin.

8 78181 6. Testipakkaus patenttivaatimuksen 1 mukaisen määrityksen suorittamiseksi, tunnettu siitä, että siihen kuuluu ainakin seuraavat: - kantajaan sidottuja immunoglobuliineja, jotka on 5 kohdistettu HBsAg:ä vastaan; - immunoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen kuuluu ainakin seuraavat: 10 - kantaja, johon on sidottu immunoglobuliineja, jot ka on kohdistettu HBsAg:ä vastaan ja HBcAgtä vastaan; - merkkiaineeseen sidottuja immunoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testipakkaus, 15 tunnettu siitä, että siihen kuuluu ainakin seuraavat: - immunoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBsAg:ä vastaan, sidottuna ensimmäiseen kantajaan; - immunoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan, sidottuna toiseen kantajaan; 20 - immunoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan, sidottuna merkkiaineeseen.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää merkkiaineena entsyymiä.

25 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi substraattia entsyymiä varten.

11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen kuuluu ainakin seuraavat: 30 - immunoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBsAg:ä vastaan, sidottuna kantajaan; - immunoglobuliineja, jotka on kohdistettu HBcAg:ä vastaan, sidottuna osasiin.

12. Patenttivaatimuksien 6-11 mukainen testipak- - - 35 kaus, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi de- tergenttiä.

9 78181 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää ei-ionisoituvaa detergenttiä.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä 5 käytettävä immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää vasta-aineita, jotka on kohdistettu HBsAg:ä vastaan ja HBcAg:ä vastaan, sidottuna yhdessä kantajaan.