CN111707827A - 一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 - Google Patents

一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，包括碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗，磁微粒‑HBsAg抗体。本发明试剂盒中，抗体直接包被磁微粒具有更好的反应效率，有助于提高灵敏度；一些非特异性的结合是发生在抗体的FC端，而且切去后抗体Fab2分子量会小些，也助于提高灵敏度。

Description

一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫分析医学技术领域，尤其是涉及一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B Virus Surface Antigen，HBsAg)，是乙肝病毒的外壳蛋白。由226个氨基酸残基组成，相对分子质量24 000(糖基化形式27 000)。在HBV感染者血清中，以直径17～25nm的小圆形颗粒和长度不等的管状或丝状颗粒形式存在。
HBsAg不仅存在于血液中，还存在于许多体液和分泌物中，如唾液、乳汁、汗液、泪液、尿液、鼻咽分泌物、精液等。血清HBsAg仅为HBV感染的标志，不能反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期转阴，慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性。
酶联免疫吸附法(ELISA)因操作简单，无放射性污染，价格较低，被广泛应用，但其灵敏度较低。检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，检测结果的准确度和精密度较差。
PCR技术，DNA扩增的高效性导致了极微量的污染即可出现假阳性，因而使结果失真。此外病毒作为外原基因的入侵者，必须在阐明其全部或部分核苷酸序列时，才可以设计引物或探针，进行核酸分子杂交和PCR检测。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种灵敏度高、特异性好的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒。
一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，包括碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗，磁微粒-HBsAg抗体。
优选的，碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗的工作浓度为0.01～0.5μg/mL；磁微粒-HBsAg抗体的工作浓度为0.1-2mg/mL。
优选的，碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗的制备包括如下步骤，
1)待标记原料F(ab')2HBsAg羊多抗装入透析袋中，用0.02-0.05M的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将标记原料F(ab')2HBsAg羊多抗与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-4)进行混合，之后用0.02-0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析16-24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
优选的，活化的碱性磷酸酶的制备，包括如下步骤，
1)配制2-15mg/mL ALP溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；
4)配制浓度为20-50μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存。
优选的，所述F(ab')2HBsAg羊多抗的制备包括如下步骤，
1)取抗体HBsAg羊多抗溶液，逐滴加入等体积饱和硫酸铵并不断搅拌，室温静置30min后12000rpm离心5min，弃上清；
2)按抗体量加入0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液溶解抗体，并使抗体终浓度为5-20mg/ml，最后透析至0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液；
3)用0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液溶解胃蛋白酶，终浓度为50-200mg/ml；
4)按抗体：胃蛋白酶质量比(5-20)：1的比例，向抗体溶液中加入胃蛋白酶，并充分混匀；
5)于37℃水浴反应30min，期间不断混匀样品，加入适量1-3M Tris，pH7-9，调节反应体系pH至中性终止反应；
6)将酶切后抗体溶液透析至10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液中；
7)在还原和非还原条件下，SDS-PAGE检测抗体酶切程度，分析抗体是否酶切完全。
优选的，所述F(ab')2HBsAg羊多抗的制备还包括纯化过程，所述纯化过程包括以下步骤，
a)用10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液平衡好的CM sepharose阳离子柱；
b)将酶切完全的抗体产物透析至10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液中，过滤后上样至用pH5-7 10-30mM哌嗪缓冲液平衡好的CM sepharose阳离子柱，弃穿透液；
c)用10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液继续洗涤柱子，至UV值降至<20mAU；
d)用含1-5M NaCl pH5-7，10-30mM哌嗪缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
e)将洗脱液透析至PBS缓冲液中，即为F(ab’)2抗体片段。
优选的，所述磁微粒-HBsAg抗体的制备包括如下步骤，取100mL0.1-0.5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液，加入60-100mg表面联有氨基或羧基的磁微粒，室温搅拌40min，之后加入10-30mg HBsAg抗体，然后加入EDC，其浓度为5-10mg/mL，2-8℃反应1h后，用0.01-0.05M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01-0.05MPBS缓冲液定容至1L即可。
优选的，磁微粒为表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1～2μm。
优选的，还包括化学发光底物液，其配制包括如下步骤，
1)量取900mL的纯化水；
2)向步骤1)的纯化水中分别添加0.1-0.5gAMPPD，0.05-0.1g Na2SO3，2-10gSDS(十二烷基硫酸钠)，5-10gTris，搅拌至完全溶解；
3)向步骤2)的溶液中分别添加0.02-0.1mLTween-20和1-3mL ProclinTM300，定容至1L；
4)调节pH至9.0±0.20，储存于2～8℃。
磁微粒化学发光免疫分析(MCLIA)测定系统，该系统由免疫反应系统和化学发光系统组成，用免疫反应后的产物所产生化学发光信号来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高低，以此达到对抗原或抗体物质含量的检测。MCLIA为当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高、稳定性好、无污染等优点。
本发明试剂盒中，抗体直接包被磁微粒比链霉亲和素-生物素等间接反应体系具有更好的反应效率，有助于提高灵敏度；一些非特异性的结合是发生在抗体的FC端，而且切去后抗体Fab2分子量会小些，也助于提高灵敏度；
本发明试剂盒采用双抗体一步夹心法检测人血清中的HBsAg。HBsAg羊多抗做预处理，用酶切去其Fc端，得到F(ab')2HBsAg羊多抗。磁微粒直接连接HBsAg抗体，碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗。反应管中加入碱性磷酸酶标记的F(ab')2HBsAg羊多抗，再加入样本及磁微粒-HBsAg抗体，若样本中含有HBsAg，则与以上两种抗体形成夹心复合物，洗掉游离成分。加入化学发光底物液，碱性磷酸酶催化底物液发光，测定各样本管的发光值(RLU)。样本的发光值与其中的HBsAg呈正相关，从而定量检测人血清中的HBsAg。
相对于现有技术，本发明所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，具有与进口试剂相当的灵敏度，较低的检测成本。
本产品与国外同类产品的比较
Figure BDA0002558145300000051
附图说明
图1为本发明实施例中的试剂盒检测结果与雅培检测结果对照图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
抗体F(ab’)2HBsAg羊多抗片段制备操作方法如下：
1、实验所需试剂
0.1M柠檬酸，pH3.5缓冲液；100mg/mL胃蛋白酶；20mM哌嗪，pH6.0缓冲液；2M NaClpH6.0 20mM哌嗪缓冲液；3M Tris缓冲液；CM sepharose(GE)。
2、实验所需仪器设备
恒温水浴锅；AKTA prime plus；pH计；蛋白电泳仪SDS-PAGE；磁力搅拌器。
3、酶切过程
1)取抗体溶液，逐滴加入等体积饱和硫酸铵并不断搅拌，室温静置30min后12000rpm离心5min，弃上清；
2)按抗体量加入0.1M柠檬酸，pH3.5缓冲液溶解抗体，并使抗体终浓度为10mg/ml，最后透析至0.1M柠檬酸，pH3.5缓冲液；
3)用0.1M柠檬酸，pH3.5缓冲液溶解胃蛋白酶(国药)，终浓度为100mg/ml；
4)按抗体：胃蛋白酶质量比10：1的比例，向抗体溶液中加入胃蛋白酶，并充分混匀；
5)于37℃水浴反应30min，期间不断混匀样品，加入适量3M Tris，PH8.5，调节反应体系PH至中性终止反应；
6)将酶切后抗体溶液透析至20mM哌嗪，pH6.0缓冲液中；
7)在还原和非还原条件下，SDS-PAGE检测抗体酶切程度，分析抗体是否酶切完全。
4、纯化
1)用20mM哌嗪，pH6.0缓冲液平衡好CM sepharose阳离子柱；
2)将酶切完全的抗体产物透析至20mM哌嗪，pH6.0缓冲液中，过滤后上样至用pH6.0 20mM哌嗪缓冲液平衡好的CM sepharose阳离子柱，弃穿透液；
3)用20mM哌嗪，pH6.0缓冲液继续洗涤柱子，至UV值降至<20mAU；
4)用含2M NaCl pH6.0 20mM哌嗪缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
5)将洗脱液透析至PBS缓冲液中，即为抗体F(ab’)2HBsAg羊多抗片段。
碱性磷酸酶标记F(ab’)2HBsAg羊多抗的制备方法如下，
采用改良高碘酸钠氧化法将F(ab')2HBsAg羊多抗与碱性磷酸酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度0.5μg/mL，并加入质量分数10％酶稳定剂，储存于2～8℃；
改良过碘酸钠氧化法步骤包括：
A：碱性磷酸酶(ALP)活化
1)配制10mg/mL ALP溶液；
2)配制12.8mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；
4)配置浓度为40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存(保存时间不超过3个月)；
B、碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将标记原料与活化的ALP按质量比1:1进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析24h(期间换液2-3次)；
3)配置浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
酶稀释液的配制如下：
1)在1L工艺用水中，加入6.03g Tris、17.56g NaCl，搅拌至完全溶解；
2)再加入1.5g CaseinNa搅拌至完全溶解；
3)再加入1.1mL的吐温20(Tween-20)，混合均匀；
4)再加入2mL ProClinTM300，5mL硫酸庆大霉素搅拌30分钟；
5)用pH计测定其pH值，用6M HCl或2M NaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。
化学发光底物液(1L)的配制如下：
1)量取900mL的纯化水；
2)向1)中分别添加0.25gAMPPD，0.05g Na2SO3，5gSDS(十二烷基硫酸钠)，6gTris，搅拌至完全溶解；
3)向2)中分别添加0.05mLTween-20和1mL ProclinTM300，定容至1L。
4)调节pH至9.0，储存于2～8℃。
20倍浓缩洗液的配制如下：包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/LNaCl，10mL/L；Tween-20和体积分数为2％Proclin300。
磁微粒-HBsAg抗体的制备方法(配制1L)如下，
取100mL0.1M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液，加入80mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒，室温搅拌40min，之后加入10mgHBsAg抗体，然后加入EDC，其浓度为8mg/mL，2-8℃反应1h后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01M PBS定溶至1L即可。
分析过程：
1、根据实验需要取出适量的反应管。设置校准品各2管、质控品各2管。
2、每管加入75μL碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗配制的试剂1。
3、每管加入75μL校准品、质控品或样本。
4、在37℃下反应20分钟。
5、每管加入50μL磁性颗粒-HBsAg抗体配制的磁性颗粒工作液。
6、在37℃下反应10分钟，磁分离并清洗4次。
7、每管加入200μL化学发光底物液。
8、室温(18～25℃)暗置5秒后测定相对发光强度，每管读数时间1秒。
仪器：化学发光法免疫分析仪Axceed260：产品注册号-津食药监械(准)字2014第2400017号。
上述制备的试剂盒检测效果评价如下：
1.国家参考品标化的灵敏度参考品测试
1.1.设计要求
用经国家参考品标化的灵敏度参考品进行检定。
1.2.试验方法
检测adr、adw、ay亚型灵敏度参考品，每份检测1次。
1.3.试验结果
最低检出限
Figure BDA0002558145300000091
1.4结论：试剂盒对于国家参考品标化的灵敏度参考品测值均可满足adr≤0.05IU/mL，adw≤0.05IU/mL，ay≤0.1IU/mL，高于国家参考品标化的灵敏度参考品adr亚型≤0.1IU/mL；adw亚型≤0.1IU/mL；ay亚型≤0.2IU/mL的要求。
2.分析灵敏度
2.1.试验方法
将零校准品进行20次测定，计算相对发光强度的平均值
Figure BDA0002558145300000092
和标准差(SD)，利用S0和S1的发光值和浓度值作直线计算出相对发光强度为
Figure BDA0002558145300000101
时的浓度值为分析灵敏度。
2.2.试验结果
分析灵敏度
Figure BDA0002558145300000102
2.3.试验结论：由以上检测结果可见，三批试剂盒的分析灵敏度分别为0.01IU/mL、0.01IU/mL和0.01IU/mL，试剂盒灵敏度较高。
3.与雅培测值对照试验
3.1.试验方法
测定临床样本80例，其中HBsAg阴性样本44例(包括临界值标本1例，测值为0.09IU/mL)，HBsAg阳性样本36例。
3.2.试验结果
本发明试剂检测部分结果如下：36例HBsAg阳性样本检测结果全部为阳性；44例阴性样本中，43例检测为阴性，1例检测为临界值，经雅培试剂确定该样本为接近参考值的临界值样本，对照结果如下表：
Figure BDA0002558145300000111
Figure BDA0002558145300000121
Figure BDA0002558145300000131
排除线性范围外的测值，使用本发明试剂盒检测结果及雅培结果进行直线回归统计，结果如图1所示。数据以回归式Y＝bX十a,表示这些数据的直线趋势。这是以X方法为准，Y方法与之配合的关系式。式中b为斜率,a为截距。相关系数r常用来表示两个变量间互相关系密切的程度。
3.3.试验结论
由以上结果，b＝1.0626，R2＝0.9777，即R＝0.99，证明本发明HBsAg试剂测值与雅培测值符合性良好。
4.稳定性
4.1.设计要求
试剂盒37±1℃放置7天，物理性能、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、分析灵敏度、线性、质控品测值、精密度检测结果应符合设计要求。
4.2.试验方法
将试剂盒37±1℃放置7天后取出，检测参考品。
4.3.试验结果
稳定性-企业参考品检测结果
Figure BDA0002558145300000132
Figure BDA0002558145300000141
稳定性-企业参考品检测数据
Figure BDA0002558145300000142
Figure BDA0002558145300000151
Figure BDA0002558145300000161
4.4试验结论：由以上结果可见，三批试剂盒37±1℃放置7天后检测，三批试剂盒均液体组分澄清，无沉淀或絮状物，其他组分无包装破损；阴性参考品检测均为阴性；阳性参考品检测均为阳性；最低检出限的灵敏度参考品adr亚型≤0.1IU/mL；adw亚型≤0.1IU/mL；ay亚型≤0.2IU/mL均为阳性；相关系数r均不低于0.9900；质控品测值均在范围内；批内不精密度均不高于7.5％，批间不精密度均不高于10％。本HBsAg试剂稳定性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：包括碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗，磁微粒-HBsAg抗体。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗的工作浓度为0.01～0.5μg/mL；磁微粒-HBsAg抗体的工作浓度为0.1-2mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：碱性磷酸酶标记F(ab')2HBsAg羊多抗的制备包括如下步骤，
1)待标记原料F(ab')2HBsAg羊多抗装入透析袋中，用0.02-0.05M的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将标记原料F(ab')2HBsAg羊多抗与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-4)进行混合，之后用0.02-0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析16-24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
4.根据权利要求3所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：活化的碱性磷酸酶的制备，包括如下步骤，
1)配制2-15mg/mL ALP溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；
4)配制浓度为20-50μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存。
5.根据权利要求3所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：所述F(ab')2HBsAg羊多抗的制备包括如下步骤，
1)取抗体HBsAg羊多抗溶液，逐滴加入等体积饱和硫酸铵并不断搅拌，室温静置30min后12000rpm离心5min，弃上清；
2)按抗体量加入0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液溶解抗体，并使抗体终浓度为5-20mg/ml，最后透析至0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液；
3)用0.1-0.5M柠檬酸，pH2-5缓冲液溶解胃蛋白酶，终浓度为50-200mg/ml；
4)按抗体：胃蛋白酶质量比(5-20)：1的比例，向抗体溶液中加入胃蛋白酶，并充分混匀；
5)于37℃水浴反应30min，期间不断混匀样品，加入适量1-3M Tris，pH7-9，调节反应体系pH至中性终止反应；
6)将酶切后抗体溶液透析至10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液中；
7)在还原和非还原条件下，SDS-PAGE检测抗体酶切程度，分析抗体是否酶切完全。
6.根据权利要求5所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：所述F(ab')2HBsAg羊多抗的制备还包括纯化过程，所述纯化过程包括以下步骤，
a)用10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液平衡好的CM sepharose阳离子柱；
b)将酶切完全的抗体产物透析至10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液中，过滤后上样至用pH5-710-30mM哌嗪缓冲液平衡好的CM sepharose阳离子柱，弃穿透液；
c)用10-30mM哌嗪，pH5-7缓冲液继续洗涤柱子，至UV值降至<20mAU；
d)用含1-5M NaCl pH5-7，10-30mM哌嗪缓冲液洗脱，收集洗脱峰；
e)将洗脱液透析至PBS缓冲液中，即为F(ab’)2抗体片段。
7.根据权利要求1或2所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：所述磁微粒-HBsAg抗体的制备包括如下步骤，取100mL0.1-0.5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液，加入60-100mg表面联有氨基或羧基的磁微粒，室温搅拌40min，之后加入10-30mg HBsAg抗体，然后加入EDC，其浓度为5-10mg/mL，2-8℃反应1h后，用0.01-0.05M PBS缓冲液洗涤3次，最后用0.01-0.05MPBS缓冲液定容至1L即可。
8.根据权利要求7所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：磁微粒为表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1～2μm。
9.根据权利要求1或2所述的乙型肝炎表面抗原检测试剂盒，其特征在于：还包括化学发光底物液，其配制包括如下步骤，
1)量取900mL的纯化水；
2)向步骤1)的纯化水中分别添加0.1-0.5gAMPPD，0.05-0.1g Na2SO3，2-10gSDS(十二烷基硫酸钠)，5-10gTris，搅拌至完全溶解；
3)向步骤2)的溶液中分别添加0.02-0.1mLTween-20和1-3mL ProclinTM300，定容至1L；
4)调节pH至9.0±0.20，储存于2～8℃。
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