CN111707826B - 一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒 - Google Patents
一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，包括磁微粒‑HBsAg重组抗原、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原。本发明所述的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析医学技术领域，尤其是涉及一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒。
背景技术
乙型肝炎是一种严重的传染性疾病，具有广泛性，给人们的健康带来了严重的危害，它主要是通过母婴、血液及性接触传播，是较常见的传染病之一。
乙型肝炎病毒表面抗体(Antibody to Hepatitis B Surface Antigen，HBsAb，即抗-HBs)，是一种由乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B Virus Surface Antigen，HBsAg)诱导产生的特异性抗体。抗-HBs在血清中检出提示HBV感染后康复或接种乙肝疫苗后已有免疫力。急性乙型肝炎患者处于恢复期时，随着HBsAg的逐步消失，血清中出现抗-HBs，其为一种中和抗体，以HBsAg为疫苗免疫人体而产生，对HBV感染具有保护性免疫作用。
酶联免疫吸附法(ELISA)因操作简单，无放射性污染，价格较低，被广泛应用，但其灵敏度较低。检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，检测结果的准确度和精密度较差。
胶体金免疫层析技术(GICA)：20世纪90年代初在免疫渗滤技术基础上建立的一种免疫学检测技术，快速方便，成本低廉，结果易于判读，但灵敏度过低。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种灵敏度高、特异性好的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，包括磁微粒-HBsAg重组抗原、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原。
优选的，磁微粒-HBsAg重组抗原的工作浓度为0.1-2mg/mL、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的工作浓度为0.01-0.5μg/mL。
优选的，所述磁微粒-HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤，取100mL0.1-0.5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液，加入60-100mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒，室温搅拌40-60min，之后加入5-10mg HBsAg重组抗原，然后加入EDC，其浓度为5-10mg/mL，2-8℃反应1-1.5h后，用0.02-0.1mol/L Tris缓冲液洗涤3次，最后用0.02-0.1mol/L Tris缓冲液定溶至1L即可；优选的，磁微粒为表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1-2μm。
优选的，碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤，
1)将待标记原料HBsAg重组抗原装入透析袋中，用0.02-0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将经步骤1)处理的待标记原料HBsAg重组抗原与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-4)进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析16-24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
优选的，活化的碱性磷酸酶的制备，包括如下步骤，
1)配制2-15mg/mL ALP溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；
4)配制浓度为20-50μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存。
优选的，磁微粒-HBsAg重组抗原以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原中的HBsAg重组抗原均经过如下处理，
1)二硫苏糖醇(DTT)用超纯水溶解，配制成0.5mol/L浓储，溶解后分装-20℃保存；
2)HBsAg重组抗原中加入步骤1)配制的DTT浓储，至DTT终浓度为10-20mmol/L，室温避光反应20min；
3)使用HBsAg重组抗原透析液透析HBsAg重组抗原2h。
优选的，HBsAg重组抗原透析液的配制包括如下步骤，
1)在600mL纯化水中，加入5-10g Tris；
2)再加入10-20gEDTA搅拌至完全溶解；
3)加入1-5gNaCl，搅拌至完全溶解；
4)再加入50-100mL的甘油，混合均匀；
5)用纯化水定容至1L；
6)用pH计测定其pH值，用6M HCl或2M NaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。
优选的，步骤3)中，HBsAg重组抗原透析后，其中的DTT含量为1-5mmol/L。
高浓度(≥10mmol/L)可以打开蛋白的二硫键，对抗体的特异性有益；低浓度的DTT(≤5mmol/L)可以保护蛋白，提高其稳定性。
优选的，还包括化学发光底物液，其配制包括如下步骤，
1)量取900mL的纯化水；
2)向步骤1)的纯化水中分别添加0.1-0.5gAMPPD，0.05-0.1g Na2SO3，2-10gSDS(十二烷基硫酸钠)，5-10gTris，搅拌至完全溶解；
3)向步骤2)的溶液中分别添加0.02-0.1mLTween-20和1-3mL ProclinTM300，定容至1L；
4)调节pH至9.0±0.20，储存于2～8℃。
磁微粒化学发光免疫分析(MCLIA)测定系统，该系统由免疫反应系统和化学发光系统组成，用免疫反应后的产物所产生化学发光信号来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高低，以此达到对抗原或抗体物质含量的检测。MCLIA为当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高、稳定性好、无污染等优点。
本发明试剂盒采用双抗原夹心法检测人血清中的HBsAb。HBsAg重组抗原使用高浓度的二硫苏糖醇(DTT)对其进行预处理，处理完成后进行透析纯化，在特定透析液中透析2h，此时原料中DTT浓度降至1-5mmol/L。磁微粒直接连接处理后HBsAg重组抗原，碱性磷酸酶标记处理后的HBsAb重组抗原。反应管中加入磁微粒-HBsAg重组抗原及样本，再加入碱性磷酸酶标记处理后的HBsAg重组抗原，若样本中含有HBsAb，则与以上两种抗原形成夹心复合物，洗掉游离成分。加入化学发光底物液，碱性磷酸酶催化底物液发光，测定各样本管的发光值(RLU)。样本的发光值与其中的HBsAb呈正相关，从而定量检测人血清中的HBsAb含量。
相对于现有技术，本发明所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，具有与进口试剂相当的灵敏度，且较低的检测成本。
附图说明
图1为本发明实施例中的试剂盒检测结果与雅培检测结果对照图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，包括磁微粒-HBsAg重组抗原、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原。
磁微粒-HBsAg重组抗原的工作浓度为0.5mg/mL、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的工作浓度为0.5μg/mL。
所述磁微粒-HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤，取100mL0.1M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液，加入80mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒，室温搅拌40min，之后加入5-10mg HBsAg重组抗原，然后加入EDC，其浓度为8mg/mL，2-8℃反应1h后，用0.05mol/LTris缓冲液洗涤3次，最后用0.05mol/L Tris缓冲液定溶至1L即可；磁微粒为四氧化三铁，粒径1～2μm。
碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原，采用改良高碘酸钠氧化法将HBsAg重组抗原与碱性磷酸酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度0.01～0.5μg/mL，并加入10％酶稳定剂，储存于2～8℃；
改良过碘酸钠氧化法步骤包括：
1)将待标记原料HBsAg重组抗原装入透析袋中，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将经步骤1)处理的待标记原料HBsAg重组抗原与活化的碱性磷酸酶按质量比1:4进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液，按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
活化的碱性磷酸酶的制备，包括如下步骤，
1)配制10mg/mL ALP溶液；
2)配制12.8mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；
4)配制浓度为40μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存。
磁微粒-HBsAg重组抗原以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原中的HBsAg重组抗原均经过如下处理，
1)二硫苏糖醇(DTT)用超纯水溶解，配制成0.5mol/L浓储，溶解后分装-20℃保存；
2)HBsAg重组抗原中加入步骤1)配制的DTT浓储，至DTT终浓度为10mmol/L，室温避光反应20min；
3)使用HBsAg重组抗原透析液透析HBsAg重组抗原2h。HBsAg重组抗原透析后，其中的DTT含量为1-5mmol/L。
高浓度(≥10mmol/L)可以打开蛋白的二硫键，对抗体的特异性有益；低浓度的DTT(≤5mmol/L)可以保护蛋白，提高其稳定性。
二硫苏糖醇(DTT)含量测定过程如下：
1.方法：钼酸铵法
2.目的：检测HBsAg重组抗原透析后二硫苏糖醇含量。
3.仪器与试剂：
3.1仪器：
3.1.1分光光度计
3.1.2电子天平
3.1.3吸管、量筒、中试管、试管架、烧杯
3.1.4水浴锅
3.2试剂配制：
3.2.1 0.04mol/L钼酸铵(A液)：称取5g钼酸铵，加蒸馏水溶解至100ml，4℃保存。
3.2.2乙酸盐缓冲液(B液)：称取0.295g无水乙酸钠、0.9676ml冰乙酸，加蒸馏水溶解至100ml，4℃保存。
3.2.3 0.2M NaH2PO4(C液)：31.012g NaH2PO4H2O加蒸馏水溶解至1000ml
3.2.4 DTT标准液：50ug/ml
3.2.4显色液：A液+B液+2mlC液
4.操作：
4.1标准曲线
精确量取标准DTT溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分别加入试管中，补水至1ml，各管中均加入显色液1ml，80℃水浴锅4h后，690nm测定其OD值，空白管调零。
4.2样品测定
精确量取适量样品补水至1ml，各管中均加入显色液1ml，80℃水浴锅4h后，690nm测定其OD值，
5.计算结果：
5.1标准工作曲线：
分别计算平行管OD值均值，将各稀释标准的DTT含量对其相应的OD值均值进行线性回归处理，求出其回归方程。
5.2样品DTT含量计算：
将待测样品的OD值均值带入回归方程，计算出相应的值，本数值乘以相应的稀释倍数即为样品的DTT含量。
6.注意事项：
6.1各稀释度均应做两管平行
6.2标准曲线的线性方程r值不应小于0.99
HBsAg重组抗原透析液的配制包括如下步骤，
1)在600mL纯化水中，加入6.03g Tris；
2)再加入14.6gEDTA搅拌至完全溶解；
3)加入2.9gNaCl，搅拌至完全溶解；
4)再加入50mL的甘油，混合均匀；
5)用纯化水定容至1L；
6)用pH计测定其pH值，用6M HCl或2M NaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。
化学发光底物液，其配制包括如下步骤，
1)量取900mL的纯化水；
2)向步骤1)的纯化水中分别添加0.25gAMPPD，0.05g Na2SO3，5gSDS(十二烷基硫酸钠)，6gTris，搅拌至完全溶解；
3)向步骤2)的溶液中分别添加0.05mLTween-20和1mL ProclinTM300，定容至1L；
4)调节pH至9.0，储存于2～8℃。
20倍浓缩洗液的配制，包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20和体积分数为2％Proclin300。
酶稀释液的配制过程为：
1)在1L工艺用水中，加入6.03g Tris、15g NaCl，搅拌至完全溶解；
2)再加入2g CaseinNa,5gBSA搅拌至完全溶解；
3)加入0.1gMgCl2，0.1g CaCl2，搅拌至完全溶解；
4)再加入1.1mL的吐温20(Tween-20)，混合均匀；
5)再加入2mL ProClinTM300，5mL硫酸庆大霉素搅拌30分钟；
6)用pH计测定其pH值，用6M HCl或2M NaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。
分析过程：
1.根据实验需要取出适量的反应管。设置校准品各2管、质控品各2管。
2.每管加入50μL碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原配置的试剂1。
3.每管加入50μL校准品、质控品或样本。
4.在37℃下反应20分钟。
5.每管加入50μL磁性颗粒-HBsAg重组抗原配制的磁性颗粒工作液。
6.在37℃下反应5分钟，磁分离并清洗4次。
7.每管加入200μL化学发光底物液。
8.室温(18～25℃)暗置5秒后测定相对发光强度，每管读数时间1秒。
仪器：化学发光法免疫分析仪Axceed260：产品注册号-津食药监械(准)字2014第2400017号。
上述制备的试剂盒检测效果评价如下：
1.国家参考品标化的灵敏度参考品测试
1.1.设计要求
用国家参考品或经国家参考品标化的灵敏度参考品进行检定，最低检出限不高于10.0mIU/mL。
1.2.试验方法
用校准品稀释液分别稀释国家参考品灵敏度参考品(50mIU/ml)至10mIU/mL、5mIU/mL、2mIU/mL，每个浓度检测10次，分别计算其精密度。
1.3.试验结果
最低检出限
试验结论：由以上检测结果可见，三批试剂盒检测灵敏度参考品，2mIU/mL，5mIU/mL，10mIU/mL分别测试10孔，其精密度(CV)均小于15％，均能检出，远优于乙型肝炎病毒表面抗体国家参考品最低检出限不高于10.0mIU/mL的标准。
2.分析灵敏度
2.1.设计要求
不高于2mIU/mL。
2.2.试验方法
将零校准品进行20次测定，计算相对发光强度的平均值(X)和标准差(SD)，利用S0和S1的发光值和浓度值作直线计算出相对发光强度为X+2SD时的浓度值为分析灵敏度。
2.3.试验结果
分析灵敏度
2.4.试验结论：由以上检测结果可见，三批试剂盒的分析灵敏度分别为0.26mIU/mL、0.31mIU/mL和0.43mIU/mL，确定试剂盒分析灵敏度不高于2mIU/mL，试剂盒灵敏度较高。
3.与雅培测值对照试验
3.1.试验方法
测定临床样本178例，其中抗-HBs阴性样本86例，抗-HBs阳性样本92例。
3.2.试验结果
本公司试剂部分检测结果：86例抗-HBs阴性样本检测结果全部为阴性；92例阳性样本中，92例检测为阳性。具体信息见下表：乙型肝炎病毒表面抗体(抗-HBs)雅培测值对比结果。
乙型肝炎病毒表面抗体(抗-HBs)雅培测值对比
排除两种分析方法线性范围外的样本测值，共11例，剩余167例测试结果结果进行直线回归统计。数据以回归式Y＝bX十a,表示这些数据的直线趋势.这是以X方法为准，Y方法与之配合的关系式。式中b为斜率,a为截距。相关系数r常用来表示两个变量间互相关系密切的程度。
3.3试验结论
由以上结果，b＝0.96，R2＝0.9871，即R＝0.99，证明本发明HBsAb试剂测值与雅培HBsAb试剂测值符合性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，其特征在于：包括磁微粒-HBsAg重组抗原、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原；
磁微粒-HBsAg重组抗原的工作浓度为0.1-2mg/mL、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的工作浓度为0.01-0.5μg/mL；
所述磁微粒-HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤，取100mL0.1-0.5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液，加入60-100mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒，室温搅拌40-60min，之后加入5-10mgHBsAg重组抗原，然后加入EDC，其浓度为5-10mg/mL，2-8℃反应1-1.5h后，用0.02-0.1mol/LTris缓冲液洗涤3次，最后用0.02-0.1mol/LTris缓冲液定溶至1L即可；
碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤，
1)将待标记原料HBsAg重组抗原装入透析袋中，用0.02-0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将经步骤1)处理的待标记原料HBsAg重组抗原与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-4)进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析16-24h，期间换液2-3次；
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液，按1mg ALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于4℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01MPBS于4℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存；
磁微粒为表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1-2μm；
活化的碱性磷酸酶的制备，包括如下步骤，
1)配制2-15mg/mLALP溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，室温避光反应30min；
4)配制浓度为20-50μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应30min，活化即完成，放-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，其特征在于：磁微粒-HBsAg重组抗原以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原中的HBsAg重组抗原均经过如下处理，
1)二硫苏糖醇(DTT)用超纯水溶解，配制成0.5mol/L浓储液；
2)HBsAg重组抗原中加入步骤1)配制的DTT浓储液，至DTT终浓度为10-20mmol/L，室温避光反应20min；
3)使用HBsAg重组抗原透析液透析HBsAg重组抗原2h。
3.根据权利要求2所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，其特征在于：HBsAg重组抗原透析液的配制包括如下步骤，
1)在600mL纯化水中，加入5-10gTris；
2)再加入10-20g EDTA搅拌至完全溶解；
3)加入1-5g NaCl，搅拌至完全溶解；
4)再加入50-100mL的甘油，混合均匀；
5)用纯化水定容至1L；
6)用pH计测定其pH值，用6M HCl或2M NaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。
4.根据权利要求2所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，其特征在于：步骤3)中，HBsAg重组抗原透析后，其中的DTT含量为1-5mmol/L。
5.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒，其特征在于：还包括化学发光底物液，其配制包括如下步骤，
1)量取900mL的纯化水；
2)向步骤1)的纯化水中分别添加0.1-0.5g AMPPD，0.05-0.1g Na2SO3，2-10gSDS(十二烷基硫酸钠)，5-10g Tris，搅拌至完全溶解；
3)向步骤2)的溶液中分别添加0.02-0.1mL Tween-20和1-3mL ProclinTM300，定容至1L；
4)调节pH至9.0±0.20，储存于2～8℃。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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Address after: 300300 building 14, international medical device Industrial Park, No. 16, Wujing Road, economic and Technological Development Zone, Dongli District, Tianjin Applicant after: Tianjin boasaisi Biotechnology Co.,Ltd. Address before: No. 201, No. 10, Siwei Road, Dongli Development Zone, Dongli District, Tianjin Applicant before: BIOSCIENCE (TIANJIN) DIAGNOSTIC TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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Effective date of registration: 20230821 Address after: 300300 building 14, international medical device Industrial Park, No. 16, Wujing Road, economic and Technological Development Zone, Dongli District, Tianjin Applicant after: Tianjin boasaisi Biotechnology Co.,Ltd. Applicant after: BIOSYS (Chongqing) Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 300300 building 14, international medical device Industrial Park, No. 16, Wujing Road, economic and Technological Development Zone, Dongli District, Tianjin Applicant before: Tianjin boasaisi Biotechnology Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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