CN101382553A - 乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s区化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括：1)大蛋白前S区校准品；2)链亲和素化的载体；3)生物素化的大蛋白前S区单克隆抗体；4)碱性磷酸酶标记的大蛋白前S区单克隆抗体；以及5)化学发光底物。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以大蛋白前S区纯品配制校准品；2)以链亲和素包被载体；3)使大蛋白前S区单抗生物素化；4)以碱性磷酸酶标记大蛋白前S区单抗；5)配制化学发光底物；6)分装上述校准品、酶标记物和化学发光底物；以及7)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

Description

乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区测定试剂盒及其制备方法，结合了生物素—亲和素免疫放大技术和化学发光免疫分析技术。

背景技术

乙型肝炎病毒属嗜肝病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且和肝癌的发生密切相关。中国是乙型肝炎的高流行区，但目前尚无有效的抗病毒方法治疗乙型肝炎病毒慢性感染，因此病毒的预防和检测就是避免感染的重要手段，对病毒感染的动态监测也能为乙肝的发展、预后提供重要的信息。

乙肝病毒表面抗原是乙型肝炎病毒的外膜蛋白，由乙型肝炎病毒基因组的S区所编码。乙型肝炎病毒表面抗原依靠三个启动子进行表达后，产物分别为大蛋白(LHBs，包括前S1，前S2和S)；中蛋白(MHBs，包括前S2和S)；小蛋白(SHBs，包括S)，我们通常检测的乙肝表面抗原实际指的是小蛋白(SHBs)。

乙型肝炎病毒可以分泌三种病毒颗粒：小球形颗粒(直径约22nm)，主要由MHBs和SHBs组成，管状颗粒(直径约22nm，长度约100-1000nm)，由LHBs，MHBs和SHBs组成；Dane颗粒，其外膜结构蛋白组成与管状颗粒一致，Dane颗粒包含有乙型肝炎病毒DNA。完整病毒颗粒外膜的组成依赖于LHBs，MHBs和SHBs三种蛋白的共同作用，而在LHBs缺失的情况下，后两者只能形成小球形颗粒，因此LHBs的表达实际上起着调节病毒外膜组装能力的作用。只有当LHBs蛋白表达达到一定的量时，病毒颗粒才能以有包膜的形式(包括管状颗粒和Dane颗粒)被释放。因此，检测LHBs，实际反应的是体内管状颗粒和Dane颗粒的实际水平，由于Dane颗粒代表着病毒基因在血液中的实际存在，因此LHBs的存在实际上不仅因意味着病毒基因，也代表着无病毒基因管状颗粒形式的存在。而临床的慢性肝炎病人中，血液中和肝细胞中都有管状颗粒，其浓度甚至是真病毒颗粒的上万倍。因此可以根据检测血液中LHBs的含量，来判断病毒携带者体内的乙型肝炎病毒是否杂进行复制。

近年来，临床开始出现前S1抗原诊断试剂盒，其利用单独表达前S1片段制备单克隆抗体，进行免疫学检测血清中前S1蛋白的存在，但是临床数据显示这种试剂盒存在诸多不足，最显著的就是漏检，临床已经发现大量PCR检测乙型肝炎病毒DNA阳性的标本使用前S1抗原诊断试剂盒检测是阴性。而大量基础研究表明：在乙肝病毒大蛋白上并不存在单独的前S1区段，而是存在前S1和前S2区组成的构象型前S区，前S区和S区一起构成大蛋白。大蛋白的前S序列对于乙型肝炎病毒的形成具有重要功能，该区域内的少量氨基酸的替换都会阻断病毒粒子的形成，这个区域也横跨了前S1和前S2的衔接区，因此前S区更应当作为一个整体来研究。

化学发光免疫分析技术是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫分析方法相结合发展起来的一项具有化学发光分析的高灵敏度和免疫分析法的高选择性的新的免疫分析技术。利用双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白，两株配对的单克隆抗体分别针对一个抗原表位，因而具有极高的特异性，可以迅速的从血清中高度特异的识别相应的抗原。单纯利用物理吸附把单克隆抗体包被到固相上(聚苯乙烯板，磁颗粒等)会存在单抗用量大，活性损失大等缺点，而且工艺优化较为繁琐，而将链亲和素包被于固相载体上，使捕获抗体生物素化，以上问题即可迎刃而解，本发明利用链亲和素固相，将生物素化单抗和碱性磷酸酶(ALP)标记单抗以适当的比例统一于一种液相内，将血清样品加入固相抗体，再加入两种标记单抗的混合液，固相上的链亲和素迅速与生物素结合，生物素化单抗和ALP标记单抗与血清中的大蛋白分子形成特异性的夹心结合，然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光强度，就可以定量分析反映血清中乙型肝炎病毒大蛋白的含量，进而体现乙型肝炎病毒的感染水平。

生物素-亲和素系统(biotin-avidin system，BAS)具有多级的信号放大作用，并且不增加非特异性干扰，且具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点。生物素亲和素免疫放大技术可以直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测，这种方法称为标记亲和素-生物素法。待测反应体系可以利用生物素化抗体，使得亲和素-生物素系统与免疫分析检测体系偶联，放大终反应：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗原)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再加入亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分析的灵敏度。

本发明的目的正是为了解决目前临床上用前S1单克隆抗体作为乙型肝炎大蛋白指标检测手段的不足，利用基因工程技术，表达出与体内大蛋白序列基本一致、拓扑结构相似的大蛋白，利用此大蛋白制备筛选出两株配对的单抗，以此为基础，研制出特异性诊断乙型肝炎病毒大蛋白前S区化学发光测定试剂盒，经临床实验证明，操作简便，灵敏度高，特异性好，与PCR检测乙型肝炎病毒DNA结果符合度极高，提高了乙型肝炎病毒大蛋白前S区的检出率，辅助临床在蛋白水平上观察病毒复制的水平，为尽早采取有效综合治疗方案，预防肝硬化和肝癌的发生。

另外，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒采用微孔板化学发光免疫分析技术结合生物素-亲和素系统，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。

发明内容

本发明同时解决了上述问题，即将生物素—亲和素免疫放大技术结合化学发光技术与乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区的免疫分析学有效地结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区的试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种生物素—亲和素免疫放大技术结合化学发光免疫分析测定乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区的试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

根据本发明的试剂盒包括：1)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品；2)链亲和素化的固相载体；3)生物素化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体；4)碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体；以及5)上述碱性磷酸酶所作用的化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物。

根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2＇-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

优选地，上述试剂盒中，所述化学发光底物液包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL3-(2＇-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin 300、1000mL双蒸水。

进一步，本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)以乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区纯品配制乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品；

2)以链亲和素包被固相载体；

3)使乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体生物素化；

4)用碱性磷酸酶标记乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体；

5)配制化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物；

6)分装上述乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品、生物素化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物；以及

7)组装为成品。

根据本发明的方法，优选，所述链亲和素包被固相载体的步骤2)包括以下步骤：

1)包被

采用0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的链亲和素混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

2)用生理盐水洗涤上述固相载体；以及

3)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9gNaH₂PO₄·12H₂O、10g BSA和1mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～7.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。

具体地，所述包被方法可以包括：

1)包被

采用1000mL的0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液(包含4.44g的柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓冲液)，与适当浓度的链亲和素混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

2)用生理盐水洗涤上述固相载体；以及

3)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9gNaH₂PO₄·12H₂O、10g BSA和1mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～7.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。

在上述方法中，优选，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

在上述方法中，优选，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2＇-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star；更优选地，所述化学发光底物液包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mL HCl、200mL 3-(2＇-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin 300、1000mL双蒸水。

具体的上述试剂盒可以包括乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品、链亲和素化的微孔板、生物素化的单抗、碱性磷酸酶标记物、化学发光底物液、洗涤缓冲液等。其中，所述乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品的原料为标准级，纯度不低于90％；链亲和素化的微孔板为48或96孔的微孔板条；标记抗体的酶为偶联碱性磷酸酶(ALP)；化学发光底物液为3-(2＇-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)溶液；洗涤缓冲液为Tris-HCl。

本发明“乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒”可以准确的诊断出乙型肝炎病毒的复制感染情况。该发明使用了针对构象型乙型肝炎大蛋白前S区的高度特异性单克隆抗体，真实地反应出血清中大蛋白前S区的实际水平，显示出极高的灵敏度，没有交叉反应，特异性良好，便于产业化及质量控制。该试剂盒可以根据乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区含量的多少判断治疗效果及其病情的变化，具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区测定试剂盒(化学发光法与生物素-亲和素免疫放大技术结合)的各项指标均达到酶联免疫分析试剂盒的分析法水平。

并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的抗体与载体上包被的抗体和被测样品的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区形成“双抗体夹心”结构，因此本发明采用的“双抗体夹心法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理，又确保了检测的灵敏度。另外，这种模式还便于操作和生产。

本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而临床符合率大大提高，可为乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

近年大量研究证实，生物素—亲合素系统可以与包括酶在内的多种标记试剂结合。本发明的试剂盒应用生物素—亲合素系统，与酶标记的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体高亲合力的牢固结合，并产生多级放大效应，使生物素—亲合素系统免疫标记和示踪分析更加灵敏，能够更高效地诊断乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区。

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒校准曲线的线性图。

具体实施方式

实施例1制备本发明的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒

一、酶标抗体制备和生物素偶联抗体的制备

1.乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，—20℃以下保存。

2.生物素偶联乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体的制备

(1)用常规方法将生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)配成1mg/mL；

(2)用0.1mol/L pH值为9.0的NaHCO₃将纯化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体稀释为1～2mg/mL；

(3)按BNHS与抗体容积比为1：8或重量比1：7左右混合，室温搅拌下反应2～4h；

(4)装入透析对0.05mol/L pH值为7.2的PBS，4℃透析过夜，结合物加等体积甘油，小量分装，—20℃以下保存备用。

3.生物素化单抗和酶标记单抗混合工作液的配制

将制备好的生物素化单抗和酶标记单抗以不同的配比混合，使用酶稀释液将酶标记单抗稀释成不同的稀释度，使用棋盘滴定法选择出最佳的配比为3：4、最佳的酶稀释度为1：20000。

二、乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品的制备

用乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区纯品配制校准品，浓度分别为0、2、5、20、50、100ng/mL，分装6瓶。

三、链亲和素化的固相微孔板制备

(1)包被

采用0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的链亲和素混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

具体地，所述包被方法包括

柠檬酸           4.44g

柠檬酸三钠       7.3g

去离子水         1000mL

溶解混匀后，调整pH值至4.6，加入5.0mg链亲和素混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110μL，4℃过夜。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭

NaH₂PO₄·2H₂O         0.2g

Na₂HPO₄·12H₂O         2.9g

BSA                   10g

Proclin 300           1mL

双蒸水                定容至1000mL

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，测定pH值为7.0。

每孔分别加入封闭液300μL，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2～8℃保存。

四、酶标单抗稀释液

Tris       12.120g

BSA        5g

Proclin    1mL

双蒸水     1000mL

五、化学发光底物液

本发明所使用的碱性磷酸酶(ALP)的化学发光底物液的配制方法：

Tris      24g

NaCl      160g

KCl       4g

HCl       15mL

双蒸水           1000mL

Proclin 300      1mL

AMPPD            200mL

六、洗涤缓冲液

Tris             24g

NaCl             160g

KCl              4g

HCl              15mL

去离子水         1000mL

调整pH值至7.4。

七、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，包括标记抗体与生物素化抗体的活性、亲和素化载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、ALP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对亲和素化载体的方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和封闭液进行试验，选择出最适合的包被缓冲液和封闭液，通过亲和素不同包被浓度试验找到最佳的浓度条件。对于生物素偶联抗体和对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比试验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对生物素偶联抗体和酶标记物使用的稀释液进行了长期的考察试验，配制出了能够使生物素偶联抗体和酶标记物长期保持活性而稳定的稀释液。再次通过多次方阵交叉试验确定了生物素化的抗体与酶标记物混合的适当比例为3：4。

利用本发明的试剂盒进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛查。

实施例2～4制备本发明的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒

除以分别以塑料珠、塑料管或磁性颗粒作为载体，以及封闭液pH值为7.2、7.4、7.6外，其余均以与实施例1相同的方法制备乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒。

实施例5本发明的试剂盒的使用方法

以上实施例1制备的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒的具体操作如下：

1)洗涤缓冲液配制：将试剂盒提供的洗涤液缓冲液加蒸馏水20倍稀释；

2)将链亲和素包被的固相载体(微孔板条)、校准品/待测样品、化学发光底物液、酶标记抗体从4℃冰箱中取出，放置15min，平衡至室温；

3)将实验需要的微孔板条(已包被好链亲和素)固定在板架上；

4)反应孔中分别加待测样品和各浓度校准品每孔加0、2、5、20、50、100ng/mL各25μL，每次试验设空白1孔，然后除空白孔外各孔加生物素化的抗体和酶标记物混合体积100μL，于微量振荡器上振荡30秒混匀，室温温育45分钟；

5)弃去孔中溶液，用PBS洗液，自动洗板机或者手工洗板5次，在吸水纸上拍干；

6)每孔加化学发光底物100μL，振荡混匀，室温(20～28℃)反应30分钟；

7)在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔；

8)分别对校准品浓度和对应RLU取对数，在双对数坐标图上建立标准曲线，以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，见附图1，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区的浓度；

9)打印检测结果报告。

实施例6 本发明的试剂盒的方法学检定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果见下表1：

表1 试剂盒的技术指标检测结果

 

检验项目	检验标准	检验结果
			准确性	平均回收率在90.0～110.0％	95.8％
特异性	与其类似物的交叉反应率≤0.01％	<0.01％
			精密性CV(％)	≤15％(n＝10)	5.4％
灵敏度	≤2.4ng/mL	2.0ng/mL
			稳定性	各试剂组分置37℃至少7天	符合以上指标

以上结果表明“乙肝表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒”的准确性、特异性、精密性、灵敏度和稳定性是完全符合要求的。

实施例7 使用本发明的试剂盒与市场上的酶联免疫试剂盒对病人血样测值的比较

使用本发明的试剂盒和酶联免疫大蛋白检测试剂盒同时检测45份乙肝大三阳病人标本，两种试剂盒的比较结果见下表2：

表2 本试剂盒与酶联试剂盒检测对比结果

从所列检测结果数据分析，本发明试剂盒在45份大三阳标本中检出34份阳性，阳性率为76％，而酶免试剂盒检出30份阳性，阳性率为67％。结果显示本试剂盒的检测结果与临床具有更高的符合率，更便于推广应用，安全可靠。

Claims (9)

1、一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品；

2)链亲和素化的固相载体；

3)生物素化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体；

4)碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体；以及

5)上述碱性磷酸酶所作用的化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链亲和素化的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

4、如权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为溶液，其包含24g Tris、160g NaCl、4g KCI、15mL HCl、200mL 3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin 300、1000mL双蒸水。

5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区纯品配制乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品；

2)以链亲和素包被固相载体；

3)使乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体生物素化；

4)用碱性磷酸酶标记乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体；

5)配制化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物；

6)分装上述乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区校准品、生物素化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物1，2-二氧乙烷类衍生物；以及

7)组装为成品。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述链亲和素包被固相载体的步骤2)采用以下方法：

1)包被

采用0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的链亲和素混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；

2)用生理盐水洗涤上述固相载体；以及

3)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9gNaH₂PO₄·12H₂O、10g BSA和1mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～7.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。

7、如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述链亲和素包被的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

8、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

9、如权利要求5或8所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为溶液，其包含24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15mLHCl、200mL 3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、1mL Proclin 300、1000mL双蒸水。

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