CN108089007A - 一种定量检测c反应蛋白的试剂盒及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体；包被有C反应蛋白的单克隆抗体的载体；C反应蛋白校准品和洗涤液；化学发光底物液。同时，试剂盒的制备方法包括，示踪物标记C反应蛋白的单克隆抗体；以C反应蛋白的单克隆抗体包被载体；以C反应蛋白纯品配制CRP校准品；分装上述C反应蛋白校准品、标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体、和该示踪物所作用的化学发光底物；组装为成品。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。

Description

一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及其制备方法。
背景技术
C－反应蛋白（C-neactveprotein,简称CRP），早于1930年发现，是一种能与肺炎球菌C多糖体反应形成复合物的急性时相反应蛋白。并且在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质（急性蛋白），激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞。近年来，由于检测技术的更新，测定CRP的快速、简便和可靠的方法已迅速建立。使CRP在临床应用领域大大增加，其在医学上的价值正得到广泛验正和承认。CRP在炎症开始数小时就升高，48小时即可达峰值，随着病变消退、组织、结构和功能的恢复降至正常水平。此反应不受放疗、化疗、皮质激素治疗的影响。因此，CRP的检测在临床应用相当广泛，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断，手术后感染的监测；抗生素疗效的观察；病程检测及预后判断等。
现有技术检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、生化免疫分析、酶联免疫吸附方法和化学发光免疫分析。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。但现有技术中对CRP的检测方法一般都有各自的特点及不足：放射性同位素免疫分析结果比较准确，缺点是耗时长，操作复杂，放射性标记物会对实验人员产生危害，并且会产生环境污染，目前已经逐渐被其他方法所替代；生化免疫法已被广泛应用，但其检测灵敏度低；酶联免疫吸附方法目前存在结果受环境影响大，灵敏度低等缺点，并且不适合随机检测；现有技术的使用化学发光免疫分析技术在CRP免疫分析产品的应用多为定性检测，定量检测的技术也存在灵敏度低，特异性差的缺点， 主要是所使用的抗体原料的亲和力弱引起，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。
发明内容
本发明提供一种定量检测C反应蛋白的试剂盒及制备方法，克服现有技术的只能定性检测或者定量检测灵敏度低，特异性差的缺点。本发明研制的C反应蛋白测定试剂盒（化学发光法）采用的是双抗体夹心一步法反应模式，采用C反应蛋白单克隆抗体制备固相，特异性的单克隆抗体纯度高、无传染性，非特异结合反应小，可以大批量生产，同时本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。
一方面，本发明提供了一种定量检测C反应蛋白的试剂盒，本发明的试剂盒包括：
1）吖啶脂标记的C反应蛋白的单克隆抗体；
2）包被有C反应蛋白的单克隆抗体的载体；
3）C反应蛋白校准品；
4）上述吖啶脂所作用的化学发光底物。
另一方面，本发明提供了一种定量检测C反应蛋白的试剂盒的制备方法，该方法包括：
1）用吖啶脂标记C反应蛋白的单克隆抗体；
2）以C反应蛋白的单克隆抗体包被载体；
3）以C反应蛋白纯品配制C反应蛋白校准品；
4）分装上述C反应蛋白校准品、吖啶脂标记的C反应蛋白的单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；
5）组装为成品。
在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述载体可以为固相载体、磁性微粒、微孔板、塑料管或塑料珠；
在其中一个实施例中，所述载体优选为磁性微粒：由于其表面积大及结合蛋白能力强
所述吖啶类衍生物可以为吖啶酯 ，吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸。
所述化学发光底物为过氧化脲或过氧化氢，二氧乙烷类衍生物，鲁米诺或异鲁米诺。
在根据本发明的方法中，其中所述包被载体的步骤（2）可以包括以下过程：
1.称量0.2g的NaH2PO4·2H2O, 2.9g的NaH2PO4·12H2O于1L的洁净容器中，加入1L的双蒸水溶解混匀后， PH为7.0～7.5；
2.加入适量CRP单抗和偶联剂，与固相载体2～8℃反应16-24h；
3.生理盐水洗涤；
4.用磷酸盐缓冲液进行保存；
其中，所述保存液，基于1000mL所述保存液包含0.2g NaH2PO4·2H2O，2.9g NaH2PO4·12H2O、10gBSA、和1mL Proclin 300, pH值为7.0～7.5。
在本发明的过程中，发明人发现，CRP抗体原料的筛选，对CRP定量检测的灵敏度有较大影响；
在本发明的其中一个实施例中，CRP不同配对的包被单克隆抗体和标记单克隆抗体要求这些CRP单克隆抗体，纯度不低于90％；
其中，包被抗体浓度为2μg/mL-5μg/mL，低或高于于此浓度，会使CRP定量检测的灵敏度偏低 ；
标记抗体稀释比为1：10000-1:40000，低或高于于此标记抗体稀释比，会降低CRP定量检测的灵敏度（具体见实施例3）。
本领域技术人员已知，化学发光定量检测试剂盒的一般孵育时间为 60min；孵育温度为37℃；不同的孵育温度和时间对试剂盒定量检测准确度有较大的影响。
在本发明的过程中，发明人发现，CRP定量检测使用的双抗体夹心一步法的反应模式和反应条件最终也会影响试剂盒（具体见实施例4）。
具体的，上述试剂盒可以包括CRP校准品、抗体包被磁微粒、吖啶脂标记物与化学发光底物液、浓缩洗涤液等。其中，所述CRP校准品为标准级，纯度不低于90%；抗体包被磁微粒为2-3μm的磁性微球；吖啶脂标记物为吖啶脂的衍生物；化学发光底物液为HNO3、H2O2和NaOH；浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液。
本发明“C反应蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人CRP的含量，可以根据CRP含量，对急性感染的病情进行监测、疗效评价和预后的判断有重要意义。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。根据本发明的试剂盒，吖啶脂标记的CRP单抗与载体上包被的CRP单抗和被测样品的CRP抗原形成双抗体夹心的结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。
进一步地，本发明中对原料进行了筛选及优化，原料的筛选将影响包括标记抗体与包被抗体的活性、载体的吸附性能和变异大小等；最终影响试剂盒的灵敏度和特异性。
更进一步地，本发明对试剂盒的反应模式和条件进行了优化，试剂盒的反应模式和反应条件将影响定量检测的准确性。对试剂盒反应模式和条件的确定更有利于广泛推广和适用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是试剂盒校准曲线图，以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，其中线性方程为y=10863x-14307，r= 0.9993；
图2为试剂盒制备方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 CRP吖啶脂标记单抗的制备
取一定量CRP单克隆抗体，采用0.02mol/L pH9.6 CB调整浓度为2mg/mL；
按抗体：吖啶酯=1：10～20摩尔比加入已活化吖啶酯，室温反应1.0h；
将反应液移至透析袋（截留分子量8000～12000），采用0.02mol/L pH9.6 CB透析24h，加入等量甘油，放置－20℃以下保存。
实施例2 制备本发明的CRP定量测定试剂盒
一、吖啶脂抗体制备
1. 吖啶脂标记单抗稀释液:
Tris 12.12g
BSA 5g
Proclin 300 1mL
双蒸水 定容至 1000ml
放入洁净容器中，双蒸水定容，溶解混匀；
2. 吖啶脂标记单抗浓度选定：
采用方阵法选择吖啶脂标记单抗的工作浓度大于1：2000。
二、CRP校准品的制备
用CRP纯品配制，稀释液稀释，分装为0.5mL/瓶，浓度为 0、2、5、20、50、200mg/L，共6瓶，2～8℃保存。
三、磁性微粒的制备
1．包被
NaH2PO4·2H2O 0.2g
NaH2PO4·12H2O 2.9g
双蒸水 1000 ml
溶解混匀后，调节 PH值为7.3，加入适量CRP单抗和偶联剂，与磁性微粒3℃ 反应18h；
2. 洗涤：用生理盐水洗三次；
3. 封闭
NaH2PO4·2H2O 0.2g
NaH2PO4·12H2O 2.9g
BSA 10g
Proclin 300 1ml
双蒸水 定容至 1000ml
放入洁净容器中，溶解混匀,调节pH值为7.3，加入洗涤后磁微粒，静置室温3小时后，分装， 2～8℃保存；
四、成品组成。
实施例3 CRP原料的筛选
CRP抗体原料的筛选，对CRP定量检测的灵敏度有较大影响；
CRP不同配对的包被单克隆抗体和标记单克隆抗体要求这些CRP单克隆抗体，纯度不低于90％，使用这些CRP单克隆抗体，分别进行包被和标记，然后考察它们在不同浓度下的匹配反应性。
1.包被方法：
称量0.2g的NaH2PO4•2H2O,2.9g的NaH2PO4•12H2O于1L的洁净容器中，加入1L的双蒸水溶解混匀后，调节PH值为7.0～7.5；
加入适量CRP单抗和偶联剂，与固相载体2～8℃ 反应16-24h；
生理盐水洗涤；
磷酸盐缓冲液保存。
2.保存液
NaH2PO4·2H2O 0.2g
NaH2PO4·12H2O 2.9g
BSA 10g
Proclin 300 1mL
调节pH值为7.0～7.5。
3.抗体包被液浓度选择
包被抗体浓度为2μg/mL-5μg/mL，低或高于于此浓度，会降低CRP定量检测的灵敏度；
优选地，包被抗体浓度为4μg/ml，CRP定量检测的灵敏度较好。
4.标记抗体稀释比选择
标记抗体稀释比为1：10000-1:40000，低或高于于此标记抗体稀释比，会降低CRP定量检测的灵敏度；
优选地，标记抗体稀释比例在1:10000进行配对时，CRP定量检测的灵敏度较好。
实施例4 试剂盒的反应模式和反应条件
1.试剂盒孵育温度
孵育温度的范围为25℃～45℃；
优选地，孵育温度可以选择为25℃, 37℃, 40℃, 45℃；
更进一步地，孵育温度为37℃时灵敏度最好。
2.试剂盒孵育时间
孵育时间的范围为15min～45min；
优选地，孵育时间可以选择为15min，30min，45min；
更进一步地，孵育温度为30min时灵敏度最好。
实施例5 本发明的试剂盒的方法学鉴定
按照该产品的技术标准要求对实施例2中制备的试剂盒进行检定，
（1）试剂盒灵敏度实验
以S0校准品进行20孔重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度，其灵敏度为0.6mg/L。
（2）试剂盒特异性实验
与其类似物作交叉反应实验，交叉反应率<0.01%。
（3）试剂盒精密性实验
批内变异
取低、中、高三份质控血清样品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值（）和标准差（s）。按公式CV＝s/×100％计算变异系数，批内变异系数CV分别为4.5%，5.3%，4.2 %。
批间变异
选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数（CV％），批间变异CV在4.5～ 6.6%之间。
（4）试剂盒准确性实验
将高浓度的校准品原料，用正常人血清稀释成四个不同浓度值，每个浓度做5孔平行实验，分别计算回收率在91-108%范围内。
（5）试剂盒稳定性实验
试剂盒保存温度为2-800C，经过15个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求，
考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响，我们进行370C ，7天的加速实验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。
说明“C反应蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性、准确性和稳定性是完全合格的。
本发明“C反应蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人CRP的含量，可以根据CRP含量，对急性感染的病情进行监测、疗效评价和预后的判断有重要意义。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。根据本发明的试剂盒，吖啶脂标记的CRP单抗与载体上包被的CRP单抗和被测样品的CRP抗原形成双抗体夹心的结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。
进一步地，本发明中对原料进行了筛选及优化，原料的筛选将影响包括标记抗体与包被抗体的活性、载体的吸附性能和变异大小等；最终影响试剂盒的灵敏度和特异性。
更进一步地，本发明对试剂盒的反应模式和条件进行了优化，试剂盒的反应模式和反应条件将影响定量检测的准确性。对试剂盒反应模式和条件的确定更有利于广泛推广和适用。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种定量检测C反应蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体；包被有C反应蛋白的单克隆抗体的载体； C反应蛋白校准品和洗涤液；化学发光底物液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪物为吖啶类衍生物、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述吖啶类衍生物可以为吖啶酯 ，吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为磁性颗粒、微孔板、塑料珠或塑料管。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，磁性颗粒为2-3μm的磁性微球。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述C反应蛋白的单克隆抗体浓度为4μg/mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体的稀释比为1:10000。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为过氧化脲或过氧化氢，二氧乙烷类衍生物，鲁米诺或异鲁米诺。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于孵育时间为30min，孵育温度为37℃。
10.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）示踪物标记C反应蛋白的单克隆抗体；
（2）以C反应蛋白的单克隆抗体包被载体；
（3）以C反应蛋白纯品配制CRP校准品；
（4）分装上述C反应蛋白校准品、标记示踪物的C反应蛋白的单克隆抗体、和该示踪物所作用的化学发光底物；
（5）组装为成品。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述包被载体的步骤2）包括以下过程：用0.05M pH值为7.0～7.5的磷酸盐包被液，与CRP的单克隆抗体混合后负载于固相载体上，生理盐水洗涤；用pH值为7.0～7.5的磷酸盐进行封闭。
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