CN109975555A - 一种提高c反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂、方法以及高热稳定性c反应蛋白试剂盒 - Google Patents

一种提高c反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂、方法以及高热稳定性c反应蛋白试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂，所述的试剂包括以人血清白蛋白作为封闭剂制备得到的试剂R2以及含有一定浓度人血清白蛋白的校准品，通过在试剂盒中加入上述试剂R2以及校准品，得到具有高热稳定性的C反应蛋白试剂盒。本发明中克服了现有技术中的C反应蛋白试剂盒耐热性较差的缺陷，在不影响其原有的其他性能的前提下，能够有效提高了试剂盒的热稳定性，同时本发明的方法还具有工艺简单、容易操作等特点。

Description

一种提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂、方法以及高热稳 定性C反应蛋白试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂、方法以及通过该方法制备得到的高热稳定性C反应蛋白试剂盒。
背景技术
CRP是一个急性时相反应蛋白，在健康人群中浓度很低。任何伴有侵袭性细菌感染、炎症或者组织受损的疾病情况下，病人血清中都会伴有CRP浓度的增高，非常快速，并且炎症开始后6～12小时中就可检出CRP升高的情况，其峰值比其他的炎症指标来的快，这样可提供用作诊断疾病的早期诊断。检测CRP的方法也有很多，现有的医院检验的方法大多需要用到全自动生化分析仪或者全自动免疫分析仪，这些仪器虽然测试结果精准，但是其价格往往过于高昂，同时测试过程复杂时间较长不适用与快速检测，因此C反应蛋白试剂盒应运而生。
稳定性作为体外诊断试剂保持产品安全有效的重要指标，对产品的生产、运输、保存和使用等环节具有重要的指导意义。体外诊断试剂本身就是生物试剂，一些活性基团会有不同的化学不稳定性趋向，容易发生水解、酶解和氧化等反应，从而影响到试剂的质量和稳定性。目前C反应蛋白试剂盒稳定性主要体现在试剂R2和校准品上，然而现有的试剂R2和校准品其对热的稳定性较差，因此其保存难度较大，需要在较低温度下保存以保证其中的活性成分不失效。
发明内容
本发明克服了现有技术中的C反应蛋白试剂盒中的试剂耐热性较差，在常温环境下易失效，保藏难度大的缺陷；因此本发明的第一个目的在于：提供了一种用于提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂与方法；同时本发明的第二个目的在于提供了一种通过前述方法制得含有前述试剂的具有高热稳定性C反应蛋白试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明通过技术方案实现：
一种用于提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂，所述的试剂包括试剂R2以及校准品；
所述的试剂R2由以下工艺制备：将胶乳颗粒在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的作用下形成活性酯，再将所述活性酯与CRP多抗反应，然后以人血清白蛋白作为封闭剂，完成偶联形成所需试剂的胶乳试剂；
所述的校准品中含有一定浓度的人血清白蛋白。
本发明中的试剂R2与现有技术中的最突出的区别特征在于，本发明中的试剂R2在制备过程中其通过使用人血清白蛋白作为封闭剂，而传统的试剂R2使用的却是牛血清白蛋白，两者在性质上有极大的差异。
现有技术中使用牛血清蛋白作为封闭剂加入到试剂R2中，其与C反应蛋白抗体以及 C反应蛋白之间的结合能力较差，因而其稳定性较差，在受热条件下可能会变性或者失效，因此其无法起到稳定以及保护作用。
而人血清白蛋白是人血浆中含量最丰富的蛋白质，其具有结合和运输内源性与外源性物质的性质，维持血液胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能。由于C反应蛋白抗体是从C反应蛋白抗原免疫制备出来的，而人血清白蛋白与C反应蛋白本来就处于结合状态，因此在试剂R2的交联过程中用人血清白蛋白作为封闭剂更能够使得两者有效地结合，从而提高试剂R2的稳定性。此外由于人血清白蛋白对C反应蛋白具有良好的稳定保护作用，本发明将人血清白蛋白加入试剂R2，试剂的稳定性也得到了有效提高。在后续实验中发现，通过对比人血清白蛋白和牛血清白蛋白对反应幅度区别不大，说明人血清白蛋白对试剂R2具有稳定保护而不影响试剂其他性能的作用。
现有技术中的校准品其通常为含有一定浓度C反应蛋白抗原的缓冲液，其内部没有添加可以保护C反应蛋白抗原稳定性的试剂，因而高温条件下(例如37℃)其结构可能发生变性导致校准品浓度大幅下降，测试结果却无法准确表达。
而本发明在校准品中添加人血清白蛋白，为校准品原料中的蛋白提供了稳定良好的微环境，间接提高了校准品的稳定性。加入人血清白蛋白后，校准品在37℃环境下7天，校准品浓度无明显变化，而不加入人血清白蛋白的校准品浓度普遍下降20-60％左右，且加入人血白蛋白后对校准品浓度影响不大，说明人血清白蛋白对校准品具有稳定保护不影响校准品其他性能的作用。
作为优选，所述的胶乳颗粒的粒径为50-180nm。
本发明中的胶乳颗粒的粒径范围在50-180nm之间，在此区间范围内，当试剂R2与人血清样本中的C反应蛋白特异性结合，能够使得浊度变化始终处于一个高灵敏度的范围内，从而能够有效提高试剂盒的检测限以及准确度。
作为优选，所述的校准品的组分包括：pH为6-8的Good’s缓冲液10-50mmol/L、人血清白蛋白0.1-10‰以及所需浓度的C反应蛋白抗原，然后将其倍比稀释成系列浓度的溶液。
一种提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的方法，所述的C反应蛋白试剂盒中添加有如前所述的试剂R2以及校准品。
一种通过如前所述的方法制备的高热稳定性C反应蛋白试剂盒，包括试剂R1、如前所述的试剂R2以及如前所述的校准品。
作为优选，所述的试剂R1与试剂R2之间的体积比为3:1。
作为优选，所述的试剂R1的组分包括：Good’s缓冲液10-50mmol/L、表面活性剂1.0-10.0g/L、氯化钠2.0-30.0g/L、反应增强剂1.0-20.0g/L以及微生物抑制剂0.001-1.1g/L。
本发明的检测原理为胶乳增强免疫比浊法，具体为在试剂R1中加入人血清样本，试剂R1作为缓冲体系使用，然后加入试剂R2，试剂R2中与C反应蛋白多抗交联的纳米微球上的C反应蛋白多抗和人血清样本中的C反应蛋白特异性结合，形成可溶性抗原抗体复合物，其形成的浊度与样本中的C反应蛋白含量成正相关，从而可以计算得到人血清样本中C反应蛋白含量。
因此，本发明具有以下有益效果：
(1)将人血清白蛋白引入到试剂R2以及校准品中，有效提高了试剂R2以及校准品的热稳定性；
(2)本发明中的试剂盒由于其中的试剂的热稳定性的提升，从而使得其在储存测试过程中不会轻易变性，导致产品失效；
(3)本发明中的试剂盒其灵敏响应度高，有利于保证测试结果的准确性。
附图说明
图1是37℃第0天，实验组的定标曲线图。
图2是37℃第0天，对照组的定标曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明各实施例中的原料以及原料生产厂家如下表1所示，但其仅仅表示个例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
表1
实施例1
本实施例主要描述了试剂R2以及校准品的制备方法。
一种用于提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂，所述的试剂包括试剂R2以及校准品；
所述的试剂R2由以下工艺制备：将胶乳颗粒在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的作用下形成活性酯，再将所述活性酯与CRP多抗反应，然后以人血清白蛋白作为封闭剂，完成偶联形成所需试剂的胶乳试剂。
其具体步骤如下(S.1)～(S.5)中所述：
(S.1)在离心管内分别加入366μL粒径为50-180nm的纳米胶乳颗粒(优选粒径100nm，优但不限于此，产品为乳液状，产品中纳米胶乳颗粒含量为10％(w/v))，260μL pH 6.0的25mmol/L MES缓冲液，加入30ul的12.5mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在37℃金属浴振荡器中震荡20min，4℃高速离心(15000r/min)1小时，弃上清液；
(S.2)在沉淀中加入等体积的磷酸盐缓冲液置于冰浴中，超声振荡3min，超声1秒，间隔3 秒，再加入2.5mL磷酸盐缓冲液，1.67mL的C反应蛋白多抗溶液(预先配制抗体溶液，浓度为0.431mg/mL，原C反应蛋白多抗浓度为10mg/mL，溶剂为磷酸盐缓冲液)，在37℃金属浴振荡器中震荡60min，4℃高速离心(15000r/min)1小时，弃上清液；
(S.3)在沉淀中加入等体积的磷酸盐缓冲液置于冰浴中，超声振荡3min，超声1秒，间隔3 秒，再加入120μL 10g/L的Tween20溶液和360μL 20g/L的人血清白蛋白溶液，在37℃金属浴振荡器中震荡5min；
(S.4)继续加入0.83mL磷酸盐缓冲液，在37℃金属浴振荡器中震荡10min；
(S.5)加入3μL ProClin 300，得到C反应蛋白多抗交联的纳米微球颗粒。
本实施例中的校准品中各组分及含量如下：pH为7.5的磷酸盐缓冲液10-50mmol/L(优选50mmol/L，但不限于此)，人血清白蛋白含量为0.1-10‰(优选1‰，但不限于此)，根据所需的浓度加入C反应蛋白抗原(3.26mg/mL)，以此配制成一系列浓度的配套校准品(0mg/L、5mg/L、20mg/L、40mg/L、150mg/L、300mg/L)。
实施例2
本实施例主要描述了一种高热稳定性C反应蛋白试剂盒，包括试剂R1、R2及校准品，其中试剂R1与R2的试剂比为3:1。
所述的R1组成及含量如下：
pH为5.30的柠檬酸缓冲液10-50mmol/L(优选50mmol/L，但不限于此)，表面活性剂(Tween20)1.0-10.0g/L(优选10.0g/L，但不限于此)，氯化钠2.0-30.0g/L(优选24.0g/L，但不限于此)，反应增强剂(聚乙二醇8000)1.0-20.0g/L(优选10.0g/L，但不限于此)，微生物抑制剂(ProClin 300)0.001-1.1g/L(优选0.5g/L，但不限于此)。
所述的试剂R2以及校准品如实施例1中所述。
对比例1
本对比例中试剂R2的制备过程中，其制备过程与试剂加入量同实施例1中的(S.1)～(S.5) 所示，但是人血清白蛋白换成牛血清白蛋白。其余试剂R1以及校准品与实施例2中相同，通过比较在试剂R2中加入人血清白蛋白和不加入人血清白蛋白作为封闭剂时，两种试剂盒的稳定性。
具体检测参数如下：
检测参数
反应类型：两点终点法 温度：37℃ 比色杯光径：1.0cm
主/副波长：570nm/800nm 单位：mg/L 反应方向：上升。
表2
结果参见表3、4。从结果可以看出：用人血清白蛋白作为封闭剂后，试剂R2在37℃环境下7天，试剂反应幅度无明显变化，而不用入人血清白蛋白的试剂R2的反应幅度变化幅度在0-20％左右，且图1和图2分别是37℃第0天，实验组与对照组的定标曲线图，根据图以及表1和2结果可以看出，在用人血清白蛋白和牛血清白蛋白对反应幅度区别不大，说明人血清白蛋白对试剂R2具有稳定保护而不影响试剂其他性能的作用。
检测结果
表3
表4
对比例2
本实施例主要比较加入人血清白蛋白和不加入人血清白蛋白的校准品的稳定性，其检测参数如同实施例3。
结果参见表5、6。从结果可以看出：加入人血清白蛋白后，校准品在37℃环境下7天，校准品浓度无明显变化，而不加入人血清白蛋白的校准品浓度普遍下降20-60％左右，且加入人血白蛋白后对校准品浓度影响不大，说明人血清白蛋白对校准品具有稳定保护不影响校准品其他性能的作用。
表5
表6

Claims (7)

1.一种用于提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂，其特征在于，所述的试剂包括试剂R2以及校准品；
所述的试剂R2由以下工艺制备：将胶乳颗粒在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的作用下形成活性酯，再将所述活性酯与CRP多抗反应，然后以人血清白蛋白作为封闭剂，完成偶联形成所需试剂的胶乳试剂；
所述的校准品中含有一定浓度的人血清白蛋白。
2.根据取权利要求1所述的一种用于提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂，其特征在于，所述的胶乳颗粒的粒径为50-180nm。
3.根据取权利要求1所述的一种用于提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂，其特征在于，所述的校准品的组分包括：pH为6-8的Good’s缓冲液10-50mmol/L、人血清白蛋白0.1-10‰以及所需浓度的C反应蛋白抗原，然后将其倍比稀释成系列浓度的溶液。
4.一种提高C反应蛋白试剂盒热稳定性的方法，其特征在于，所述的C反应蛋白试剂盒中添加有如权利要求1~3中所述的试剂R2以及校准品。
5.一种通过权利要求4中所述的方法制备的高热稳定性C反应蛋白试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、如前所述的试剂R2以及如前所述的校准品。
6.根据权利要求5所述的一种高热稳定性C反应蛋白试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1与试剂R2之间的体积比为3:1。
7.根据权利要求5或6所述的一种高热稳定性C反应蛋白试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1的组分包括： Good’s缓冲液10-50mmol/L、表面活性剂1.0-10.0g/L、氯化钠2.0-30.0g/L、反应增强剂1.0-20.0g/L以及微生物抑制剂0.001-1.1g/L。
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