CN108548816A - 一种用于检测触珠蛋白含量的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用免疫透射比浊法检测触珠蛋白含量的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括:(1)试剂R1:缓冲液、表面活性剂、电解质、高分子加速剂、防腐剂;(2)试剂R2:缓冲液、抗人触珠蛋白抗体、电解质、防腐剂和稳定剂;(3)校准品:触珠蛋白抗原、稳定剂、防腐剂。本试剂盒具有准确度高、重复性好、检测快速、稳定性强等优点,能够满足临床快速高通量检测样本的要求,具有很高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,涉及一种临床生物化学类检测试剂盒,特别是涉及一种用免疫透射比浊法检测血清或血浆中触珠蛋白含量的试剂盒。
背景技术
触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)又称结合珠蛋白,分子量约80000,是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白,广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及其他体液中。触珠蛋白在肝脏合成,其主要功能是可以与游离血红蛋白(Hemoglobin,Hb)结合形成稳定的Hp-Hb复合物。当某种原因诱发红细胞在血管内破坏时,大量血红蛋白会释放到血液循环中,血红蛋白可以从人的肾脏滤过,造成肾脏损害。而触珠蛋白与游离血红蛋白结合成的复合物,由于其分子较大,不能从肾脏排出,这样可以阻止血红蛋白从肾小球滤过,避免游离血红蛋白对肾小管的损害。触珠蛋白与游离血红蛋白结合成复合物后,呈现出新的抗原决定簇,可被单核细胞、巨噬细胞表面的血红蛋白清除受体(CD163)所识别并结合,之后被吞噬降解,从而除去了血循环中游离的血红蛋白。这种生理现象,为临床检验学提供了一个十分有意义的参照指标,当医生利用实验仪器发现血清触珠蛋白含量下降时,结合病人的临床表现,可以确定是否发生了血管内溶血性疾病,如阵发性睡眠性血红蛋白尿症和蚕豆病,以及先天性无结合珠蛋白血症等。
触珠蛋白还是目前较为敏感的急性期反应标志物,是急性时相反应物之一。当机体处在应激状态时,血液中的触珠蛋白明显增多,如心肌梗塞、肿瘤、炎症、创伤、感染等病理状态时,以及应用某些激素,如皮质激素和雄性激素后,其血清含量常有显著升高,并与严重程度和预后有关。科学人员利用急性肺栓塞为研究对象,采用RT-PCR的方法检测急性肺栓塞大鼠模型肺组织中结合珠蛋白和铁蛋白mRNA水平的变化,结果发现,急性肺栓塞后大鼠肺组织中结合珠蛋白和铁蛋白mRNA水平逐渐升高,血清中结合珠蛋白和铁蛋白的蛋白水平也逐渐升高。这说明急性肺栓塞后肺组织细胞增加了结合珠蛋白和铁蛋白的合成,导致这两种蛋白的血清水平明显升高。研究结论表明,监测血清结合珠蛋白和铁蛋白含量的变化,对急性肺栓塞的病人具有一定的诊断价值。
此外,由于触珠蛋白的合成与降解均在肝脏,并且在触珠蛋白与血红蛋白的复合物形成与降解的过程中,触珠蛋白不能重复利用,因此当肝脏功能出现问题时,体内的触珠蛋白数量常发生明显的变化。合成不足则其含量减少,降解不足则其含量增多。此时化验检查血液中的触珠蛋白含量是否减少或增加,对诊断肝脏疾病,判断疾病的预后,很有帮助。
正常人血清触珠蛋白含量为30-200mg/dL。在某些疾病中,特别是在发生感染、创伤、炎症、肿瘤、心梗等病理状态时,其含量显著升高。
现有技术中常用的触珠蛋白检测方法是放射免疫分析法、酶联免疫法。这些技术存在诸多不足,如需要特殊的设备,样本需要预处理,不能上全自动生化分析仪进行批量检测分析等。放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题。酶联免疫法应用比较普遍,但该方法为非均相免疫检测系统,测定过程较为繁琐,耗时较长;自动化程度不高,批间差相对较大;酶免法需要配备多种专门设备,一定程度上增加了成本。
随着样本检验数量的不断增加,临床上迫切需要一种更为简便、快捷的方法来进行规模化批量操作。免疫比浊法检测触珠蛋白可直接在全自动生化分析仪上完成批量样本分析,操作简单、可实现快速、高通量样本的检测。另外,为了提高试剂稳定性,特别添加了一种稳定剂用于改善试剂性能,可以保存更长时间。
发明内容
针对现有技术存在的缺点与不足,本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,达到操作简单、重复性好、能够进行批量样本全自动化检测的目的。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是,一种用免疫透射比浊法检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品,所述试剂R1包含如下组分:缓冲液,浓度为10~500mM,pH范围是5.5~9.0;表面活性剂,浓度为0.5~5g/L;电解质,浓度为5~50g/L;高分子促进剂,浓度为2~100g/L;防腐剂,浓度为1~10g/L;所述试剂R2包含如下组分:缓冲液,浓度为10~500mM,缓冲液的pH范围是5.5~9.0;抗人触珠蛋白抗体;电解质,浓度为5~50g/L;防腐剂,浓度为1~10g/L;稳定剂,浓度为5~50g/L;所述校准品包含如下组分:触珠蛋白抗原;稳定剂,浓度为5~50g/L;防腐剂,浓度为1~10g/L。
上述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,所述的缓冲液为TRIS缓冲液;所述的抗人触珠蛋白抗体选自兔抗人或羊抗人抗体,抗体种类为多克隆抗体或单克隆抗体,抗体浓度为10~50%(w/v);所述的电解质为氯化钠;所述的高分子促进剂为聚乙二醇(PEG),分子量为6000~10000;所述表面活性剂选自Tween系列;所述防腐剂为叠氮钠;所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖和牛血清蛋白中的一种或几种。
上述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,所述的缓冲液优选TRIS缓冲液,缓冲液浓度优选20~100mM,缓冲液的pH值范围优选7.0~8.0;所述的抗人触珠蛋白抗体优选兔抗人触珠蛋白多克隆抗体,抗体浓度优选12~20%(w/v);所述的电解质为氯化钠,电解质浓度优选5~15g/L;所述的高分子促进剂优选PEG 6000,浓度优选50~100g/L;所述的表面活性剂优选Tween 20,浓度优选1~5g/L;所述的防腐剂优选叠氮钠,浓度优选1~5g/L;所述的稳定剂优选海藻糖,浓度为5~10g/L。
上述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,所述的校准品包括触珠蛋白抗原5~500mg/dL、稳定剂5~50g/L、防腐剂1~10g/L。
上述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,所述的触珠蛋白抗原浓度优选10~360mg/dL,所述的抗原稳定剂优选牛血清白蛋白,浓度为10g/L,抗原防腐剂为1g/L叠氮钠。
上述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,所述的校准品制备成高浓度单点校准品,在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品,或者直接制备成6个不同浓度的参考校准品。
本发明的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒采用免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法,其基本原理是:样本中的触珠蛋白抗原和试剂R2中的触珠蛋白抗体发生相应的免疫反应,形成不溶性的抗原-抗体复合物,使反应液产生一定的浊度。反应液中触珠蛋白抗体过量时,形成的免疫复合物的量随着样本中触珠蛋白抗原量的增加而增加,反应液的浊度也相应增加。在特定波长下测定该复合物的吸光值,与校准品标定的校准曲线比较,即可计算出样本中的触珠蛋白的含量。
相较于现有技术,本发明提供的用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒具有如下优点及有益效果:使用简便快速,能够满足临床快速高通量检测样本的要求,检测效率明显提高,试剂更稳定,适合临床推广。
附图说明
图1为本发明测定血清触珠蛋白含量的方法示意图;
图2为本发明实施例2的触珠蛋白校准品的标准曲线;
图3为本发明试剂实施例2与实施例3稳定性试验对比;
图4为本发明试剂实施例2与实施例3稳定性试验对比。
具体实施方式
以下就本发明提供的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒做进一步说明。
实施例1
1.配制试剂:
试剂R1:
试剂R2:
校准品:
触珠蛋白抗原 352.0mg/dL
牛血清白蛋白BSA(稳定剂) 10g/L
叠氮钠(防腐剂) 1g/L
按照需要的校准品浓度将相应量的触珠蛋白抗原添加到上述溶液中,制备得到触珠蛋白校准品。该校准品可以是高浓度单点校准品,在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品,也可以直接制备成6个不同浓度的参考校准品。本实施例配制6个不同浓度的参考校准品,分别为0.0mg/dL、22.0mg/dL、44.0mg/dL、88.0mg/dL、176.0mg/dL和352.0mg/dL。然后用0.22μm的滤膜过滤除菌,放置2~8℃保存。
实施例2
1.配制试剂:
试剂R1:
试剂R2:
校准品:
牛血清白蛋白BSA(稳定剂) 8g/L
叠氮钠(防腐剂) 1g/L
触珠蛋白抗原 352.0mg/dL
按照需要的校准品浓度将相应量的触珠蛋白抗原添加到上述溶液中,制备得到触珠蛋白校准品。该校准品可以是高浓度单点校准品,在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品,也可以直接制备成6个不同浓度的参考校准品。本实施例选用的是高浓度单点参考校准品,触珠蛋白抗原浓度为352.0mg/dL,然后用0.22μm的滤膜过滤除菌,放置2~8℃保存。使用时用生理盐水稀释成5个不同浓度的参考校准品,分别为0.0mg/dL、22.0mg/dL、44.0mg/dL、88.0mg/dL、176.0mg/dL和352.0mg/dL。
2.检测:
触珠蛋白检测方法如图1所示,分析方法为两点终点法,具体来说:样本加样量为4μl,试剂R1和R2加样量分别为240μl和60μl;240μl试剂R1加入4μl样本在37℃保温5分钟,然后加入60μl试剂R2,紧接着记录吸光度值OD1,37℃继续保温5分钟后记录吸光度值OD2;检测波长分别为:主波长340nm,副波长660nm。
3.标准曲线绘制:
采用本实施例试剂及上述测定方法,使用日立7180全自动生化分析仪测得的6个不同浓度触珠蛋白(HP)校准品的吸光度,并绘制标准曲线,如图2所示。X轴代表触珠蛋白含量,Y轴代表吸光度值。该标准曲线可以用于检测标本中触珠蛋白含量。
采用实施例2的检测方法及标准曲线,取二个临床血清样本,使用日立7180全自动生化分析仪对每个样本重复检测10次,检测结果如表1所示。
表1血清样本触珠蛋白浓度及变异系数(浓度:mg/dL)
测定次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV |
样本1 | 31.3 | 30.3 | 30.3 | 31.0 | 30.0 | 30.8 | 30.4 | 30.2 | 30.3 | 30.4 | 1.32% |
样本2 | 138.4 | 138.7 | 140.5 | 138.8 | 141.1 | 144.9 | 148.9 | 141.7 | 141.9 | 142.6 | 2.27% |
结果显示,测定低值样本变异系数为1.32%,测定高值样本变异系数为2.27%,表明本发明所述试剂盒具有较高精密度。
实施例3
1.配制试剂:
试剂R1:
试剂R2:
校准品:
牛血清白蛋白BSA(稳定剂) 8g/L
叠氮钠(防腐剂) 1g/L
触珠蛋白抗原 352.0mg/dL
实施例3的试剂配制方法与实施例2基本一致,只是试剂R2中不添加海藻糖。实施例3的标准品浓度和制备方法同实施例2完全一样。
将实施例3和实施例2的试剂R1、R2同时在生化分析仪上用同一批标准品定标,并绘制标准曲线(图3)。然后,将二种试剂置于37℃条件下进行加速破坏试验,7天后在生化分析仪上再次对两种试剂定标,并绘制标准曲线,定标曲线见图4。比较图3和图4可以看出,实施例3定标吸光度下降明显,试剂灵敏度降低,而添加海藻糖的实施例2定标吸光度在加速试验前后没有明显改变,这说明海藻糖可以提高试剂稳定性,增加试剂保存期限。
实施例4
1.配制试剂:
试剂R1:
试剂R2:
校准品:
触珠蛋白抗原 240.0mg/dL
牛血清白蛋白BSA(稳定剂) 5g/L
叠氮钠(防腐剂) 1g/L
按照需要的校准品浓度将相应量的触珠蛋白抗原添加到上述溶液中,制备得到触珠蛋白校准品。该校准品可以是高浓度单点校准品,在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品,也可以直接制备成6个不同浓度的参考校准品。本实施例配制6个不同浓度的参考校准品,分别为0.0mg/dL、15.0mg/dL、30.0mg/dL、60.0mg/dL、120.0mg/dL和240..0mg/dL。然后用0.22μm的滤膜过滤除菌,放置2~8℃保存。
实施例5
1.配制试剂:
试剂R1:
试剂R2:
校准品:
触珠蛋白抗原 500mg/dL
牛血清白蛋白BSA(稳定剂) 50g/L
叠氮钠(防腐剂) 2g/L
按照需要的校准品浓度将相应量的触珠蛋白抗原添加到上述溶液中,制备得到触珠蛋白校准品。该校准品可以是高浓度单点校准品,在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品,也可以直接制备成6个不同浓度的参考校准品。本实施例配制6个不同浓度的参考校准品,分别为0.0mg/dL、31.3mg/dL、62.5mg/dL、125.0mg/dL、250.0mg/dL和500.0mg/dL。然后用0.22μm的滤膜过滤除菌,放置2~8℃保存。
以上所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是,凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于检测血清或血浆中触珠蛋白含量的试剂盒,该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品,其特征在于:
所述试剂R1包含如下组分:
缓冲液,浓度为10~500 mM, pH范围是5.5~9.0;
表面活性剂,浓度为0.5~5 g/L;
电解质,浓度为5~50 g/L;
高分子促进剂,浓度为2~100 g/L;
防腐剂,浓度为1~10 g/L;
所述试剂R2包含如下组分:
缓冲液,浓度为10~500 mM,缓冲液的pH范围是5.5~9.0;
抗人触珠蛋白抗体,浓度为10~50%(w/v);
电解质,浓度为5~50 g/L;
防腐剂,浓度为1~10 g/L;
稳定剂,浓度为5~50 g/L;
所述校准品包含如下组分:
触珠蛋白抗原,浓度为0.05~5.0 g/L;
稳定剂,浓度为5~50 g/L;
防腐剂,浓度为1~10 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,其特征在于:
所述的缓冲液为TRIS缓冲液;
所述的抗人触珠蛋白抗体选自兔抗人或羊抗人抗体,抗体种类为多克隆或单克隆抗体;
所述的电解质为氯化钠;
所述的高分子促进剂为聚乙二醇(PEG),分子量为6000~10000;
所述表面活性剂选自Tween系列;
所述防腐剂为叠氮钠;
所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖和牛血清蛋白中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,其特征在于:
所述的缓冲液优选TRIS缓冲液,缓冲液浓度优选20~100 mM,缓冲液的pH值范围优选7.0~8.0;
所述的抗人触珠蛋白抗体优选兔抗人触珠蛋白多克隆抗体,抗体浓度优选12~20%(w/v);
所述的电解质为氯化钠,电解质浓度优选5~15 g/L;
所述的高分子促进剂优选PEG 6000,浓度优选50~100 g/L;
所述的表面活性剂优选Tween 20,浓度优选1~5 g/L;
所述的防腐剂优选叠氮钠,浓度优选1~5 g/L;
所述的稳定剂优选海藻糖,浓度为5~10 g/L。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,其特征在于:所述的校准品包括触珠蛋白抗原5~500 mg/dL、稳定剂5~50 g/L、防腐剂1~10 g/L。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,其特征在于:所述的触珠蛋白抗原浓度优选10~360 mg/dL,所述的抗原稳定剂优选牛血清白蛋白,浓度为10 g/L,抗原防腐剂为1 g/L叠氮钠。
6.根据权利要求1、4和5所述的一种用于检测血清中触珠蛋白含量的试剂盒,其特征在于:所述的校准品制备成高浓度单点校准品,在使用时用生理盐水稀释成6个不同浓度的参考校准品,或者直接制备成6个不同浓度的参考校准品。
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CN111323601A (zh) * | 2020-03-14 | 2020-06-23 | 北京市糖尿病研究所 | 用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒及方法 |
CN111381040A (zh) * | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种性能高效的检测结合珠蛋白检测试剂 |
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CN111323601A (zh) * | 2020-03-14 | 2020-06-23 | 北京市糖尿病研究所 | 用于检测尿液中微量触珠蛋白的化学发光试剂盒及方法 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180918 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |