CN108362892A - 一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，可有效解决降钙素原的检测问题，技术方案是，包括试剂1和试剂2，试剂1是由三羟甲基氨基甲烷、叠氮钠，加水混匀，用盐酸调pH值制成；试剂2是由三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇20000、吐温‑20、蔗糖、叠氮钠、干酪素，加水混匀，用盐酸调pH得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，调整浓度，即得试剂2。本发明组份科学，新颖独特，易生产，成本低，性能稳定，保质期长，测试准确，无环境污染，经济和社会效益显著，是降钙素原检测试剂上的创新。

Description

一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂。
背景技术
降钙素原(procalcitonin，PCT)是一种糖蛋白，分子结构为含32个氨基酸CT、含21个氨基酸钙抑肽和含57个氨基酸的N末端碎片组成，分子量为13kDa，为血清降钙素(cT)的前肽，是一种无激素活性的糖蛋白，也是一种内源性非类固醇类抗炎物质，由Maya等在1975年发现，其完整的结构在1981年被测出，Assicot等在1993年发现了血清PCT水平的增高与全身感染性疾病有密切相关。在正常的生理状态下，无激素活性的降钙素原是由甲状腺C-细胞产生与分泌，并由细胞内特殊蛋白酶分解降钙素原成降钙素，在其它不同组织中也有PCT mRNA表达，如在肝、肺、肾和睾丸中也有表达，但血清PCT的浓度极低(10～50pg/m1)，常规的方法检测不到。在病理状态下，如髓质甲状腺肿瘤或其他神经内分泌肿瘤、严重细菌感染、脓毒症、多器官功能障碍综合症(MODS)等等，PCT的血清浓度大幅增高，可超过10ng/mI。机体局部感染、病毒感染或自身免疫性疾病时PCT水平只轻微升高，非细菌性炎症和过敏反应时PCT水平不升高，在寄生虫、真菌、患疟疾等感染性疾病时患者PCT水平也增高，细菌感染引起的PCT水平升高主要来自上述各种器官的巨噬细胞和单核细胞。近年来，许多学者对PCT做大量的探索与研究，其在临床诊断中的应用和其生物学特性不断被发现，在全身性感染性疾病的诊断及感染情况发展变化和预后的判断，对症治疗等提供了可靠的诊断标准，其检测方法亦在不断更新，向自动化、微量化迈进。
目前，检测PCT的方法有很多，不仅可以定性，亦可以定量，常用的方法有：凝胶层析及高效液相色谱分析、酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、放射免疫测定(Radioimmunoassay，RIA)、免疫发光法、胶体金层析法和胶乳颗粒增强免疫比浊法。其中，凝胶层析及高效液相色谱分析费时且不易自动化；ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；RIA法既能检测游离PCT，又能检测结合型PCT，也可检测降钙素基因相关前体(Pro-CGRP)，此法可信敏感度为4pg/ml，能检测正常人血清PCT，较双抗夹心法敏感，RIA缺点是所需时间较长，检测结果不稳定，重复性比ELISA差，且存在放射性污染危险。金标方法虽稳定性较好，但灵敏度较低，一般只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用，尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。免疫发光法采用两个抗原特异性抗体分别结合在PCT的不同位点。一株抗体是光标记(示踪物)，而另一株则结合于试管内壁的包被物上。在孵育过程中，抗体与标本中的降钙素原分子结合形成夹心复合物，而光标抗体则结合于试管表面的包被物。反应完成后，清洗，将过剩的示踪物弃去，应用适当的光度计和发光检测试剂测量光信号，计算结合到管壁包被物上的剩余示踪物的量。光信号强度与PCT浓度成正比。应用已知的抗原浓度建立标准曲线，通过它就可求得血清或血浆中未知的PCT浓度。该方法特异性强，敏感性高，但需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，一般多在特定医疗机构使用。
胶乳颗粒增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA检测是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定，抗原抗体反应后可直接测定反应液的吸光度值，省去了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，可用于自动化仪器检测，几分钟就能获得结果，省时省力。目前市售各种胶乳免疫比浊检测产品灵敏度对于降钙素原比浊产品应用于临床是远远不够的，因此开发灵敏度更高、特异性更强、稳定性更好、抗干扰能力更强的PCT产品，仍是临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，准确度和精密度高、重复性好、操作简单、测定时间短、适用于各种类型的全自动生化分析仪，同时能有效解决实际应用中污染环境的问题。
解决的技术方案是，本发明一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1是由三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05g、叠氮钠(NaN3)0.5～1.5g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.15～8.35制成；所述的试剂2是由三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05g、牛血清白蛋白(BSA)1～10g、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)0.5～1.5g、聚乙二醇20000(PEG20000)0.5～1.5g、吐温-20(Tween-20)2～10ml、蔗糖35～65g、叠氮钠(NaN3)0.5～1.5g、干酪素0.5～2g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.15～8.35得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，比例为11毫克抗体/1L胶体金溶液，调整浓度至520nm吸光度(OD)为0.2～0.3，即得试剂2。
本发明组份科学，新颖独特，易生产，成本低，性能稳定，保质期长，测试准确，无环境污染，经济和社会效益显著，是降钙素原检测试剂上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明具体实施方式作进一步详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例实现。
实施例1
本发明一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1是由三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05g、叠氮钠(NaN3)0.5g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.15制成；所述的试剂2是由三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05g、牛血清白蛋白(BSA)1g、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)0.5g、聚乙二醇20000(PEG20000)0.5g、吐温-20(Tween-20)2ml、蔗糖35g、叠氮钠(NaN3)0.5g、干酪素0.5g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.15得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，比例为11毫克抗体/1L胶体金溶液，调整浓度至520nm吸光度(OD)为0.2，即得试剂2。
实施例2
本发明一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1是由三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05g、叠氮钠(NaN3)1.0g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.25制成；所述的试剂2是由三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05g、牛血清白蛋白(BSA)5g、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)1.0g、聚乙二醇20000(PEG20000)1.0g、吐温-20(Tween-20)5ml、蔗糖50g、叠氮钠(NaN3)1.0g、干酪素1.25g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.25得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，比例为11毫克抗体/1L胶体金溶液，调整浓度至520nm吸光度(OD)为0.25，即得试剂2。
实施例3
本发明一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1是由三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05g、叠氮钠(NaN3)1.5g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.35制成；所述的试剂2是由三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.05g、牛血清白蛋白(BSA)10g、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)1.5g、聚乙二醇20000(PEG20000)1.5g、吐温-20(Tween-20)10ml、蔗糖65g、叠氮钠(NaN3)1.5g、干酪素2g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.35得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，比例为11毫克抗体/1L胶体金溶液，调整浓度至520nm吸光度(OD)为0.3，即得试剂2。
本操作方法既可用于手工操作，亦可用于自动化仪器。基本参数如下：反应温度37℃；比色杯光径1.0cm；主波长546nm；样品和校准品量3μL；所述的样品为被测品，即血清、血浆或尿液，所述的标准品为具有溯源性的定值血清，以下同。试剂l为240μL，试剂2为60μL，第一试剂反应时间为300s，第二反应时间为300s。
样品和校准品加试剂l混匀，37℃下孵育300s，然后加入试剂2混匀，37℃孵育10s后读取第一点吸光度A1，300s后读取第二点吸光度A2，△A＝A2－A1。
式中：△AU-样品管吸光度变化；△AS-校准管吸光度变化；△AB-空白管吸光度变化；CS-校准品中PCT浓度
1)本发明选择三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，使整个配方处于一种极其稳定的状态，提高了试剂的稳定性。
2)本发明中选取PEG20000为促凝剂，以增加抗原抗体反应速度。
3)本发明中选取吐温-20(Tween-20)为表面活性剂，是抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒的增溶剂，是反应的促进剂、润滑剂，它提高检测的灵敏度，促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定的影响。
4)本发明中选取一种合成水溶性高分子化合物聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)作为保护剂，PVP可促进纳米金颗粒的分散，阻止纳米颗粒的团聚，起到很好的保护作用，有效的减缓试剂空白升高的弊病，从而保证了试剂的稳定性；
5)本发明中选取牛血清白蛋白(BSA)、干酪素作为稳定剂，牛血清白蛋白(BSA)、干酪素是惰性蛋白，它们即保护抗人降钙素原抗体的活性，也维持胶体金的胶体稳定。它们是封闭金颗粒未被占据的位点以减少非特异性反应的物质，也起着有分散胶体金颗粒的骨架作用，从而保证试剂的稳定性。
6)本发明中选取蔗糖为稳定剂，对抗人降钙素原抗体的活性具有保护性，对产品的储存稳定性具有帮助。
7)NaN3防腐剂，保证产品在有效期内不长菌。
用本发明的降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂基于下列原理测定血清降钙素原：处于液态反应环境的降钙素原抗体标记胶体金颗粒增大了与样本中PCT抗原的反应面积，使得血液样本中的降钙素原(PCT)能够与胶体金上标记的PCT抗体充分并快速的发生反应，并在促凝剂的作用下，使胶体金产生聚集，在546nm下检测产生吸光度的变化，而吸光度的变化幅度与血液样本中PCT的含量在一定范围内成正比，从而可以定量检测血液样本中的降钙素原(PCT)含量，本发明组份科学，新颖独特，易生产，成本低，性能稳定，保质期长，测试准确，无环境污染。
本发明试剂经多次反复实验均取得了一致的结果，相关实验资料如下：
本发明试剂进行了性能检测，并与市销降钙素原检测试剂盒(荧光免疫层析法)进行临床样品对比实验，相关实验资料如下：
实验质控品：霍尔姆斯(北京)诊断技术有限公司生产，靶值：3.0ng/L(批号20170714)；靶值：8.5ng/L(批号20170714)
仪器：HITICH7060全自动生化分析仪
实验1准确度实验
检测质控品3.0ng/L、8.5ng/L，重复检测3次，取测定结果均值(M)，按下列公式计算相对偏差(B)。
式中：M—测试结果均值；
T—有证参考物质标志值，或各浓度人源样品定值。
测定准确度结果如下表：
表1准确度实验
实验2精密度(变异系数CV)实验
取本发明三个批号的试剂，每个批号对质控品(批号20170714)PCT靶值3.0g/L进行10次重复测定，然后计算测定值的均数、测定值的标准差S与测定值的变异系数CV值，其公式如下：
式中：
—为测定值的平均数；
S—为测定值的标准差；
CV—为测定值的变异系数。
三个批号试剂分别测定结果如下表：
表2精密度(变异系数CV)实验结果
批号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X S CV(％)
20170923 3.2 3.1 2.9 2.8 2.9 3.0 3.1 3.1 3.2 2.9 3.02 0.140 4.64
20170930 3.0 2.9 2.8 3.1 3.1 3.2 2.9 3.0 3.1 3.2 3.03 0.134 4.42
20171007 2.9 3.1 3.1 3.2 3.0 3.2 2.9 2.8 2.9 3.0 3.01 0.137 4.55
实验3线性实验
选择经参比方法定值的患者血清，线性范围上限接近的作为高值浓度水平(H)，接近下限的作为低值浓度水平(L)，各1份，H和L按5H+0L、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、0H+5L的关系各自配制，形成系列检测标本，用实验方法对系列浓度标本进行检测，每个浓度水平测定4次，取平均值进行回归分析。结果见下表：
表3线性实验结果
PCT的回归方程及相关系数：
Y(测定值)＝0.993164X(理论值)+0.2905，相关系数为0.9992。
结果表明降钙素原在60ng/L范围内线性良好。
实验4临床对比实验
同时用本发明试剂与市销试剂盒检测72例临床标本，其正常值符合率为97.96％(48/49)，异常值符合率为96.15％(25/26)，总符合率为97.33％。
两种试剂检测75例临床标本CRP结果分析：
表4临床对比实验结果
综上所述，本发明降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂与现有技术的试剂相比，本发明的试剂既保留了现有试剂的优点：试剂稳定，保存期长，又使用效果好，检测准确性高达97％以上，成本降低50％以上，且对环境无污染，节能环保，经济和社会效益巨大，是测定降钙素原试剂上的创新。

Claims (4)

1.一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，其特征在于，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1是由三羟甲基氨基甲烷 6.05g、叠氮钠0.5～1.5g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.15～8.35制成；所述的试剂2是由三羟甲基氨基甲烷 6.05g、牛血清白蛋白1～10g、聚乙烯吡咯烷酮K30 0.5～1.5g、聚乙二醇20000 0.5～1.5g 、吐温-20 2～10ml、蔗糖 35～65g、叠氮钠 0.5～1.5 g、干酪素0.5～2g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.15～8.35得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，比例为11毫克抗体/1L胶体金溶液，调整浓度至 520nm 吸光度为0.2～0.3，得试剂2。
2.根据权利要求1所述的降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，其特征在于，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1是由三羟甲基氨基甲烷6.05g、叠氮钠0.5g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.15制成；所述的试剂2是由三羟甲基氨基甲烷6.05g、牛血清白蛋白 1g、聚乙烯吡咯烷酮K30 0.5g、聚乙二醇20000 0.5g 、吐温-20 2ml、蔗糖35g、叠氮钠 0.5g、干酪素0.5g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.15得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，比例为11毫克抗体/1L胶体金溶液，调整浓度至520nm 吸光度为0.2，得试剂2。
3.根据权利要求1所述的降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，其特征在于，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1是由三羟甲基氨基甲烷6.05g、叠氮钠1.0g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.25制成；所述的试剂2是由三羟甲基氨基甲烷 6.05g、牛血清白蛋白 5g、聚乙烯吡咯烷酮K30 1.0g、聚乙二醇20000 1.0g 、吐温-20 5ml、蔗糖50g、叠氮钠 1.0g、干酪素1.25g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.25得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，比例为11毫克抗体/1L胶体金溶液，调整浓度至 520nm 吸光度为0.25，得试剂2。
4.根据权利要求1所述的降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂，其特征在于，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1是由三羟甲基氨基甲烷 6.05g、叠氮钠 1.5g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.35制成；所述的试剂2是由三羟甲基氨基甲烷 6.05g、牛血清白蛋白10g、聚乙烯吡咯烷酮K30 1.5g、聚乙二醇20000 1.5g 、吐温-20 10ml、蔗糖 65g、叠氮钠1.5 g、干酪素2g，加水至1000ml混匀，用盐酸调pH值至8.35得缓冲液，再用缓冲液溶解标记有抗人降钙素原抗体的胶体金颗粒，比例为11毫克抗体/1L胶体金溶液，调整浓度至 520nm吸光度为0.3，得试剂2。
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