CN106198993A - 一种降钙素原蛋白的测定试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降钙素原蛋白的测定试剂及其制备方法,属于生化手段测试技术领域。包括R1试剂、R2试剂和降钙素原蛋白标准品,所述的R1试剂的主成分是磷酸盐缓冲液、聚乙二醇;所述的R2试剂的主成分是磷酸盐缓冲液、羊抗人PCT抗体的致敏乳胶颗粒;所述的降钙素原蛋白标准品的主成分是降钙素原蛋白、磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白和叠氮钠。将本申请应用于降钙素原蛋白的测定,具有快速灵敏、准确性好、稳定性好、操作简便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种降钙素原蛋白的测定试剂及其制备方法,属于生化手段测试技术领域。
背景技术
感染是造成人类死亡最重要的因素,据世界卫生组织(WHO)统计数据显示,感染约占全球每年总体死亡率的25.5%(约1,500万人)。其中呼吸道感染是导致患者死亡最主要的感染性疾病,每年约造成430万人死亡。
由于造成感染性疾病的临床症状和体征缺乏特异性,因此,临床上除了依靠血常规、胸部影像或者是微生物学检查来反映感染的真实情况,还借助于一些特殊的血清学检测项目指标来早期诊断感染,鉴别病原体类型,评估感染程度并有效指导抗菌药物的使用。降钙素原(PCT)是临床上采用较多的用于发现炎症,评估抗生素治疗效果和预后,评估SIRS的重症度(全身炎症反应综合征),脓毒血症以及脓毒血症性休克的预后情况的检测项目。
PCT是无激素活性的降钙素原前肽物质,由116个氨基酸组成,分子量为13KD的糖蛋白。PCT的半衰期为25-30小时,在体外稳定性很好。健康人血浆PCT含量极低(<0.1ng/ml),0.5ng/ml被认为是检测感染性疾病诊断的分界值。
PCT选择性地对系统性细菌感染、真菌感染及寄生虫感染有反应,而对无菌性炎症和病毒感染无反应或仅有轻度反应。许多学者研究发现,全身性细菌、真菌和寄生虫感染时,PCT水平异常增高,增高的程度与感染的严重程度及预后相关,在全身性细菌感染和脓毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值。PCT水平的监测,对于严重威胁生命的感染性疾病过程和跟踪治疗方案是很有用的,PCT浓度的升高标志着炎症反应正在进行中,使用足够的抗生素、炎症灶清除术治疗等,PCT值下降,证明治疗方案正确,预后良好,反之需改变治疗方案。
PCT为所有不知病因的炎症性疾病的鉴别诊断提供帮助与支持,如细菌性与毒素性的急性成人呼吸窘迫综合症(ARDS)的鉴别;胆源性与毒素性胰腺炎的鉴别;细菌性与病毒性脑膜炎的鉴别;微生物诱导的发热与非细菌性发热的鉴别,特别是发热待查(FOU)的诊断,病毒感染或自身免疫失调与免疫抑制条件下的急性细菌感染的鉴别,发热的病因的鉴别,如在肿瘤患者中被肿瘤溶解物或化疗诱导与细菌、真菌或其他感染病因区别。
PCT可早期诊断新生儿和婴儿全身性细菌感染与败血症引起的急性发热;术后常规,包括术后感染预警及用药监测,术后切除感染灶(如腹膜炎、软组织感染)后的治疗指导,监测腹膜炎、吻合口漏和无典型腹部症状的疾病过程;器官移植后的监测。移植前排除急性细菌或其他感染,鉴别急性器官排斥、急性病毒、细菌与真菌感染;长期在ICU的患者及长期机械通气患者的监测,监测疾病过程及指导治疗;监测高危患者,早期获得有关并发症和内环境衰退的信息。
许多临床研究证明,PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值,与目前多应用的诊断指标相比,PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息。随着临床实践性研究的不断深入,临床数据的不断积累,PCT作为一个全身性细菌感染和脓毒症辅助和鉴别诊断的常规指标将成为共识,已经得到广泛的应用。
目前国内检测降钙素原蛋白(PCT)的方法主要有胶体金法和酶联免疫法(ELISA)。胶体金法操作简便、快速、结果判断直观,但检测的灵敏度较低;ELISA法的检测灵敏度相对较高,但是操作步骤繁琐、费时,自动化程度低,不适用于大量检测。
基于此,做出本申请。
发明内容
为了克服现有降钙素原蛋白(PCT)在测试过程中存在的上述缺陷,本发明首先提供一种快速灵敏、准确性好、稳定性好、操作简便,适用于临床全自动或半自动生化分析的降钙素原蛋白(PCT)测定试剂。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:
一种降钙素原蛋白(PCT)的测定试剂,包括R1试剂、R2试剂和降钙素原蛋白标准品,所述的R1试剂的主成分是磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000(PEG);所述的R2试剂的主成分是磷酸盐缓冲液、羊抗人PCT抗体的致敏乳胶颗粒;所述的降钙素原蛋白标准品的主成分是降钙素原蛋白、磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白(BSA)和叠氮钠。
具有上述特征降钙素原蛋白(PCT)测定试剂的制备方法如下:
(1)R1试剂的配制:将磷酸盐缓冲液加入到容器中,搅拌均匀,加入聚乙二醇,继续搅拌至完全溶解;用磷酸盐缓冲液定容;
(2)R2试剂的配制:将磷酸盐缓冲液加入到容器中,搅拌均匀,加入羊抗人PCT抗体的致敏乳胶颗粒,继续搅拌至完全溶解,用磷酸盐缓冲液定容;
(3)降钙素原蛋白标准品的配制:将磷酸盐缓冲液加入到容器中,搅拌均匀后,加入降钙素原蛋白,搅拌至完全溶解;加入牛血清蛋白,继续搅拌至完全溶解;加入叠氮钠,搅拌至完全溶解;用磷酸盐缓冲液定容得到校准品。
进一步的,作为优选:
所述的聚乙二醇为聚乙二醇6000。
步骤(3)中,磷酸盐缓冲液定容得到标准品的具体工序为:先用磷酸盐缓冲液定容至100mL,获得校准品一;取上述标准液一50mL,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品二;取50mL校准品二,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品三;取50mL校准品三,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品四;取50mL校准品四,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品。
所述的搅拌速度均为300-500转/分。
本发明的工作原理如下:
样本中的降钙素原蛋白(PCT)在磷酸盐缓冲系统中与试剂中羊抗人PCT抗体的致敏乳胶颗粒发生抗原抗体反应,于促聚剂聚乙二醇作用下产生凝集以使浊度上升,570nm波长处检测反应液吸光度的变化,其变化程度与样本中的PCT含量成正比。
具体实施方式
本实施例一种降钙素原蛋白(PCT)的测定试剂,包括R1试剂、R2试剂和降钙素原蛋白标准品,所述的R1试剂的主成分是磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000(PEG);所述的R2试剂的主成分是磷酸盐缓冲液、羊抗人PCT抗体的致敏乳胶颗粒;所述的降钙素原蛋白标准品的主成分是降钙素原蛋白、磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白(BSA)和叠氮钠。
其中上述降钙素原蛋白(PCT)测定试剂的制备方法如下:
(1)R1试剂的配制:
①将2.0L磷酸盐缓冲液加入到适当容器中;
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分;
③将28.8g聚乙二醇6000(PEG)加入上述溶液中,搅拌十分钟,直至完全溶解;
④用磷酸盐缓冲液定容至2.4L。
(2)R2试剂的配制:
①将500mL磷酸盐缓冲液加入到适当容器中;
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分;
③将0.18g羊抗人PCT抗体的致敏乳胶颗粒加入上述溶液中,搅拌十分钟,直至完全溶解;
④用磷酸盐缓冲液定容至600mL。
(3)降钙素原蛋白标准品的配制:
①将80mL磷酸盐缓冲液加入到适当容器中;
②开启电动搅拌器,搅拌速度均为450转/分;
③将5.0mg降钙素原蛋白加入上述溶液中,搅拌十分钟,直至完全溶解;
④将4.5mg牛血清蛋白加入上述溶液中,搅拌十分钟,直至完全溶解;
⑤将42mg叠氮钠加入上述溶液中,搅拌十分钟,直至完全溶解;
⑥用磷酸盐缓冲液定容至100mL,获得校准品五;
⑦取上述溶液(校准品五)50mL,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品四;
⑧取50mL校准品四,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品三;
⑨取50mL校准品三,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品二;
⑩取50mL校准品二,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品一。
(4)试剂检验
①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生化分析仪。
测定参数严格按照产品说明书在仪器中设定,基本测定参数如下:
方法:终点法;反应方向:递增;波长:570nm;温度:37℃。
比色杯光径:1cm;R1试剂:200μl,R2试剂:50μl,样品:25μl。
第一测光点:在R2试剂加入后1分钟读取;第二测光点:在R2试剂加入后5分钟读取。
②试剂外观检查:目测检查。
③装量检查:用通用量具测量。
④试剂空白测定:
用蒸馏水或去离子水作为空白样品测试试剂盒,在测试主波长下,记录测试启动时吸光度(A1试剂)和约5分钟后的吸光度(A2试剂),A2即为工作试剂的空白吸光度。
⑤线性范围测定:
取接近线性范围上限的高值样本用生理盐水倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列。以H值与稀释比例计算出预期值。稀释方法参照表1所示(根据高值的大小可相应调整稀释梯度)。
表1样本稀释表
实施例 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
生理盐水(ml) | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
高值标本H(ml) | 1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
稀释比例 | 原倍 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 |
表中:实施例1样本的浓度为已知定值CH,实施例2-5样本浓度按公式:样本浓度=CH×稀释比例,计算作为预期值,将稀释好的样本系列充分混匀,在校正后的测定系统上按从低值到高值顺序平行测定2次,均值作为对应实施例样本实测值(如2次测定结果有明显偏差应剔除重测)。
统计学分析:以预期值为横坐标,样本实测值为纵坐标作图及直线回归分析,确定线性区间计算出直线方程y=a+bx及相关系数,当相关系数r≥0.990时为线性良好。
数据分析处理采用Microsoft Excel软件。
相关公式如下:
式中,C:浓度;V:容积;b:回归线的斜率;∣a∣:回归线截距的绝对值;r:相关系数;Xi:各管预期值;Yi:各管测定值;i:1、2、3.……、n;n:测定样本数。
⑥精密度测定:
a.重复性测定:
用临床标本或质控血清测试试剂盒,重复测试10次,计算测量值的平均值
和标准差(s)。按如下公式计算变异系数(CV)。
与变异系数CV(%)
式中:——待测血清样本的均值;
Xi——测定血清样本的测定结果;
n——测定次数
CV——变异系数
b.批间差测定
取三个批号送检试剂,每个批号取3瓶,分别测定1份临床样本或质控血清,可选用罗氏质控品,分别计算9份试剂测定均值和每个批号3份试剂的测定均值并用Microsoft Excel软件统计三个批号试剂测定的变异系数。
相关公式如下:
式中:
中的最大值;
中的最小值;
——总均值。
⑦准确性测定:
取校准品(有证参考物质,CRM)对试剂盒进行测试,重复检测3次,取测试结果均值(M),按公式(7)计算相对偏差(B)。
相对偏差(B)=(M-T)/T×100%………………………………………(7)
式中:T——有证参考物质(CRM)标示值;M——样品测定结果均值;
⑧分析灵敏度:
用已知浓度或活性的样品测试试剂盒,记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变,换算为n单位的吸光度差值(ΔA)。
(5)试剂测定结果如下:
线性范围:在线性范围(0.1-50ug/L)内,线性回归的相关系数r≥0.990。当浓度≤5Ug/L时,绝对偏差不超过±1.0ug/L;当浓度>5Ug/L时,相对偏差在±15%范围内。
准确度:相关系数r≥0.990。相对偏差≤15%。
测量精密度:变异系数CV≤10%,相对极差R≤10%。
空白吸光度:空白吸光度(A)≤1.0(在温度37℃;波长570nm;比色皿光径1.0cm)。
分析灵敏度:试剂测试2.0ug/L被测物时,吸光度差值(ΔA/min)≥0.02ABS。
校准品准确度:相关系数r≥0.990,相对偏差≤12%。
校准品瓶间差:瓶间CV≤10%。
Claims (6)
1.一种降钙素原蛋白的测定试剂,其特征在于:包括R1试剂、R2试剂和降钙素原蛋白标准品,所述的R1试剂的主成分是磷酸盐缓冲液、聚乙二醇;所述的R2试剂的主成分是磷酸盐缓冲液、羊抗人PCT抗体的致敏乳胶颗粒;所述的降钙素原蛋白标准品的主成分是降钙素原蛋白、磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白和叠氮钠。
2.如权利要求1所述的一种降钙素原蛋白的测定试剂,其特征在于:所述的聚乙二醇为聚乙二醇6000。
3.如权利要求1所述的一种降钙素原蛋白的测定试剂的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)R1试剂的配制:将磷酸盐缓冲液加入到容器中,搅拌均匀,加入聚乙二醇,继续搅拌至完全溶解;用磷酸盐缓冲液定容;
(2)R2试剂的配制:将磷酸盐缓冲液加入到容器中,搅拌均匀,加入羊抗人PCT抗体的致敏乳胶颗粒,继续搅拌至完全溶解,用磷酸盐缓冲液定容;
(3)降钙素原蛋白标准品的配制:将磷酸盐缓冲液加入到容器中,搅拌均匀后,加入降钙素原蛋白,搅拌至完全溶解;加入牛血清蛋白,继续搅拌至完全溶解;加入叠氮钠,搅拌至完全溶解;用磷酸盐缓冲液定容得到校准品。
4.如权利要求3所述的一种降钙素原蛋白的测定试剂的制备方法,其特征在于:所述的聚乙二醇为聚乙二醇6000。
5.如权利要求3所述的一种降钙素原蛋白的测定试剂的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,磷酸盐缓冲液定容得到标准品的具体工序为:先用磷酸盐缓冲液定容至 100mL,获得校准品一;取上述标准液一50mL,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品二;取50mL校准品二,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品三;取50mL校准品三,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品四;取50mL校准品四,加入50mL磷酸盐缓冲液继续搅拌十分钟,获得校准品。
6.如权利要求3所述的一种降钙素原蛋白的测定试剂的制备方法,其特征在于:所述的搅拌速度均为300-500转/分。
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