CN103975241A

CN103975241A - 用于提高a型链球菌免疫测定法的特异性的n-乙酰基-d-葡糖胺

Info

Publication number: CN103975241A
Application number: CN201280048811.8A
Authority: CN
Inventors: P.Y.任; J.麦克卢尔; K.S.理查森
Original assignee: Kui Deer Co
Current assignee: Kui Deer Co
Priority date: 2011-08-03
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-07-31
Also published as: US10168329B2; JP2014521971A; EP2739975B1; US20190094221A1; EP2739975A1; US20220107315A1; DK2739975T3; US20130196337A1; CN103975241B; JP6055828B2; WO2013019817A1

Abstract

本发明描述了用于检测生物样品中的A型链球菌的方法、组合物和试剂盒。更具体地说，本公开内容提供其中检测A型链球菌的特异性通过添加N-乙酰基-D-葡糖胺而提高的免疫测定法。这些方法、组合物和试剂盒可用于方便可靠地早期诊断人受试者的链球菌感染。

Description

用于提高 A 型链球菌免疫测定法的特异性的 N- 乙酰基 -D- 葡糖胺

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年8月3日提交的美国专利申请61/514,790的权益，其通过引用结合到本文中。

技术领域

本公开内容总的来说涉及诊断学的领域，具体地说涉及用于检测生物样品中的分析物的装置、方法和试剂盒。更具体地说，本公开内容提供其中通过添加N-乙酰基-D-葡糖胺提高检测A型链球菌的特异性的免疫测定法。

发明背景

酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) (A型链球菌)是一种以细胞链或细胞对存在的非运动性的、不产生孢子的革兰氏阳性细菌，其中各个细胞是圆形到卵形的球菌，直径为0.6-1.0微米。A型链球菌的细胞表面结构由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸的重复单位组成，是标准的肽聚糖。在历史上，链球菌的决定性标识在于最初由Rebecca Lancefield描述的“细胞壁”多糖抗原的血清学反应性。确定了18种类型特异性抗原(Lancefield类型)。A型荚膜多糖(亦称“C物质”或“碳水化合物抗原型”)是N-乙酰葡糖胺和鼠李糖的聚合物。一些类型的抗原为一种以上菌种共有。(K. Todar, Online Textbook of Bacteriology；参见textbookofbacteriology.net)。

酿脓链球菌是人类最常见的病原体之一。大约5-15%的正常个体通常在呼吸道中带有该细菌，但保持无症状。作为正常菌群，酿脓链球菌可以在以下情况下感染：当防御受损或当该生物能够渗透固有防御时。当细菌被引入或传播到易感组织时，便会发生各种类型的化脓性感染。

与酿脓链球菌有关的急性疾病主要发生在呼吸道、血流或皮肤中。链球菌性疾病最通常为呼吸道感染(咽炎或扁桃体炎)或皮肤感染(脓皮病)。急性酿脓链球菌感染可作为咽炎(脓毒性咽喉炎)、猩红热(皮疹)、脓疱病(皮肤浅层感染)或蜂窝织炎(皮肤深层感染)呈现。侵入性产毒感染可导致坏死性筋膜炎、关节或骨感染、肌炎、脑膜炎、心内膜炎和链球菌中毒性休克综合征。在由酿脓链球菌引起急性感染后，患者还可能发生免疫介导性链球菌后后遗症，例如急性风湿热和急性肾小球性肾炎，这发生在1-3%的未治疗感染中。这些病况及其病理学不归因于细菌的传播，而归于对A型链球菌抗原的免疫反应异常。

由于青霉素在A型链球菌性疾病的治疗中是有效的，因此大多数感染只意味着伴随有皮疹的咽炎。然而，由于快速进展性疾病的偶发病例和由于未治疗感染中严重后遗症的小风险，酿脓链球菌仍然是主要的健康顾虑，并且正在努力以阐明这些后遗症的风险和机制以及鉴定链球菌的致风湿病菌株和致肾炎菌株。

酿脓链球菌的细胞表面构成许多细菌毒力的决定因素，尤其涉及定居和逃避吞噬作用和宿主免疫应答的那些。细菌的表面极为复杂并且在化学上是多种多样的。抗原组分包括荚膜多糖(C物质)、细胞壁肽聚糖和脂膜酸(LTA)和各种表面蛋白，包括M蛋白、菌毛蛋白、纤连蛋白结合蛋白(例如蛋白质F)和结合细胞的链激酶。

酿脓链球菌的细胞质膜含有一些抗原，其类似于人心脏、骨骼和平滑肌、心脏瓣膜成纤维细胞和神经元组织的抗原。已提出病原体和宿主间的分子模拟为发生自身免疫病的机制。由于微生物含有与宿主蛋白质类似的蛋白质，因此宿主免疫应答可被抑制或能耐受感染。相反地，宿主B细胞和T细胞被分子模拟的刺激可引起宿主免疫系统开始对自身蛋白产生应答，就好像他们是外来的。

正如在其它自身免疫病中一样，环境和遗传因子两者参与风湿性心脏炎和炎性心脏病的发生，且A型链球菌和心脏组织间的分子模拟似乎起作用。针对A型链球菌抗原的B细胞和T细胞反应的研究已得到一些有关在A型链球菌感染后风湿性心脏炎发病机制的几个步骤的信息。早期步骤包括针对A型链球菌碳水化合物抗原N-乙酰葡糖胺和心脏肌球蛋白的交叉反应性自身抗体的发生。这些抗体然后与心瓣内皮反应，心瓣内皮变得发炎，具有血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1)表达。T细胞CD4+和CD8+，然后通过内皮/心内膜浸润进入瓣(一种血管结构)。可在心内膜下形成含有巨噬细胞和T细胞的Aschoff小体或肉芽肿病变。T细胞对链球菌M蛋白抗原序列起反应。瓣出现瘢痕，在瓣中最终具有新血管形成和进行性慢性疾病。在宿主中，模拟抗原心脏肌球蛋白和层粘连蛋白已分别包括在心肌和瓣中。(Cunningham, Front. Biosci., 2003, 8:s533-43)。

风湿热(RF)和抗磷脂综合征(APS)是共有类似的心脏和神经病理的自身免疫病。在RF和APS中，表现出相当多的体液免疫重叠，这支持在两种疾病中共同致病机制是心瓣病变和中枢神经系统异常发生原因的假设。发现参与这些自身免疫病况的致病分子M蛋白、N-乙酰基-β-D-葡糖胺(亦称“NAG”或“GlcNAc”)和β2糖蛋白-I (β2GPI)共有一些表位。来自APS患者的免疫球蛋白G血清含有相当多的抗链球菌M蛋白以及抗GlcNAc活性。此外，β2GPI抑制患有舞蹈症的APS患者的抗GlcNAc活性。(Blank等，2006，Rheumatology (Oxford). 45(7):833-41)。

生物样品中微生物病原体的检测在临床医学中具有特殊价值，因为治疗可根据致病生物而显著变化。因此，准确快速地鉴定疑似患有感染性疾病的患者的生物样品中的病原体可对于为患者提供迅速适当的治疗至关重要。快速鉴定生物样品中的致病生物甚至对非威胁生命的感染也很重要。

已研发出诊断微生物感染的快速方法以及时提供用于指导临床治疗的结果。这些快速方法最有效的一些建立在免疫学基础上。已研发出针对微生物特异性抗原的单克隆和多克隆抗体，并用于免疫测定法中以鉴定生物样品中的特定微生物。例如，用于鉴定人样品中的A型链球菌抗原的免疫测定法可用于酿脓链球菌感染的早期检测，使得可以开始合适的抗生素治疗。

可通过对A型链球菌有特异性的抗原的多克隆抗体来鉴定咽渗出物中的A型链球菌。一个这类试验描述于美国专利号5,770,460，提供了针对A型链球菌特异性抗原的一步横向流动测定法。然而，依赖于咽拭子的试验常常由于高的假阳性率而被复杂化。虽然使用咽拭子试验的说明书明确指示用户避免舌、颊和/或牙与拭子接触，但是因疏忽造成的接触时常发生。来源于舌、颊和/或牙的上皮细胞可含有酿脓链球菌细胞壁的一种或多种组分的分子模拟物，且对A型链球菌有特异性的多克隆抗体可结合和“识别”未被A型链球菌感染或未携带A型链球菌的试验对象的上皮细胞上的表位，导致假阳性结果。需要假阳性率降低的高特异性和容易的免疫测定法以提供A型链球菌感染的准确检测。颇出人意料地，本公开内容满足了这些和其它相关需要。

发明概述

本公开内容提供用于检测生物样品中的A型链球菌(本文亦称为“Strep A”)的装置、方法和改进的诊断试剂盒。更具体地说，本公开内容提供改进的免疫测定法，其中通过将N-乙酰基-D-葡糖胺加入测定法中以降低的假阳性率结果来检测A型链球菌感染。

一方面，提供用于检测样品中A型链球菌存在的装置。该装置包括基质，所述基质具有：(i)样品接受区，其用于接受含有或疑似含有A型链球菌特异性抗原的样品，(ii)标记区，其含有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的抗体，和(iii)俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上，且其中样品接受区和标记区的至少一个包含N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)。

在一个实施方案中，抗体为多克隆抗体。

在另一个实施方案中，抗体是荧光标记的。

在另外又一个实施方案中，用于特异性结合标记的抗原的工具是俘获抗体。在一个实施方案中，俘获抗体是多克隆抗体。

另一方面，提供试剂盒。试剂盒包括包含基质的装置，所述基质具有：(i)样品接受区，其用于接受含有或疑似含有A型链球菌特异性抗原的样品，(ii)标记区，其含有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的抗体，和(iii)俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上；和装有提取试剂的容器。提取试剂、样品接受区和标记区的至少一个包含N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)。

在一个实施方案中，NAG沉积在样品接受区上。

另一方面，提供用于检测生物样品中A型链球菌存在与否的方法。所述方法包括提供本文所述装置或试剂盒，将生物样品放入装置中；并通过例如目视读出(用肉眼、用仪器或用眼辅以仪器)装置的试验线上(test line)的结果，确定A型链球菌存在与否。

在一个实施方案中，所述方法还包括提供用于收集生物样品的器具；并收集器具上的生物样品。

在另外又一个实施方案中，所述方法还包括提供使用说明书，其中说明书不提醒在收集样品时舌、口腔两侧或顶部不与器具接触。

另一方面，提供试剂盒。试剂盒包括本文所述实施方案中任一个的装置、装有提取试剂的容器、用于收集生物样品的器具和使用说明书。

在一个实施方案中，所述器具为拭子。

在另一个实施方案中，说明书不提醒在收集样品时舌、口腔两侧或顶部不与器具接触。

在又一个方面，提供降低检测样品中A型链球菌的横向流动测定法的假阳性率的方法，其中，在横向流动测定法中，用于该测定法的多克隆抗体标记的N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)结合组分被优先结合。该方法包括将吸水基质用有效作为阻滞剂的一定量的N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)处理，以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合，并降低该测定法的假阳性率。

在一个实施方案中，提供用于检测样品中A型链球菌存在的装置。该装置包括接受室，其用于接受疑似包含A型链球菌特异性抗原的样品，该室尺寸为足以接受与样品混合以形成处理样品的液体提取试剂和N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)；和基质，所述基质具有样品接受区，其接受处理样品；标记区，其具有用于当抗原从其中通过时将其特异性标记的多克隆抗体和俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上。

在另一个实施方案中，提供用于检测样品中A型链球菌存在的方法。所述方法包括提供基质，所述基质具有：(i)样品接受区，其用于接受含有或疑似含有A型链球菌特异性抗原的样品，(ii)标记区，其含有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的抗体，和(iii)俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上；使样品接受区与样品接触，其中在接触前将所述样品用包含N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)的液体试剂处理；并检测俘获区中抗原是否存在。

在另一个实施方案中，提供用于检测样品中A型链球菌存在的装置。该装置包括接受室，其用于接受疑似包含A型链球菌特异性抗原的样品，该室的尺寸足以接受与样品接触以提供处理样品的液体提取试剂；和基质，所述基质具有样品接受区，其接受处理样品；标记区，其含有N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)和用于当抗原从中通过时特异性地标记该抗原的多克隆抗体；俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上。

在另外又一个实施方案中，提供用于检测样品中A型链球菌存在的装置。该装置包括接受室，其用于接受疑似包含A型链球菌特异性抗原的样品，该室的尺寸足以接受与样品接触以提供处理样品的液体提取试剂；和基质，所述基质具有样品接受区，其接受处理样品；标记区，其含有用于当抗原通过其中时特异性地标记该抗原的多克隆抗体；和俘获区，其含有N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)；和用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上。

在另外又一个实施方案中，提供降低检测样品中A型链球菌的横向流动测定法的假阳性率的方法，其中在横向流动测定法中，用于该测定法的多克隆抗体标记的N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)结合组分被优先结合。所述方法包括将有效作为阻滞剂的一定量的N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)加入提取试剂中，或加入免疫测定试验条(test strip)的局部区域，以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低该测定法的假阳性率。

在另一个实施方案中，提供用于检测A型链球菌的免疫测定装置的改进，该装置具有箱(housing)，其具有从中通过以将液体样品引入箱中的至少一个开口；提取试剂；在所述箱中与所述液体样品接触的多孔材料的样品接受区；和标记区中的多克隆抗体标记剂。所述改进包括以有效作为阻滞剂的量将N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)加到样品接受区中以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低该测定法的假阳性率。

在另外又一个实施方案中，提供用于检测A型链球菌的免疫测定装置的改进，该装置具有箱，其具有从中通过以将液体样品引入箱中的至少一个开口；提取试剂；在所述箱中与所述液体样品接触的多孔材料的样品接受区；和标记区中的多克隆抗体标记剂。所述改进包括以有效作为阻滞剂的量将N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)加到标记区中以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低该测定法的假阳性率。

在另外又一个实施方案中，提供用于检测A型链球菌的免疫测定装置的改进，该装置具有箱，其具有从中通过以将液体样品引入箱中的至少一个开口；提取试剂；在所述箱中与所述液体样品接触的多孔材料的样品接受区；和标记区中的多克隆抗体标记剂。所述改进包括以有效作为阻滞剂的量将N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)加到提取试剂中以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低该测定法的假阳性率。

下文描述和说明的下列方面和其实施方案意在示例性和说明性的，并不限制范围。

附图简述

图1是柱状图，显示取自健康个体(C-001至C-030)的喉拭子、阴性和阳性对照样品中的A型链球菌抗原的绝对计数，各采用A型链球菌横向流动诊断免疫测定法测试；

图2是柱状图，显示自人的唾液(整体和离心后的级分)、颊、舌、鼻、耳和皮肤及自实验工作台上表面收集的样品在A型链球菌免疫测定装置试验线上的信号绝对值；

图3是柱状图，显示来自健康个体(C-001至C-0030)的唾液样品在A型链球菌免疫测定装置试验线上的信号绝对值，其中在制备用于在免疫测定法中沉积的样品时，将已知量的抗A型链球菌抗体加到提取试剂中；

图4是柱状图，显示检测舌拭子样品A型链球菌的免疫测定装置试验线上观察到的相对信号，所述舌拭子样品通过在提取试剂中包括规定化合物来制备以用于在装置上测试；

图5说明示例性的免疫测定装置；

图6是对于舌拭子样品(菱形)和2 x 10³个生物/试验的A型链球菌质量控制标准(正方形)而言，在A型链球菌免疫测定装置试验线上的相对信号随存在于提取试剂中的NAG浓度而变化的曲线图；

图7是柱状图，显示图1提供的数据和在将0.5 mg/mL NAG加到提取试剂中的免疫测定A型链球菌检测条上再次测试的样品提供的数据(对各指定患者而言在各个数据集中的右手条形柱)；

图8是柱状图，显示通过以下方法在装置样品垫中包含NAG的A型链球菌免疫测定装置试验线上的绝对信号：将浓度为0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1 mg/mL的NAG溶液沉积到样品垫上，使之干燥，并在加入盐水(阴性对照，在各数据集中的左边条形柱)、2 x 10³个生物/试验的质量控制标准(在各数据集中的中间条形柱)和舌拭子(在各数据集中的右边条形柱)时测试信号；和

图9是显示按照本发明添加NAG而改进的A型链球菌免疫测定法的灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值的计算的表格。

在接下来的详述中进一步描述这些和其它实施方案。

发明详述

I. 定义

在描述本发明的方法和组合物前，要了解本公开内容不限于所描述的具体实施方案，因此当然可以改变。下面详细地描述本公开内容的若干实施方案。这些实施方案可呈现许多不同的形式，并且不应解释为限于本文明确给出的那些实施方案。相反，提供这些实施方案，使得本公开内容更全面透彻，并向本领域技术人员充分传达本公开内容的范围。还要了解，本文所用术语只为了描述具体实施方案的目的，并无意限制，因为本发明的范围只受随附权利要求书的限制。

本文提及的所有专利、申请、已公布的申请和其它出版物均通过引用以其整体结合到本文中。

本文所用的下列术语意具有下列含义：

本文所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象，除非文中另有明确规定。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种这样的蛋白质，提及“制剂”包括提及一种或多种制剂和本领域技术人员已知的其等同物等。

在提供值的范围时，要了解除非文中另有清楚说明，否则所述范围上限和下限之间，至下限单位的十分之一的每个中间值亦被明确公开。本公开内容包括规定范围中的任何规定值或中间值与该规定范围中的任何其它规定值或中间值之间的各个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或不包括在该范围中，而且其中极限值的任一个包括在较小范围内、权限值的任一个不包括在较小范围内或两个极限值都包括在较小范围内的各范围也包括在本公开内容中，受制于该规定范围的任何明确排除的极限值。在规定范围包括极限值的一个或两个时，排除那些已包括的极限值的任一个或两个的范围也属于本公开内容的范围。

“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”可互换使用以表示至少两个氨基酸通过酰胺键共价连接的聚合物，而不论长度或翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、脂化、十四烷基化(myristilation)、泛素化等)如何。D-氨基酸和L-氨基酸以及D-氨基酸和L-氨基酸的混合物包括在该定义中。

N-乙酰葡糖胺(亦称“N-乙酰基-D-葡糖胺”、“NAG”或“GlcNAc”)是分子式为C₈H₁₅NO₆、摩尔质量为221.21 g/mol的葡萄糖的单糖衍生物。它是细菌细胞壁中生物聚合物的部分，具体地说，酿脓链球菌(A型链球菌)的细胞表面结构包含在N-乙酰胞壁酸(MurNAc)的乳酸残基上与寡肽交联的NAG和MurNAc的交替单位。这种成层结构称为肽聚糖。NAG是聚合物壳多糖的单体单位，壳多糖形成昆虫和甲壳动物的外骨骼。与葡糖醛酸聚合的NAG形成乙酰透明质酸，乙酰透明质酸为高等生物的结缔、上皮和神经组织的组分。

术语“序列同一性”意指应用序列比对程序比对的两个或更多个比对序列中核苷酸或氨基酸序列同一性。

可用来确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于BLAST程序的套件，例如BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，可公开获自互联网(ncbi.nlm.gov/BLAST/)。另参见Altschul，S.F.等，1990和Altschul，S.F.等，1997。

“序列同一性百分比”和“百分比同源性”在本文可互换使用，是指多核苷酸间和多肽间的比较，通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列来确定，其中与用于两个序列的最佳比对的参比序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即空位)。可如下计算百分比：确定出现在两个序列中的相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗的位置总数，将结果乘以100得到序列同一性百分比。或者，可如下计算百分比：确定出现在两个序列中的相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数或者将核苷酸碱基或氨基酸残基与空位比对得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗的位置总数，并将结果乘以100得到序列同一性百分比。本领域技术人员了解，有许多可用来比对两个序列的已确立的算法。比较序列的最佳比对可如下进行：例如通过Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源性比对算法；Pearson和Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)的相似性检索方法；这些算法的计算机化执行(GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过目视检查(一般参见Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel等编辑, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.和John Wiley & Sons, Inc.的合资企业, (1995增刊) (Ausubel))。适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410和Altschul等(1977) Nucleic Acids Res. 3389-3402。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)以默认值使用，字长(W)为11，预期值(E)为10，M=5，N=-4和两个链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序以默认值使用，字长(W)为3，预期值(E)为10，和BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))。

虽然所有上述算法和程序适于确定序列比对和%序列同一性，但是对于本文的公开内容的目的，%序列同一性的确定通常应用使用所提供的默认参数的GCG Wisconsin软件包的BESTFIT或GAP程序(Accelrys，Madison WI)进行。

短语“%序列同一性”是指当应用序列比对程序比对时，两个或更多个比对序列之间的核苷酸或氨基酸序列同一性的水平。例如，70%同源性意指与通过规定算法确定的70%序列同一性相同的意思，因此给定序列的同源物在给定序列的长度内具有大于70%序列同一性。序列同一性的示例性水平包括但不限于与给定序列(例如本文所述的核苷酸或蛋白质的氨基酸序列)有70%、75%、80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。

“关联的(Associated)”是指与疾病、病况或表型的发生或表现一致。关联(Association)可能由于但不限于其改变可为各种疾病和病况提供基础的负责持家功能的基因；是参与具体疾病、病况或表型的途径的部分的基因和对疾病、病况或表型的表现间接产生影响的基因。

鉴于本公开内容，生物流体可为固体或半固体样品，包括粪便、活检样本、皮肤、甲和毛发，或者液体样品，例如尿液、唾液、痰、粘液、血液、血液组分(例如血浆或血清)、羊水、精液、阴道分泌物、眼泪、脊髓液、洗出液和其它体液。来自例如宫颈、尿道、鼻孔和咽喉的拭子样本包括在样品中。这类样品的任一种可来自活的、死的或濒死的动物或植物。动物包括哺乳动物，例如人。

“抗体”是指基本上由一种或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，其进而分别确定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体是这样的免疫球蛋白，其在其表面上或在腔隙中具有与另一个分子的特定空间和极性结构特异性结合并因此定义为与其互补的区域。抗体可以是多克隆或单克隆的。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段。其片段可包括Fab、Fv和F(ab')2、Fab'等。抗体还可包括通过重组方法制备的嵌合抗体或其片段。

“抗体”包括完整抗体，包括IgG、IgM和IgA同种型的完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合部分的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文简称为VH)和重链恒定区组成。IgG重链恒定区由4个结构域CH1、铰链、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文简称为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分成超变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布有更为保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由3个CDR和4个FR组成，按下列顺序自氨基端向羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。

本文使用的“分离抗体”意指基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如与目标蛋白质特异性结合的分离抗体基本不含与非目标蛋白质的抗原特异性结合的抗体)。然而，与目标蛋白质的表位、同种型或变体特异性结合的分离抗体可与例如来自其它特种的其它相关抗原(例如物种同源物)具有交叉反应性。此外，分离抗体可基本不含其它细胞物质和/或化学物质。在一些实施方案中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合以极确定的组成组合在一起。

“特异性结合''是指与预定的抗原结合的抗体。通常，抗体以10^– ⁷ M或更低的解离常数(KD)结合，并且以其与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)而非预定的抗原或密切相关的抗原结合的KD的至多1/2的KD与预定的抗原结合。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原有特异性的抗体”在本文与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。

本文所用“免疫结合”一般是指发生在抗体或其片段与抗体对其有特异性的1型干扰素或受体之间的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可根据相互作用的解离常数(Kd)来表示，其中Kd越小表示亲和力越大。可采用本领域众所周知的方法，量化选定抗体的免疫结合性质。一种这样的方法需要测量抗原结合部位/抗原复合体形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合体配偶体的浓度、相互作用的亲和力和同样影响两个方向的速率的几何参数。因此，可通过计算浓度和缔合与解离的实际速率，来计算“结合速率常数” (Kon)和“分离速率常数” (Koff)两者。Koff/Kon的比率使得能够消除与亲和力无关的所有参数，因此等于解离常数Kd。一般参见Davies 等, Annual Rev. Biochem. 59:439-473 (1990)。

对IgG抗体的“高亲和力”是指KD为10^-8 M或更低、更优选10^-9 M或更低和甚至更优选10^-10 M或更低的抗体。然而，对于其它抗体同种型，“高亲和力”结合可变化。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合是指KD为10^-7 M或更低、更优选10^-8 M或更低的抗体。

可采用提供通过培养中的连续细胞系产生抗体分子任何技术，制备抗化合物的单克隆抗体。这些包括但不限于最初描述于Kohler和Milstein，1975，Nature 256:495-497和/或Kaprowski，美国专利号4,376,110的杂交瘤技术；Kosbor等，1983，Immunology Today 4:72和/或Cote等，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030描述的人B细胞杂交瘤技术；以及Cole等, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症疗法), Alan R. Liss, Inc., 第77-96页描述的EBV-杂交瘤技术。另外，可采用通过将来自合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自合适生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起针对“嵌合抗体”的产生而研发的技术(Morrison等，1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312:604-608；Takeda等，1985，Nature 314:452-454；Boss，美国专利号4,816,397；Cabilly，美国专利号4,816,567)。或者可以制备“人源化”抗体(参见例如Queen，美国专利号5,585,089)。或者，对用于单链抗体产生所描述的技术(参见例如美国专利号4,946,778)进行改动以产生化合物特异性的单链抗体。

含有特异性结合部位缺失的抗体片段可通过已知技术产生。例如，所述片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')2片段和可通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生的Fab片段。或者，可构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science 246:1275-1281)以供快速容易地鉴定对目标肽有所需特异性的单克隆Fab片段。

可将对所需肽有特异性的抗体或抗体片段与例如琼脂糖连接，并且将抗体-琼脂糖复合体用于免疫色谱法以纯化肽。参见Scopes, 1984, Protein Purification: Principles and Practice (蛋白质纯化：原理和实践), Springer-Verlag New York, Inc., N.Y., Livingstone, 1974, Methods In Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731。

“检测(detect或detection)”具有其标准含义，意包括检测、测量和/或表征选定的蛋白质或蛋白质活性。例如在检测、筛选或表征蛋白质的抑制剂、激活剂和调节剂的过程中“检测”酶活性。

术语“参比水平”是指阳性或阴性对照的检测水平。例如，阳性对照的参比水平可以是已知量的A型链球菌特异性抗原，其获自已知A型链球菌细菌的样品或培养物、已知感染A型链球菌的受试者，或者可指自已知来源的A型链球菌特异性抗原推算的数值。

“标记”是指当与本文所述部分(例如肽、蛋白质或抗体)连接时，赋予该部分采用已知检测方法(例如光谱法、光化学法、电化学发光法和电泳法)可检测的任何部分。适用于本公开内容的各种标记包括通过化学或物理手段产生信号的标记，其中信号通过目视或仪器方法可检出。示例性的标记包括但不限于荧光团和放射性同位素。这类标记允许通过合适的检测器(例如荧光计)直接检测标记的化合物。这类标记可包括酶和底物、色原、催化剂、荧光化合物、磷光化合物、化学发光化合物和放射性标记。通常使用目视可检出的标记，因此供仪器(例如分光光度计)读出样品中分析物的量。标记包括酶例如辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶(α和/或β)和碱性磷酸酶。合适的底物包括3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和1,2-二氧杂环丁烷。检测方法将取决于所用标记，并且对本领域技术人员而言将是显而易见的。合适的直接标记的实例包括放射性标记、荧光团、发色团、螯合剂、微粒、化学发光剂等。

对于这类实施方案，标记可以是直接标记，即自身是可检测的或产生可检测信号的标记，或者可以是间接标记，即在另一种化合物存在下是可检测的或产生可检测信号的标记。“标记的第二抗体”是指与可检测标记连接的抗体。标记允许抗体产生与流体样品中分析物的存在有关的可检测信号。

放射性标记：合适的放射性标记包括例如但不限于³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵⁷Co、¹³¹I和¹⁸⁶Re。

“发色团”是指具有吸收特性的部分，即能够在被多种光子源的任一种照射时激发。发色团可以是发荧光或非发荧光的，尤其包括染料、荧光团、发光分子、化学发光分子和电化学发光分子。

合适的间接标记的实例包括能够与底物反应或相互作用以产生可检测信号的酶(例如用于ELISA和EMIT免疫测定法的酶)、能够结合标记的部分的配体等。用作间接标记的合适酶包括例如但不限于碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和脲酶。这些酶在ELISA和EMIT免疫测定法中的用途详细描述于Engvall, 1980, Methods Enzym. 70: 419-439和美国专利4,857,453。

“基质”、“支持体”、“固体支持体”、“固体载体(solid varrier)”或“树脂”是可互换的术语，是指任何固相材料。基质还包括例如“固相”、“表面”和/或“膜”等术语。固体支持体可由有机聚合物组成，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚乙烯氧(polyethyleneoxy)和聚丙烯酰胺及其共聚物和接枝物。固体支持体还可以是无机的，例如玻璃、二氧化硅、可控孔度玻璃(CPG)、反相二氧化硅或金属，例如金或铂。“固体支持体”包括膜(例如硝化纤维)、微量滴定板(例如PVC、聚丙烯、聚苯乙烯)、试纸、试管和玻璃或塑料珠粒。基质的构造可为珠粒、球、微粒、颗粒、凝胶、膜或表面的形式。表面可以是平面的、基本平面的或非平面的。固体支持体可以是多孔的或无孔的，并且可具有溶胀或非溶胀特性。固体支持体可配置成孔、凹陷或其它容器、器皿、部件或定位的形式。多种支持体可配置在各种位置的阵列上，可寻址用于自动递送试剂，或者通过检测方法和/或仪器寻址。用于使生物分子固定化的方法是本领域众所周知的，且抗体可共价或非共价连接。在一个实施方案中，固体支持体是生物素化抗体与之非共价连接的链霉抗生物素包被板。

在统计学和诊断测试中，灵敏度和特异性是二元分类检验的性能的统计度量。灵敏度(亦称“召回率(recall rate)”)衡量本身被正确鉴定的实际阳性的比例(例如被正确鉴定为患有病况的病人的百分比)。特异性衡量被正确鉴定为阴性的比例(例如被正确鉴定为未患有病况的健康人的百分比)。这两种度量与I型和II型误差的概念密切相关。理论上的最优预测旨在达到100%灵敏度(即预测来自患病组的所有人为病人)和100%特异性(即不预测来自健康组的任何人为病人)，然而理论上，任何预测因子都将具有称为贝叶斯出错率(Bayes error rate)的最小误差界。

“特异性”涉及诊断试验鉴定阴性结果的能力。

如果试验具有高特异性，则试验的阳性结果意味着存在正进行试验的疾病的高概率。

“灵敏度”涉及诊断试验鉴定阳性结果的能力。

如果试验具有高灵敏度，则阴性结果将表明疾病不存在。例如，100%的灵敏度意味着试验识别全部实际阳性 – 即所有病人被识别为患病。因此，与高特异性试验相反，高灵敏度试验的阴性结果用来排除疾病。

对于任何试验，在两个度量之间通常有某种权衡。例如：在机场安全背景中，其中一项是测试对安全的潜在威胁，可将扫描仪设置为在低风险项(像带扣和钥匙)时引发(低特异性)，以降低遗漏确实对飞机和机上的人带来威胁的物体的风险(高灵敏度)。这种权衡可通过使用接受者操作特征(ROC)曲线以图表表示。

在一些实施方案中，ROC用来产生汇总统计量。一些常见的形式为：ROC曲线与同非判别线呈90度的线的截矩(亦称Youden J统计量)；ROC曲线和非判别线之间的面积；ROC曲线下面积或“AUC” (“曲线下面积”)或A' (显著的“a-prime”)；d' (显著的“d-prime”)，在仅噪声条件下系统中活性分布与在仅信号条件下活性分布的均值之间的距离，除以其标准差，假定这两种分布是正态的，具有相同的标准差。在这些假设下，可证实ROC的形状只取决于d'。

试验的“阳性预测值(PPV)”或“准确率”是用来描述具有被正确诊断为阳性试验结果的受试者的比例的汇总统计量。它是诊断方法的性能的度量，因为它反映了阳性试验反映正测试的基础病况的概率。然而其值的确取决于对于特定目标人群可能是未知的目标结果的发生率。PPV可应用贝叶斯定理推导。

PPV定义为：

其中“真阳性”是试验作出阳性预测，且受试者在金标准下具有阳性结果的事件，而“假阳性”是试验作出阳性预测，且受试者在金标准下具有阳性结果的事件。

“阴性预测值(NPV)”定义为被正确诊断的具有阴性试验结果的受试者的比例。高的NPV意味着当试验得出阴性结果时，结果应是阳性是不常见的。在医学测试的类似情况下，高的NPV意味着试验只极少将病人错误归类为健康者。注意，这并不表明试验将健康人错误归类为患病的倾向。

NPV按下确定：

其中“真阴性”是试验作出阴性预测，且受试者在金标准下具有阴性结果的事件，而“假阴性”是试验作出阴性预测，且受试者在金标准下具有阳性结果的事件。

如果已知发生率、灵敏度和特异性，则可如下计算任何发生率的阳性和阴性预测值(PPV和NPV)：

如果疾病的发生率非常低，则即使灵敏度和特异性两者高，阳性预测值也不会接近1。因此在筛选普通人群时，不可避免地，许多具有阳性试验结果的人将是假阳性。

异常越罕见，越能确定阴性试验表明无异常，且越不确定阳性结果实际上表明异常。发生率可解释为在进行试验前受试者患有疾病的概率，称为疾病的前概率。阳性和阴性预测值是在试验中为阳性和阴性的那些受试者的相同概率的修订估值，称为后概率。前概率和后概率之间的差异是评价试验有用性的一种手段。

对于任何试验结果，我们可将获得患者是否真正患有目标病况的结果的概率与他或她是否健康的相应概率进行比较。这些概率的比率称为似然比，以灵敏度/(1-特异性)计算。(Altman DG，Bland JM (1994). “Diagnostic tests 2: Predictive values (诊断试验2：预测值)”，BMJ 309 (6947):102)。

“排除标准(Rule-out criteria)”、“排除”或“RO”是用于疾病或病况的医学差异诊断的术语，其中在剔除或纳入的临床决定制定过程中对某些标准进行评价。当在考虑标准确定受试者不满足全部或大多数患有疾病的标准时，受试者被“排除”。

II. 包含 NAG 的装置和试剂盒及使用方法

在支持本发明所进行的研究中，从三十(30)名健康志愿者中收集喉拭子。使用用于检测A型链球菌的免疫测定试验条，筛选各样品A型链球菌抗原的存在与否。出乎意料的是，这些拭子的大部分给出阳性结果，如图1提供的每个人的数据所见，通过标志C-001-C030表示。阴性对照样品用左边的3个条形柱表示，注明“Noswab-Neg”、“eswab-Neg”和“eswab-Neb1.5”。阳性对照样品在最右边，标明“阳性(2x10^-3)。至少患者C-001、C-002、C-007、C010、C-013、C-017、C-018、C-020、C-023、C-024和C-030是A型链球菌阳性。怀疑这些的大部分是假阳性，因为样品来自健康个体。进行了进一步的研究以了解所观察到的大量假阳性。

几种商用A型链球菌横向流动试验(例如QUICK-VUE^® Strep A (Quidel Corporation))的包装说明书提醒临床人员或在拭子上收集样品的人避免拭子碰到舌、扁桃体、颊或牙。在上述研究中获得的和测试的样品中遵照这种提醒，因此不清楚为什么观察到大的假阳性率。怀疑来自受试者口腔的舌、颊和牙的人类生物材料可能引起使用A型链球菌免疫测定法的假阳性。

进行了另一项研究，其中使用拭子从健康人中收集唾液、内颊、舌、鼻道粘膜、耳和皮肤的样品。作为阴性对照，取实验工作台表面的拭子。采用横向流动免疫测定法，测试拭子A型链球菌的存在。在该研究中，收集唾液样品，离心得到同样测试的上清液和沉淀。结果见图2，表明来自耳、皮肤和工作台表面的样品不含A型链球菌抗原，因为这些样品具有与阴性对照样品(仅提取试剂、干净拭子、PBS/BSA样品)大约相同的绝对信号。然而，相对于阴性对照，从口腔组织、唾液、颊和舌获得的样品为A型链球菌存在阳性。

另一项研究描述于实施例1，其中在将已知量的多克隆抗A型链球菌抗体加入或不加入样品中的情况下，测试唾液样品A型链球菌的存在与否。结果见图3，其中沿x轴每个标记左侧的条形柱对应于唾液样品，x轴上各样品标记右侧的条形柱对应于唾液样品加添加抗A型链球菌抗体。最右边的3个样品对应于在加入和未加入抗A型链球菌抗体情况下具有已知生物数的A型链球菌的质量控制标准。图中的数据表明唾液样品中的组分而非A型链球菌抗原引起免疫测定装置的试验线的假阳性读数。

进行了进一步的研究以鉴定假阳性读数的可能来源或原因。在实施例2中详述的研究中，测试了一系列化学物质在A型链球菌免疫测定法中抑制或阻断抗A型链球菌多克隆抗体的结合的能力。受测化合物包括N-乙酰葡糖胺(NAG)、葡糖胺、乙酰基-半乳糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、乙酰胞壁酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖和透明质酸(HA-50K)。获得来自健康人类患者的舌拭子样品和A型链球菌质量控制标准(1 x 10³个生物/试验)用于测试。采用用于检测A型链球菌的免疫测定装置，将舌拭子样品(图4中各数据集的右手条形柱)和QC标准(图4中各数据集的左手条形柱)各自在图4中沿x轴标明的试验化合物存在下用提取试剂(例如市购可获得的QUICK-VUE^® A型链球菌试剂盒中的提取试剂)处理。作为对照和比较物，A型链球菌QC标准和舌拭子样品各自也用提取试剂处理(图4中的左边数据集，在图4中标为“Extr A+B”；左边条形柱是阳性对照QC标准，右边条形柱为舌拭子数据集)。结果见图4，其中显示了试验线上相对于其合适对照的信号的相对活度。受测化合物中，N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)抑制自免疫测定装置试验线上A型链球菌QC标准产生的信号超过50%，并且能够抑制来自舌拭子的信号至对照舌拭子信号的16%。来自舌拭子样本的假阳性信号通过加入NAG被有效抑制的事实表明，A型链球菌多克隆抗体含有对舌/口腔的人组织或细胞的某种非特异性结合活性。

因此，在一个实施方案中，考虑将NAG加入免疫测定法中，其中NAG的存在有效降低A型链球菌多克隆抗体群中的抗体和试验样品中的组分之间的非特异性结合达在缺乏NAG时获得的信号的至少约50%、更优选达至少约60%、70%或75%。

虽然不受理论的束缚，但是数据表明，可通过将NAG加入免疫测定法中有效地阻断或抑制非有意收集在咽拭子样本上的上皮细胞中存在的糖蛋白的假阳性信号。在一些实施方案中，用于免疫测定法的多克隆抗A型链球菌抗体包括识别模拟A型链球菌细胞壁蛋白质的人上皮细胞壁糖蛋白的抗体群。通过向免疫测定法提供可阻断所述抗体群的试剂，就总精度而言，通过降低假阳性率可改进免疫测定法的性能。本发明通过在免疫测定装置中包括NAG和/或在免疫测定法所提供的提取试剂中包括NAG来满足这种需要。

考虑了包含NAG的用于检测A型链球菌的免疫测定法，其中该测定法包括允许以提高的特异性一步预处理和检测A型链球菌生物的横向流动装置。免疫测定装置是本领域已知的，通常具有至少样品接受区、标记区和俘获区，并且可按照美国专利号5,415,994、5,763,262和5,770,460任一个的描述制备，所述专利通过引用以其整体结合到本文中。

因此，本公开内容的一个方面，提供用于检测样品中A型链球菌的存在的装置。考虑了装置的各种实施方案，并且本文描述了示例性的实施方案用于说明目的。然而，技术人员应了解，说明性实施方案不限制本文提供的发明构思。

在通用实施方案中，装置包括流体连通中的一系列区域。在一个优选的实施方案中，样品接受区与第二区和后继区(例如标记区、俘获区和/或吸收区)呈流体连通。图5中描述了装置的第一实施方案，图中显示用于检测A型链球菌的免疫测定试验条。示例性试验条10包括优选延伸到试验条的长度的支持层12。支持层12连续地支持样品垫14、标记垫16、硝化纤维膜17和任选吸收垫18。在硝化纤维膜上是试验线20和控制线22。为了检测A型链球菌，标记垫包含抗A型链球菌抗体，试验线同样包含抗A型链球菌抗体。在一个实施方案中，沉积在标记垫上的抗体包含辅助或允许检测抗体的标记。标记的抗体在A型链球菌抗原通过标记区时与之特异性结合。俘获区包含用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具。按照本发明，在将样品施加到装置中前和/或在其流动通过装置期间，使之与N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)接触。本文所述研究说明了在NAG掺入测定法中时欲用于检测A型链球菌的装置的改进性能。可将NAG掺入装置中，例如在样品接受区、标记区或两者，和/或样品可在施加到装置的样品接受区之前将其用NAG处理。

在一个实施方案中，横向流动免疫测定法包括具有可用肉眼直观读出的标记(例如有色珠粒或微粒)的免疫测定法，其中使用者可用肉眼观察免疫测定法试验线上的所述珠粒或微粒的聚集。在另一个实施方案中，横向流动免疫测定法包括具有通过仪器或借助仪器用眼读出的标记的免疫测定法。例如，采用可激发标记的仪器来检出免疫测定法中的荧光标记，且激发的标记可用仪器、用眼辅以仪器或用眼读出。示例性的仪器和横向流动免疫测定法描述于美国申请号61/666,689，其通过引用结合到本文中。

另一方面，提供用于检测样品中A型链球菌的存在的装置，其中该装置包括基质，所述基质具有：(i)样品接受区，其用于接受含有或疑似含有A型链球菌特异性抗原的样品，(ii)标记区，其含有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的抗体，和(iii)俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上，且其中样品接受区、标记区或两者含有NAG。

考虑使用的装置的另一个实施方案描述于美国专利号5,415,994，其通过引用结合到本文中。在该实施方案中，该装置包括接受室，其放置或可放置在与横向流动免疫测定装置进行流体接触的位置上，优选放置在与免疫测定试验条的样品接受区或标记区进行流体连通的位置上。例如通过插入含有样品的拭子或通过将等分的样品分配到接受室，将疑似含有A型链球菌的生物样品放入接受室中。另外可将一种或多种提取剂或处理剂加入接受室或拭子中。在一个实施方案中，处理剂包含NAG。在一个实施方案中，接受室位于样品接受区上方，被制成所需尺寸以接受包含NAG的液体提取试剂，且任选包含圆柱形部分以接受含有患者样品的拭子。免疫测定试验条包括基质，所述基质具有样品接受区，其用于接受含有疑似包含A型链球菌抗原的处理样品的提取液体；标记区，其具有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的多克隆抗体；和俘获区，具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上。

在本文所述装置的一些实施方案中，所提供的处理生物样品的提取试剂含有NAG。在一些实施方案中，免疫测定装置的标记区含有NAG。在一些实施方案中，免疫测定装置的俘获区含有NAG。在一些实施方案中，免疫测定装置的样品接受区含有NAG。在一些实施方案中，这些特定区域的全部或一些包含NAG，任选在提取试剂中与NAG组合。

采用上述装置以进一步评价NAG对装置灵敏度和准确度的作用。在描述于实施例3的另一项研究中，评价了不同浓度的NAG在免疫测定法中对A型链球菌假阳性信号的抑制。舌拭子取自健康个体，并通过使用所提供的提取试剂提取样品制备用于测试的A型链球菌质量控制(QC)标准(2.0 x 10³个生物/试验)，不同的是以0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL将NAG加入提取试剂中。使样品沉积在免疫测定装置上。结果见图6，对于舌拭子样品(菱形)和2 x 10³个生物/试验的A型链球菌质量控制标准(正方形)，随存在于提取试剂中的NAG的浓度而变化。

图6中的结果表明，与受抑制的A型链球菌阳性信号相比，NAG更有效地抑制假阳性。以0.5 mg/mL (提取试剂的体积)的浓度存在于免疫测定法中的NAG能够抑制假阳性至在不存在NAG时观察到的信号的约20%，而在相同的NAG浓度下，在2.0x10³个生物/试验下的A型链球菌QC标准的阳性信号保持在不存在NAG时所观察到的信号的50%。

在描述于实施例4的另一项研究中，再次测试最初收集的30个样品(图1)，这次将0.5 mg/mL NAG加入免疫测定法试验试剂盒提供的提取试剂中。图7是再次表示图1的数据(各数据集的左边条形柱)和用包含0.5 mg/mL NAG的提取试剂制备的相同患者(例如C-002)的唾液样品等分试样(各指定患者的各个数据集的右手条形柱)的柱状图。

图8显示另一项研究的结果，其中在装置的样品垫上包含NAG的免疫测定装置上对患者样品进行测试。通过使0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1 mg/mL浓度的NAG溶液沉积到样品垫上并使之干燥，来制备装置。在装置上分别对舌拭子样品和A型链球菌QC标准连同盐水阴性对照进行测试。在图8的柱状图中，在加入盐水(阴性对照)时在样品垫中包含NAG的A型链球菌免疫测定装置试验线上的绝对信号以各数据集的左边条形柱显示，2 x 10³个生物/试验的质量控制标准以各数据集的中间条形柱显示，舌拭子以各数据集的右边条形柱显示。在测试A型链球菌QC标准以及舌拭子样本时，在NAG存在下观察到阳性信号的抑制。此结果与在提取溶液使用NAG的研究结果一致(上文图7和实施例4)。因此，证实了NAG可包括在免疫测定装置本身的适当位置上或离线提取介质中。

本文提供的数据显示，将NAG加入A型链球菌的免疫测定法中改进A型链球菌试验的特异性，并降低假阳性率。因此，NAG可用来有效地降低所述试验的假阳性。技术人员应了解，可调节抗体、NAG和样品的量以使观察来自酿脓链球菌的阳性信号同时通过NAG阻断假阳性最优化。基于本文进行的研究的试验的灵敏度和特异性见图9，其显示了改进的A型链球菌免疫测定法的灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值的计算。

根据前文所述，且另一方面，提供用于检测样品中A型链球菌存在与否的方法，所述方法包括(a)提供具有以下的基质：(i)样品接受区，其用于接受含有或疑似含有A型链球菌特异性抗原的样品，(ii)标记区，其含有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的抗体，和(iii)俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上；和(b)使样品接受区与样品接触，其中所述样品在接触前用包含NAG的液体试剂处理；和(c)检测俘获区中抗原是否存在。在一个实施方案中，基质还包含俘获区下游的吸收区。

另一方面，提供在检测液体样品中的A型链球菌时降低横向流动测定法的假阳性率的方法，其中，在横向流动测定法中，用于该测定法的多克隆抗体标记的NAG结合组分优先被结合，该方法包括用有效作为阻滞剂的一定量的NAG处理吸水基质以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低该测定法的假阳性率。

另一方面，提供在检测液体样品中的A型链球菌时降低横向流动测定法的假阳性率的方法，其中，在横向流动测定法中，用于该测定法的多克隆抗体标记的NAG结合组分优先被结合，该方法包括将有效作为阻滞剂的一定量NAG加入提取试剂中以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低该测定法的假阳性率。

可通过以有效作为阻滞剂的量将NAG加入样品接受区中以提高至少部分的多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合，来进行用于检测A型链球菌的已知免疫测定装置的改进，从而降低测定法的假阳性率。改进还包括以有效作为阻滞剂的量将NAG加入标记区中以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低该测定法的假阳性率。改进还包括以有效作为阻滞剂的量将NAG加入提取试剂中以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低该测定法的假阳性率。

在一些实施方案中，通过使用咽拭子来收集样品。在一些实施方案中，通过咽、舌、颊、牙、牙龈或鼻道的拭子来收集样品。在一些实施方案中，对体液采样，例如尿液、唾液、痰、粘液、血液、血液组分例如血浆或血清、羊水、精液、伤口分泌物、阴道分泌物、眼泪、脊髓液、洗出液和其它体液。来自例如宫颈、尿道、鼻孔和咽喉的拭子样本包括在样品中。

在一些实施方案中，第一抗体是与A型链球菌的一个或多个表位结合且还与NAG结合的多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为多克隆抗体群，该群包括与NAG具有特异性结合的一部分抗体。在一些实施方案中，抗体不与葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、乙酰胞壁酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖和/或透明质酸(例如HA-50K)结合。

在一些实施方案中，抗体具有用于检测A型链球菌抗原的高特异性和低敏感度。在一些实施方案中，抗体具有用于检测A型链球菌抗原的高敏感度和低特异性。在一些实施方案中，抗体具有用于检测A型链球菌抗原的高特异性和高敏感度。

用于本公开内容的免疫测定法的抗体的实例可包括但不限于多克隆抗体，例如亲和纯化的兔抗A型链球菌抗体。

描述用于检测A型链球菌的前体组合物的组分、方法和试剂盒以及各种抗体的说明性出版物包括：美国专利号5,415,994、5,763,262和5,770,460。所有这些专利、申请和出版物均通过引用以其整体结合到本文中。

试剂盒

还考虑了包含本文所述的免疫测定装置的试剂盒。除免疫测定装置以外，试剂盒还另包括以下的任一种或多种：使用装置和收集生物样品的书面说明、用于收集生物样品的器具或工具、用于标明装置的标记、含有用于制备处理样品的试剂的容器或小瓶。试剂盒可另包括出于读出和解释测定结果的说明书。试剂盒还可包含可用来与标本样品比较试验结果的参比样品。在一个实施方案中，试剂盒包括用于收集生物样品的拭子和用于测定的用法和用于收集样品的说明书，其中说明书不含针对与例如咽喉背部、扁桃体、颊或舌的一种或多种相接触的提醒。

因此，另一方面，提供试剂盒，其包含(a)包含基质的装置，所述基质具有：(i)样品接受区，其用于接受含有或疑似含有A型链球菌特异性抗原的样品，(ii)标记区，其含有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的抗体，和(iii)俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，和任选(iv)吸收区，其中样品接受区、标记区和俘获区(和如存在的话任选吸收区)排列在液体流动路径中的基质上；和(b)装有提取试剂的容器；其中提取试剂、样品接受区和标记区的至少一个含有NAG。

实施例6概括了使用由以下组成的试剂盒进行的研究：嵌入在具有样品接受室的盒中的横向流动免疫测定试验条、含试剂溶液的小瓶和牢固装配在小瓶的开口端的滴管头、无菌人造丝拭子、涂布热灭活的无感染性A型链球菌的阳性对照拭子、涂布热灭活的无感染性C型链球菌的阴性对照拭子和使用说明书。试验试剂盒用于临床研究，其中2个喉拭子获自533名患有提示有细菌咽炎的症状的患者。

用于实施例的研究中的横向流动免疫测定试验条在试验条的样品垫上含有干燥形式的NAG (参见图5)。试验条被设计成与能够读出自试验条的试验线和控制线上发射的荧光或发光信号的仪器联合起作用。研究结果详述于实施例6，其中可见，灵敏度和特异性分别为99%和96%。

实施例

下面的实施例描述了可采用本文公开的方法和组合物进行的示例性测定法。然而，本公开内容绝不能视为局限于下文描述的具体实施方案。

实施例 1 ：使用健康志愿者的唾液样品的研究

唾液样本自三十(30)名健康供体收集。作为阳性对照，获得由已知数目的抗原组成的A型链球菌的质量控制(QC)标准。获得具有3.75 x 10²个生物/试验、3.75 x 10⁴个生物/试验和3.75 x 10⁵个生物/试验的QC标准。将各唾液样本的等分试样沉积在横向流动免疫测定试验条上，所述试验条包含与图5所示类似的且包含对A型链球菌抗原有特异性的具有荧光标记的多克隆抗体。将各唾液样本的第二等分试样与已知量(2 mg/mL)的亲和纯化的多克隆A型链球菌抗体混合。将唾液加抗体样品沉积在免疫测定装置上，对于表明抗原的荧光信号的存在，目视观察免疫测定装置的试验线。结果见图3。

如图3所见，当使用荧光分析仪读数时，在免疫测定装置试验线上，一些唾液样本表明阳性信号。当处理样品时加至提取混合物中的抗A型链球菌抗体抑制阳性信号，如图3中各样品的右手条形柱所见。唾液样品和QC标准中抗A型链球菌抗体的存在不同地减弱阳性信号。唾液样本中存在A型链球菌抗体时的减弱小于A型链球菌QC标准的减弱。这通过测定在抗体存在或不存在时的信号比率可见，如下表1所示。这些结果表明，唾液样本中的组分而非A型链球菌抗原导致假阳性信号。

表1

实施例 2 ：糖类化合物对所观察到的假阳性结果的分析

鉴定并选择由与细菌细胞壁和人组织的结构类似的结构组成的化合物或具有所述结构的化合物用于研究抑制A型链球菌免疫测定试验中阳性信号产生的能力。选用于研究的化学物质为N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)、葡糖胺、乙酰基-半乳糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、乙酰胞壁酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖和透明质酸(HA-50K)。

在该研究中，获得来自健康人患者的舌拭子样品。还获得A型链球菌质量控制标准(1 x 10³个生物/试验)用于测试。舌拭子样品和QC标准样品各用试验化合物之一处理，然后将样品沉积在免疫测定装置上以检测A型链球菌。作为对照和比较物，A型链球菌QC标准和舌拭子各用A型链球菌免疫测定法试验试剂盒提供的提取试剂处理(图4中的左边数据集，在图4标为“Extr A+B”；左边条形柱是阳性对照QC标准，右边条形柱是舌拭子集)。结果见图4，其中显示了舌拭子样品(图4中各数据集的右手条形柱)和QC标准样品(图4中各数据集的左手条形柱)在试验线上相对于其合适对照的信号的相对活度。受测化合物中，N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)抑制自免疫测定装置试验线上产生的A型链球菌QC标准的信号超过50%，并且能够抑制来自舌拭子的信号至对照舌拭子信号的16%。通过加入NAG可有效抑制来自舌拭子样本的假阳性信号的事实表明，亲和纯化的A型链球菌抗体含有对舌/口腔的人组织或细胞的某种非特异性结合活性。

实施例 3 ： NAG 对阳性和假阳性信号的剂量反应

从健康个体中收集6个舌拭子。获得具有2.0x10³个生物/试验的A型链球菌质量控制(QC)标准。使用具有荧光标记的多克隆A型链球菌抗体制备拭子和QC标准，以用于使用免疫测定装置的测试。将各样品与包含0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL的NAG的试剂混合。使样品沉积在免疫测定装置上，使用荧光分析仪，目视观察试验线存在的阳性信号。结果见图6，对于舌拭子样品(菱形)和2 x 10³个生物/试验的A型链球菌质量控制标准(正方形)，随存在于提取试剂中的NAG的浓度而变化。

实施例 4 ：提取试剂中包含 NAG 的免疫测定法

用针对A型链球菌的免疫测定法测试了自健康供体收集的30个喉拭子，其中以0.5 mg/mL的浓度将NAG加到提取混合物中。使提取的样品沉积在免疫测定中，使用荧光分析仪观察试验线获得发射信号的绝对计数。在提取试剂中不使用NAG的情况下还测试了各患者的等分样品(图1中的数据和图7表示的数据用于比较)。结果见图7，其中各患者各数据集右手侧的条形柱对应于在NAG存在下制备的样品。结果显示，来自健康供体的一些喉拭子样本可导致强的假阳性信号，但这些假阳性可被0.5 mg/mL NAG显著抑制。特别参见样本#18 (“C-018”)。通过细胞培养，证实样本#24 (“C-024”)为A型链球菌阳性。

实施例 5 ：免疫测定装置样品垫中包含 NAG 的免疫测定法

制备在样品垫中含已知量的NAG的免疫测定装置。通过将0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1 mg/mL浓度的NAG溶液沉积在样品垫中并使之干燥，来制备该装置。

在具有各种浓度的NAG的免疫测定装置中分别测试舌拭子样品和A型链球菌QC标准以及盐水阴性对照。结果见图8，其中在加入盐水(阴性对照)时在样品垫中包含NAG的A型链球菌免疫测定装置试验线上的绝对信号以各数据集的左边条形柱显示，2 x 10³个生物/试验的质量控制标准以各数据集的中间条形柱显示，舌拭子在各数据集右边条形柱显示。

实施例 6 ：样品垫中包含 NAG 的 A 型链球菌免疫测定试验条的特异性和灵敏度

制备包含用于检测A型链球菌的免疫测定试验条的试剂盒。试剂盒包括嵌入在具有样品接受室的盒中的免疫测定试验条、含试剂溶液的小瓶和牢固装配在小瓶的开口端的滴管头、无菌人造丝拭子、涂布热灭活的无感染性A型链球菌的阳性对照拭子、涂布热灭活的无感染性C型链球菌的阴性对照拭子和使用说明书。免疫测定试验条包括试验条样品垫上的NAG，并被设计为具有通过仪器可读取的荧光标记。

临床研究中使用试验试剂盒，其中2个喉拭子获自533名患有提示有细菌咽炎的症状的患者。将冰水袋上的1个喉拭子运送到中心参照实验室(Reference Laboratory)，在绵羊血液琼脂平板(SBA)上划线，并培养直到48小时。紧接划线后，在荧光免疫测定试验条上测试该同一个拭子。通过将荧光免疫测定试验条的结果与相应的培养结果进行比较，确定其性能。在第一象限中具有10个或更多个A型链球菌(GAS)‐阳性菌落、且其它3个象限中为零或多个阳性菌落的细菌培养物划线板被视为培养物阳性。表6-1提供该分析的结果。不包括显示极少菌落(即在第一象限少于10个菌落，其它象限无生长)的SBA板。

表 6-1：同一拭子的荧光免疫测定结果和培养板结果

	SBA培养：阳性	SBA培养：阴性
			免疫测定试验：阳性	70	16
免疫测定试验：阴性	0	432
			共计	70	448

从该数据来看，灵敏度为70/70 (100%) (95%置信区间(C.I.) 94‐100%)；特异性为432/448 (96%) (95% C.I. 94‐98%)；阳性预测值为81%，阴性预测值为100%。

表6-2提供了基于在SBA板中生长的细菌水平的GAS‐阳性培养物的分布和用荧光免疫测定试验条获得的相应结果。还确定了培养结果的分类。分类以划线板各象限中GAS阳性菌落的数目为基础，范围从稀少(第一象限少于10个菌落，且其它象限无生长)至4+ (所有4个象限中大于10个菌落)。表6-2中提供了基于这种培养物分类的荧光免疫测定试验条结果。

表 6-2 喉拭子样本的培养物分类和相应 Sofia A 型链球菌 FIA 结果

培养物分类	荧光免疫测定试验条结果
		稀少	10/15 (67%)
1+	9/9 (100%)
		2+	19/19 (100%)
3+	25/25 (100%)
		4+	17/17 (100%)

自同一患者收集的其它喉拭子直接在医师事务所或诊所进行测试，无需在SBA上划线。将结果与用其它拭子获得的培养物(参见上表6-1)进行比较。用该拭子的直接测试获得的灵敏度和特异性分别为99% (69/70)和96% (426/442)。有15个稀少(参见上表6-2)和6个无效；这些不包括在临床准确度的计算中。还使用荧光免疫测定试验条以证实绵羊血液琼脂板上推定的A型链球菌菌落的鉴定。对于培养确认，试验为100%灵敏度和95%特异性(表6-3)。

表 6-3 用 Sofia A 型链球菌 FIA 的细菌培养结果的确认

	SBA培养：阳性	SBA培养：阴性
			免疫测定试验：阳性	17	1
免疫测定试验：阴性	0	20
			共计	17	21

从该数据来看，灵敏度为17/17 (100%) (95% C.I. 78‐100%)；特异性为20/21 (96%) (95% C.I. 76‐100%)；阳性预测值为94%，阴性预测值为100%。

虽然说明和描述了各种具体的实施方案，但技术人员应认出各种修改、置换、添加及其次级组合，并且应了解这些可在不偏离本公开内容的精神和范围的情况下进行。因此，要了解本公开内容不限于本文公开的具体实施方案，由此以实施例的方式来提供。虽然本文采用特定的术语，但它们只是以通用和描述性含义使用，并非出于限制的目的。

本申请引用的所有文献和类似资料，包括但不限于本公开内容引用的专利、专利申请、文章、书籍、专著、互联网网页和其它出版物，不论所述文献和类似资料的形式如何，都通过引用以其整体明确予以结合用于任何目的，其程度正如各自单独指明通过引用予以结合一样。在所结合的文献和类似资料的一份或多份不同于本公开内容或与本公开内容抵触的情况下，包括但不限于定义的术语、术语使用、所述技术等等，以本公开内容为准。

Claims

1. 一种用于检测样品中A型链球菌的存在的装置，其包括：

基质，所述基质具有：(i)样品接受区，其用于接受含有或疑似含有A型链球菌特异性抗原的样品，(ii)标记区，其含有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的抗体，和(iii)俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中所述样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上，和

其中所述样品接受区和标记区的至少一个包含N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)。

2. 权利要求1的装置，其中所述抗体为多克隆抗体。

3. 权利要求1或权利要求2的装置，其中所述抗体是荧光标记的。

4. 权利要求1-3中任一项的装置，其中所述用于特异性结合标记的抗原的工具是俘获抗体。

5. 权利要求4的装置，其中所述俘获抗体是多克隆抗体。

6. 一种试剂盒，其包含：

包含基质的装置，所述基质具有：(i)样品接受区，其用于接受含有或疑似含有A型链球菌特异性抗原的样品，(ii)标记区，其含有用于当抗原从其中通过时特异性标记该抗原的抗体，和(iii)俘获区，其具有用于将标记的抗原特异性结合在其上的工具，其中所述样品接受区、标记区和俘获区排列在液体流动路径中的基质上；和

装有提取试剂的容器；

其中所述提取试剂、样品接受区和标记区的至少一个包含N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)。

7. 权利要求6的试剂盒，其中所述NAG沉积在样品接受区上。

8. 一种用于检测生物样品中A型链球菌存在与否的方法，其包括：

提供权利要求1-5中任一项的装置；

将生物样品放入所述装置中；和

测定A型链球菌存在与否。

9. 权利要求8的方法，其还包括：

提供用于收集生物样品的器具；和

将生物样品收集到器具上。

10. 权利要求8或权利要求9的方法，其还包括：

提供使用说明书，其中所述说明书不提醒在收集样品时舌、口腔两侧或顶部不与器具接触。

11. 一种试剂盒，其包括：

权利要求1-5中任一项的装置；

装有提取试剂的容器；

用于收集生物样品的器具；和

使用说明书。

12. 权利要求11的试剂盒，其中所述器具为拭子。

13. 权利要求11或权利要求12的试剂盒，其中所述说明书不提醒在收集样品时舌、口腔两侧或顶部不与器具接触。

14. 一种提供降低检测样品中A型链球菌的横向流动测定法的假阳性率的方法，其中，在所述横向流动测定法中，用于该测定法的多克隆抗体标记的N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)结合组分优先被结合，所述方法包括：

将吸水基质用有效作为阻滞剂的一定量N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG)处理以提高多克隆抗体与A型链球菌抗原的特异性结合并降低所述测定法的假阳性率。