CN117074674B - 检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸及其制备方法 - Google Patents

检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测N‑乙酰‑β‑D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸及其制备方法，涉及N‑乙酰‑β‑D氨基葡萄糖苷酶的检测技术领域。本发明提供的胶体金试纸在结合垫上吸附有胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或NAG抗体Ⅱ，相应地在反应垫的T线上包被有所述NAG抗体Ⅱ或NAG抗体Ⅰ；NAG抗体Ⅰ的重链和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27‑28所示；NAG抗体Ⅱ的重链和轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.29‑30所示。本发明提供的检测尿液中N‑乙酰‑β‑D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸产品，检出限可达10U/L，灵敏度极高且检测方法简便可靠，只需要10min即可完成检测；适用于各类定性或半定量的POCT检测。

Description

检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的检测技术领域，特别涉及检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸条、试纸卡及其应用。
背景技术
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG,β-2-aceta-mido-2-deoxy-D-glucoside acetamidodeoxyglucohydrolase，EC3.2.1.30)是一种位于溶酶体内的酸性水解酶，简称NAG，其分子量约112500±19000，广泛存在于人体各种组织器官、体液及血细胞的溶酶体中，但在前列腺和肾脏近端肾小管中含量最高。当肾近曲小管受损时，尿液中的NAG水平明显升高。因此，NAG是反应肾小管功能的敏感指标。NAG也可作为糖尿病早期肾损伤诊断的标志物。
目前，常用的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的测定方法有底物法、酶法、速率法、两点法等。以上方法都是利用N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶与底物的酶促反应来测定其活性，反应容易受酶浓度、底物浓度、反应温度以及检测样本的pH、离子强度和可能存在的抑制剂的干扰。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸及其制备方法，具体通过以下技术实现。
检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，所述胶体金试纸包括底板，以及设在底板上的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述结合垫上吸附有胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或NAG抗体Ⅱ，相应地，所述反应垫的T线上包被有所述NAG抗体Ⅱ或所述NAG抗体Ⅰ；
所述NAG抗体Ⅰ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.1-3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为YAS；
所述NAG抗体Ⅱ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.6-8所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9-10所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为WAS。
本发明提供的胶体金试纸，是同时使用了两种NAG抗体，即NAG抗体Ⅰ和NAG抗体Ⅱ。需要说明的是，这两种NAG抗体的制备方法是，先在胎盘中提取N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG蛋白)，再将NAG蛋白用动物免疫，提取B细胞并之辈杂交瘤细胞，最后筛选出能特异性识别NAG蛋白的抗体，送至第三方基因测序公司测序后，获得了NAG抗体Ⅰ和NAG抗体Ⅱ的核苷酸序列。还需要说明的是，在使用这两种抗体时，可以将NAG抗体Ⅰ吸附在结合垫上，将NAG抗体Ⅱ包被在T线上；也可以反过来NAG抗体Ⅱ吸附在结合垫上，将NAG抗体Ⅰ包被在T线上。这两种方式制备的胶体金试纸的检测效果都非常好。
优选地，所述NAG抗体Ⅰ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11-14所示，轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.15-18所示；
所述NAG抗体Ⅱ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.19-22所示，轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23-26所示。
更优选地，所述NAG抗体Ⅰ、NAG抗体Ⅱ的轻链恒定区均为κ链，重链恒定区均为IgG2a型。
进一步优选地，所述NAG抗体Ⅰ的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示；所述NAG抗体Ⅱ的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。
优选地，所述结合垫上的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ，与胶体金是按照2-5μg/mL进行标记，胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的使用量为50μL/cm2。
优选地，所述反应垫的T线上包被的NAG抗体Ⅱ或Ⅰ的包被浓度为0.5-3mg/mL，包被量为0.8-1.2μL/cm。
优选地，所述反应垫的C线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体，且包被浓度为0.5-3mg/mL，包被量为0.8-1.2μL/cm。
优选地，所述反应垫为孔径3-15μm的硝酸纤维素膜。
本发明还提供了上述的胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：
S1、用氯化钠溶液分别配制用于包被所述反应垫的T线的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的工作液，以及包被所述反应垫的C线的多克隆抗体工作液；将NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的工作液、多克隆抗体工作液分别包被到反应垫的T线和C线上，干燥备用；
制备胶体金复溶液，将胶体金和碳酸钾溶液混合均匀，然后相应地加入NAG抗体Ⅱ或Ⅰ，继续搅拌，再加入聚乙二醇，搅拌、离心，收集沉淀；将沉淀用所述胶体金复溶液复溶混合均匀，得到胶体金标记的NAG抗体Ⅱ或Ⅰ，并将其均匀铺到所述结合垫上，干燥密封备用；
S2、将处理好的样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫依次粘贴在底板上，裁剪得到胶体金试纸成品。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
1、本发明提供的一种基于免疫技术，利用双抗体夹心法原理和胶体金技术检测尿液中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸产品，可以作为肾小管损伤和糖尿病早期肾损伤的辅助诊断；检出限可达10U/L，灵敏度极高且检测方法简便可靠，只需要10min即可完成检测；适用于各类定性或半定量的POCT检测；
2、本发明提供的检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸检测灵敏度高，阴性符合率和阳性符合率高且重复性好，具在尿液N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶检测上有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的胶体金试纸条的结构图；
图2为实施例4的胶体金试纸条的检测结果；
图3为实施例5的胶体金试纸的灵敏度分析结果；
图4为实施例6的胶体金试纸的阴性符合率判定结果；
图5为实施例7的胶体金试纸的阳性符合率判定结果。
具体实施方式
本发明全文提到的“抗体”为广义概念，包括各种抗体结构，包括但不限于Y形抗体(即全长抗体)、Y形抗体的抗原结合部分、及前述两者的遗传或化学修饰。抗原结合部分指Y形抗体的一个或多个片段，且所述一个或多个片段保留抗体特异性结合NAG蛋白的能力。现有技术中已经证实全长抗体的抗原结合功能是能够通过其片段来实现的。
下列实施例中提到的“单克隆抗体(mAb)”是指基本同质的抗体，各个抗体基本相同，个别抗体中可能存在少量自然突变。单克隆抗体能够表现出对特定抗原表位的特异性和亲和力。单克隆抗体与多克隆抗体不同，多克隆抗体包括针对不同抗原表位的多种不同抗体，而单克隆抗体一般仅可以靶向抗原相同或基本相同的表位。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，而不要求通过任何特定方法生产。事实上，抗体可以通过各种方法制备，如单个B细胞培养和克隆、杂交瘤、重组DNA或噬菌体抗体文库分离筛选。
下列实施例中提到的“识别NAG蛋白的单克隆抗体mAb”指能够以足够的亲和力结合NAG蛋白的单克隆抗体，从而能够在靶向NAG蛋白的检测、诊断和/或治疗剂中使用。本申请中的术语“亲和力”指在分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的总的非共价分子间相互作用的强度。分子间的相互作用包括氢键、静电相互作用、疏水力以及范德华力。
下列实施例中提到的“鼠抗体”、“鼠抗NAG蛋白mAb”等术语中的修饰语“鼠”表示该抗体的互补决定区(CDR)来自鼠种系免疫球蛋白序列。鼠抗体或鼠抗NAG蛋白mAb包括CDR序列来自鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。优选地，鼠抗体或鼠抗NAG蛋白mAb包括CDR序列来自鼠种系免疫球蛋白序列，而抗体骨架区(FR)来自另一种哺乳动物(如兔、羊或人类)的免疫球蛋白序列的抗体。优选地，鼠抗体或鼠抗NAG蛋白mAb包括其FR和CDR均来自鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。本申请中的“鼠抗体”或“鼠抗NAG蛋白mAb”也可以是不包含由鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机或定点诱变、体内体细胞突变引发的抗体。但，本申请中的“鼠抗体”或“鼠抗NAG蛋白mAb”不包括CDR序列来自其他哺乳动物(例如兔)的抗体。
在下列实施例中，鼠抗NAG蛋白mAb是Y形抗体，包括重链和轻链，重链包括一个可变区(VH)和至少一个恒定区(CH)。VH一般位于重链的N端，且与CH相比，VH在氨基酸序列上具有更高的变异性。不同抗体的VH可以是不同的，且可以对每种抗体特异性识别。在同种型或同类型的抗体中，CH的氨基酸序列可以是相同的，但不同种型CH的氨基酸序列是不同的。本申请中的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgG)。哺乳动物抗体具有五种不同类型的重链：γ、δ、α、μ和ε，分别代表了五种类型的抗体：IgG、IgD、IgA、IgM和IgE，人和小鼠均具有上述五种抗体同种型。
轻链是相对于重链的小多肽亚基，包括一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)。VL一般位于轻链的N端，且与CL相比，VL在氨基酸序列上具有更高的变异性。不同抗体的VH可以是不同的，并且对每种抗体的氨基酸序列具有特异性。
每个可变区VH和VL包括互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。CDR是可变区内的高变区，其包含抗原接触残基，能够实现Y形鼠单抗对NAG蛋白的识别和接触功能。本申请的实施例中提供的抗NAG蛋白的单克隆抗体包含6个CDR，其中3个在VH区，另外3个在VL区。
VH和VL的相邻CDR由FR隔开，即抗NAG蛋白的单克隆抗体包含8个FR，其中4个在VH区，另外4个在VL区。FR是可变区的保守区，可充当支架使CDR具备能够与抗原(如NAG蛋白的胞外域)接触的三维结构。
CDR区决定抗NAG蛋白的单克隆抗体的特异性和亲和力。FR区能够协助维持抗NAG蛋白的单克隆抗体可变区的整体结构，并支撑CDR使其能够以合适的构型与抗原结合。
不同抗体FR的三维结构可以是相同的。在某些实施例中，单克隆抗体的CDR可以在保留其结合NAG蛋白的能力的情况下转接至来自其他物种的另一抗体的FR中，以形成嵌合抗体。如，可以将鼠抗NAG蛋白的单克隆抗体的CDR移植到人抗体的FR中，形成针对NAG蛋白的人源化抗体。
鼠抗NAG蛋白的制备方法有多种，包括单克隆抗体法，如细胞杂交等，包括但不限于B淋巴细胞的病毒转化或原代转化，也可以通过单个B细胞制备技术获得。
脾细胞的免疫、分离及融合可采用本领域常规方法。例如，通过刺激Balb/c小鼠的免疫反应获得NAG蛋白的胞外域的免疫原，具体包括从PBMC和次级淋巴组织中分离出NAG蛋白特异性B细胞，扩增候选IgG基因以重组表达鼠mAb。通过直接抗原ELISA验证mAb候选物的结合力和特异性，捕获ELISA和夹心ELISA对可识别NAG蛋白的mAb进一步表征，以进行后续分析开发。
鼠mAb的分离和纯化方法有多种，如可以从用鼠抗体基因转染的哺乳动物细胞的培养上清液中分离，然后利用蛋白A亲和层析进行纯化，纯度和功能效果可以通过SDS-PAGE和ELISA进行验证。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所使用的NAG单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体均为武汉奥科博泰生物科技有限责任公司生产。
实施例1：NAG抗体Ⅰ、NAG抗体Ⅱ的制备
1、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白的提取
将人胎盘解冻后去除脐带，用预冷的纯水清洗，去除血管和膜，剪碎；继续用预冷的含有0.5mM EDTA，1％ NaN3的纯水漂洗3次。在洗净剪碎的胎盘中加入2L预冷的缓冲液(含有0.5mM EDTA、1％ NaN3、0.01M phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、pH＝6.0)匀浆；充分匀浆后，4℃低温10000×g离心10min，收集上清。沉淀中再次加入1L预冷的缓冲液(含有0.5mM EDTA、1％ NaN3、0.01M phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、pH＝6.0)匀浆；充分匀浆后，4℃低温10000×g离心10min，取上清，并透析至缓冲液(0.5M NaCl、1％ NaN3、0.125M琥珀酸钠、pH＝6.0)中。
透析完全后的样品，4℃低温12000×g离心1h后，上清经过0.45μM膜过滤，等待上样。用平衡液(0.5M NaCl、0.1％ NaN3、12.5mM琥珀酸钠，pH＝6.0)平衡5mL Con A Beads4FF层析柱30mL；过滤好的样品以0.5mL/min流速上样，上样完成后，经10mM phosphatebuffer(Na2HPO4/KH2PO4)、0.5M NaCl，pH＝7.0洗杂至基线走平；10mM phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、0.2Mα-D-甲基葡萄糖苷、pH＝7.0洗脱。洗脱样品透析至5mM phosphatebuffer(Na2HPO4/KH2PO4)、pH＝7.5中。
透析完全后的样品，4℃低温12000×g离心10min，上清经过0.45μM膜过滤，等待上样。用平衡液5mM phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)，pH＝7.5平衡1mL CaptoTM MMCImpRes层析柱20mL；过滤好的样品以0.5mL/min流速上样，上样完成后，用平衡液5mMphosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、pH＝7.5洗至基线走平；5mM phosphate buffer(Na2HPO4/KH2PO4)、1M NaCl、pH＝7.5洗脱。
将洗脱样品透析至20mM phosphate buffer(Na2HPO4/NaH2PO4)、0.15M NaCl、pH＝7.4缓冲液中；透析后的样品用BCA Protein Quantification Kit测定蛋白浓度为1.1mg/mL共13.5mg，加入1％ NaN3置于-20℃保存。
2、动物免疫
选取5只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠进行免疫，抗原是提纯后的NAG蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，200μL每只每次，采取背部多点，腹沟及腋下免疫。免疫步骤：初次免疫，抗原50μg/只，加弗氏完全佐剂进行皮下、背部多点注射；间隔两周后进行第二次免疫，剂量途径同第一次，加弗氏不完全佐剂；再15天后进行第三次免疫，剂量同上，加弗氏不完全佐剂，腹腔注射；最后一次免疫与上一次免疫时间间隔一月，NAG抗原50μg/只进行肌肉强化免疫(不含佐剂)，3天后采取尾血，ELISA检测血清抗体效价。
3、B细胞的构建
(1)骨髓瘤细胞株的培养及制备
本发明采用的是SP/20骨髓瘤细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间为10-12小时。融合时选择对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应做适应性培养，使细胞生长到最佳状态(即对数生长期)。
融合当天，用弯头滴管将骨髓瘤细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管或融合管内，用离心机进行1000r/min离心5-10min，弃去上清液，沉淀加入30mL培养基，离心洗涤一次，离心5-10min，弃上清，沉淀用20mL培养基混匀备用。
(2)脾细胞的准备
取已经完成动物免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并用离心机进行分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。
通过颈脱位的方法致死小鼠，将小鼠浸泡于75％酒精中5min，在超净台中用无菌取脾，取出脾脏置于已盛有10mL培养基的平皿中，轻轻洗涤，并剥去周围结缔组织，用无菌注射器带液刺穿脾脏至脾脏发白，收集平皿里的脾细胞于50mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，加10mL培养基，吸取少量10稀释计数。
(3)细胞融合
融合前3天将阳性小鼠强化免疫，小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0按10:1混合，PEG融合，后置于HAT选择培养基中培养。10天后，ELISA法筛选杂交瘤细胞上清，筛选出的阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆，经过5次筛选，最终确定6株细胞为阳性细胞。
(4)杂交瘤细胞的筛选
ELISA法：NAG抗原以10μg/mL，50μL/孔包被至96孔板，37度吸附1h，弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗涤3次，拍干，每孔加100μL封闭液37℃封闭1h，洗涤2次，拍干。每孔加100μL待检6株杂交瘤细胞培养上清液，同时设立阳性、阴性对照和空白对照标准，37℃孵育0.5h，洗涤4次，拍干。取辣根酶标记的羊抗鼠IgG 1:10000，100μL每孔加入酶标板，37℃孵育30min，洗涤4次，拍干。
最后加入TMB底物显色液100μL/孔，显色15min后用2mol/L稀盐酸50μL/孔终止反应。如图1所示，以450nm、630nm双波长测定各孔OD值，空白孔值0.02以下，阴性孔值0.1以下，阴阳区分明显，可以判低出抗NAG的杂交瘤细胞分泌出能特异性识别NAG蛋白的抗体。用同样的方法测小鼠眼球血效价，达1:100000，可用于细胞融合
4、编码鼠单克隆抗体基因的克隆
培养后的杂交瘤细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA，利用总RNA提取试剂盒反转录成cDNA(65℃反转录5min)。采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列：
NAG抗体Ⅰ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.1-3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为YAS；
NAG抗体Ⅰ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.11-14所示；轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.15-18所示；
NAG抗体Ⅱ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.6-8所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9-10所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为WAS。
NAG抗体Ⅱ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.19-22所示；轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23-26所示。
NAG抗体Ⅰ的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.28所示；NAG抗体Ⅱ的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，轻链的氨基酸序列如SEQID NO.30所示。
5、单克隆抗体的生产和纯化
将步骤3鼠单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在pCDN3.4表达载体上，将质粒转染293F细胞；转染72-96h获得培养上清中含有重组的识别人proAMH蛋白的兔单克隆抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出多株重组的识别人proAMH蛋白的兔单克隆抗体，依次命名为NAG抗体Ⅰ和NAG抗体Ⅱ，抗体鉴定后分装，于-20℃低温保存备用。
6、单克隆抗体特性鉴定
抗体浓度的测定：用紫外分光光度法测定单克隆抗体在280nm和260nm的吸光度值A280和A260。结果蛋白质含量为NAG抗体Ⅰ(10mg/mL)和NAG抗体Ⅱ(8mg/mL)。蛋白质含量按照下列公式计算：
蛋白质含量(mg/mL)＝(A280×稀释倍数)/1.35。
抗体分子质量鉴定：采用SDS-PAGE进行测定单克隆抗体，如图2所示，显示单克隆抗体的重链为约46KD，轻链约为25KD。
ELISA效价的测定：采用间接ELISA测定纯化后的腹水单克隆抗体，如图3所示，结果显示纯化后的效价都为1:100000。
实施例2：利用NAG抗体Ⅰ和NAG抗体Ⅱ，制备胶体金试纸条
1、制备胶体金快试纸条
胶体金试纸的结构为：(1)底板；(2)样品垫；(3)结合垫，吸附有含有胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ；(4)反应垫(硝酸纤维素膜)，检测线T线上包被有NAG抗体Ⅱ或Ⅰ；(5)吸水垫。胶体金垫。
胶体金试纸的具体制备方法是：
S1、将3-15μm孔径，宽度2.5cm，长度30.5cm的硝酸纤维素膜作为反应垫；
用质量分数0.9％的氯化钠溶液分别配制用于包被所述反应垫的T线的NAG抗体Ⅰ的工作液(浓度为1.8mg/mL)，以及包被所述反应垫的C线的羊抗鼠IgG多克隆抗体工作液(浓度为1.0mg/mL)；将NAG抗体Ⅰ的工作液、多克隆抗体工作液分别包被到反应垫的T线和C线上，包被好NAG抗体的反应垫在温度18-28℃，湿度≤30％的条件下干燥4-6h，备用；
向配液罐中加入试剂生产量的纯化水，用分析天平称量蔗糖、酪蛋白钠盐、聚乙烯比咯烷酮、柠檬酸三钠和Proclin300，直接加入到配液罐中搅拌直至完全溶解并充分混匀，备用。胶体金复溶液中含有5％(w/v)的蔗糖、1％(w/v)的酪蛋白钠盐、0.5％(w/v)的柠檬酸三钠、0.5％(w/v)聚乙烯比咯烷酮和0.05％(v/v)的ProClin300，制备成胶体金复溶液；
用量筒量取需要标记量的胶体金，按0.55％(v/v)加入0.2M的碳酸钾溶液，磁力搅拌器上搅拌混匀5min后，按3.5μg/mL加入NAG抗体Ⅱ，继续搅拌30min，再加入0.05％(w/v)的聚乙二醇，搅拌30min后离心，收集沉淀；将沉淀用所述胶体金复溶液按反应总体积的30％复溶并混合均匀，得到胶体金标记的NAG抗体Ⅱ，并将其均匀铺到所述结合垫上，干燥密封备用；
S2、将上述准备好的胶体金标记的NAG抗体Ⅱ按照50μL/cm2均匀的铺到准备好的规格为0.5cm×30cm的胶体金结合垫上，在温度18-28℃，湿度≤30％的条件下干燥4-6h，将干燥好的胶体金结合垫放入到装有干燥剂的铝箔袋中密封保存，并做好标记，备用；
将处理好的样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫依次按照胶体金的常规组装和粘贴方法粘贴在底板上，使结合垫压住反应垫约2mm，使吸水垫压住反应垫约2mm，使样品垫压住结合垫约2mm，裁剪成条状得到胶体金试纸条，如图1所示。
实施例3：检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸卡的制备
本实施例提供的检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸卡，包括实施例1中的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶胶体金试纸，还包括卡壳(含有上盖和下盖)；卡壳内部有定位槽，定位槽上安装了胶体金试纸条；卡壳的上盖上设置有视窗和加样孔；加样孔对应于N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶胶体金试纸的样品垫；视窗对应于胶体金试纸的反应垫。
实施例4：利用胶体金试纸卡定性检测尿液中的NAG蛋白
将样品、试纸卡均在室温下平衡；除去包装，用滴管吸取样品，在试纸卡的加样孔内加入3滴；10min内观察试纸条的检测线和质控线是否显色。
在层析作用下，样本中的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶率先与胶体金垫上胶体金标记的NAG单克隆抗体Ⅰ结合形成反应复合物，反应复合物沿着反应垫(硝酸纤维素膜)前移，被反应垫上的T线固定的NAG抗体Ⅱ捕获并呈现色带，样本中的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶越多，检测线(T)上复合物积聚越多，色带颜色越深。
如果样本中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶为阴性则不发生结合，即不显色。无论样本中有无N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶，质控线(C)都应显示呈现色带，如无则检测无效。
2、检测结果解释(如图2所示)
阳性：检测线(T)和质控线(C)位置均出现清晰的色带，表示样本中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶活性偏高，提示患者有肾小管损伤或糖尿病早期的肾损伤。
阴性：仅质控线(C)位置出现清晰的色带，表示样本中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶活性正常。
无效：质控线(C)位置无色带，不论检测线(T)位置是否出现色带，试验均无效。
实施例5：检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸灵敏度分析
取N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶胶体金试纸和样品在室温平衡30min后用滴管垂直加入3滴到试纸上样垫中间，每份样品测试5条，10min观察结果；样品L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8组对应的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的活性分别为0、2U/L、5U/L、10U/L、20U/L、50U/L、100U/L、200U/L。
结果图3所示，结果显示样品中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶活性≥10U/L时，试纸条通过目测能判为阳性，且检出率为100％(5/5)。结果表明本发明提供的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶胶体金试纸条应用方便且灵敏度高，重复性好。
实施例6：检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸的阴性符合率判定
取胶体金试纸条和健康人群尿液50例，在室温平衡30min后用滴管垂直加入3滴到试纸上样垫中间，10min观察结果，如图4所示。结果显示50例健康人尿液测试结果均为阴性，阴性符合率为100％(50/50)。结果表明本发明提供的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶胶体金试纸条应用方便且特异性好。
实施例7：检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸的阳性符合率判定
取N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶胶体金试纸和阳性尿液20例，在室温平衡30min后用滴管垂直加入3滴到试纸上样垫中间，10min观察结果，如图5所示。结果显示16例阳性尿液测试结果均为阳性，阳性符合率100％(16/16)。结果表明本发明提供的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶胶体金试纸条应用方便且临床符合率好。

Claims (8)

1.检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，所述胶体金试纸包括底板，以及设在底板上的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，其特征在于，所述结合垫上吸附有胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或NAG抗体Ⅱ，相应地，所述反应垫的T线上包被有所述NAG抗体Ⅱ或所述NAG抗体Ⅰ；所述反应垫的T线上包被的NAG抗体Ⅱ或Ⅰ的包被浓度为0.5-3mg/mL，包被量为0.8-1.2μL/cm；
所述NAG抗体Ⅰ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.1-3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-5所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为YAS；
所述NAG抗体Ⅱ的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.6-8所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9-10所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列为WAS。
2.根据权利要求1所述的检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述NAG抗体Ⅰ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.11-14所示，轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15-18所示；
所述NAG抗体Ⅱ的重链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.19-22所示，轻链可变区的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.23-26所示。
3.根据权利要求2所述的检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述NAG抗体Ⅰ、NAG抗体Ⅱ的轻链恒定区均为κ链，重链恒定区均为IgG2a型。
4.根据权利要求3所述的检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述NAG抗体Ⅰ的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.28所示；所述NAG抗体Ⅱ的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。
5.根据权利要求1所述的检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述结合垫上的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ，与胶体金是按照2-5μg/mL进行标记，胶体金标记的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的使用量为50μL/cm2。
6.根据权利要求1所述的检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述反应垫的C线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体，且包被浓度为0.5-3mg/mL，包被量为0.8-1.2μL/cm。
7.根据权利要求1所述的检测N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的胶体金试纸，其特征在于，所述反应垫为孔径3-15μm的硝酸纤维素膜。
8.权利要求1-7任一项所述的胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、用氯化钠溶液分别配制用于包被所述反应垫的T线的NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的工作液，以及包被所述反应垫的C线的多克隆抗体工作液；将NAG抗体Ⅰ或Ⅱ的工作液、多克隆抗体工作液分别包被到反应垫的T线和C线上，干燥备用；
制备胶体金复溶液，将胶体金和碳酸钾溶液混合均匀，然后相应地加入NAG抗体Ⅱ或Ⅰ，继续搅拌，再加入聚乙二醇，搅拌、离心，收集沉淀；将沉淀用所述胶体金复溶液复溶混合均匀，得到胶体金标记的NAG抗体Ⅱ或Ⅰ，并将其均匀铺到所述结合垫上，干燥密封备用；
S2、将处理好的样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫依次粘贴在底板上，裁剪得到胶体金试纸成品。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117069849B (zh) * 2023-03-21 2024-02-23 武汉奥科博泰生物科技有限公司 识别nag的单克隆抗体及其应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0666805A (ja) * 1992-06-19 1994-03-11 Shionogi & Co Ltd β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼのサンドイッチ免疫測定法、および該測定法に用いるモノクロ−ナル抗体
US5358850A (en) * 1992-06-19 1994-10-25 Shionogi Seiyaku Kabushiki Kaisha Sandwich immunoassay of β-n-acetylglucosaminidase and monoclonal antibody used therein
CN102631409A (zh) * 2011-11-17 2012-08-15 宁波海逸生物科技有限公司 一种增强免疫力、缓解体力疲劳、抗肿瘤功能的保健药物配方
WO2013019817A1 (en) * 2011-08-03 2013-02-07 Quidel Corporation N-acetyl-d-glucosamine for enhanced specificity of strep a immunoassay
CN104168918A (zh) * 2012-03-19 2014-11-26 德国癌症研究中心 含有t-细胞表位的b细胞受体复合体结合蛋白质
CN107074960A (zh) * 2014-08-22 2017-08-18 王慧茹 基于糖类的生物标记物和治疗剂
CN110161239A (zh) * 2019-05-08 2019-08-23 扬州大学 一种基于EFTu的双抗体夹心胶体金试纸、葡萄球菌检测方法及应用
CN110678197A (zh) * 2017-03-15 2020-01-10 牛津生物医学（英国）有限公司 方法
CN113164626A (zh) * 2019-01-14 2021-07-23 南京传奇生物科技有限公司 嵌合受体多肽及其用途
CN114057870A (zh) * 2021-11-23 2022-02-18 武汉奥科博泰生物科技有限公司 用于新型冠状病毒Delta突变株检测的标记抗体及其应用
CN117069849A (zh) * 2023-03-21 2023-11-17 武汉奥科博泰生物科技有限公司 识别nag的单克隆抗体及其应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0666805A (ja) * 1992-06-19 1994-03-11 Shionogi & Co Ltd β−Ｎ−アセチルグルコサミニダ−ゼのサンドイッチ免疫測定法、および該測定法に用いるモノクロ−ナル抗体
US5358850A (en) * 1992-06-19 1994-10-25 Shionogi Seiyaku Kabushiki Kaisha Sandwich immunoassay of β-n-acetylglucosaminidase and monoclonal antibody used therein
WO2013019817A1 (en) * 2011-08-03 2013-02-07 Quidel Corporation N-acetyl-d-glucosamine for enhanced specificity of strep a immunoassay
CN103975241A (zh) * 2011-08-03 2014-08-06 奎德尔公司 用于提高a型链球菌免疫测定法的特异性的n-乙酰基-d-葡糖胺
CN102631409A (zh) * 2011-11-17 2012-08-15 宁波海逸生物科技有限公司 一种增强免疫力、缓解体力疲劳、抗肿瘤功能的保健药物配方
CN104168918A (zh) * 2012-03-19 2014-11-26 德国癌症研究中心 含有t-细胞表位的b细胞受体复合体结合蛋白质
CN107074960A (zh) * 2014-08-22 2017-08-18 王慧茹 基于糖类的生物标记物和治疗剂
CN110678197A (zh) * 2017-03-15 2020-01-10 牛津生物医学（英国）有限公司 方法
CN113164626A (zh) * 2019-01-14 2021-07-23 南京传奇生物科技有限公司 嵌合受体多肽及其用途
CN110161239A (zh) * 2019-05-08 2019-08-23 扬州大学 一种基于EFTu的双抗体夹心胶体金试纸、葡萄球菌检测方法及应用
CN114057870A (zh) * 2021-11-23 2022-02-18 武汉奥科博泰生物科技有限公司 用于新型冠状病毒Delta突变株检测的标记抗体及其应用
CN117069849A (zh) * 2023-03-21 2023-11-17 武汉奥科博泰生物科技有限公司 识别nag的单克隆抗体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
尿NAG及其同工酶检测方法进展;黄君富, 魏明竟;国际检验医学杂志(第06期) *

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