CN107074960A - 基于糖类的生物标记物和治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够与含有由癌细胞或炎症细胞表达的N‑乙酰基葡糖胺或N‑乙酰基‑半乳糖胺的表位特异性结合的抗体。还提供包含这些抗体的组合物，以及多核苷酸、载体、宿主细胞和可用于其生产的方法。本发明还提供通过对个体给药特异性结合含有N‑乙酰基葡糖胺或N‑乙酰基‑半乳糖胺的表位的抗体，并选择性联合给药另外的抗癌剂，治疗或预防个体中癌症的方法和试剂盒。本发明还提供用于通过对个体给药特异性结合含有N‑乙酰基葡糖胺或N‑乙酰基‑半乳糖胺的表位的抗体来治疗或预防个体中的胃肠道疾病的方法和试剂盒。本发明还提供包括特异性结合含有N‑乙酰基葡糖胺和/或N‑乙酰基‑半乳糖胺的表位的抗体的用于检测个体中的癌细胞的存在的方法和试剂盒。

Description

基于糖类的生物标记物和治疗剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月22日提交的国际专利申请系列号PCT/CN2014/085027的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及与由癌细胞或炎症细胞表达的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺特异性结合的抗体，以及与其相关的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞、生产方法、使用方法和试剂盒。
背景技术
由于多种原因，癌症是现代医学中待治疗的最具挑战性的疾病之一。由于癌症来自于人自身细胞的异常行为，因此很难在患者体内区分癌细胞与正常细胞。通常身体自身的免疫系统难以识别和消除癌细胞。此外，“癌症”是指个体疾病的群集，即癌症的类型和亚型。许多不同的细胞类型可以通过许多不同的机制变成癌症，导致可能出现的癌细胞类型中极多的表型变体。这种多样性对癌症治疗造成很大的问题，因为不同类型的癌细胞诊断可能具有不同的识别特性，或者可能具有不同的治疗弱点或抗性特性。这一问题使得很难提出通过单一治疗方案或试剂找到诊断、治疗和/或预防多种类型的癌症的方式。尽管肿瘤学在过去十年中发展迅速，仍然需要鉴定新的癌细胞特异性的生物标记物，特别是具有多种类型的癌症的特征而不具有正常组织的特征的生物标记物。
细胞表面分子对于癌细胞非常重要。这些分子在细胞之间的相互作用中起关键作用，这对于许多癌细胞行为，包括细胞侵袭、转移、逃避免疫系统和对治疗剂的响应是重要的。已知癌细胞表达与正常细胞不同的许多细胞表面蛋白。然而，许多细胞表面蛋白通过添加糖类(saccharides)(例如N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺)来进行修饰，这一过程被称为蛋白质糖基化。如何通过添加糖类修饰特定的细胞表面蛋白(哪些糖类可以在哪些细胞表面蛋白上被发现)，以及在不同类型或阶段的癌变中糖基化模式如何变化是刚开始探索的问题(综述参见Moremen,KW等(2012)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.13(7):448-62)。糖基化的这种多样性提高了通过表面生物标记物识别癌细胞的复杂性。因此，仍然需要用于诊断、治疗和预防癌症的新的生物标记物和治疗剂，特别是用于靶向糖基化癌症特异性模式的生物标记物和试剂。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请文件、专利公开文件和UniProtKB/Swiss-Prot登录号通过引用整体并入本文，如同具体和单独指明每个单独的参考文献通过引用并入。
发明内容
为了满足对诊断、治疗和预防多种类型的癌症的新的生物标记物和治疗剂的需求，本文公开了与癌细胞或炎症细胞表达的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺特异性结合的单克隆抗体，以及与其相关的组合物、多核苷酸、载体、宿主细胞、生产方法和试剂盒。进一步公开了通过给药抗体来治疗或预防个体中癌症的方法，所述抗体与在癌细胞的细胞表面上表达的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺特异性结合，以及使用与N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺特异性结合的抗体诊断癌症的方法。这些组合物和方法部分基于以下预料不到的发现，代表许多不同类型癌症的人癌细胞比正常人组织表达更高水平的N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺。此外，本发明证明了预料不到的结果，即与癌细胞的细胞表面上表达的N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺特异性结合的抗体在降低几种不同类型的癌症的生长速率(在体外和体内两种情况下)中是高效和有效的。另外，本申请描述了预料不到的发现，即与N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺特异性结合的抗体可用于对胃肠道疾病例如病毒感染、炎症性肠病和痔疮的有效预防和治疗。
一方面，本文提供了能够与包含N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体，其中所述表位由癌细胞或炎症细胞表达。还提供了包含这些抗体的组合物，以及与其相关的多核苷酸、载体、宿主细胞和生产中有用的方法。进一步提供了用于治疗或预防个体中癌症的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒通过对个体给药能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体，所述抗体可选择性与另外的抗癌剂组合。进一步提供了通过对个体给药抗体用于治疗或预防个体中的胃肠道疾病的方法和试剂盒，所述抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。更进一步提供了用于检测个体中癌细胞的存在的方法和试剂盒，所述方法通过从个体获得生物样品，使生物样品与抗体接触，所述抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合，并检测结合到生物样品的抗体的量，其中所述抗体结合指示个体中癌细胞的存在。
在某些方面，本发明提供了分离的单克隆抗体，所述抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合，其中所述表位由癌细胞或炎症细胞表达。在某些实施方式中，抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺的表位和包含N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，抗体是抗体片段。在某些实施方式中，抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双抗体(diabody)、scFv多聚体或双特异性抗体(bispecific antibody)片段。在某些实施方式中，抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，抗体是人抗体。在某些实施方式中，抗体是嵌合抗体。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，表位在癌细胞的细胞表面上表达。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，表位在癌细胞内表达。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，癌细胞选自胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和宫颈腺癌细胞。在某些实施方式中，肺癌细胞是小细胞肺癌细胞、肺鳞状细胞癌细胞或肺腺癌细胞。在某些实施方式中，抗体与表位的结合抑制癌细胞的生长。在某些实施方式中，炎症细胞是结肠炎、炎症性肠病或胃肠炎的肠炎症细胞，并且表位在炎症细胞的细胞表面上表达。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的三个HVR。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:24所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:25所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:26所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:28所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:29所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的三个HVR。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:30所示的HVR-H2序列和SEQ IDNO:31所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ IDNO:14所示的HVR-L2所示序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQID NO:6所示的氨基酸序列的三个HVR。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:32所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:33所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:34所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:35所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:36所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:37所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:12所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:13所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ IDNO:14所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在其它方面，本发明提供了包含能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体和药学上可接受的载体的组合物。在其它方面，本发明提供了包含根据任何上述实施方式的抗体和药学上可接受的载体的组合物。在其它方面，本发明提供了包含编码抗体的核酸序列的分离的多核苷酸，所述抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。在其它方面，本发明提供了包含编码根据任何上述实施方式的抗体的核酸序列的分离的多核苷酸。在另外的方面，本发明提供了包含编码抗体的核酸序列的载体，所述抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。在另外的方面，本发明提供了包含编码根据任何上述实施方式的抗体的核酸序列的载体。在又一些方面，本发明提供了包含载体的分离的宿主细胞，所述载体包含编码能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的核酸序列。在又一些方面，本发明提供了包含载体的分离的宿主细胞，所述载体包含编码根据任何上述实施方式的抗体的核酸序列。在又一些方面，本发明提供了制备抗体的方法，包括培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的核酸序列，所述宿主细胞产生由该核酸编码的抗体，并从细胞培养物中回收该抗体。在又一些方面，本发明提供了产生抗体的方法，包括培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码根据任何上述实施方式的抗体的核酸序列，所述宿主细胞产生由该核酸编码的抗体，并从细胞培养物中回收该抗体。在又一些方面，本发明提供了通过培养包含载体的宿主细胞制备的抗体，所述载体包含编码能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的核酸序列，所述宿主细胞产生由该核酸编码的抗体，并从细胞培养物中回收该抗体。在又一些方面，本发明提供了通过培养包含载体的宿主细胞产生的抗体，所述载体包含编码根据任何上述实施方式的抗体的核酸序列，所述宿主细胞产生由所述核酸编码的抗体，并从细胞培养物中回收该抗体。
在其它方面，本发明提供了用于治疗或预防个体中癌症的方法，包括对个体给药有效量的包含抗体的组合物，所述抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。在其它方面，本发明提供了用于治疗或预防个体中癌症的方法，包括对个体给药有效量的包含根据任何上述实施方式的抗体的组合物。在某些实施方式中，所述癌症选自脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌。在某些实施方式中，个体是人。在某些实施方式中，个体是非人动物。
在其它方面，本发明提供了用于治疗或预防个体中癌症的方法，包括对个体给药一定量的能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体，和一定量的另外的抗癌剂，其中所述抗体和抗癌剂联合提供个体中癌症的有效治疗或预防。在其它方面，本发明提供了用于治疗或预防个体中癌症的方法，包括对个体给药一定量的根据任何上述实施方式的抗体和一定量的另外的抗癌剂，其中所述抗体和抗癌剂联合提供对个体中癌症的有效治疗或预防。在某些实施方式中，所治疗的癌症选自脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌或胃部癌症(stomach or gastric cancer)、食管癌和纤维肉瘤。在某些实施方式中，个体是人。在某些实施方式中，个体是非人动物。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，抗癌剂是化疗剂。
在其它方面，本发明提供了用于检测个体中的癌细胞的方法，包括使来自个体的生物样品与能够特异性结合包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体接触，并检测抗体与生物样品的结合，其中所述抗体与样品的结合可以指示个体中的癌细胞的存在。在其它方面，本发明提供了用于检测个体中的癌细胞的方法，包括使来自个体的生物样品与根据任何上述实施方式的抗体接触，并检测抗体与生物样品的结合，其中所述抗体与样品的结合可以指示个体中的癌细胞的存在。在某些实施方式中，所述方法还包括将检测到的抗体结合的量与结合到对照样品的抗体的量进行比较。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，抗体与生物样品的结合通过选自ELISA测定、流式细胞术测定、免疫组织化学测定、免疫荧光测定、血循环肿瘤细胞测定和免疫胶体金测定的方法检测。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，生物样品选自血液、血清、尿液、粪便、乳汁、精液、唾液、胸液(chest fluid)、腹腔液、脑脊液、痰液和任何其它体液或分泌物。在某些实施方式中，个体是人。在某些实施方式中，个体是非人动物。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:24所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:25所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:26所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:28所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:29所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:30所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:31所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:14所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:12所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:13所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或包含具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:14所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。在某些实施方式中，抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的轻链可变区。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，所述癌细胞选自肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌或结肠直肠癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、宫颈癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞和淋巴瘤细胞。
在其它方面，本发明提供了治疗或预防个体中的胃肠道疾病的方法，包括对个体给药有效量的能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体。在其它方面，本发明提供了治疗或预防个体中的胃肠道疾病的方法，包括对个体给药有效量的根据任何上述实施方式的抗体。在某些实施方式中，个体患有炎症性肠病。在某些实施方式中，个体患有克罗恩病。在某些实施方式中，个体患有溃疡性结肠炎。在某些实施方式中，个体患有急性感染性胃肠炎。在某些实施方式中，个体患有痔疮。在某些实施方式中，个体患有由病毒感染引起的胃肠道疾病。在某些实施方式中，病毒感染是轮状病毒感染或猪流行性腹泻病毒感染。在某些实施方式中，个体是人。在某些实施方式中，个体是非人动物。在可以与任何前述实施方式组合的某些实施方式中，抗体通过静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内(intraorbitally)、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内给药。
在其它方面，本发明提供了包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体。在其它方面，本发明提供了包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物包含根据任何上述实施方式的抗体。在某些方面，所述试剂盒还包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗或预防癌症的说明书。在某些方面，所述试剂盒还包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗或预防胃肠道疾病的说明书。在某些方面，所述试剂盒还包括用于检测个体中的癌细胞的存在的说明书。在某些方面，所述试剂盒还包括用于测定来自患有癌症的个体的生物样品中的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的水平的说明书。
在其它方面，本发明提供了试剂盒，其包含具有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的组合物和使用所述组合物检测患有癌症或炎症的个体中自身抗体的存在的说明书或其它试剂。
在其它方面，本发明提供了包含植物凝集素的试剂盒，其中所述植物凝集素特异性结合N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺，以及使用所述组合物测定来自患有癌症的个体的生物样品中的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺水平的说明书或其它试剂。在一些实施方式中，植物凝集素是小麦胚芽凝集素(WGA)或大豆凝集素(SBA)。
应当理解的是，本文所述的各种实施方式的一种、一些或所有特性可以组合以形成本发明的其它实施方式。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的这些和其它实施方式通过以下详细描述进一步描述。
附图说明
图1显示了使用特异性识别N-乙酰基-葡糖胺的小麦胚芽凝集素的健康人组织(A)、人癌旁组织(B)和人癌症组织(C)的免疫组织化学染色。每组样品使用的组织如标记所示。人皮肤恶性黑素瘤是癌变组织(cancerous tissue)(“皮肤-B”)作为阳性对照。组织板由美国FDA推荐。
图2显示了使用小麦胚芽凝集素(WGA；A)或大豆凝集素(SBA；B)对Hep-G2和HEK-293细胞系的荧光染色。
图3显示了筛选单克隆抗体的ELISA测定的结果，所述单克隆抗体用于结合N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺和来自各种癌细胞系的裂解物，如所示。
图4显示了用MTT法测定细胞生长的分析，表示用单克隆抗体2F7H4进行处理而抑制各种人癌细胞系的生长速率的结果。每个测定使用的抗体和细胞系的剂量如标记所示。值指的是用抗体处理观察到的生长抑制的百分比。
图5显示了用MTT法测定细胞生长的分析，表示用单克隆抗体1C5C9进行处理而抑制各种人癌细胞系的生长速率的结果。每个测定使用的抗体和细胞系的剂量如标记所示。数值指的是经抗体处理后观察到的生长抑制的百分比。
图6显示了用MTT法测定细胞生长的分析，表示用单克隆抗体3C4F12进行处理而抑制各种人癌细胞系的生长速率的结果。每个测定使用的抗体和细胞系的剂量如标记所示。数值指的是经抗体处理后观察到的生长抑制的百分比。
图7显示了各种单克隆抗体(浓度为1.0μg/mL)对MCF-7、SKOV-3和Hela人癌细胞系的生长抑制的影响(图如A中所示；表如B中所示)。数值指的是经抗体处理后观察到的生长抑制的百分比，负值表示对抗体处理的反应为提高的生长速率。
图8显示了各种单克隆抗体(浓度为2.0μg/mL)对SW11/b、ECAP-1090、HUTU-80、HT-1080和ACC-2人癌细胞系的生长抑制的影响(图如A中所示；表如B中所示)。数值指的是经抗体处理后观察到的生长抑制的百分比。
图9显示了使用体内肿瘤异种移植模型的抗体3C4F12对肿瘤大小的影响。(A)随时间绘制的经盐水、小麦胚凝集素(WGA)或3C4F12处理的动物体内肿瘤异种移植物的大小曲线。(B)用盐水、小麦胚芽凝集素(WGA)或3C4F12处理的肿瘤异种移植物的影像图。
图10表示了一种基于ELISA分析法测定的结果；该法使用单克隆抗体1C5C9检测来自患有各种类型癌症的患者血清样品中癌症相关抗原。在表3中描述了样品分级的系统。
图11表示了一种基于流式细胞分析法测定的结果；该法使用单克隆抗体2F7H4检测来自患有各种类型癌症的患者血液样品中的循环癌细胞。
图12表示了一种基于流式细胞分析法测定的结果；该法使用单克隆抗体1C5C9检测来自患有各种类型癌症的患者血液样品中的循环癌细胞。
图13表示了一种基于流式细胞分析法测定的结果；该法使用单克隆抗体1B3E12检测来自患有各种类型癌症的患者的血液样品中的循环癌细胞。
图14显示了一种免疫荧光染色的结果；该法使用单克隆抗体1C5C9对来自患有由轮状病毒感染诱导的炎症的小鼠的肠组织切片(B)及来自健康小鼠的肠组织切片(A)进行比较性免疫荧光染色。
图15比较了用MAb-1C5C9或恩诺沙星治疗的暴露于猪流行性腹泻病毒(PEDV)的仔猪的死亡率(表示为百分比)，并与未治疗的对照组相比较。图中显示了与MAb-1C5C9治疗相比较，各种治疗观察到的死亡率的统计学显著性。
图16通过ELISA测定显示了人源化1C5C9抗体与N-乙酰基葡糖胺(NAG)的结合。测试的抗体包括：嵌合1C5C9(“XHC+XLC”)、人源化1C5-VK1(“VH5+VK1”)、人源化1C5-VK2(“VH5+VK2”)、人源化1C5-VK3、人源化1C5-VK4(“VH5+VK4”)和人源化1C5-VK5(“VH5+VK5”)。
图17显示了人源化1C5-VK2抗体对TNBS诱导的小鼠IBD模型的肠形态的作用效果，该效果通过在第7天进行的大体解剖评分判断。治疗组包括G1：未治疗(n＝4)。G2：5μg 1C5-VK2/只动物，腹膜内注射(IP)(n＝6)；G3：5μg1C5-VK2/只动物，口服(PO)(n＝6)；和G4：2μg1C5-VK2/只动物，腹膜内注射(IP)(n＝6)。*表示t检验(在治疗组G2和未治疗对照组G1之间，以及在治疗组G2和治疗G4组之间比较)中的p<0.05。
图18A显示了在TNBS诱导的IBD模型的第7天得到的大体影像图。在IBD造模后48小时进行人源化1C5-VK2抗体的给药治疗。治疗组同上文图17中的描述。治疗前的IBD造模后48小时分离的结肠样品的状况如图所示。
图18B显示了在IBD造模的第7天得到的大体影像图。在IBD造模后48小时进行人源化1C5-VK1抗体的给药治疗。治疗组包括G1：未治疗；和G5：5μg1C5-VK1/只动物，腹膜内注射(IP)。治疗前的IBD造模后48小时分离的结肠样品的状况如图所示。
图19A显示了在IBD模型的第7天得到的组织学影像图。在IBD造模后48小时进行人源化1C5-VK2抗体的给药治疗。治疗组如上文图17中的描述。箭头表示肠上皮再生。治疗前的IBD造模后48小时分离的结肠样品的状况如图所示。
图19B显示了在IBD模型的第7天得到的组织学影像图。在IBD造模后48小时给药人源化1C5-VK1治疗。所有样品来自治疗G5组：5μg 1C5-VK1/只动物，腹膜内注射(IP)。箭头表示肠上皮再生。
图20显示了与对照小鼠相比较，用人源化1C5-VK2抗体治疗的小鼠结肠切片的免疫组织化学(IHC)染色结果。从一周龄的IBD模型小鼠获得组织，并用抗人IgG-HRP染色。箭头指示在结肠炎症部位检测出的1C5-VK2抗体。
图21显示了人源化1C5-VK2抗体的小鼠急性毒性测试结果(体重/时间)。治疗组包括G1：1.0mg/kg，静脉内注射(IV)；G2：1.0mg/kg，口服(PO)；G3：5.0mg/kg，静脉内注射(IV)；和G4：5.0mg/kg，腹膜内注射(IP)。所有组的样本大小为6只动物。
图22显示了用ELISA测定的、经静脉内注射人源化1C5-VK2治疗的小鼠血清中抗体的水平。y轴表示检测的抗体的水平(OD450nm)。x轴表示治疗后样品收集的时间(以小时计，除了“2w”表示2周)。治疗组及样本大小如上文图21中所述。
图23显示了用ELISA测定的、口服人源化1C5-VK2治疗的小鼠血清中抗体的水平。x轴表示治疗后样品收集的时间(以小时计)。治疗组和样本大小如上文图21中的描述。
图24显示了TNBS诱导的炎症性肠病(IBD)模型中，人源化1C5-VK2抗体对大鼠体重随时间的影响。治疗组包括G1：未治疗(n＝5)；G2：125μg/kg的人IgG，腹膜内注射(IP)(n＝5)；G4：125μg/kg的1C5-VK2，腹膜内注射(IP)(n＝5)；G5：122μg/kg的1C5-VK2，皮下注射(SC)(n＝6)；和G6：250μg/kg的1C5-VK2，口服管饲(PO)(n＝6)。
图25显示了在IBD模型的第8天得到的大体影像图。在IBD造模后48小时进行人源化1C5-VK2抗体的给药治疗。治疗组如上文图24中的描述。
图26显示了在大鼠IBD模型的第8天大鼠结肠大体评价的评分。在诱导IBD模型后48小时进行人源化1C5-VK2抗体的给药治疗。治疗组如上文图24中的描述。*表示在指定的治疗组与未治疗的对照组(G1)的t检验比较中p<0.05。
图27显示了IBD模型的第8天的大鼠结肠重量。在IBD造模后48小时进行人源化1C5-VK2抗体的给药治疗。治疗组如上文图24中的描述。*表示在指定的治疗组与未治疗的对照组(G1)的t检验比较中p<0.05。
具体实施方式
本申请的发明人证明了N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺更倾向在许多人癌症和癌细胞系中表达，但在大多数正常人组织中仅很少的表达或不表达。此外，本发明人制备了识别N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体。本文所述的结果证明了这些抗体能够结合并抑制各种人癌细胞的生长。本文所述的结果还证明了这些抗体可用于预防或治疗各种胃肠道疾病。此外，本文描述的结果进一步显示了这些抗体可用于检测在各种癌症中差异表达并释放到血液和其它体液或分泌物中的糖类相关的生物标记物。
I.一般技术
本领域技术人员使用常规方法学可以很好地理解和采用本文描述或参考的技术，例如，广泛利用的方法学描述于：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编著，(2003))；Harlow和Lane编著(1988)Antibodies,A Laboratory Manual，and Animal Cell Culture(R.I.Freshney编著(1987))；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Monoclonal Antibodies:APractical Approach(P.Shepherd和C.Dean编著，Oxford University Press，2000)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编著，J.B.LippincottCompany，1993)。
II.定义
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于特定的组合物或生物体系，其当然可以改变。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不意在限制。
如在本说明书和随附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另有明确指示。因此，例如，所提到的“分子”任选地包括两个或以上这样的分子的组合等。
本文使用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文中对“约”值或参数的提及包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方式。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方式包括“包含方面和实施方式”、“由其组成”和“基本上由其组成”。
术语“炎症”是指身体组织对有害刺激(例如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物反应。急性炎症的经典体征包括但不限于疼痛、发热、发红、肿胀和功能丧失。炎症是一般反应，因此它被认为是先天免疫的机制。炎症可以分为急性或慢性。急性炎症是指身体对有害刺激的初始反应，并且通过血浆和白细胞(尤其是粒细胞)从血液到损伤组织中的加速运动来实现。一系列生化事件使炎症反应扩散并成熟，涉及损伤组织内的局部血管系统、免疫系统和各种细胞。长期的炎症，称为慢性炎症，导致存在于炎症部位的细胞类型的进行性变化，并且其特征在于来自炎症过程的组织的同时破坏和愈合。
术语“炎症细胞”是指通常存在于血液中并通过外渗移入发炎组织而有助于炎症的白细胞(例如嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。一些充当吞噬细胞，摄取细菌、病毒和细胞碎片。其它释放损伤致病侵入物的酶颗粒。白细胞还释放产生和维持炎症反应的炎症介质。通常，急性炎症由粒细胞介导，而慢性炎症由单核细胞例如单核白细胞和淋巴细胞介导。
术语“炎症性肠病(IBD)”是指特征在于消化道的全部或局部的慢性炎症的病理状态。IBD主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。两者通常涉及严重的腹泻、疼痛、疲劳和体重减轻。溃疡性结肠炎是在大肠(结肠)和直肠中引起持久性炎症和疮(溃疡)的IBD的形式。克罗恩病是引起消化道炎症的IBD的形式。在克罗恩病中，炎症通常深入到受影响的组织中。炎症可涉及消化道的不同区域，例如大肠、小肠或两者。胶原性结肠炎和淋巴细胞性结肠炎也被认为是炎症性肠病，但通常认为与经典炎症性肠病不同。
术语“癌症”和“癌细胞”是指或描述通常以不受调节的细胞生长为特征的动物中的生理状况。癌症的实例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、肝细胞癌、脑癌(包括恶性少突胶质细胞瘤、成胶质细胞瘤或神经胶质瘤)、胃肠癌(包括但不限于：食管癌、胃部癌症、肠癌、结肠癌和结肠直肠癌)、肾透明细胞癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、喉癌、霍奇金淋巴瘤、甲状腺髓样癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、泌尿道癌、乳腺癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、前列腺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、白血病和相关转移瘤。在一些实施方式中，癌症的类型选自：脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌。在一些实施方式中，癌细胞选自：胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和宫颈腺癌细胞。
术语“免疫球蛋白”(Ig)与本文中的“抗体”可互换使用。本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(例如Fab片段、scFv、微抗体、双抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段)，只要它们显示所需的生物活性即可。
如本文所用，术语“特异性结合”或“对……特异性”是指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，其在包括生物分子的分子的异质群体的存在下确定靶标的存在。例如，与靶标特异性结合(其可以是表位)的抗体是以比其结合到其它靶标更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方式中，与靶标特异性结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在另一个实施方式中，特异性结合可以包括但不需要排他性结合。
抗体的“可变区”或“可变域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变域可以分别称为“VH”和“VL”。这些域通常是抗体的最可变部分(相对于相同类别的其它抗体)并且包含抗原结合位点。
术语“可变的”是指可变域的某些区段在抗体之间的序列中广泛不同的事实。V域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性不是均匀分布在可变域的整个跨度上。相反，它集中在轻链和重链可变域(每个抗体或其抗原结合片段共有6个HVR)中称为“高变区(HVR)”的三个区段中。如本文所用，“高变区(HVR)”含有赋予抗体特异性抗原结合的高度可变序列。可变域的更高度保守的部分称为骨架区(FR)。每条链中的HVR通过FR区紧密靠近在一起，并且与来自其它链的HVR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Immunological Interest，第五版，NationalInstitute of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
许多HVR描述被使用并且包括在本文中。Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性并且是最常用的(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。而Chothia指代结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR和Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于可获得的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基记录如下。
HVR可以包含如下的“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，根据Kabat等在上文对可变域残基进行编号。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即包含相同群体(除了可以少量存在的可能的自然存在的突变和/或翻译后的修饰(例如异构化、酰胺化))的单个抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
修饰语“单克隆”表示如从基本上同质的抗体群体获得的抗体特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤法(例如，Kohler和Milstein，Nature，256:495-97(1975)；重组DNA法(参见例如美国专利号4,816,567)；噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人，Nature，352:624-628(1991))；以及用于在动物中产生人型或人样抗体(human or human-likeantibody)的技术，所述人型或人样抗体具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部(参见例如Jakobovits等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Lonberg等，Nature 368:856-859(1994))。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合部分和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；微抗体；双抗体；scFv；scFv多聚体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的双特异性或多特异性抗体。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指通过构建具有短接头(约5-10个残基)的scFv片段(参见前述段落)而制备的小抗体片段，所述短接头在VH和VL结构域之间，以实现V结构域的链间而不是链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双抗体更详细地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 90:6444-48(1993)。
本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及这种抗体的片段，只要它们显示所需的生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA，81:6851-55(1984))，嵌合抗体中，重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。
非人(例如鼠科动物)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施方式中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR的残基被来自具有所需的特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的HVR的残基替代。更多细节参见例如Jones等，Nature 321:522-525(1986)。
“人抗体”具有对应于由人产生的抗体和/或使用本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列。人抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，例如描述于Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1):86-95(1991)中的方法。
“分离的”抗体是从其生产环境的组分(例如，天然或重组地)识别、分离和/或回收的抗体。优选地，分离的多肽不含通常会干扰抗体使用的污染组分，例如酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。
如本文所用，术语“治疗”是指设计用于改变在临床病理学过程期间治疗的个体或细胞的自然过程的临床干预。治疗的期望效果包括降低疾病进展的速率、改善或缓解疾病状态，以及缓解或改进预后。例如，如果减轻或消除与癌症相关的一种或多种症状，则成功地“治疗”了个体。
如本文所用，术语“预防”包括提供关于个体中疾病的发生或复发的预防。个体可能易患某种类型的癌症，易受某种类型的癌症影响，或处于发生某种类型的癌症的风险中，但尚未被诊断患有该疾病。
“有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效实现所需治疗或预防结果的至少量。有效量可以在一次或多次给药中提供。
“治疗有效量”是至少实现特定病症(例如癌症)可测量的改善所需的最小浓度。本文的治疗有效量可根据例如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及单克隆抗体在个体中引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是单克隆抗体的治疗有益效果超过任何毒性或有害作用时的量。“预防有效量”是指在该剂量和必需的时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但不是必需的，由于在疾病的早期阶段之前或在疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，预防有效量可以小于治疗有效量。
如本文所用，与另外的化合物或组合物“联合”给药包括同时给药和/或在不同时间给药。联合给药还包括作为联合制剂给药或作为单独组合物给药，包括以不同的给药频率或间隔给药，使用相同的给药途径或不同的给药途径。
用于治疗或预防目的的“个体”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园动物、体育运动动物或宠物动物(例如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方式中，个体是人。在一些实施方式中，个体是非人动物。
如本文所用的“载体”包括对以所采用的剂量和浓度暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。通常生理学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“药学上可接受的”缓冲剂和盐包括衍生自上述酸和碱两者的酸和碱加成盐的缓冲剂和盐。特定的缓冲液和/或盐包括组氨酸、琥珀酸盐和乙酸盐。
本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。
编码本文的抗体的“分离的”多核苷酸是从至少一种污染性核酸分子识别和分离的核酸分子，所述核酸分子通常在其产生环境中与污染性核酸分子结合。编码本文的多肽和抗体的分离的核酸分子是以其在自然界中发现的形式或设置以外的形式存在。优选地，分离的核酸不与生产环境相关的所有组分结合。
本文所用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另外的核酸的核酸分子。载体的类型包括质粒(即，其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA)和病毒载体。某些载体能够在引入它们的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中自主复制。其它载体可以整合到宿主细胞的基因组中并与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
III.糖类
本发明的某些方面涉及含有糖类的表位。如本文所用，“糖类”可以指单糖、寡糖或多糖。单糖包括但不限于果糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、半乳糖、乳糖、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基葡糖胺和唾液酸。寡糖是包含通过组分糖的糖苷键连接的多个糖单体的糖类聚合物。
糖蛋白或蛋白糖(proteosaccharide)是指与糖连接的蛋白质，并且通常可以包含例如与蛋白质中的氨基酸侧链或脂质部分相容的单糖的O-或N-糖苷键。如本文所用，术语“聚糖”和“糖基部分”可互换使用，指的是单独的糖类或作为糖蛋白的糖类组分的糖。两种类型的糖基化在本领域中是已知的：与天冬酰胺侧链的酰胺氮N-连接的糖基化和与丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧O-连接的糖基化。其它糖包括但不限于O-GlcNAc、GAG链、糖胺基糖和糖鞘脂。O-和N-连接糖类在真核生物中非常常见，也可以在原核生物中发现，但较不常见。
本发明的某些方面涉及N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺。N-乙酰基葡糖胺可以指包括N-连接有葡糖胺部分的任何氨基糖化合物。如本文所用，N-乙酰基葡糖胺可以指单糖本身，或作为较大多糖的组分的单糖。如本文所用，N-乙酰基葡糖胺可以指糖类实体本身，或者作为糖蛋白的聚糖组分或蛋白质被一种或多种基于N-乙酰基葡糖胺的组分糖基化的糖类(例如含有N-乙酰基葡糖胺的单糖或多糖)。
N-乙酰基-半乳糖胺可以指包括与乙酸部分N-连接的葡糖胺的任何化合物。N-乙酰基-半乳糖胺可以指包括N-连接有半乳糖胺部分的任何氨基糖化合物。如本文所用，N-乙酰基-半乳糖胺可以指单糖本身，或作为较大多糖的组分的单糖。如本文所用，N-乙酰基-半乳糖胺可以指糖类实体本身，或作为糖蛋白的聚糖组分或蛋白质被一种或多种N-乙酰基-半乳糖胺部分糖基化的糖类(例如，含有N-乙酰基-半乳糖胺的单糖或多糖)。
虽然已知许多蛋白质被糖基化，但是糖蛋白通常在细胞的外表面(即，细胞外)上发现或被分泌。因此，糖蛋白对于外部试剂(例如，给药至患者的外源化合物)是高度可接近的。例如，特异性识别某些糖蛋白(例如抗体或凝集素)的组分能够在完整生物体中结合到在其细胞表面上表达这些糖蛋白的细胞。特异性识别某些糖蛋白的组分还能够结合分泌的糖或糖蛋白，例如可在某些组织样品(包括但不限于血液或血清)中发现游离的糖或糖蛋白。
凝集素在本领域中已知是能够以高特异性识别同源糖部分的糖结合蛋白质。这些高度特异性结合相互作用可以用于例如检测组织中的特定糖(例如，用于检测被特定糖部分糖基化修饰的细胞表面蛋白)。凝集素可以包括例如动物凝集素、植物凝集素和病原体凝集素。在哺乳动物中，已知凝集素在免疫系统中发挥重要作用，例如通过识别排他性地在病原体上发现或在宿主细胞上难见到的碳水化合物。
本发明的某些方面使用植物凝集素来检测特定糖部分的存在或表达。例如，植物凝集素可包括但不限于对果糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺和N-乙酰基-葡糖胺特异的凝集素。
IV.抗体
表位结合
本发明的某些方面涉及能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体。如上所述，这样的抗体将显示可测量的和可再现的相互作用，例如结合到含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位。例如，能够与表位特异性结合的抗体是以比其结合到其它靶标更大亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合该表位的抗体。含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的实例包括含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺聚糖的糖蛋白，例如但不限于在癌细胞的表面上表达的带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺部分的细胞表面糖蛋白。
特异性结合可以包括但不需要排他性结合。虽然是能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体，但是也发现它们结合到不含有这些部分的其它表位，例如具有比含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺的表位更小的结合亲和力。
在一些实施方式中，抗体能够与含有N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。例如，抗体能够与含有N-乙酰基葡糖胺的表位和含有N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体能够与同时含有N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。
在一些实施方式中，抗体与癌细胞的细胞表面上表达的含有N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的结合而抑制癌细胞的生长。如本文所用，抑制细胞生长可以指抑制其增殖速率。不希望受理论束缚，通过结合到细胞表面，抗体可通过多种机制抑制细胞的生长。例如，与细胞表面结合的抗体可能对细胞有毒性，或者以其它方式导致细胞死亡，例如但不限于凋亡或坏死。结合到细胞表面的抗体可以减缓或停止细胞增殖。与细胞表面上的细胞表面糖蛋白结合的抗体可以抑制或增强糖蛋白的功能，例如细胞信号转导功能，并且在这样做时，抗体结合可以抑制细胞的生长。与细胞表面结合的抗体可与外源配体竞争，所述外源配体例如生长因子通过结合到细胞表面加速细胞的生长。这种竞争可以是间接的，即抗体不需要竞争性结合到与外源配体相同的糖蛋白上的表位。与细胞表面结合的抗体还可以吸引免疫系统的一种或多种组分，例如自然杀伤或NK细胞，其抑制抗体结合细胞的生长。不同抗体通过结合细胞表面上的表位抑制细胞生长的机制可以根据细胞环境或特异性抗体或表位而不同。
抗体特征
在本发明中描述和表征了能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的某些抗体。在一些实施方式中，抗体是2F7H4。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的三个HVR。在一些实施方式中，重链可变区包括包含序列FTFSDFYME(SEQ ID NO:24)的HVR1、包含序列ASRNKANDYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:25)的HVR2和包含序列DAWFA(SEQ ID NO:26)的HVR3。在一些实施方式中，轻链可变区包括包含序列KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO:27)的HVR1、包含序列WASTRES(SEQ ID NO:28)的HVR2和包含序列QQYYSYPR(SEQ ID NO:29)的HVR3。
在一些实施方式中，抗体是1C5C9。在一些实施方式中，抗体包含具有来自SEQ IDNO:3的氨基酸序列的三个HVR的重链可变区和含有来自SEQ ID NO:4的氨基酸序列的三个HVR的轻链可变区。在一些实施方式中，重链可变区包括包含序列YTFPDYNIH(SEQ ID NO:7)的HVR1、包含序列CIYPYNGNTAYNQKFKT(SEQ ID NO:30)的HVR2和包含序列SDLYYFGSRGFV(SEQ ID NO:31)的HVR3。在一些实施方式中，轻链可变区包括包含序列RASQDISTYLN(SEQID NO:11)的HVR1、包含序列FTSRLHS(SEQ ID NO:14)的HVR2和包含序列QQGNTLPW(SEQ IDNO:15)HVR3。
在一些实施方式中，抗体是抗体1C5C9的人源化形式。在一些实施方式中，抗体是人源化1C5-VK1。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含YTFPDYNIH(SEQ ID NO:7)的HVR-H1序列、CIYPYNGNTA(SEQ ID NO:8)的HVR-H2序列和SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:9)的HVR-H3序列。在一些实施方式中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含QASQDISTYLN(SEQ ID NO:10)的HVR-L1序列、FTSNLET(SEQ ID NO:12)的HVR-L2序列和QQGNTLPW(SEQ ID NO:15)的HVR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体包含具有以下氨基酸序列的重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:16)，
和/或含有以下氨基酸序列的轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLE
(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方式中，抗体包含具有以下氨基酸序列的重链：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:17)，和/或含有以下氨基酸序列的轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLERTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:19)。
在一些实施方式中，抗体是人源化1C5-VK2。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含YTFPDYNIH(SEQ ID NO:7)的HVR-H1序列、CIYPYNGNTA(SEQ IDNO:8)的HVR-H2序列和SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:9)的HVR-H3序列。在一些实施方式中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含RASQDISTYLN(SEQ ID NO:11)的HVR-L1序列、FTSSLQS(SEQ ID NO:13)的HVR-L2序列和QQGNTLPW(SEQ ID NO:15)的HVR-L3序列。
在一些实施方式中，抗体包含具有以下氨基酸序列的重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:16)，
和/或包含以下氨基酸序列的轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLE(SEQ ID NO:20)。
在一些实施方式中，抗体包含具有以下氨基酸序列的重链：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:17)，
和/或包含以下氨基酸序列的轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLERTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:21)。
在一些实施方式中，抗体包含重链可变区，其包含以下氨基酸序列的重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO:16)，
和/或包含以下氨基酸序列的轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLE(SEQ ID NO:22)。
在一些实施方式中，抗体包含具有以下氨基酸序列的重链：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:17)，
和/或包含以下氨基酸序列的轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPWTFGGGTKLERTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:23)。
在一些实施方式中，抗体是人源化1C5-VKW。在一些实施方式中，抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含YTFPDYNIH(SEQ ID NO:7)的HVR-H1序列、CIYPYNGNTA(SEQ IDNO:8)的HVR-H2序列和SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO:9)的HVR-H3序列。在一些实施方式中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含RASQDISTYLN(SEQ ID NO:11)的HVR-L1序列、FTSRLHS(SEQ ID NO:14)的HVR-L2序列和QQGNTLPW(SEQ ID NO:15)的HVR-L3序列。
在一些实施方式中，所述抗体是3C4F12。在一些实施方式中，抗体包含具有来自SEQ ID NO:5的氨基酸序列的三个HVR的重链可变区和含有来自SEQ ID NO:6的氨基酸序列的三个HVR的轻链可变区。在一些实施方式中，所述重链可变区包括包含序列FAFSSYDMS(SEQ ID NO:32)的HVR1、包含序列YISSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:33)的HVR2和包含序列RYYYGSSWAMD(SEQ ID NO:34)的HVR3。在一些实施方式中，轻链可变区包括包含序列KASQSVSNDVA(SEQ ID NO:35)的HVR1、包含序列YASNRYT(SEQ ID NO:36)的HVR2和包含序列QQDYSSPY(SEQ ID NO:37)的HVR3。在一些实施方式中，抗体是1B3E12。
用于本发明的抗体可包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和F(ab')2)、嵌合抗体、双特异性抗体、多价抗体、异源缀合抗体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体和包含所需特异性的抗原识别位点(例如，用于包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体可以是鼠科动物、大鼠、人或任何其它来源(包括嵌合或人源化抗体)。
在一些实施方式中，能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是单克隆抗体。例如，单克隆抗体可以使用由Kohler等，Nature，256:495(1975)首先描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(美国专利号4,816,567)。
测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体(例如含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位)的产生。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定，例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体也可以通过重组DNA法制备，例如上述那些。使用常规程序容易分离和测序编码单克隆抗体的DNA并将其置于表达载体中，并转染到宿主细胞例如大肠杆菌细胞或CHO细胞内以产生重组单克隆抗体。
在一些实施方式中，能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是人源化抗体。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，所述人免疫球蛋白中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。参见Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-329(1988)和Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。人源化可以基本上按照Jones等，Nature 321:522-525(1986)的方法进行；或通过用非人CDR序列取代人抗体的相应序列。为了确保人源化抗体保留对抗原的高亲和力，可以通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。一般来说，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
在一些实施方式中，能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是人抗体。用于产生人抗体的本领域已知的方法包括但不限于噬菌体展示技术和使用响应抗原产生人抗体的转基因动物。
在一些实施方式中，能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是嵌合抗体。嵌合抗体可以指来自互补决定区(CDR)或衍生自一个物种的可变区的残基与对应于来自另一物种的恒定区的序列连接的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号4,816,567)。
在一些实施方式中，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是抗体片段。在一些实施方式中，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和并被其分泌，从而允许直接产生大量的这些片段，或者从噬菌体文库中分离。这样的线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
在一些实施方式中，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是双特异性抗体。双特异性抗体(BsAb)是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体，包括在相同或另外的蛋白质上的表位。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的常规生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性。
在一些实施方式中，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是多价抗体。多价抗体可以指具有多于2个抗原结合位点的任何抗体。在一些实施方式中，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体是异源缀合抗体(heteroconjugate antibody)。异源缀合抗体可以指通过连接具有不同特异性的两种抗体(例如通过共价连接)产生的任何抗体。
根据不同的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定域序列融合。将编码免疫球蛋白重链融合体和必要时的免疫球蛋白轻链的DNA插入不同的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物中。
在一些实施方式中，含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的组合物可包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，所述载体、赋形剂或稳定剂以用作药物组合物一部分的剂量和浓度对暴露于其中的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
多核苷酸、编码抗体的载体和宿主细胞
本发明的某些方面涉及能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的产生。具体地，某些方面涉及含有编码抗体的核酸序列，所述抗体能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。如上所述，多核苷酸可以指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物。这些多核苷酸可以于体内在宿主细胞内产生或通过体外转录产生。编码抗体的多核苷酸可以指携带编码抗体序列的多核苷酸，其在产生抗体的细胞(例如，B细胞或杂交瘤)中被识别，或在序列中含有同义突变的多核苷酸，将其与其自然存在的对应物区分开，但是由于遗传密码的固有简并性，编码相似的蛋白质。可以通过本领域已知的任何方法分离多核苷酸，包括PCR，随后进行PCR反应基于沉淀的纯化，或含有PCR产物的琼脂糖凝胶切片，或通过纯化含有来自宿主细胞的多核苷酸的载体(例如，来自大肠杆菌的质粒制剂)。
本发明的某些方面涉及含有编码能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的核酸序列的载体。为了重组生产抗体或其片段，分离编码所需抗体或抗体片段的核酸，并插入可复制的载体中用于进一步克隆(DNA扩增)或用于表达。编码多克隆或单克隆抗体的DNA是容易分离的(例如，使用特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，并使用常规方法即可测序。许多克隆和/或表达载体是市售可得的。
载体组分通常包括但不限于以下的一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、含有许多限制性内切核酸酶的识别序列的多克隆位点、增强子元件、启动子和转录终止序列。表达和克隆载体都含有使载体能够在一种或多种所选宿主细胞内复制的核酸序列。这样的序列对于多种细菌、酵母和病毒是公知的。表达和克隆载体还可以包含称为可选择标记的选择基因，所述选择基因的表达赋予对抗生素或其它毒素的抗性，补充营养缺陷型缺陷或提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
表达和克隆载体通常含有启动子，所述启动子被宿主生物识别并与编码抗体(例如，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体)的核酸或其片段可操作地连接。适合与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸启动子系统和杂交启动子例如tac启动子，尽管其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将含有与编码抗体和抗体片段的DNA可操作地连接的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno，S.D.)序列。启动子序列对于真核生物是已知的，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的酵母启动子和从病毒基因组获得的哺乳动物启动子，所述病毒如多瘤病毒、巨细胞病毒且最优选猿猴病毒40(SimianVirus40，SV40)。各种异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子也是已知的。用于真核宿主细胞内的表达载体还将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。
本发明的某些方面涉及具有载体的分离的宿主细胞，所述载体含有编码抗体的核酸序列，所述抗体能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。用于在载体中克隆或表达编码抗体(例如，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体)或其片段的DNA的合适的宿主细胞在本文描述为原核生物，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科如大肠杆菌。除原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是合适的克隆或表达宿主，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。关于讨论酵母和丝状真菌用于生产治疗性蛋白质的用途的综述，参见例如Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)。用于表达糖基化抗体或抗体片段的合适的宿主细胞来自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster，果蝇)或家蚕(Bomhyx mori，蛾)细胞。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例为由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(用于在悬浮培养基中生长的293或293细胞亚克隆，Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA77:4216(1980))；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；和人肝癌细胞系(Hep G2)。对于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第255-268页。这些实例是说明性而不是限制性的。
抗体生产和纯化
本发明的某些方面涉及通过培养具有含有编码抗体的核酸序列的载体的宿主细胞并从细胞培养物中回收抗体来产生抗体的方法。将宿主细胞用上述表达或克隆载体转化以进行抗体或抗体片段生产，并在改良为适合诱导启动子、筛选转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中进行培养。
本文所述的用于产生抗体(例如，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体)或抗体片段的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科氏改良的伊戈尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)，Sigma)适合于培养宿主细胞。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、核苷酸、抗生素、微量元素和葡萄糖或等效能量源。还可以包括本领域技术人员已知的合适浓度的任何其它必需的补充物。培养条件例如温度、pH等，可沿用先前用于选择用于表达的宿主细胞的条件，并且对于普通技术人员是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体(例如，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体)或抗体片段可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。从这样的细胞制备的抗体可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(例如使用连接到基质(例如琼脂糖)上的蛋白质A或蛋白质G)来纯化。
一般来说，纯化制备用于研究、测试和临床应用的抗体的各种方法在本领域是公知的，所述各种方法与上述方法学一致和/或被本领域技术人员认为适合于所关注的特定抗体。
V.癌症
本发明的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有抗体的组合物来治疗或预防个体中癌症的方法，所述抗体能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合，其中，所述表位由癌细胞表达。在一些实施方式中，表位在癌细胞的细胞表面上表达。在一些实施方式中，抗体与癌细胞的细胞表面上表达的表位的结合抑制癌细胞的生长。
本文描述的是如下出人意料的结果，即与正常人细胞的细胞表面上很少或没有表达相比，许多类型的人癌细胞的细胞表面上高表达某些糖蛋白，特别是N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基半乳糖胺。因此，这些糖部分可以用作癌症存在的生物标记物，所述生物标记物也可以用于优先将治疗剂(例如抗体)靶向到癌细胞。此外，本发明还描述可以如何方便地将对N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺特异的抗体结合到细胞表面并且能够抑制表达这些糖部分的癌细胞的生长。
本文所述的结果证明，能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体在抑制许多不同类型的癌细胞的生长方面广泛有效。这种特性已通过体外使用人癌细胞系证明。重要的是，使用肿瘤异种移植模型的实验进一步确立了能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体在体内抑制人癌细胞生长的疗效。这种肿瘤异种移植模型是本领域中已知用于测试和预测人肿瘤的药物反应的有力工具(参见例如Richmond,A.和Su,Y.(2008)Dis.Model Mech.1(2-3):78-82)。
本文所述的结果预测能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体对多种形式的人癌症广泛有效，而在一些实施方式中，生长被所述抗体抑制的癌细胞选自：胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌或胃部癌症细胞、食管癌细胞和纤维肉瘤细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是胶质瘤细胞。胶质瘤细胞可以指源自胶质细胞的任何恶性细胞，例如脑或脊髓的胶质细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其它部位的胶质瘤细胞。胶质瘤细胞可以指胶质瘤细胞的均质群体或由不同类型的胶质细胞产生的混合细胞群体。在一些实施方式中，胶质瘤细胞可以是星形细胞瘤细胞。在一些实施方式中，胶质瘤细胞可以是少突胶质瘤细胞、脑干胶质瘤细胞、室管膜瘤细胞或视胶质瘤细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是肝癌细胞。肝癌细胞可以指源自肝脏的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其它部位的肝癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是肺癌细胞。肺癌细胞可以指源自肺的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其它部位的肺癌细胞。在一些实施方式中，所述肺癌细胞可以是非小细胞肺癌细胞。在一些实施方式中，肺癌细胞可以是肺腺癌细胞。在一些实施方式中，肺癌细胞可以是肺鳞状细胞癌。在一些实施方式中，肺癌细胞可以是小细胞肺癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞。乳腺癌细胞可以指源自乳腺的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移到其它部位的乳腺癌细胞。在一些实施方式中，乳腺癌细胞可以是导管原位癌细胞。在一些实施方式中，乳腺癌细胞可以是浸润性导管癌细胞。在一些实施方式中，乳腺癌细胞可以是浸润性小叶癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是卵巢癌细胞。卵巢癌细胞可以指源自卵巢的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其它部位的卵巢癌细胞。在一些实施方式中，卵巢癌细胞可以是表面上皮间质肿瘤细胞。在一些实施方式中，卵巢癌细胞可以是性索间质肿瘤细胞。在一些实施方式中，卵巢癌细胞可以是生殖细胞肿瘤细胞。卵巢癌细胞可以指卵巢癌细胞的同质群体或由不同类型的卵巢癌产生的混合细胞群体。
在一些实施方式中，癌细胞是宫颈腺癌细胞。宫颈腺癌细胞可指源自子宫颈的任何腺癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其它部位的宫颈腺癌细胞。在一些实施方式中，宫颈腺癌细胞是腺鳞癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是结肠癌细胞。结肠癌细胞可以指源自结肠或直肠的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移到其它部位的结肠癌细胞。在一些实施方式中，结肠癌细胞是腺癌细胞。在一些实施方式中，结肠癌细胞是腺鳞癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是胃癌或胃部癌症细胞。胃癌或胃部癌症细胞可以指来源于胃的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其它部位的胃癌细胞。在一些实施方式中，胃癌或胃部癌症细胞是腺癌细胞。在一些实施方式中，胃癌或胃部癌症细胞是弥漫型腺癌(粘液型、胶质、革囊、皮革样胃)细胞。在一些实施方式中，胃癌或胃部癌症细胞是淋巴瘤细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是食管癌细胞。食管癌细胞可以指源自食管的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其它部位的食管癌细胞。在一些实施方式中，食管癌细胞是腺癌细胞。在一些实施方式中，食管癌细胞是鳞状癌细胞。
在一些实施方式中，癌细胞是纤维肉瘤细胞。纤维肉瘤细胞可以指源自纤维结缔组织的任何癌细胞，包括原发性肿瘤或已转移至其它部位的食管癌细胞。
VI.胃肠道疾病
本发明的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的组合物来治疗或预防胃肠道疾病的方法，其中所述表位由炎症细胞表达。
在一些实施方式中，所述表位在炎症细胞的细胞表面上表达。在一些实施方式中，炎症细胞是结肠炎、炎症性肠病或胃肠炎的肠炎症细胞，并且所述表位在炎症细胞的细胞表面上表达。如本文所述，特异性识别含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体可以在结肠中的炎症部位(例如在以结肠炎症(例如，结肠炎、IBD或胃肠炎)为特征的疾病中所见的炎症部位)结合到炎症细胞(例如，白细胞，例如嗜中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱粒细胞)。
VII.治疗方法
癌症
本发明的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的组合物来治疗或预防个体中癌症的方法。本文描述的意料不到的发现是，能够与在癌细胞的细胞表面上或在癌细胞内表达的含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体可以用于抑制多种癌症细胞的生长。在一些实施方式中，抗体与癌细胞的细胞表面上表达的表位的结合抑制癌细胞的生长。
在一些实施方式中，癌症可以包括脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、食管癌和纤维肉瘤。由于本发明证明许多类型的癌组织表达高水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺，本文所述的方法可广泛有效地治疗许多类型的癌症。在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是指以脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、食管癌，或纤维肉瘤的原发性肿瘤为代表的原发性肿瘤。在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是指最初以脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌结肠癌、胃癌、食管癌或纤维肉瘤为代表的转移性癌症。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是脑癌。脑癌可以指源自脑的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。脑癌的实例可以包括但不限于神经胶质瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤和垂体腺瘤。脑癌也可以指源自中枢神经系统，例如脊柱的癌症。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是肝癌。肝癌可以指源自肝脏的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。肝癌的实例可包括但不限于肝癌、胆管癌和肝母细胞瘤。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是肺癌。肺癌可以指源自肺的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。肺癌的实例可包括但不限于非小细胞肺癌，包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，以及小细胞肺癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是乳腺癌。乳腺癌可以指源自乳腺的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。乳腺癌的实例可包括但不限于导管原位癌、浸润性导管癌、三阴性乳腺癌(例如对孕酮、雌激素和HER2/neu受体阴性的细胞产生的癌症)和炎症乳腺癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是卵巢癌。卵巢癌可以指源自卵巢的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。卵巢癌的实例可包括但不限于表面上皮间质肿瘤(包括例如子宫内膜样肿瘤、粘液性囊腺癌和浆液性肿瘤)、生殖细胞肿瘤、性索间质肿瘤和混合型卵巢肿瘤。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是宫颈癌。宫颈癌可以指源自宫颈的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。宫颈癌的实例可包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、腺鳞状癌、神经内分泌肿瘤、绒毛腺型腺癌(villoglandularadenocarcinomas)和玻璃状细胞癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是结肠癌。结肠癌可以指源自结肠或直肠的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。结肠癌的实例可包括但不限于腺癌和腺鳞癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是胃癌或胃部癌症。胃癌或胃部癌症可以指源自胃的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。胃癌或胃部癌症的实例可以包括但不限于腺癌、弥漫型腺癌(粘液性、胶质、革囊、皮革样胃)和淋巴瘤。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是食管癌。食管癌可以指源自食管的任何癌症，包括但不限于由上述细胞产生的癌症。食管癌的实例可包括但不限于腺癌和鳞状癌。
在一些实施方式中，待治疗或预防的癌症是纤维肉瘤。纤维肉瘤可以指源自纤维结缔组织的任何癌，包括但不限于由上述细胞产生的癌。
给药和联合治疗
本领域已知的任意方法可用于给药有效量的含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的组合物，例如静脉内给药，推注或在一段时间内连续灌注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下，关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入途径给药。在一些实施方式中，抗体通过口服给药。在一些实施方式中，组合物含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体和另外的蛋白质，例如不特异性结合含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的另外的蛋白质。可以通过本领域已知的任何方法确定含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体的组合物的有效量，并且可以取决于如上所述的个体的许多特征。
本发明的某些方面涉及通过对个体给药有效量的含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体和一定量的另外的抗癌剂的组合物来治疗或预防个体中癌症的方法，其中所述抗体和抗癌剂联合提供个体的癌症的有效治疗或预防。本领域已知的任何合适的抗癌剂可以与本文所述的抗体组合使用。抗癌剂可包括抗体(包括抗体-药物缀合物)、小分子、免疫治疗剂、分化诱导剂、靶向治疗剂和激素。
在一些实施方式中，抗癌剂是化疗剂。许多类型的化疗剂是本领域已知的。化疗剂的实例可以包括但不限于抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶或卡培他滨)、蒽环类药物、抗肿瘤抗生素(例如放线菌素D、丝裂霉素C或博来霉素)、有丝分裂抑制剂(例如紫杉烷类，例如或埃坡霉素)、皮质类固醇、拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷)、烷化剂和铂药物(例如顺铂、草丁铂或卡铂)。这些药物作为本领域技术人员的实例提供，并且决不意图限制化疗剂的选择。
胃肠道疾病
本发明的某些方面涉及通过对个体给药有效量的组合物来治疗或预防个体中的胃肠道疾病的方法，所述组合物含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体。本文描述的意料不到的发现是，与在炎症细胞的细胞表面上表达的含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体可用于治疗或预防各种胃肠道疾病，包括自身免疫和感染性疾病。
如本文所述，本发明的方法对于个体中的各种胃肠道疾病是有效的。在一些实施方式中，个体患有炎症性肠病。本发明的炎症性肠病可以是慢性或急性的。如本领域已知的，许多胃肠道疾病例如炎症性肠病可在组织中呈现症状，包括但不限于小肠和大肠、口、胃、食管和肛门。在一些实施方式中，炎症性肠病可包括结肠炎(例如转移性、淋巴细胞性、胶原性或不确定性结肠炎)或贝切特病(Behcet's disease)。
在一些实施方式中，个体患有克罗恩病。在一些实施方式中，个体患有溃疡性结肠炎。在一些实施方式中，个体患有急性感染性胃肠炎。在一些实施方式中，个体患有痔疮。
在一些实施方式中，个体患有由病毒感染引起的胃肠道疾病。已知引起胃肠道疾病的病毒可包括但不限于轮状病毒、诺如病毒(noroviruses)、腺病毒和星状病毒。在一些实施方式中，病毒感染是轮状病毒感染。
在一些实施方式中，患有胃肠道疾病的个体是人。在一些实施方式中，患有胃肠道疾病的个体是非人动物。
适用于给药用于治疗或预防胃肠道疾病的组合物的许多方法是本领域已知的。在一些实施方式中，本发明的抗体可以经静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内给药。
VIII.检测方法
本发明的某些方面涉及通过以下步骤检测个体中的癌细胞的存在的方法：从个体获得生物样品，使生物样品与特异性结合含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体接触，以及检测与生物样品结合的抗体的量，其中抗体结合指示个体中的癌细胞的存在。有利地，本发明描述了特异性结合含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体可如何用于检测个体中癌症的存在，这是由于血清样品中的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的水平升高和癌症存在之间的相关性。这些方法可用于检测许多类型的癌症，包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌或结肠直肠癌、食管癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、甲状腺癌、脑癌和淋巴瘤。
抗体与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位之间的特异性结合可以通过本领域已知的任意方法进行检测。用于检测抗体和表位之间的结合的方法是本领域熟知的，可以包括ELISA(酶联免疫吸附测定)免疫组织化学(IHC)测定、免疫荧光测定、流式细胞术、CTC(circulating tumor cell，血循环肿瘤细胞)测定和免疫胶体金测定。这些示例性测定是本领域技术人员公知的；对于更详细的描述，参见例如，Harlow和Lane，eds.(1988)Antibodies,A Laboratory Manual。ELISA的实例可包括直接法、间接法、竞争法和夹心法ELISA。可以使用任何表面，包括但不限于板(例如96孔板)或柱子。
在一些实施方式中，可以将如上所述检测到的结合到含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的抗体的量与使用对照样品检测到的抗体结合的量进行比较。与结合到对照样品的抗体的量相比，结合到生物样品的抗体的量升高可以指示所述个体中的癌细胞的存在。如上所述，对照样品可以用来自待测个体的生物样品进行制备。对照样品的实例可以包括来自未患癌症的个体的样品或具有已知量的N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的样品。作为非限制性实例，可以使用本文所述的方法测试来自待测个体的血清，并与来自健康(即未患癌症)的个体的血清进行比较。在这种情况下，与健康个体或具有已知量的N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的血清相比，来自待测个体的血清中的抗体结合升高可指示待测个体中存在癌细胞。
任何体液或切片都可以用作本发明的生物样品。生物样品的实例可包括但不限于血液、血清、尿液、粪便、乳汁、精液、唾液、胸液、腹腔液、脑脊液、痰液和任何其它体液或分泌物。
如本文所示，可以使用本文所述的方法在个体中检测许多类型的癌细胞。可在个体中检测的癌细胞的实例包括但不限于肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌或结肠直肠癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、宫颈癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞和淋巴瘤细胞。
此外，糖类相关的生物标记物本身可用于检测患有癌症或其它疾病的受试者中的自身抗体。这些自身抗体可以与糖类结合，所述糖类在癌症组织或其它患病组织或细胞上或其中差异性表达或释放到血液、尿液、粪便、乳汁、精液、唾液和体液或分泌物中。体液或分泌物可以包括但不限于胸液、腹腔液、脑脊液、痰和器官涂片。在一些实施方式中，糖类相关的生物标记物可包括但不限于N-乙酰基-葡糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺或岩藻糖，或携带明显的N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺或岩藻糖的糖缀合物。
IX.试剂盒
本发明的某些方面涉及包含药物组合物的试剂盒，所述药物组合物含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述试剂盒还可以包括用于对个体给药有效量的药物组合物以治疗癌症的说明书。这些说明书可以指通常包括在药物的商业包装中的说明书，所述说明书包含关于通常包括在药物的商业包装中的指示性信息，所述说明书包含关于适应症、用法、剂量、给药、禁忌症、与包装产品组合的其它药物和/或关于使用这些药物的注意事项等信息。
用于本发明的试剂盒的合适的容器包括例如瓶、小瓶(例如双腔瓶)、注射器(例如单室或双室注射器)和试管。制造的制品还可包括在容器上或与容器相关联的标签或包装插件，其可指示冲调和/或使用制剂的指导。标签或包装插件可进一步指示所述制剂可用于或预期用于口服或其它给药方式以治疗或预防个体中的癌症。制造的制品还可包括商业、治疗和用户角度所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装插件。
在一些实施方式中，包含药物组合物的试剂盒可以进一步包含用于检测个体中的癌细胞的存在的说明书，所述药物组合物含有能够与含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合的抗体。这些说明书可以指通常包括在ELISA测定试剂盒、免疫组织化学(IHC)测定试剂盒、免疫荧光测定试剂盒、流式细胞术测定试剂盒、CTC(血循环肿瘤细胞)测定试剂盒和免疫胶体金测定试剂盒的商业包装中的说明书。本发明的试剂盒还可以含有有助于检测个体中的癌细胞存在的任何其它试剂，例如96孔微孔板、非特异性蛋白例如牛血清白蛋白、结合到本发明的抗体而不影响其抗原结合的第二抗体和用于检测例如荧光或发光标记的试剂，或产生可检测信号的酶和底物(例如辣根过氧化物酶和TMB)。
本发明的某些方面涉及试剂盒，所述试剂盒包含药物组合物和使用所述药物组合物以检测患有癌症或炎症的个体中的自身抗体的存在的说明书或其它试剂，所述药物组合物含有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺。这些说明书可以指通常包括在ELISA测定试剂盒、免疫组织化学(IHC)测定试剂盒、免疫荧光测定试剂盒、流式细胞术测定试剂盒、CTC(血循环肿瘤细胞)测定试剂盒和免疫胶体金测定试剂盒的商业包装中的说明书。本发明的试剂盒还可以含有有助于检测个体中的癌细胞存在的任何其它试剂，例如96孔微孔板，非特异性蛋白如牛血清白蛋白、结合到本发明的抗体而不影响其抗原结合的第二抗体和用于检测例如荧光或发光标记的试剂，或产生可检测信号的酶和底物(例如辣根过氧化物酶和TMB)。
本说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文所示和所述的那些之外，根据前述描述，本发明的各种修改对本领域技术人员将是显而易见的，并且落入随附权利要求书的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利文件和专利申请文件通过引用以其整体并入本文。
实施例
通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且本领域技术人员将建议根据其进行各种修改或改变，并且这些修改或改变包括在本申请的精神和范围内，和随附权利要求书的范围内。
实施例1：N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺在癌细胞上的表达
更倾向于由癌细胞而不是正常人细胞表达的生物标记物的识别可以允许设计新的检测和治疗途径以帮助诊断、治疗和/或预防癌症。为了满足这种需求，本文描述了与N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺结合的单克隆抗体。这些结果部分基于意料不到的发现，即N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺在许多完全不同的癌细胞的表面上表达，但在正常人组织中微量表达或没有表达。其结果是，单克隆抗体可能在癌症的诊断、治疗和/或预防中具有极大的潜在用途，所述单克隆抗体与N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺结合并抑制癌细胞生长。
材料和方法
组织阵列
用组织阵列芯片检测小麦胚芽凝集素(WGA)与人健康和恶性组织的结合。该芯片含有来自FDA推荐的正常人器官和来自癌症患者的恶性组织的表位(Imgenex，San Diego；和US Biomax，Rockville，MD，USA)。对于组织阵列的更详细的描述，参见WO2009126652。
免疫组织化学
用植物凝集素的免疫组织化学(IHC)测定用于识别与癌症和其它疾病相关的与糖类相关的生物靶标或标记物。健康或癌症人组织用以下植物凝集素染色：生物素化小麦胚芽凝集素(WGA)，其特异性识别N-乙酰基葡糖胺；生物素化的荆豆凝集素I(Biotinylated-Ulex Europaeus agglutinin，UEA I)，其特异性识别岩藻糖；生物素化大豆凝集素(SBA)或双花扁豆凝集素(dolichos biflorus agglutinin，DBA)，其特异性识别N-乙酰基-半乳糖胺；生物素化花生凝集素(PNA)，其特异性识别半乳糖；生物素化蓖麻凝集素(RCA I或RAC120)，其特异性识别半乳糖和N-乙酰基-半乳糖胺；和生物素化伴刀豆球蛋白A(ConA)，其特异性识别甘露糖。所有植物凝集素由Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA提供。辣根过氧化物酶亲和素D(HRP Avidin D)和VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)用作第二试剂和过氧化物酶底物。
单克隆抗体的产生
用来自代表肺癌(A549)、肝癌(HEP-G2)和结肠癌(SW11/b)的人肿瘤细胞系的裂解物的混合物免疫BALB/c小鼠。通过将骨髓瘤细胞与已经用人肿瘤抗原免疫的小鼠的脾细胞融合来制备杂交瘤细胞。使用乙酰基-葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺作为筛选抗原通过ELISA选出结合N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体。用于小鼠免疫、产生杂交瘤细胞和基于ELISA的筛选的方法是本领域已知的。
与糖蛋白和肿瘤抗原结合的抗体的ELISA测定
研发了ELISA测定，用于检测单克隆抗体与N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺和人肿瘤抗原的结合。简要地讲，用人肿瘤抗原(0.25mg/ml)100μl/孔包被96孔ELISA板，一式两份。阳性对照包括一式两份的N-乙酰基葡糖胺(0.25mg/ml)和N-乙酰基-半乳糖胺(0.25mg/ml)，100μl/孔。磷酸盐缓冲盐水(PBS)用作阴性对照。辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG用作第二试剂，和TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)过氧化物酶EIA底物试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)用于检测HRP标记的抗体。在OD450下通过ELISA检测仪读板。
肿瘤细胞生长的MTT测定
研发了MTT测定，用于检测本发明公开的单克隆抗体对人肿瘤细胞的体外抑制。简要地讲，将铺有约50％人肿瘤细胞的96孔组织培养板与不同浓度的单克隆抗体共同培育48小时。然后除去每个孔的培养基，并用100μL新鲜培养基替换。向各孔中加入10μL的12mMMTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)储备液，并将10μL的MTT储备液加入到100μL单独的培养基中作为阴性对照。将板在37℃下孵育4小时，然后向每个孔中加入50μL DMSO并充分混合。然后使用570nm的吸光度读板。
异种移植物
简要地讲，将3-4周龄的雌性C.B-17SCID大鼠(Harlan，Madison，WI)随机分成三组(每组3只小鼠)。每只小鼠通过皮下注射接种5×106个A549细胞；随后在细胞接种后第10、14、17和21天每天静脉内(iv)注射盐水(载体对照)、小麦胚芽凝集素(WGA)或单克隆抗体3C4F12一次。一剂量的WGA是5μg WGA溶于100μl盐水。一剂量的单克隆抗体3C4F12是50μg抗体溶于100μl盐水。从细胞植入后第10天每周测量肿瘤生长两次。使用以下公式计算肿瘤大小：
长度×(宽度/2)×2π＝肿瘤大小
基于ELISA的血液检测
简要地讲，用来自癌症患者的人血清以80μl/孔一式两份地包被96孔ELISA板。阳性对照以100μl/孔一式两份地包被N-乙酰基葡糖胺(0.25mg/ml)。PBS用作空白对照。MAb-1C5C9(2-5μg/ml，100μl/孔)用作检测抗体。辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG用作第二试剂，并使用TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)过氧化物酶EIA底物试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)检测HRP标记的抗体。在OD450下通过ELISA检测仪读板。基于OD450的值确定结果。
流式细胞分析法检测
简要地讲，将来自健康个体或癌症患者的100μl新鲜血液分别用2F7H4、1C5C9和1B3E12单克隆抗体和用荧光标记的山羊抗小鼠IgG染色。然后用红细胞裂解缓冲液破坏红细胞。用流式细胞仪检测外周血单核细胞(PBMC)中的荧光阳性细胞。
结果
使用上述材料和方法中描述的植物凝集素作为探针，使用免疫组织化学检查正常和癌症人组织中的各种糖蛋白的表达。特异性检测N-乙酰基葡糖胺的生物素化小麦胚芽凝集素染色的代表图显示在图1中(分别比较图1A中的健康组织与图1B和图1C中的癌旁组织和癌组织)。这些实验证明了除骨髓、唾液腺和垂体之外大多数正常人体器官中微量或没有N-乙酰基葡糖胺的表达。
相比之下，发现以下癌变组织表达N-乙酰基葡糖胺：皮肤恶性黑素瘤、脑恶性少突胶质细胞瘤、肾透明细胞癌、皮肤基底细胞癌、喉癌、霍奇金淋巴瘤、结肠中间级间质瘤、甲状腺髓样癌和皮肤鳞状细胞癌。这些结果的定量如表1所示。
表1
表1.GlcNAc*在癌变组织上或癌变组织中的表达
*GlcNAc＝N-乙酰基葡糖胺
为了进一步检查各种糖蛋白在癌细胞上的表达，将转化的细胞系Hep-G2和HEK-293用生物素化凝集素和荧光标记的链霉亲和素的免疫荧光检测中染色。如图2所示，特异性识别N-乙酰基葡糖胺的小麦胚芽凝集素对Hep-G2和HEK-293细胞两者产生强染色(图2A)。特异性识别N-乙酰基-半乳糖胺的大豆凝集素(SBA)给HEK-293细胞染色(图2B)。这些结果表明，与在正常人细胞的细胞表面上微量表达或没有表达相比，某些糖蛋白，特别是N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺在许多类型的人癌细胞的细胞表面上高表达。有时N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺在癌细胞内高表达(例如，图2A：Hep-G2细胞)。因此，N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺可以用作治疗癌症的生物标记物或潜在的治疗靶标。类似地，与癌症和其它疾病(例如炎症)相关的其它糖类相关生物靶标或标记物可以通过寻找对其它患病组织特有的其它糖类特异的其它凝集素的结合，并将其与人、动物的健康组织或如上所述的各种肿瘤细胞系比较而容易识别。
实施例2：识别N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体的产生
上述结果证明如下意料不到的发现，N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺更倾向在人癌变组织和细胞系的范围内表达，但在大多数正常人组织微量有或没有表达。因此，可以通过使用能够结合怀疑患有癌症的受试者生物样品中的N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的分子来检测N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的存在，从而开发用于诊断癌症的方法。此外，结合并抑制表达N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的癌细胞生长的试剂或抑制与N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表达相关途径的试剂可以潜在用于治疗和/或预防癌症。为了实现该目标，本文描述了特异性识别N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体。
用来自代表肺癌(A549)、肝癌(HEP-G2)和结肠癌(SW11/b)的人肿瘤细胞系的裂解物的混合物免疫小鼠。如上所述产生杂交瘤并选择抗体。
获得的单克隆抗体包括1B3E12、3C4F12、7E6A10、1C5C9、2F7H4、7C10H11、4C8C12、7E6C12、4E1G10、8D9B12、7G1E12和4H6H7。使用上述的ELISA检测法测试那些单克隆抗体对N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺和人肿瘤抗原的特异性。测试抗体对来自各种人肿瘤细胞系(包括SMMC-7721(肝癌)、NCI-H446(小细胞肺癌)、SPC-A-1(肺腺癌)、MCF-7(乳腺癌)、SW11/b(结肠癌)和ECAP-1090(食管腺癌))的反应性。基于如表2所述的OD450nm值对样品进行评分。
表2
ELISA结果 OD450
阴性(-) ＜0.25
介于两者之间(±) 0.25-0.30
阳性(+) 0.31-0.49
阳性(2+) 0.50-0.75
阳性(3+) 0.76-0.99
阳性(4+) ≥1.00
基于ELISA的筛选的结果显示在图3中。这些结果证明单克隆抗体1B3E12、3C4F12、7E6A10、1C5C9、2F7H4、7C10H11、4C8C12、7E6C12、8D9B12和7G1E12与N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺结合。这些单克隆抗体也可能与携带明显的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的糖缀合物结合。此外，一些单克隆抗体能够结合人肿瘤抗原，如图3所示。不希望受理论束缚，这些结果可能表明，图3中列出的肿瘤抗原包括N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺，或者包括携带明显的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺部分的糖缀合物。这些结果表述了识别N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基葡糖胺的新型单克隆抗体的产生。
实施例3：识别N-乙酰基-葡糖胺和N-乙酰基半乳糖胺的单克隆抗体在体外抑制癌细胞生长
前述的实施例证明了识别N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体的产生。随后测试了这些抗体在体外阻断各种癌细胞系生长的能力。
为了测试选择的抗体，使用上述MTT生长检测来检查用各个抗体处理将如何影响人癌细胞系U251(神经胶质瘤)、SMMC-7721(肝癌)、NCI-H466(小细胞肺癌)、SK-MES-1(肺鳞状细胞癌)、SPC-A1(肺腺癌)、MCF-7(人乳腺癌)、SKOV-3(人卵巢癌)、Hela(宫颈癌)的增殖(例如生长速率)。在每个实验中，在一定浓度范围(即剂量)下测试抗体。
图4显示单克隆抗体2F7H4对各种人细胞系增殖的影响。在多个浓度下，2F7H4抑制至少50％的U251和SPC-A1细胞的细胞生长。因此，单克隆抗体2F7H4具有治疗或诊断多种人癌症的潜力，包括但不限于脑肿瘤，例如神经胶质瘤；和肺癌，例如腺癌。
图5显示单克隆抗体1C5C9对各种人细胞系增殖的影响。在多个浓度下，1C5C9抑制至少50％的U251、SMMC、SK-MES-1和SPC-A1细胞的细胞生长。因此，单克隆抗体1C5C9具有治疗或诊断多种人癌症的潜力，包括但不限于脑肿瘤，例如神经胶质瘤；肝癌；和肺癌，例如肺鳞状细胞癌和腺癌。
图6显示单克隆抗体3C4F12对各种人细胞系增殖的影响。在多个浓度下，3C4F12抑制至少50％的NCI-H446和SK-MES-1细胞的细胞生长。因此，单克隆抗体3C4F12具有治疗或诊断多种人癌症的潜力，包括但不限于肺癌、例如小细胞肺癌和肺鳞状细胞癌。
图7显示各种单克隆抗体对MCF-7(乳腺癌)、SKOV-3(卵巢癌)和Hela(宫颈癌)人癌细胞系的生长速度的影响。这些结果表明，当以1.0μg/ml给药时，单克隆抗体7E6C12、8D9B12、1C5C9、3C4F12、2F7H4和7C10H11抑制超过50％的MCF-7、SKOV-3和Hela细胞的细胞生长。因此，这些单克隆抗体具有治疗或诊断人乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌的潜力。此外，单克隆抗体1B3E12促进了三种肿瘤细胞系的细胞生长。虽然单克隆抗体1B3E12可能不适合治疗这三种癌症，但它可用于诊断这些癌症。
图8显示各种单克隆抗体对SW11/b(结肠癌)、ECAP-1090(食管腺癌)、HUTU-80(十二指肠腺癌)、HT-1080(纤维肉瘤)和ACC-2(唾液腺腺样囊性癌)人癌细胞系的生长速度的影响。这些结果证明，当以2.0μg/ml给药时，单克隆抗体2F7H4、1C5C9、3C4F12、7C10H11和8D9B12分别抑制超过50％的SW11/b、ECAP-1090、HUTU-80、HT-1080和ACC-2细胞的细胞生长。因此，这些单克隆抗体具有治疗或诊断人食管癌、十二指肠癌、纤维肉瘤和唾液腺癌的潜力。
总之，这些结果表明识别含有N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的多种单克隆抗体能够结合各种人癌细胞并抑制其生长。
实施例4：结合N-乙酰基-葡糖胺和N-乙酰基半乳糖胺的单克隆抗体抑制体内癌细胞生长
接下来在体内模型中测试识别含有N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位以抑制癌症生长的单克隆抗体的能力。
使用上述人癌细胞异种移植模型来测试本发明的单克隆抗体对肿瘤细胞生长的抑制疗效。结果示于图9。WGA和盐水具有相似的作用，两者都不能抑制肿瘤异种移植物的生长。相比之下，单克隆抗体3C4F12能够显著抑制肿瘤异种移植物的生长，特别是当异种移植物生长在第17天后加速时(图9A)。这种生长速率的抑制反映在肿瘤异种移植物的整体大小中，因为用3C4F12治疗的异种移植物的尺寸比用盐水或WGA治疗的小得多(图9B)。
重要的是，这些结果证明识别N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体能够在体内抑制癌细胞的生长。与使用人细胞系的体外数据结合，这些结果表明识别N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体可广泛用于体内治疗多种人癌症类型。
实施例5：在基于ELISA的血液测试中使用识别N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体的应用
前面的实施例描述了识别N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体如何可以用于结合人癌细胞，所述人癌细胞的特征在于这些糖高水平的表面表达。因为这些标记物不仅更倾向于在癌细胞上或在癌细胞内表达，而且还被释放到体液(例如，包括血液或其它分泌物)中，以下实施例证实了这种特性如何不仅可用于预防和/或治疗如上所述癌症，而且可用于诊断患者的癌症。
使用上述基于ELISA的分析方法检测了用单克隆抗体1C5C9检测患者血液样品中抗原。这些检测结果的分级指标提供在表3中。
表3
分级 OD450
阴性(-) ＜0.25
介于两者之间(±) 0.25-0.30
阳性(+) 0.31-0.49
阳性(2+) 0.50-0.75
阳性(3+) 0.76-0.99
阳性(4+) ≥1.00
如图10所示，少于3％的健康受试者的血液样品在他们的血液中具有显著水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的分子)，而79.3％、70.6％、66.7％和50.0％的患有乳腺癌、肺癌、结肠癌和甲状腺癌的患者的血液样品分别具有显著水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的分子)。
这些数据表明识别本发明的糖类相关生物标记物的单克隆抗体可以用于检测在各种癌中差异表达并释放到血液和其它体液或分泌物的糖类相关生物标记物。因此，本文所述的抗体在诊断检测(例如基于ELISA的那些)中用于诊断组织样品(例如，血液)中癌细胞的存在是非常有用的。本领域公知的用于与本文所述的抗体共同诊断使用的其它方法可以包括但不限于免疫胶体金检测。
实施例6：特异性结合N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体在基于流式细胞分析的癌症血液测试中的应用
由于诸如N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的标记物更倾向在癌细胞上表达，以下实施例说明了该特性如何不仅可用于如上所述预防和/或治疗癌症，而且可用于诊断患者的癌症。
使用上述基于流式细胞分析法测试了用单克隆抗体2F7H4(图11)、1C5C9(图12)和1B3E12(图13)检测患者血液样品中的循环癌细胞。这些检测结果的分级指标提供在图11-13中。应当说明，该分析法检测存在于外周血中的癌细胞。不希望受理论束缚，如果癌细胞不进入外周血液循环，其可能不能被检测到，因此阴性结果可能不必然指示个体中不存在癌症。
图11显示使用单克隆抗体2F7H4的基于流式细胞分析的检测结果。通过单克隆抗体2F7H4测得：全部来自10个健康个体的PBMC有少于2.2％的细胞具有显著水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的分子)，而50％-100％来自患有肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌或结肠直肠癌、食管癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、甲状腺癌、脑癌、淋巴瘤的患者的PBMC分别有超过2.3％的细胞具有显著水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的分子)。因此，单克隆抗体2F7H4具有诊断多种人癌症的潜力，如上所述，特别是肺癌、乳腺癌、结肠癌或结肠直肠癌、胃癌和子宫内膜癌。
图12显示使用单克隆抗体1C5C9的基于流式细胞分析的检测结果。通过单克隆抗体1C5C9测得：所有来自十个健康个体的PBMC(外周单核细胞)中，有小于3.3％的细胞具有显著水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的分子)，而14％-100％来自患有肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌或结肠直肠癌、食管癌、宫颈癌、甲状腺癌、胰腺癌的患者的PBMC分别有超过3.4％的细胞具有显著水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的分子)。因此，单克隆抗体1C5C9具有诊断多种人癌症的潜力，如上所述，特别是结肠癌或结肠直肠癌和肝癌。
图13显示使用单克隆抗体1B3E12的基于流式细胞术的检测的结果。通过单克隆抗体1B3E12测得：所有来自10个健康个体的PBMC(外周单核细胞)有小于3.2％的细胞具有显著水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的分子)，而30％-67％来自患有肝癌、乳腺癌、结肠癌或结肠直肠癌、食管癌、卵巢癌、胰腺癌的患者的PBMC分别有超过3.3％的细胞有显著水平的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺(或带有N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的分子)。因此，单克隆抗体1B3E12具有诊断多种人癌症的潜力，如上所述，特别是结肠癌或结肠直肠癌和乳腺癌。
这些数据表明识别本发明的糖类相关生物标记物的单克隆抗体可以用于检测患者血液中的循环癌细胞。循环癌细胞差异表达糖类相关生物标记物并释放到血液和其它体液或分泌物中。因此，本文所述的抗体在诊断检测(例如基于流式细胞分析的那些)中用于诊断组织样品(例如血液)中癌细胞的存在是非常有用的。应当注意，一些不能抑制癌细胞增殖的抗体仍然可用于检测方法。例如，本发明的单克隆抗体1B3E12促进乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌的肿瘤细胞系的细胞生长，但是可用在流式细胞术诊断各种癌症中。
实施例7：特异性结合N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的单克隆抗体在预防和治疗胃肠道疾病中的应用
已经研究了N-乙酰基葡糖胺作为炎症的生物标记物(例如，由轮状病毒感染引起的肠炎；参见PCT/US2009/039810)。然而，尚不清楚N-乙酰基葡糖胺在炎症中的作用和它是否可能充当胃肠道疾病的潜在治疗靶标。因此，测试了特异性结合N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的抗体用于预防和治疗新生仔猪的急性感染性胃肠炎。
首先，测试了单克隆抗体1C5C9(MAb-1C5C9)和轮状病毒感染诱导的炎症肠细胞的结合。在出生后第2天通过口服给与恒河猴轮状病毒(RRV)(RRV感染组)处理两组balb/c乳鼠幼崽。这种病毒性疾病的病程通常使得在RRV感染后的第1周内，幼崽患有腹泻与灰色大便(alcoholic stool)，饮食差及不像健康小鼠一样增重，30-40％的幼崽患有严重疾病并出现黄疸。到第2周，所有小鼠通常都患有黄疸，并且不能很好地进食和增重，80％的幼崽患有严重疾病死亡。病毒通常在5天内清除，且在第5天检测不出。在治疗后不同天处死幼崽，制备血清样品、快速冷冻和福尔马林固定肠和肝组织。在一个免疫荧光检测中，用RRV感染第5天的小鼠的肠组织切片及抗体1C5C9(MAb-1C5C9)染色，并且用荧光标记的抗小鼠IgG作为第二试剂。未被RRV感染的健康小鼠的肠组织切片作为对照。
图14显示MAb-1C5C9强烈结合到被轮状病毒感染的小鼠的组织切片的炎症细胞(图14B)。相比之下，MAb-1C5C9不结合没有轮状病毒感染的健康小鼠的肠组织切片(图14A)。这些数据表明，识别含有N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的表位的单克隆抗体能够结合肠中的炎症细胞。
在一次暴发流行中，1-5日龄的新生仔猪被猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染引起急性感染性胃肠炎。100％的新生仔猪被感染，且80-90％的感染仔猪死亡。对于这种感染没有有效的疗法。
为了测试MAb-1C5C9在预防病毒感染中的疗效，当观察到在一窝中几只仔猪(1-2只仔猪)感染时，将单剂量的MAb-1C5C9(50μg)口服给药至同一窝所有未感染的仔猪。约500只仔猪用MAb-1C5C9治疗。用MAb-1C5C9治疗的未感染的仔猪没有一只感染或死亡。用MAb-1C5C9治疗(N＝500)的窝死亡率为约28％；用恩诺沙星治疗(N＝500)的窝死亡率为约81％；而未治疗的窝死亡率(N＝500)为89％。与抗生素(恩诺沙星)治疗或未治疗的仔猪相比时，MAb-1C5C9在降低死亡率方面的疗效显示具有p值＜0.0001的统计学显著性(图15)。
这些结果表明，MAb-1C5C9有效且效果比用于预防由病毒感染(包括但不限于PEDV感染和其它肠道病毒)引起的胃肠炎的抗生素更好。
还在人中测试了MAb-1C5C9在治疗胃肠道疾病中的疗效。55岁的女性(约58kg)患肠炎症与腹泻、血便和腹痛，持续4周。结肠镜检查显示除痔疮外无异常。用抗生素(环丙沙星)治疗一周无效。
每天一次口服给药MAb-1C5C9(2-3μg/kg，0.13mg/剂量)10天。在2次剂量后，血便减少，5次剂量后停止；7次剂量后腹泻停止；并且患者在治疗10天后康复。在治疗后7个月内没有肠炎症或痔疮复发。
这些结果表明MAb-1C5C9有效且效果比用于治疗炎症性肠病和痔疮的抗生素更好。总之，这些结果表明，特异性结合N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的抗体可用于治疗各种胃肠道疾病，例如炎症疾病，包括病毒感染、炎症性肠病和痔疮。
实施例8：在IBD小鼠模型中测试特异性结合N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的人源化抗体
前述实施例证明了MAb-1C5C9在抑制癌细胞生长、检测循环癌细胞和治疗IBD中的疗效。随后将MAb-1C5C9人源化。以下实施例描述具有共同重链可变区(VH)和不同轻链可变区(VK)的人源化1C5C9的变体。在IBD的多个体内动物模型中测试人源化1C5C9抗体的疗效、结合和毒性。
材料和方法
人源化抗体与N-乙酰基葡糖胺(NAG)的结合
将100μL NAG以1μg/mL的浓度包被在96孔板的孔中过夜，洗涤并封闭。测试5个人源化抗体克隆并与嵌合1C5C9抗体进行比较。将测试抗体加入板中后，洗板，并通过HRP标记的抗人IgG作为第二试剂检测结合。通过标准显色检测HRP，并通过OD450nm检测结合。
小鼠IBD模型
6-8周龄且体重17-19克的BALB/c雌性小鼠用于诱导急性结肠炎；通过肛门给药0.15mL剂量的溶于50％乙醇的120mg/mL的三硝基苯磺酸(TNBS；Sigma-Aldrich)。将小鼠分成5个治疗组，如下：
G1：未治疗(n＝6)；
G2：用5μg抗体1C5-VK2/只动物治疗，腹膜内注射(IP)(n＝6)；
G3：用5μg抗体1C5-VK2/只动物治疗，口服(PO)(n＝6)；
G4：用2μg抗体1C5-VK2/只动物治疗，腹膜内注射(IP)(n＝6)；和
G5：用5μg抗体1C5-VK1/只动物治疗，腹膜内注射(IP)(n＝6)。
G2-G5小鼠的治疗为从TNBS诱导IBD后48小时始，每天给药一次，持续4天。
在IBD模型过程中每天记录每组小鼠的体重和临床体征。在TNBS诱导IBD模型后48小时处死来自对照组(G1)的两只小鼠，并收集全部结肠组织。最后一次给药后一天(24小时)，对所有动物结束该操作(操作期间的第7天)。根据图18所示的提示(key)，收集全结肠组织用于大体病理学(结肠重量、溃疡)和组织学评价(结肠组织切片的标准HE染色)，并且得到代表性图。使用如图20A所示的标准组织学方法评价结肠组织病理学性状。
还使用结肠组织切片以及HRP标记的抗人IgG作为检测试剂的标准免疫组织化学方法(HE染色)评价抗体1C5-VK2在被治疗的小鼠中的定位。将组G2小鼠的代表性图与对照小鼠进行比较，如图20所示。
结果
检测5个人源化1C5C9克隆与NAG的结合并与嵌合1C5C9抗体(即，连接到人Fc区的亲本小鼠可变域)进行比较。图16显示所有抗体显示对NAG的剂量依赖性结合。选择人源化抗体1C5-VK1和1C5-VK2用于进一步定性。
如上所述在小鼠中诱导急性结肠炎，并测试人源化1C5-VK2给药对体重、临床体征例如腹泻和结肠状况的影响。通过根据图17中提供的提示，用大体评分结肠状况来检测抗体治疗的效果。来自治疗组G1-G4中的小鼠的结肠评价为结肠炎存在，如下表4所示。
表4.与未治疗的对照相比，抗体治疗的小鼠结肠炎的发生率。
组 患有结肠炎的动物数 未患结肠炎的动物数
G1 6 0
G2 2 4
G3 6 0
G4 6 0
图17显示，与未治疗的对照相比，用1C5-VK2治疗导致得分显著降低，表明抗体治疗导致溃疡和炎症的显著缓解。
从这些结肠样品获取的代表性大体影像图显示在图18A。对照组(G1)的所有未治疗的小鼠显示严重的结肠炎与严重的溃疡、炎症和组织坏死。在G2组中，一例样品(#1)显示肠壁增厚，没有溃疡和炎症，而3例样品(#2、3和6)没有显示溃疡和炎症。剩下的两例显示溃疡和炎症。在G3组中，3例(#1、2和4)显示肠壁增厚，没有溃疡和轻微炎症。这些结果说明1C5-VK2治疗导致溃疡和炎症的显著缓解。
还测试了1C5-VK1抗体治疗在该小鼠IBD模型中的作用。如图18B所示，代表性大体影像图显示，与未治疗的G1对照相比，G5治疗组中的6只动物中有5只显示结肠炎的改善。这些结果说明，1C5-VK1治疗也导致缓解溃疡和炎症。
接下来，通过如上所述的结肠组织切片的组织化学制备(HE染色)获得代表性病理图。图19A显示用来自组G1-G4中的1C5-VK2治疗的小鼠的代表性图。所有未治疗的对照组(G1)的小鼠显示严重的溃疡和炎症，没有上皮再生。在G2组中，两例样品(#1和2)显示上皮再生和溃疡覆盖(covering of the ulcer)，且一例样品(#5)显示部分上皮再生(由箭头所示)。样品3和6没有显示溃疡和炎症，只有1例样品(#4)显示溃疡和炎症。在G3组中，四例样品(#1-4)显示上皮再生和溃疡覆盖(箭头)。这些图表明用1C5-VK2治疗缓解了IBD病状，其中通过IP注射治疗的5/6(83％)小鼠和通过口服给药(PO)治疗4/6(67％)的小鼠显示溃疡和炎症的显著缓解。
图19B显示来自用G5组中的1C5-VK1治疗的小鼠的代表性组织化学图。在G5组中，三例样品显示康复(#1)或上皮再生(#3和5，如箭头突出显示)。两例样品(#2和4)也显示炎症减少。这些图证明了用1C5-VK1治疗的小鼠中的5/6(83％)也显示缓解的IBD病状。另外，图19A和19B中的组织学数据表明抗体1C5-VK1和1C5-VK2可以促进肠上皮再生。
也使用上述免疫组织化学方法检测1C5-VK2抗体第7天在治疗的小鼠中的定位。图20显示在患有结肠炎的小鼠的炎症细胞(箭头表示代表性染色)和再生的结肠上皮细胞上检测到了1C5-VK2。这证明了1C5-VK2在给药时定位于炎症部位。
实施例9：特异性结合N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的人源化抗体对小鼠的毒性和药代动力学(PK)检测
材料和方法
毒性研究
BALB/c小鼠，8周龄，体重22-24克，随机分为4个治疗组。每组包括3只雄性和3只雌性小鼠。各组按如下治疗：
G1：1.0mg/kg(20μg总剂量)1C5-VK2，静脉内(IV)给药一次
G2：1.0mg/kg(20μg总剂量)1C5-VK2，口服(PO)给药一次
G3：5.0mg/kg(100μg总剂量)1C5-VK2，静脉内(IV)给药一次
G4：5.0mg/kg(100μg总剂量)1C5-VK2，口服(PO)给药一次
在治疗后14天中观察小鼠的体重。在第14天，通过如上所述的大体解剖评分和组织化学制备来检测结肠样品。
药代动力学(PK)研究
BALB/c小鼠，8周龄，体重22-24克，随机分为4个治疗组。每组包含3只雄性和3只雌性小鼠。各组按如下治疗：
G1：1.0mg/kg(20μg总剂量)1C5-VK2，静脉内(IV)给药一次
G2：1.0mg/kg(20μg总剂量)1C5-VK2，口服(PO)给药一次
G3：5.0mg/kg(100μg总剂量)1C5-VK2，静脉内(IV)给药一次
G4：5.0mg/kg(100μg总剂量)1C5-VK2，口服(PO)给药一次
在治疗后的以下时间点从小鼠收集血液：5分钟，0.5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，24小时和2周。从血液中分离血清，并将10μl血清加上90μl PBS(共100μl)包被在96孔板的孔中过夜。通过使用HRP标记的抗人IgG作为检测试剂的直接ELISA检测血清中的1C5-VK2水平。
每隔一天记录每个治疗组的小鼠的体重和临床体征。在第14天对所有动物结束该过程。收集以下器官用于组织学评价：结肠、小肠、胃、肝、胰腺、心脏、肺、肾、脾和脑。
结果
1C5-VK2治疗的毒性如上所述。图21显示，与未治疗的对照相比，通过2种不同途径(IV和PO)用2种不同剂量(1.0mg/kg和5.0mg/kg)治疗对小鼠体重没有显著影响。此外，组织学评价显示，与未治疗的对照(未显示数据)相比，通过2种不同途径(IV和PO)用2种不同剂量(1.0mg/kg和5.0mg/kg)治疗对小鼠器官组织学没有显著副作用。总之，在1C5-VK2治疗时，在小鼠的最低有效剂量(0.1mg/kg)的10-50倍剂量下没有观察到显著的不良反应。人的等效最低有效剂量为约0.005mg/kg至0.01mg/kg。
如上所述给药1C5-VK2的血清PK也通过ELISA检测。来自IV和PO给药的结果分别提供在图22和图23中。
实施例10：在IBD大鼠模型中测试特异性结合N-乙酰基葡糖胺和/或N-乙酰基-半乳糖胺的人源化抗体
材料和方法
按照0.25mL的剂量，通过肛门给药120mg/mL的溶于50％乙醇的三硝基苯磺酸(TNBS；Sigma-Aldrich)，在9周龄且体重140-160克的SD雌性大鼠中诱导急性结肠炎。将大鼠分为5个治疗组，如下：
G1：未治疗；
G2：用125μg/kg的人IgG治疗，腹膜内注射(IP)；
G4：用125μg/kg的1C5-VK2治疗，腹膜内注射(IP)；
G5：用122μg/kg的1C5-VK2治疗，皮下注射(SC)；
G6：用250μg/kg的1C5-VK2治疗，口服管饲(PO)。
G2-G6大鼠的治疗为从TNBS诱导IBD后48小时起，每天给药一次，共4天。
使用的测试用品在下表5中提供。
表5.大鼠IBD实验的测试用品。
组 动物数 测试品 原始浓度 给药途径 剂量
G1 5 对照 N/A N/A N/A
G2 5 人IgG 10mg/mL IP 125μg/kg
G4 5 1C5-VK2 1.44mg/mL IP 125μg/kg
G5 6 1C5-VK2 1.44mg/mL SC 125μg/kg
G6 6 1C5-VK2 1.44mg/mL PO 250μg/kg
每天记录每个治疗组的大鼠的体重和临床体征。最后一次给药后两天(48小时)，对所有动物(该过程的第8天)结束该过程。收集结肠组织(自肛门10cm长)用于大体病理学(结肠重量、溃疡)和组织学评价，并得到代表性图。
结果
图24显示抗体治疗对大鼠体重的影响。从治疗的第一天(整个过程的第4天)，与未治疗的对照相比，所有治疗组显示体重增加。
图25提供结肠组织样品的代表性总图。对照组(G1)的未治疗大鼠的4/5(80％)显示严重的结肠炎与严重溃疡、炎症和组织坏死。总体上，用1C5-VK2(G4、G5和G6)治疗的大多数大鼠显示康复的迹象，例如炎症减少(更少的炎症细胞和更少的充血)、组织坏死减少、溃疡覆盖(covered ulceration)(全部或部分)和更好的形态(更平滑的肠壁)。在G4组中，两只大鼠(G4-4和G4-5)没有显示溃疡和炎症；一只大鼠(G4-3)显示肠壁增厚、炎症减轻和溃疡覆盖(康复中)；一只大鼠(G4-1)显示肠壁增厚和炎症，没有溃疡。剩余的大鼠(G4-2)显示减少的炎症和溃疡部分覆盖。类似地，4/6(67％)的G5大鼠(G5-1、G5-4、G5-5和G5-6)显示康复的迹象，并且5/6(83％)的G6大鼠(G6-1、G6-2、G6-3、G6-4和G6-5)与对照大鼠相比显示康复的迹象。这些结果说明通过注射(G4组或G5组)或口服给药(G6组)的1C5-VK2治疗导致结肠炎溃疡和炎症显著减轻。
根据图26中所示的提示，在这些组织样品中大体评价结肠形态学和结肠炎病理学症状。评分表明，抗体治疗导致结肠炎病状的严重性降低，与未治疗的对照相比，G4组表现出评分的统计学显著降低。
接下来，将来自每个治疗组的结肠称重作为其长度的功能。如图27所示，未治疗的大鼠的结肠重量由于炎症和溃疡而显著提高，而用1C5-VK2经由SC(G5)或PO(G6)途径治疗的大鼠的结肠重量没有显著提高。这些数据表明，与未治疗的对照大鼠相比，G5组和G6组大鼠的结肠处于更接近正常大鼠的状况。
总之，实施例8-10的结果证明了用针对N-乙酰基葡糖胺和N-乙酰基-半乳糖胺的人源化抗体治疗在两个IBD动物模型中显示效果。两种抗体在IBD小鼠模型中显示效果。通过治疗缓解IBD的病理体征如溃疡和炎症，并且在治疗后观察到上皮再生。
序列
除非另有说明，所有多肽序列均以N-端至C-端的方式示出。
2F7H4重链可变区：
EVKLQQSGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYMEWVRQPPGKRLEWIAASRNKANDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCARDAWFAYWGQGTIVTVSS(SEQ ID NO：1)
2F7H4轻链可变区：
DIVITQTPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRGSGVPDRFTGSGSGTDGTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPRTFGGGTKFEIK(SEQ ID NO：2)
1C5C9重链可变区：
EVQLEESGPELVKPGASVKISCKASGYTFPDYNIHWVKQSHGKSLEWIGCIYPYNGNTAYNQKFKTKATLTVDTSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCARSDLYYFGSRGFVYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：3)
1C5C9轻链可变区：
DIVLTQSPSSLSASLGDRVTISCRASQDISTYLNWYQQKPDGTVKLLVYFTSRLHSGVPSRFSGTGSGTDFSLTINNLDQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：4)
3C4F12重链可变区：
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARRYYYGSSWAMDYWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：5)
3C4F12轻链可变区：
DIVMTQSTKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：6)
人源化1C5C9和亲本-1C5C9HVR-H1：
YTFPDYNIH(SEQ ID NO：7)
人源化1C5C9 HVR-H2：
CIYPYNGNTA(SEQ ID NO：8)
人源化1C5C9 HVR-H3：
SDLYYFGSRGFD(SEQ ID NO：9)
人源化1C5-VK1 HVR-L1：
QASQDISTYLN(SEQ ID NO：10)
人源化1C5-VK2/亲本-1C5C9 HVR-L1：
RASQDISTYLN(SEQ ID NO：11)
人源化1C5-VK1 HVR-L2：
FTSNLET(SEQ ID NO：12)
人源化1C5-VK2 HVR-L2：
FTSSLQS(SEQ ID NO：13)
人源化亲本-1C5C9 HVR-L2：
FTSRLHS(SEQ ID NO：14)
人源化1C5-VK1/VK2/亲本-1C5C9 HVR-L3：
QQGNTLPW(SEQ ID NO：15)
人源化1C5C9重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFPDYNIHWVRQAPGQGLEWMGCIYPYNGNTAYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDLYYFGSRGFDYWGQGTLVTVSSA(SEQ ID NO：16)
人源化1C5C9重链：
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SEQUENCE LISTING
<110> 王慧茹
<120> 基于糖类的生物标记物和治疗剂
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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65 70 75 80
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Lys
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Val
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
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Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Thr Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asp Tyr
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<212> PRT
<213> Humanized 1C5C9 Heavy Chain
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Cys Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Asp Leu Tyr Tyr Phe Gly Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> Humanized 1C5-VK1 Light Chain Variable Region
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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<212> PRT
<213> Humanized 1C5-VK1 Light Chain
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Arg Gly Glu Cys
210
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<212> PRT
<213> Humanized 1C5-VK2 Light Chain Variable Region
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<212> PRT
<213> Humanized 1C5-VK2 Light Chain
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Phe Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
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210
<210> 22
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<212> PRT
<213> Humanized parental-1C5C9 Light Chain Variable Region
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<211> 212
<212> PRT
<213> Humanized parental-1C5C9 Light Chain
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
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Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
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<212> PRT
<213> 3C4F12 HVR-L1
<400> 35
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 3C4F12 HVR-L2
<400> 36
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 3C4F12 HVR-L3
<400> 37
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
1 5

Claims (79)

1.一种分离的单克隆抗体，该抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合，其中，所述表位由癌细胞或炎症细胞表达。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体能够与包含N-乙酰基葡糖胺的表位和包含N-乙酰基-半乳糖胺的表位特异性结合。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中，所述抗体是抗体片段。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体是Fab片段、scFv、微抗体、双抗体、scFv多聚体或双特异性抗体片段。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体是人抗体。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体是嵌合抗体。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的抗体，其中，所述表位在癌细胞的细胞表面上表达。
9.根据权利要求1-7中任意一项的抗体，其中，所述表位在癌细胞内表达。
10.根据权利要求8或9所述的抗体，其中，所述癌细胞选自由胶质瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和宫颈腺癌细胞组成的组中。
11.根据权利要求10所述的抗体，其中，所述肺癌细胞是小细胞肺癌细胞、肺鳞状细胞癌细胞或肺腺癌细胞。
12.根据权利要求8-11中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体与所述表位的结合抑制癌细胞的生长。
13.根据权利要求1-7中任意一项所述的抗体，其中，所述炎症细胞是结肠炎、炎症性肠病或胃肠炎的肠炎症细胞，并且所述表位在炎症细胞的细胞表面上表达。
14.根据权利要求1-5和7-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的三个HVR。
15.根据权利要求1-5和7-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:24所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:25所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:26所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:28所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:29所示的HVR-L3序列。
16.根据权利要求1-5和7-15中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。
17.根据权利要求1-5和7-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的三个HVR。
18.根据权利要求1-5和7-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:30所示的HVR-H2序列，和SEQ ID NO:31所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:14所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。
19.根据权利要求1-5、7-13、17和18中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区。
20.根据权利要求1-5和7-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含来自SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的三个HVR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的三个HVR。
21.根据权利要求1-5和7-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:32所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:33所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:34所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:35所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:36所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:37所示的HVR-L3序列。
22.根据权利要求1-5、7-13、20和21中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的轻链可变区。
23.根据权利要求1-5和8-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:12所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。
24.根据权利要求1-5、8-13和23中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含具有SEQID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。
25.根据权利要求1-5和8-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:13所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。
26.根据权利要求1-5、8-13和25中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含具有SEQID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的轻链可变区。
27.根据权利要求1-5和8-13中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:14所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。
28.根据权利要求1-5、8-13和27中任意一项所述的抗体，其中，所述抗体包含具有SEQID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的轻链可变区。
29.一种组合物，该组合物包含权利要求1-28中任意一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
30.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码权利要求1-28中任意一项所述的抗体的核酸序列。
31.一种载体，该载体包含编码权利要求1-28中任意一项所述的抗体的核酸序列。
32.一种分离的宿主细胞，该宿主细胞包含权利要求31所述的载体。
33.一种产生抗体的方法，该方法包括培养权利要求32所述的宿主细胞，并从细胞培养物中回收所述抗体，所述宿主细胞能够产生由核酸编码的抗体。
34.通过权利要求33所述的方法产生的抗体。
35.一种用于治疗或预防个体中癌症的方法，该方法包括对所述个体给药有效量的组合物，所述组合物包含权利要求1-28和34中任意一项所述的抗体。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述癌症选自由脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌组成的组中。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中，所述个体是人。
38.根据权利要求35或36所述的方法，其中，所述个体是非人动物。
39.一种用于治疗或预防个体中癌症的方法，该方法包括对所述个体给药一定量的权利要求1-28和34中任意一项所述的抗体和一定量的另外的抗癌剂，其中，所述抗体和抗癌剂联合提供对个体中癌症的有效治疗或预防。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所治疗的癌症选自由脑癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌或胃部癌症、食管癌和纤维肉瘤组成的组中。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中，所述个体是人。
42.根据权利要求39或40所述的方法，其中，所述个体是非人动物。
43.根据权利要求39-42中任意一项所述的方法，其中，所述抗癌剂是化疗剂。
44.一种用于检测个体中的癌细胞的方法，该方法包括:
(a)使来自所述个体的生物样品与权利要求1-28和34中任意一项所述的抗体接触；和
(b)检测抗体与生物样品的结合，其中所述抗体与样品的结合能够指示个体中癌细胞的存在。
45.根据权利要求44所述的方法，还包括将步骤(b)中检测的结合的抗体的量与结合到对照样品的抗体的量进行比较。
46.根据权利要求44或45的方法，其中，所述抗体与生物样品的结合通过选自由ELISA测定、流式细胞术测定、免疫组织化学测定、免疫荧光测定、血循环肿瘤细胞测定和免疫胶体金测定组成的组中的方法来检测。
47.根据权利要求44-46中任意一项所述的方法，其中，所述生物样品选自由血液、血清、尿液、粪便、乳汁、精液、唾液、胸液、腹腔液、脑脊液、痰液和任何其它体液或分泌物组成的组中。
48.根据权利要求44-47中任意一项所述的方法，其中，所述个体是人。
49.根据权利要求44-47中任意一项所述的方法，其中，所述个体是非人动物。
50.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。
51.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:24所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:25所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:26所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:28所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:29所示的HVR-L3序列。
52.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区。
53.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:30所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:31所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:14所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。
54.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:12所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。
55.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的轻链可变区。
56.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:13所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。
57.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的轻链可变区。
58.根据权利要求44-49中任意一项的方法，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的HVR-H1序列、SEQ ID NO:8所示的HVR-H2序列和SEQ ID NO:9所示的HVR-H3序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11所示的HVR-L1序列、SEQ ID NO:14所示的HVR-L2序列和SEQ ID NO:15所示的HVR-L3序列。
59.根据权利要求44-49中任意一项所述的方法，其中，所述抗体包含具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的轻链可变区。
60.根据权利要求44-59中任意一项所述的方法，其中，所述癌细胞选自由肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌或结肠直肠癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞、子宫内膜癌细胞、宫颈癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞和淋巴瘤细胞组成的组中。
61.一种用于治疗或预防个体中的胃肠道疾病的方法，该方法包括对所述个体给药有效量的权利要求1-28和34中任意一项所述的抗体。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，所述个体患有炎症性肠病。
63.根据权利要求61所述的方法，其中，所述个体患有克罗恩病。
64.根据权利要求61所述的方法，其中，所述个体患有溃疡性结肠炎。
65.根据权利要求61所述的方法，其中，所述个体患有急性感染性胃肠炎。
66.根据权利要求61所述的方法，其中，所述个体患有痔疮。
67.根据权利要求61所述的方法，其中，所述个体患有由病毒感染引起的胃肠道疾病。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述病毒感染是轮状病毒感染或猪流行性腹泻病毒感染。
69.根据权利要求61-68中任意一项所述的方法，其中，所述个体是人。
70.根据权利要求61-68中任意一项所述的方法，其中，所述个体是非人动物。
71.根据权利要求61-70中任意一项所述的方法，其中，所述抗体通过静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内进行给药。
72.一种试剂盒，该试剂盒包含药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-28和34中任意一项所述的抗体。
73.根据权利要求72所述的试剂盒，还包括用于对个体给药有效量的所述药物组合物以治疗或预防癌症的说明书。
74.根据权利要求72所述的试剂盒，还包括用于对个体给药有效量的所述药物组合物以治疗或预防胃肠道疾病的说明书。
75.根据权利要求72所述的试剂盒，还包括用于检测个体中癌细胞的存在的说明书。
76.根据权利要求72所述的试剂盒，还包括用于测定来自患有癌症的个体的生物样品中的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的水平的说明书。
77.一种试剂盒，该试剂盒包含：
(a)包含N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的组合物；和
(b)使用所述组合物检测患有癌症或炎症的个体中自身抗体的存在的说明书或其它试剂。
78.一种试剂盒，该试剂盒包含:
(a)包含植物凝集素的组合物，其中，所述植物凝集素与N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺特异性结合；和
(b)使用所述组合物测定来自患有癌症的个体的生物样品中的N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺的水平的说明书或其它试剂。
79.根据权利要求78所述的试剂盒，其中，所述植物凝集素是小麦胚芽凝集素(WGA)或大豆凝集素(SBA)。
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