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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zum Diagnostizieren von
multipler Sklerose und insbesondere ein Verfahren zum Diagnostizieren
von multipler Sklerose durch das Messen von Spiegeln von Antikörpern gegen
Glycane in einer biologischen Probe.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Multiple
Sklerose (MS) ist eine chronische entzündliche Autoimmunkrankheit
des zentralen Nervensystems. Sie ist eine häufige Ursache von bleibenden
Behinderungen bei jungen Erwachsenen. Bei Patienten, die an MS leiden,
zerstört
das Immunsystem die Myelinhülle
von Axonen in dem Gehirn und dem Rückenmark, was eine Vielzahl
neurologischer pathologischer Befunde verursacht. Bei der häufigsten
Form von MS, Rückfallend-Remittierend, folgen
auf Episoden einer akuten Verschlechterung der neurologischen Funktion
(Verschlimmerungen, Anfälle
bzw. Schübe)
partielle oder vollständige
Genesungsperioden (Remissionen), die frei von einer Weiterentwicklung
der Krankheit sind (stabil). Es wurde berichtet, dass neunzig Prozent
der Patienten mit MS anfangs ein klinisch isoliertes Syndrom aufgrund
einer entzündlichen
demyelinisierenden Läsion
in dem Sehnerv, Gehirnstamm oder Rückenmark aufweisen. Ca. dreißig Prozent
dieser Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom machen innerhalb
von 12 Monaten nach dem Erscheinen eine Weiterentwicklung zu klinisch
eindeutiger MS durch. Die anschließende Weiterentwicklung der
Krankheit kann von Patient zu Patient signifikant variieren. Die
Weiterentwicklung kann von einem gutartigen Verlauf bis zu einem
klassischen, rückfallend-remittierenden,
chronischen progressiven oder seltenen fulminanten Verlauf reichen.
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Ein
Verfahren zum Diagnostizieren von MS, welches einen frühen Nachweis
von klinisch eindeutiger MS erleichtert, wäre sowohl dafür wertvoll,
die Krankheit zu bewältigen,
als auch eine Beratung für
den Patienten zu liefern. Beispielsweise könnten Patienten, bei denen
früh klinisch
eindeutige MS diagnostiziert wurde, Behandlungen zur Modifizierung
der Krankheit angeboten werden, von denen kürzlich gezeigt wurde, dass
sie bei früher
MS nützlich
sind.
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Derzeitige
Verfahren zur Bewertung und Verfolgung des Fortgangs von MS basieren
auf der Bewertung und Auswertung der Funktionen der Patienten bei
Anfällen
und der akkumulierten Behinderungen während der Anfälle. Eine
Bewertung, die verwendet wird, um MS zu bewerten, ist die häufig verwendete
Expanded Disability Status Scale (EDSS). Jedoch basiert die EDSS
auf einer subjektiven Bewertung der Patientenfunktionen.
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Verfahren
zur Diagnose können
ebenfalls ein Verfolgen von Gehirnläsionen durch Magnetresonanztomographie
(MRI) oder Testen von Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) auf Oligoklonale
Banden (OCB) beinhalten. MRI ist ein physikalisches Verfahren zur
Bewertung von Gehirnläsionen
und ist für
eine routinemäßige Anwendung
teuer. Darüber
hinaus ist die Korrelation zwischen MRI-Ergebnissen und der Aktivität der Krankheit schlecht.
Die Cerebrospinalpunktion ist ein unangenehmer invasiver Vorgang,
der für
eine routinemäßige Anwendung
nicht geeignet ist. Zusätzlich
bewerten beide Verfahren den Schaden nur, nachdem dieser aufgetreten
ist; kein Verfahren kann das Einsetzen von Anfällen vorhersagen. Ein weiterer
Nachteil beim Testen auf OCB in CSF und bei der MRI als ein Weg,
um MS zu diagnostizieren, ist, dass negative OCB oder MRI das Vorliegen
von MS nicht ausschließen.
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Es
gibt einen Bedarf für
ein Verfahren, das objektiv bewertete Marker verwendet, zum Diagnostizieren von
MS und zum Vorhersagen des Einsetzens von Anfällen bei Patienten, die an
MS leiden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung basiert teilweise auf dem Fund, dass MS-Patienten erhöhte Serumspiegel
von Autoantikörpern
von IgG, IgA, IgM, die an die Glycanstrukturen Glc (α) oder Glc
(α 1–4) Glc
(α) oder
Glc (α 1–4) Glc (β) binden,
im Vergleich zu den Serumspiegeln dieser Autoantikörper bei
gesunden Individuen aufweisen. Zusätzlich sind dieselben Autoantikörper, die
für diese
Glycanstrukturen spezifisch sind, während des Verschlimmerungszustands
im Vergleich zu dem Spiegel erhöht,
der bei Patienten in Remission und gesunden Individuen beobachtet
wird. Eine hohe Korrelation wurde ebenfalls zwischen IgM anti-Glc
(α)-Antikörper-Serumspiegeln
bei weiblichen Personen, klinisch diagnostizierten (rückfallend-remittierenden)
MS-Patienten und dem EDSS (Expanded Disability Status Scale)-Wert bei Frauen beobachtet.
Die hohe Korrelation zeigt an, dass die Spiegel von IgM anti- α-Glucose im Serum als ein klinischer
Ersatzendpunktmarker für
die Aktivität
der Krankheit und ein Weg, die Effizienz einer Arzneimittelverbindung
bei klinischen Versuchen aufzuspüren,
wirken können.
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Ein Überwachen
der Spiegel dieser Antikörper
in dem Blut von Patienten, die in dem Verdacht stehen, MS zu haben,
erleichtert eine schnelle und kosteneffiziente frühe Diagnose
von MS-Patienten und eine frühe Verschreibung
von krankheitsmodifizierenden Arzneimitteln. Ein Überwachen
der Spiegel dieser Antikörper
im Blut von definierten MS-Patienten wird ebenfalls eine schnelle
und kosteneffiziente Überwachung
der Wirkungen von verschriebenen Arzneimitteln und einen frühen Nachweis
von Anfällen
ermöglichen,
was eine frühe prophylaktische
Behandlung ermöglicht.
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Zu
den zusätzlichen
Vorteilen der Erfindung gehört,
dass die Existenz von MS bei Patienten in einem früheren Stadium
der Krankheit festgestellt werden kann, wenn deren Symptome vielen
anderen MS-ähnlichen Krankheiten ähneln können. Eine
frühe Diagnose
erlaubt den Ärzten,
MS früher
in dem Verlauf der Krankheit zu behandeln, wodurch die Schädigung,
die durch die Zerstörung
von Myelin verursacht wird, und die Behinderungen, die diese Zerstörung mit
sich bringt, minimiert oder verhindert werden können. Zusätzlich ermöglichen die hierin offenbarten
Verfahren den Ärzten,
MS-Patienten regelmäßig zu verfolgen,
um die Schwere der Krankheit zu bewerten, um die Therapie zu überwachen
und die Behandlung zu verändern,
sobald Anzeichen für
kommenden Anfälle
erscheinen. Beispielsweise kann eine Zunahme bei den Biomarkern,
die ein Anzeichen für
einen MS-Anfall sind, die Verabreichung an den Patienten von Methylpredison
rechtfertigen, welches ein allgemeines antientzündliches Mittel ist, das üblicherweise
während
Anfällen
verabreicht wird.
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Die
hierin offenbarten Verfahren können
ebenfalls verwendet werden, um die beste Arzneimittelbehandlung
für einen
bestimmten Patienten auszuwählen.
Beispielsweise kann ein Patient den Behandlungsverlauf mit einem
gewissen Arzneimittel beginnen, und die Änderung bei den Markerspiegeln
wird ein Hinweis auf die Wirksamkeit des Arzneimittels sein. Eine
Rückkehr
der Markerspiegel zu einem Krankheitszustand zeigt an, dass das
Arzneimittel Wirksamkeit verliert, und das Arzneimittel kann nach
einem kurzen Zeitraum durch ein zweites Arzneimittel ersetzt werden.
Andernfalls muss ein Arzt auf die nächsten Anfälle warten, um zu bestimmen,
ob das Arzneimittel für
den bestimmten Patienten wirksam ist.
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Die
hierin offenbarten Biomarker können
zusätzlich
als ein Ersatzendpunkt wirken, um die Antwort eines Patienten auf
das getestete Arzneimittel in einer kosteneffizienten Weise zu bewerten.
Ein Ersatzendpunkt, der auf einem serologischen Test basiert, erleichtert
das effiziente Testen von neuen potentiellen MS-Arzneimitteln.
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Unter
einem Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein Verfahren zum
Diagnostizieren von multipler Sklerose in einem Patienten aus. Das
Verfahren beinhaltet das Bereitstellen einer Testprobe aus einem
Patienten und das Nachweisen in der Testprobe wenigstens eines Biomarkers,
der ein Antikörper
ist, welcher spezifisch an eine Glycanstruktur bindet. Der Antikörper kann
z. B. ein anti-Glc (α)-Antikörper, ein
anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörper, ein
anti-Glc (α 1–4) Glc
(β)-Antikörper, ein
anti-Glc (β)-Antikörper, ein
anti-Gal (β)-Antikörper; ein
anti-Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β)-Antikörper, ein
anti-GlcNAc (β 1–4) GlcNAc
(β)-Antikörper, ein
anti-L-Araf (α)-Antikörper, ein
anti-L-Rha (α)-Antikörper, ein
anti-Gal (β 1–3) [GlcNAc
(β 1–6))] GalNAc
(α)-Antikörper, ein
anti-Gal (β 1–4) GlcNAc
(α)-Antikörper, ein
anti-Gal (β 1–3) GalNAc
(α)-, ein
anti-Gal (β 1–3) GlcNAc (β)-, ein anti-GlcA
(β)-Antikörper oder
ein anti-GlcA (β)-Antikörper oder
ein anti-Xyl (α)-Antikörper sein.
Die Spiegel des Antikörpers
oder der Antikörper
in der Testprobe werden mit einer Kontrollprobe verglichen, welche
von einem oder mehreren Individuen, die Symptome multipler Sklerose
zeigen, und denen, die Symptome multipler Sklerose bei einem bekannten
multiple Sklerose-Status aufweisen, oder von einem Individuum oder Individuen,
die keine Symptome multipler Sklerose zeigen, stammt. Der MS-Status
kann z. B. Verschlimmerungen, Anfälle, Remissionen und stabile
Stadien der Krankheit beinhalten.
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Bei
verschiedenen Ausführungsformen
werden wenigstens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17 oder 18 dieser Antikörper
nachgewiesen. Bei einigen Ausführungsformen
ist der in der Testprobe nachgewiesene Antikörper ein anti-Glc (α)-Antikörper, ein
anti-Glc (α 1–4) Glc
(a)-Antikörper
oder sowohl ein anti-Glc (α)-Antikörper als
auch ein anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörper.
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Bei
einigen Ausführungsformen
besteht die Kontrollprobe aus einer Population von einem oder mehreren
Individuen, die keine Symptome einer multiplen Sklerose zeigen.
Bei anderen Ausführungsformen
besteht die Kontrollprobe aus einer Population, die Symptome einer
multiplen Sklerose zeigt. Das Vorliegen von MS in der Kontrollprobe
kann bestimmt werden, indem Techniken, die im Stand der Technik
bekannt sind, z. B. eine Expanded Disability Status Scale (EDSS)-Bewertung
oder eine Magnetresonanztomographie (MRI)-Bewertung oder beide,
verwendet werden.
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Die
Testprobe kann z. B. eine biologische Flüssigkeit sein. Beispiele für biologische
Flüssigkeiten
beinhalten z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Rückenmarkflüssigkeit, Urin oder Speichel.
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Der
Patient kann entweder weiblich oder männlich sein.
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Der
nachgewiesene Antikörper
kann z. B. einer vom Typ IgM oder vom Typ IgA oder ein IgG-Antikörper sein.
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Bei
einigen Ausführungsformen
ist der Typ der multiplen Sklerose, die nachgewiesen wird, eine
frühe multiple
Sklerose.
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Ebenfalls
offenbart wird ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Verschlimmerung
der multiplen Sklerose in einem Patienten. Das Verfahren beinhaltet
das Bereitstellen einer Testprobe aus einem Patienten und das Nachweisen
eines anti-Glc (α)-Antikörpers vom
Typ IgM und/oder eines anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörpers vom
Typ IgM in der Testprobe. Die Spiegel des Antikörpers in der Testprobe werden
mit einer Kontrollprobe verglichen, welche von einem oder mehreren
Individuen stammt, deren multiple Sklerose-Status bekannt ist.
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Die
Kontrollprobe besteht aus einer Population von einem oder mehreren
Individuen, die keine Symptome einer Verschlimmerung der multiplen
Sklerose zeigen und deren multiple Sklerose-Status in Remission ist.
Eine Verschlimmerung der multiplen Sklerose wird in dem Patienten
diagnostiziert, wenn mehr anti-Glc (α)-Antikörper oder anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörper in
der Testprobe vorliegen als in der Kontrollprobe. Die Kontrollprobe
besteht aus einer Population von einem oder mehreren Individuen,
die Symptome einer Verschlimmerung der multiplen Sklerose zeigen,
und eine Verschlimmerung der multiplen Sklerose wird in dem Patienten
diagnostiziert, wenn die Spiegel eines anti-Glc (α)-Antikörpers vom
Typ IgM und/oder eines anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörpers vom
Typ IgM in ähnlichen
Mengen in der Testprobe und der Kontrollprobe vorliegen.
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Die
Testprobe kann z. B. eine biologische Flüssigkeit sein. Beispiele für biologische
Flüssigkeiten
beinhalten z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Rückenmarkflüssigkeit, Urin oder Speichel.
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Der
Patient kann entweder weiblich oder männlich sein.
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Der
nachgewiesene Antikörper
kann z. B. einer vom Typ IgM oder ein Antikörper vom Typ IgA oder IgG sein.
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Die
Diagnose ist eine frühe
Diagnose der Verschlimmerung der multiplen Sklerose.
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Der
Patient wurde mit einem MS-Therapiemittel, z. B. Interferon beta
oder Glitamereracetat, das subkutan verabreicht wurde, behandelt.
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Ebenfalls
offenbart wird ein Verfahren zum Bewerten der Schwere der multiple
Sklerose-Krankheit
in einem Patienten. Das Verfahren beinhaltet das Bereitstellen einer
Testprobe aus einem Patienten und das Bestimmen, ob die Testprobe
einen anti-Glc (α)-Antikörper vom
Typ IgM und/oder einen anti-Glc (α 1–4) Glc (α)-Antikörper vom
Typ IgM enthält.
Die Menge des Antikörpers
in der Testprobe wird verglichen mit der Menge des Antikörpers in
der Kontrollprobe, welche aus einem oder mehreren Individuen stammt,
deren Schwere der multiple Sklerose-Krankheit bekannt ist.
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Die
Kontrollprobe besteht aus einer Population von einem oder mehreren
Individuen, deren Schwere der multiple Sklerose-Krankheit durch
die Expanded Disability Status Scale (EDSS), Änderungen bei einem EDSS-Wert
oder eine Magnetresonanztomographie (MRI)-Bewertung definiert ist.
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Die
Testprobe kann z. B. eine biologische Flüssigkeit sein. Beispiele für biologische
Flüssigkeiten
beinhalten z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Rückenmarkflüssigkeit, Urin oder Speichel.
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Wenn
gewünscht
kann das Verfahren weiterhin das Auswählen eines therapeutischen
Mittels zur Behandlung von multipler Sklerose beinhalten, indem
ein therapeutisches Mittel und ein Dosierungsregime auf der Basis
der relativen Spiegel des Antikörpers
oder der Antikörper
in der Testprobe und in der Kontrollprobe ausgewählt werden.
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Höhere Spiegel
der Antikörper
in der Testprobe in Bezug auf die Kontrollprobe indizieren die Auswahl eines
therapeutischen Mittels und Dosierungsregimes an, welches eine subkutane
Verabreichung von Interferon beta (BETAFERON®; AVONEX®;
REBIF®)
oder eine subkutane Verabreichung von Glitamereracetat (COPAXONE®)
ist.
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Der
Patient kann entweder weiblich oder männlich sein.
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Ebenfalls
wird von der Erfindung ein Kit zum Diagnostizieren von Symptomen,
die mit multipler Sklerose zusammenhängen, bereitgestellt. Das Kit
beinhaltet ein erstes Reagens, welches spezifisch einen anti-Glc
(α)-Antikörper nachweist,
ein zweites Reagens, welches spezifisch einen anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörper nachweist,
und Anleitungen zur Verwendung des Kits. Das Kit beinhaltet gegebenenfalls
ein Reagens, das spezifisch einen Antikörper vom Typ IgM nachweist.
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Ebenfalls
innerhalb der Erfindung liegen Substrate, die Reagenzien einschließen, die
spezifisch die hierin offenbarten Antikörper, z. B. einen anti-Glc
(α)-Antikörper, einen
anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörper, einen anti-Glc
(α 1–4) Glc
(β)-Antikörper, einen
anti-Glc (β)-Antikörper, einen
anti-Gal (β)-Antikörper; einen
anti-Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β)-Antikörper, einen
anti-GlcNAc (β 1–4) GlcNAc
(β)-Antikörper, einen
anti-L-Araf (α)-Antikörper, einen
anti-L-Rha (α)-Antikörper, einen
anti-Gal (β 1–3) [GlcNAc
(β 1–6)] GalNAc
(α)-Antikörper, einen
anti-Gal (β 1–4) GlcNAc
(α)-Antikörper, einen
anti-Gal (β 1–3) GalNAc
(α)-, einen
anti-Gal (β 1–3) GlcNAc (β)-, einen
anti-GlcA (β)-Antikörper oder
einen anti-GlcA (β-Antikörper oder
einen anti-Xyl (α)-Antikörper, nachweisen.
Das Substrat kann z. B. planar sein.
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Weiter
offenbart wird ein Verfahren zum Auswählen eines therapeutischen
Mittels zur Behandlung von multipler Sklerose. Das Verfahren beinhaltet
das Bereitstellen einer Testprobe aus einem Patienten, bei dem multiple
Sklerose diagnostiziert wurde oder der ein Risiko dafür aufweist,
und das Bestimmen, ob die Testprobe einen anti-Glc (α)-Antikörper enthält. Die
Spiegel des Antikörpers
in der Testprobe werden mit den Spiegeln des Antikörpers in
einer Kontrollprobe verglichen, die aus einem oder mehreren Individuen
besteht, deren Schwere der multiple Sklerose-Krankheit bekannt ist.
Ein therapeutisches Mittel und ein Dosierungsregime werden auf der
Basis der relativen Spiegel des Antikörpers in der Patientenprobe
und der Kontrollprobe ausgewählt.
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Das
Verfahren beinhaltet weiterhin die Bestimmung, ob die Testprobe
einen anti-Glc (α 1–4) Glc (α)-Antikörper enthält, und
das Vergleichen der Spiegel des anti-Glc (α 1–4) Glc (α)-Antikörpers in der Testprobe mit
Spiegeln des Antikörpers
in einer Kontrollprobe, die aus einem oder mehreren Individuen besteht,
deren Schwere der multiple Sklerose-Krankheit bekannt ist.
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Die
Kontrollprobe besteht aus einem oder mehreren Individuen, deren
Status keine multiple Sklerose oder eine stabile multiple Sklerose
ist.
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Sofern
nicht anders definiert haben alle technischen und wissenschaftlichen
Ausdrücke,
die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung wie sie üblicherweise
von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu welchem diese
Erfindung gehört,
verstanden wird. Auch wenn Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent
zu den hierin beschriebenen sind, bei der Praktizierung und dem
Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden
geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. In
dem Fall eines Konflikts geht die vorliegende Beschreibung, einschließlich der
Definitionen, vor. Zusätzlich
sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend
und nicht dazu gedacht, beschränkend
zu sein.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten
Beschreibung und den Ansprüchen
klar werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
den Entscheidungsbaum zur Bestimmung, dass ein Patient, bei dem
MS vermutet wird, tatsächlich
MS hat.
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2 zeigt
den Entscheidungsbaum zur Auswahl eines Arzneimittels und einer
Dosis für
einen MS-Patienten auf der Basis der Spiegel von anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)- oder
Glc (α)-Antikörpern.
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3 zeigt
den Entscheidungsbaum zur Vorhersage und frühen Diagnose von Anfällen bei
MS-Patienten.
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4 ist
eine Tabelle, welche die relative Fluoreszenz aus der Bindung von
verschiedenen anti-Glycan-Antikörpern
bei MS-Patienten wie auch bei normalen Individuen zeigt. Die Glycanstrukturen
sind in der obersten Zeile der Tabelle in LINEARCODE®-Syntax
dargestellt.
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5 zeigt
das durchschnittliche und das Median-Signal für anti-Glycan-Antikörper gegen
verschiedene Glycane aus Seren, die von MS-Patienten entnommen wurden,
gegenüber
normalen Kontrollseren. Die Glycanstrukturen werden in LINEARCODE®-Syntax dargestellt.
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6 ist
ein Schaubild, welches die Unterschiede zwischen durchschnittlichen
Signalen von MS- und gesunden Individuen zeigt, wobei die Balken
die Standardabweichung darstellen. Die Glycanstrukturen sind in LINEARCODE®-Syntax
dargestellt.
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7A ist ein Schaubild, welches das durchschnittliche
Signal aus der Bindung von anti Glc (α) (Glycan #11) und Glc (α 1–4) Glc
(α) (Glycan
#12) IgM bei MS- und gesunden Populationen zeigt.
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7B ist ein Schaubild, welches das durchschnittliche
Signal aus der Bindung von anti Glc (α) Glycan #11 und Glc (α 1–4) Glc
(α) Glycan
#12 IgM bei MS-Patienten während
eines Anfalls, stabilen MS-Patienten und gesunden Populationen zeigt.
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8 ist
ein Schaubild, welches die Korrelation zwischen der relativen Fluoreszenz
aus der Adhäsion von
anti-Glucose alpha-IgM-Antikörpern
in Proben von anti-Glc (α)-positiven
MS-Patienten (linker Kasten), negativen MS-Patienten (rechter Kasten)
und deren EDSS-Spiegel
zeigt.
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9 ist
ein Schaubild, welches die temporäre Stabilität des Signals aus der Bindung
von IgM-, IgG- und IgA-anti-Glycan-Antikörpern über 13 Wochen bei 7 gesunden
Individuen zeigt.
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10A–10E zeigen den Glycanarray; die chemische
Struktur, Spezifität
der Lektinwechselwirkung und Reproduzierbarkeit. 10A zeigt
ein p-Aminophenyl-P-saccharid, das an seinem reduzierenden Ende über einen
Linker kovalent mit einer festen Oberfläche verknüpft ist.
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10B zeigt die Reproduzierbarkeit von Charge
zu Charge der Bindung von biotinyliertem WGA an den Glycanarray.
Drei separate Chargen von Arrays wurden gleichzeitig mit biotinyliertem
WGA getestet.
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10C zeigt einen Kompetitionstest mit ConA
an gebundenem Man (a). Steigende Konzentrationen von löslicher
Mannose oder Gal (β 1–4) Glc
wurden mit biotinyliertem ConA (1,5 μg/ml) für 1 h inkubiert und mit Streptavidin,
das mit Europium konjugiert war, nachgewiesen.
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10D zeigt die Spezifität der Lektinbindung an verschiedene
Anomere. ConA-Bindung an die negative Kontrolle Glycerol (19), Man
(α) (26)
und Man (β)
(27). GSI-Bindung an Gal (α)
(1), Gal (β)
(2), GalNAc (α)
(7) und GalNac (β)
(8).
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10E zeigt die Reproduzierbarkeit von Platte
zu Platte des Glycanarrays. Fünf
identische Platten, die GlcNac (β)
präsentierten,
wurden mit biotinyliertem WGA sondiert.
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11 zeigt
das Glycanbindungsprofil einer gesunden menschlichen Population.
Die anti-Kohlenhydrat-Antikörperbindung
an sortierte Glycane (siehe Tabelle 5 für die Glycanstrukturen) in
Serumproben von 72 Individuen, wie sie mit biotinyliertem Protein
A gemessen wurde. Jeder Punkt steht für den Durchschnitt von zwei
Experimenten, die jeweils vierfach durchgeführt wurden. Der Kasten beinhaltet
Signale von 50% der Population. Die dicken und dünnen Linien in dem Kasten stehen
für die
Mittel- bzw. die Medianwerte. Die Grenze des Kastens am nächsten zu
Null zeigt die 25. Perzentile, und die Grenze des Kastens am weitesten
weg von Null zeigt die 75. Perzentile. Querstriche über und
unter dem Kasten zeigen die 90. und die 10. Perzentile. Der Spiegel
des gemessenen nicht spezifischen Signals wurde empirisch definiert;
Glycane, gegenenüber
welchen die Antikörperspiegel
als relativ niedrig und zwischen den Experimenten als hoch variabel
gefunden wurden, wurden bezeichnet, um den Hintergrundspiegel zu
definieren (nicht gezeigt). Der durchschnittliche Signalwert für diese
Glycane wurde berechnet und von dem Signal abgezogen, das für jede Serumprobe
und jedes bestimmte Glycan erhalten wurde. Der durchschnittliche
Hintergrund betrug 3 × 105 RFU. TEST ist Tris-gepufferte Salzlösung mit
Tween-20 (siehe Versuchsvorschrift).
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12 zeigt
die Signale von individuellen Seren gegenüber einer Reihe von Glycanen.
Die anti-Glycan-Antikörperbindung,
die in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) gemessen wurde, wurde
unter Verwendung eines Histogrammausgleichs-ähnlichen Verfahrens transformiert,
welches eine monotone, nicht lineare Funktion (mapping) einsetzt.
Auf diesem Weg wurden die RFU-Werte erneut in dem Bereich zwischen
0 (blau) und 255 (rot) eingeordnet. Die Daten wurden unter Verwendung
eines simulierten Annealing-Algorithmus geclustert.
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13A–13C zeigen das Bindungsprofil von affinitätsgereinigten
(A) anti-L-Rha (α)-(B)
anti-GlcNAc (α)-
und anti-GlcNAc (β 1–4) GlcNAc
(β)- und
(C) anti-Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β)- und
anti-GlcNAc (β 1–4) GlcNAc
(β)-Antikörpern an
ein Array von 33 Glycanen. Die Glycanstrukturen werden in Tabelle
5 beschrieben. Die Menge des Antikörpers, die gebunden wurde,
wurde gemessen, indem biotinylierter Ziegen-anti-human lgG-Antikörper verwendet
wurde.
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14A und 14B zeigen
die Spezifität
des anti-Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β)-Antikörpers. (A) Kompetitive
Inhibition der anti-Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β)-Antikörperbindung.
Inhibition der Bindung von affinitätsgereinigtem anti-Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β)-Antikörper an
p-Aminophenyl-β-Glc
(β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β), immobilisiert
an der Oberfläche
der Vertiefung, als eine Funktion der Glc (β 1–4) Glc (β 1–4) Glc- oder Gal (β 1–4) Glc-Konzentration. Die
Menge an gebundenem Antikörper
wurde gemessen, indem biotinylierter Ziegen-anti-human IgG-Antikörper verwendet
wurde. (B) Bindung von anti-Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β)-(A) und
anti-L-Rha (α)-Antikörpern (B)
an ihr zugehöriges
Saccharid nach Inkubation mit kristalliner oder amorpher Cellulose.
Die Menge an gebundenem Antikörper
wurde gemessen, indem biotinylierter Ziegen-anti-human IgG-Antikörper verwendet
wurde.
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15A–15C sind grafische Darstellungen der Bindung von
IgG-, IgA- und IgM-Isotypen von gesunden Individuen an die angegebenen
Glycane.
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16A ist eine Matrixdarstellung von Glycanen, die
verwendet wurden, um Seren von Atherosklerosepatienten zu untersuchen,
die an instabiler oder stabiler Angina litten. Glycane, gegenüber denen
signifikant verschiedene Antikörperspiegel
bei den verschiedenen Patientengruppen gemessen wurden, sind mit
gefüllten
Kästchen
markiert. Die Glycane sind in Tabelle 4 aufgelistet.
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16B ist eine grafische Darstellung, welche die
Spiegel von Antikörpern
gegen die Glycane #2 und #29 in den drei Patientengruppen zeigt;
instabil, stabil und nicht atherosklerotisch. Der Kasten beinhaltet
Signale von 50% der Population. Die dicken und dünnen Linien in dem Kasten stehen
für die
Mittel- bzw. die Medianwerte. Die Grenze des Kastens am nächsten zu
Null zeigt die 25. Perzentile, und die Grenze des Kastens am weitesten
weg von Null zeigt die 75. Perzentile. Querstriche über und
unter dem Kasten zeigen die 90. und die 10. Perzentile.
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17 ist
ein Histogramm, welches die Anzahl an Proben in den drei Patientengruppen
zeigt, die für anti-IgA-Antikörper gegen
das Glycan #2 oder das Glycan #29 positiv waren.
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18A ist ein Histogramm, welches die Verteilung
von Antikörperspiegeln
gegen die Glycane #2 und #15 in den drei Patientengruppen zeigt.
Der Kasten beinhaltet Signale von 50% der Population. Die dicken
und dünnen
Linien in dem Kasten stehen für
die Mittel- bzw. die Medianwerte. Die Grenze des Kastens am nächsten zu
Null zeigt die 25. Perzentile, und die Grenze des Kastens am weitesten
weg von Null zeigt die 75. Perzentile. Querstriche über und
unter dem Kasten zeigen die 90. und die 10. Perzentile.
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18B ist ein Histogramm, welches die Anzahl an
Proben in den drei Patientengruppen zeigt, die für anti-IgA-Antikörper gegen
das Glycan #2 oder das Glycan #15 positiv waren.
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19 ist
eine grafische Darstellung der Spezifität und Empfindlichkeit auf der
Basis der anti-IgA-Antikörperspiegel
gegen Glycan #2, Glycan #15, Glycan #17 und Glycan #49. A – Atherosklerose;
S – Stabil;
US – Instabil;
NA – Keine
Atherosklerose.
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20 ist
ein Histogramm, welches das Bindungsprofil von CD4+-Zellen aus einem
einzigen Individuum an verschiedene Glycane zeigt. Die Glycanstrukturen
sind in der LINEARCODE®-Syntax dargestellt.
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21A ist ein Schaubild, welches den Median der
relativen Fluoreszenz für
CD4+-Zellen aus jedem der sieben Individuen zeigt. Die Glycanstrukturen
sind in der LINEARCODE®-Syntax dargestellt.
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21B zeigt die Signale von individuellen Seren
gegenüber
einer Reihe von Glycanen. Die anti-Glycan-Antikörperbindung, die in relativen
Fluoreszenzeinheiten (RFU) gemessen wurde, wurde unter Verwendung
eines Histogrammausgleichs-ähnlichen
Verfahrens transformiert, welches eine monotone, nicht lineare Funktion
einsetzt. Auf diesem Weg wurden die RFU-Werte erneut in dem Bereich
zwischen 0 (blau) und 255 (rot) eingeordnet. Die Daten wurden unter
Verwendung eines simulierten Annealing-Algorithmus geclustert.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
hierin bereitgestellten Verfahren erlauben eine frühe Diagnose
von anfänglicher
und wieder auftretender multipler Sklerose unter Verwendung von
objektiv bewerteten Biomarkerspiegeln. Der derzeitige Entscheidungsbaum
zum Diagnostizieren eines Patienten mit MS ist in 1 beschrieben.
Ein Patient mit einer akuten Verschlechterung der neurologischen
Funktion muss zuerst als ein definierter MS-Patient diagnostiziert werden,
bevor dieser für
eine Behandlung mit krankheitsmodifizierenden Arzneimitteln in Frage
kommt. Der Arzt muss bestimmen, ob der Patient MS-ähnliche
Symptome (wie z. B. Schlaganfall bei Jüngeren (Younger stroke), Lupus,
Vitamin B-12-Mangel, Antiphospholipidsyndrom, schwere Migräne) aufweist
oder ob dieser tatsächlich
MS hat. Der Patient muss eine zweite akute Verschlechterung der
neurologischen Funktion (Anfall) erleiden, bevor er als ein MS-Patient
diagnostiziert wird und in der Lage ist, eine dauernde Behandlung
mit einem therapeutischen MS-Mittel wie z. B. Interferon beta oder
Glatirameracetat zu beginnen.
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Derzeit
verwenden Ärzte
eine MRI zur Identifizierung des Vorliegens von Gehirnläsionen und/oder
des Testens der Cerebrospinalflüssigkeit
(CSF) auf Oligoklonale Banden (OCB). Wenn die MRI ein klares Ergebnis in
Bezug auf das Vorliegen von Gehirnläsionen oder das Vorliegen von
OCB in der CSF ergibt, kann der Arzt die Behandlung unverzüglich beginnen,
um stumme Gehirnläsionen
zu verhindern. Eine Diagnose zur vollständigen MS-Diagnose wird derzeit
nur nach dem zweiten Anfall durchgeführt. In dem Fall, dass die
MRI kein klares Ergebnis ergibt oder es keine OCB in der CSF der
Patienten gibt, wird keine MS diagnostiziert und die Behandlung
wird bis nach einem zweiten Anfall verzögert.
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Das
hierin offenbarte Verfahren kann durchgeführt werden, indem Blut aus
einem Patienten mit akuter Verschlechterung der neurologischen Funktion
und welcher im Verdacht steht, MS zu haben, entnommen wird. Das
Verfahren kann die Existenz von MS identifizieren, indem der anti-Glc
(α) und
anti-Glc (α 1–4) Glc
(α) IgM-Spiegel
gemessen wird. Wenn der Spiegel von wenigstens einem dieser Antikörper signifikant
höher ist als
der durchschnittliche Spiegel dieser Antikörper in Seren von gesunden
Individuen, wird der Patient als ein MS-Patient diagnostiziert,
ohne dass die Notwendigkeit besteht, auf einen zweiten Anfall zu
warten. Zusätzlich erlaubt
die schnelle Diagnose, dass die Behandlung unverzüglich beginnt.
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Eine
erste Behandlungslinie für
MS ist Interferon β (z.
B. INFβ-1a
und INFβ-1b).
Die derzeitige Auswertung der Wirksamkeit und der benötigten Dosierung
des Arzneimittels basiert auf einer fortgesetzten Überwachung
mehrerer klinischer Werte. Derzeit ist der EDSS-Wert und dessen
Veränderung über die
Zeit (z. B. durch ein Vergleichen des Unterschieds bei dem EDSS
alle 3–6
Monate) der wichtigste klinische Parameter für die Bewältigung der Krankheit. Eine
wichtige Komponente der Bewertung ist der Grad der Ermüdung und Depression,
der von dem Patienten erfahren wird. Die Ermüdung und oder Depression kann
ein Symptom der MS, als einer Autoimmunkrankheit, oder eine Nebenwirkung
von der Verwendung von Interferon beta sein. Ein Identifizieren
der Ursache der Ermüdung
ist wichtig, um die Behandlung zu bewältigen. Wenn beispielsweise die
Ermüdung
ein Ergebnis einer Nebenwirkung des Interferons ist, wird der Arzt
eine Verringerung der Dosis oder sogar den Austausch von diesem
durch ein anderes Arzneimittel in Betracht ziehen. Wenn jedoch die
Ermüdung
auf den MS-Symptomen beruht, wird der Arzt eine Erhöhung der
Arzneimitteldosis in Betracht ziehen müssen (siehe 2).
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Ein
Screenen des Bluts des Patienten und ein Bestimmen des Spiegels
von hierin offenbarten Biomarkern, z. B. den IgM-Antikörpern anti
Glc (α)
und anti Glc (α 1–4) Glc
(α), erlaubt
hierin eine genaue Überwachung
der Therapie. Signifikante Abnahmen bei den Antikörperspiegeln
zeigen, dass der Patient gut auf das gegebene Arzneimittel anspricht.
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Früher Nachweis von Anfällen
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Derzeit
gibt es keinen Weg, das Einsetzen von Anfällen bei MS-Patienten vorherzusagen.
MRI und klinische Auswertung der Patienten können nur eine Schädigung zeigen,
die bereits aufgetreten ist. Eine periodische Messung des Spiegels
einiger weniger anti-Glycan-Antikörper (beispielsweise anti-Glc
(α) IgM
oder anti-Glc (α 1–4) Glc
(α) IgM)
im Blut des Patienten gemäß dem hierin
beschriebenen Verfahren erlaubt den Ärzten, bevorste hende Anfälle auf
der Basis einer Zunahme bei den Spiegeln dieser Antikörper zu
identifizieren. Die Spiegel dieser Antikörper sind in dem Blut von Patienten
in Situationen bei MS-Anfällen
gegenüber Patienten
in einem stabilen Zustand signifikant höher (siehe 7).
Beim Nachweis einer Zunahme bei diesen Antikörpern kann der Arzt mit einer
aggressiven Steroidbehandlung beginnen, um die Entzündung zu
verringern und eine Schädigung
für das
Myelin zu verhindern (siehe 3).
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Ebenfalls
hierin bereitgestellt werden Verfahren zum Identifizieren und Bewerten
von Individuen mit Atherosklerose mit einem Risiko für stabile
und instabile Angina unter Verwendung von Antikörperbiomarkern, die für Glycane
spezifisch sind, wie auch die Verwendung von immobilisierten Glycanen,
um Zellen von Interesse nachzuweisen.
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Verschiedene
Glycanstrukturen werden in dieser Anmeldung diskutiert. Die Glycane
werden entweder in der Kurzform der International Union of Pure
and Applied Chemistry (IUPAC) für
die Nomenklatur der Darstellung von Kohlenhydraten oder in der LINEARCODE®-Syntax
dargestellt; für
die Prinzipien der Linearcode-Syntax siehe (Banin E. Neuberger Y.
Altshuler Y. Halevi A. Inbar O. Dotan N. und Dukler A. (2002) A
Noval Liner Code Nomenclature for complex Carbohydrates. Trends
in Glycoscience and Glycotechnology Bd. 14 Nr. 77 Seiten 127–137). Die Übersetzung
von LINEARCODE in die IUPAC-Darstellung
findet man in Tabelle 1. All die Glycanstrukturen, die in dieser
Offenbarung diskutiert werden, sind, sofern nichts anderes erwähnt ist,
in der angegebenen Anomerie α oder β über einen
Linker mit der festen Phase verbunden, wie in 10A beschrieben ist.
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Die
Erfindung wird in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen veranschaulicht.
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Beispiel 1. Vergleich zwischen anti-Glycan-Antikörpern in
dem Serum von multiple Sklerose (MS)-Patienten und einer normalen
Population
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Ein
anti-Glycan-Antikörper
(Igs)-Profil wurde erhalten, indem GlycoChip
®-Arrays
(Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Kat.-Nr. 9100) verwendet wurden.
Die Arrays wurden konstruiert, indem in der
WO 00/49412 beschriebene Prozeduren
verwendet wurden. Anti-Glycan-Antikörperprofile
von 40 multiple Sklerose-Patienten und 40 in Geschlecht und Alter
entsprechenden normalen Blutspendern wurden verglichen.
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Alle
Serumproben wurden getestet, indem GlycoChip®-Platten
(Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Kat.-Nr. 9100) verwendet wurden,
wobei diese ein Array von Mono- und Oligosacchariden waren, die
kovalent an einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen mit reduziertem
Volumen befestigt waren. Die Mono- und Oligosaccharide, die auf
dem Array präsentiert
wurden, sind in 4 aufgelistet. Eine Übersetzung
der LinearCodeTM Syntax, die verwendet wurde,
um die Glycanstruktur zu beschreiben, in IUPAC-Nomenklatur kann
man in Tabelle 1 finden.
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Die
Seren von gesunden Freiwilligen und freiwilligen MS-Patienten, die
ein Formblatt zur informierten Zustimmung unterschrieben hatten,
wurden in evakuierten siliziumbeschichteten Gel enthaltenden Röhrchen (Estar
Technologies Kat# 616603GLV) gesammelt. Die Seren wurden von den
Blutzellen getrennt und bis zur Verwendung eingefroren bei –25°C aufbewahrt.
Sie wurden in zwei getrennten Experimenten analysiert, die jeweils
an separaten Tagen zweimal wiederholt wurden.
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Seren
von Freiwilligen wurden in TEST verdünnt (1:20), in einer GlycoChip®-Platte
unter Verwendung eines Tecan Genesis Workstation 200 Roboters (10 μl/Vertiefung)
verteilt und 30 min bei 25°C
inkubiert. Es gab 4 Wiederholungen für jede Glycan- und Serumprobe
auf der Platte.
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Die
Platten wurden mit 250 μl/Vertiefung
Hochsalzpuffer (0,15 M KNa pH 7,2, NaCl 2 M, MgSO4 0,085 M,
0,05% Tween 20) in einem automatischen Plattenwäscher (Tecan, PowerWasherTM) gewaschen. Zehn μl/Vertiefung biotinyliertes
Protein A (ICN 62–265),
1 μg/ml
in TEST, wurden manuell verteilt und die Platten für 30 min
bei 25°C
inkubiert. Die Platte wurde wieder mit Hochsalzpuffer gewaschen.
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Streptavidin-konjugiertes
Europium, Wallac, AD0062 (1 μ/ml,
10 μl/Vertiefung)
wurde manuell zugegeben, worauf eine Inkubation für 30 min
bei 25°C
im Dunklen folgte. Das Waschen den Platten mit dem Hochsalzpuffer
wurde wiederholt. DelfiaTM-Verstärkungspuffer
(Wallac, 730232, 10 μl/Vertiefung)
wurde zu den Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurden wenigstens
30 min im Dunklen inkubiert. Die Fluoreszenz der Vertiefungen wurde
mit einem Victor 1420 (Wallac) abgelesen, indem zeitaufgelöste Fluoreszenzeinstellungen von
Emi. 612 nm und Ext. 340 nm verwendet wurden.
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Die
Profile von all den getesteten Patienten werden in 4 gezeigt.
Die oberen 40 Zeilen (MS) beschreiben den anti-Kohlenhydrat-Spiegel
von MS-Proben, und die unteren 40 Zeilen (NC) beschreiben den anti-Kohlenhydrat-Spiegel
von Proben aus der normalen Kontrollpopulation. Die dargestellten
Werte sind absolute Werte ohne Abzug des Hintergrunds. Da der Nachweis
von gebundenen Antikörpern
mit biotinyliertem Protein A durchgeführt wurde, welches an IgG,
IgA und IgM bindet, stellt das Signal die gesamte Antikörperbindung
von allen Untertypen IgG, IgA und IgM dar.
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Ein
Vergleich zwischen den durchschnittlichen und Medianwerten von anti-Kohlenhydrat-Antikörpern in
der MS- und normalen Population zeigt signifikante Unterschiede
zwischen den Proben aus den MS-Patienten und den Proben aus der
normalen Population, siehe 5. Ein Beispiel
eines Hauptunterschieds, der zwischen den zwei Gruppen beobachtet
wurde, ist das durchschnittliche Signal auf das Glycan Ga4Gb. Ein t-Test
zeigte, dass der Unterschied in hohem Maße statistisch signifikant
ist (α =
0,05; p < 0,001).
Ein anderes Beispiel ist Ab3(GNb6)ANa, (α = 0,05; p < 0,001). Es gibt signifikante Unterschiede
zwischen den Medianen von Signalen der MS- und der normalen Population
bezüglich
Antikörpern,
die an die folgenden Glycane gebunden wurden: Glc (α), Glc (α 1–4) Glc
(α), Glc
(α 1–4) Glc
(β), Glc
(β), Gal
(β), Glc
(β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc (β), GlcNAc
(β 1–4) GlcNAc
(β), L-Araf
(α), L-Rha
(α), Gal
(β 1–3) [GlcNAc
(β 1–6)] GalNAc
(α), Gal
(β 1–4) GlcNAc
(α), Gal
(β 1–3) GlcNAc
(α), Gal
(β 1–3) GlcNAc
(β), GlcA
(β), GlcA
(β), Xyl
(α). Das
Signal von gebundenen Antikörpern
in der MS-Gruppe ist höher
als das Signal in der normalen Kontrollgruppe.
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6 stellt
den Unterschied zwischen den durchschnittlichen Bindungswerten von
anti-Glycan-Antikörpern zwischen
den Populationen dar.
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Referenzbeispiel 2. Unterschiede bei den
Spiegeln von anti-Glc (α)-
und anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-IgM-Antikörpern in
dem Serum zwischen MS-Patienten bei einem Anfall, stabilen MS-Patienten
und einer gesunden Population.
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Ein
Glycanarray wurde verwendet, um nach Biomarkern in dem menschlichen
glycanbindenden Serumantikörperrepertoire
zu suchen, um zwischen einer gesunden Population und einer Gruppe
von Multiple Sklerose (MS)-Patienten und zwischen MS-Patienten in
Verschlimmerungs- und Remissionsstadien zu differenzieren. Dieses
Beispiel zeigt, dass zwei IgM-Antikörper, anti-Glc (α) und anti-Glc
(α 1–4) Glc
(α), mit
signifikant höheren Spiegeln
in MS-Patienten als bei gesunden Personen (Empfindlichkeit und Spezifität von 60% bzw.
93%) und in MS-Patienten in einem Verschlimmerungsstadium in Bezug
auf Patienten in einem Remissionsstadium (Empfindlichkeit und Spezifität von 89%
bzw. 71%) gefunden werden. Ebenfalls bereitgestellt wird an anti-Glycan-Antikörperprofil
für eine
gesunde Population, einschließlich
eines Variationsbereichs während eines
Intervalls von 13 Wochen.
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Die
temporäre
Stabilität
des anti-Glycan-Antikörperprofils über 13 Wochen
bei anscheinend gesunden Individuen war hoch. Die niedrigen Spiegel
von anti-Glc (α)
und anti-Glc (α 1–4) Glc
(α) IgM
in einer normalen Population und deren hoher Spiegel in MS-Patienten
und die hohe temporäre
Stabilität
von anti-Glycan-Antikörpern
legt nahe, dass diese anti-Glc
(α) und
anti-Glc (α 1–4) Glc
(α) IgM
als Biomarker für
eine frühe
Diagnose, eine früher
Verschreibung von Arzneimitteln, die Überwachung von Arzneimittelwirkungen
und einen frühen
Nachweis von Anfällen
dienen können.
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Alle
Serumproben wurden getestet, indem ein GlycoChip
® (Glycominds
Ltd., Lod, Israel) verwendet wurde. Die Glycane wurden kovalent über einen
Linker wie früher
beschrieben (
WO 02/064556 )
an die Kunststoffoberfläche
gebunden. Eine Liste, welche die getesteten Mono- und Oligosaccharide
beschreibt, wird in Tabelle 1 bereitgestellt.
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Blutproben
wurden von anscheinend gesunden Blutspendern unter einem Protokoll
zur informierten Zustimmung, das von den Helsinki Human Studies
Ethical Committees des Belinson Medical Center in Tel-Aviv, Israel,
und Carmel Medical Center in Haifa, Israel anerkannt ist, erhalten.
Blutproben wurden von MS-Patienten gesammelt, die in der Multiple
Sklerose Klinik im Carmel Medical Center in Haifa, Israel, eingewiesen
waren. Die Blutproben wurden in evakuierten siliziumbeschichteten
Röhrchen
gesammelt, welche Gel zur Trennung der Seren von dem Blutklumpen
enthielten (Estar Technologies). Nach Koagulation des Blutes wurde
Serum durch Zentrifugation abgetrennt und gesammelt. Proben wurden
eingefroren bei –25°C gelagert, bis
sie verwendet wurden.
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Das
Volumen aller Lösungen,
die zu dem Glycanarray zugegeben wurden, betrug 10 μl/Vertiefung.
Die Seren wurden verdünnt
(1:20; Sättigungskonzentration)
in 0,15 M Tris-HCl
pH 7,2, 0,085 M Mg2SO4,
0,05% Tween 20 (TEST), welcher 1% BSA (Sigma) enthielt, in Glycanarrayplatten
verteilt, indem ein automatisiertes Behandlungssystem Tecan Genesis
Workstation 200 verwendet wurde, und für 60 min bei 37°C inkubiert.
Die Platten wurden dann mit 250 μl/Vertiefung
phosphatgepufferter Salzlösung
mit 0,05% Tween 20 (PEST, Sigma) in einem automatischen Plattenwäscher (Tecan,
PowerWasherTM) gewaschen. An diesem Punkt
wurden die folgenden Reagenzien, verdünnt in TEST mit 1% BSA, unter
Verwendung eines Multidrop 384 Dispensers (Thermo Labsystems) zugegeben
und für
60 min bei 37°C
inkubiert: zur Bestimmung von IgG, IgA und IgM – der entsprechende unterklassenspezifische
biotinylierte Ziegen-anti-human Ig-Antikörper (Jackson, PA, USA) mit
2,8 μg/ml,
3 μg/ml
bzw. 0,9 μg/ml;
zur Bestimmung der gesamten Ig-biotinyliertes
Protein A (1 μg/ml,
ICN Biomedicais). Nach Waschen mit PEST wurde mit Streptavidin konjugiertes
Europium (0,1 μg/ml),
verdünnt
in TEST mit 1% BSA, zu jeder Vertiefung zugegeben, worauf eine Inkubation
für 30
min bei 37°C
im Dunklen und Waschen mit PEST folgten. Dann wurde DelfiaTM-Verstärkungslösung zu
den Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurden für 30 bis
45 min im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz
der Vertiefungen wurde mit einem Victor 1420 (Wallac, Finnland)
Plattenlesegerät
abgelesen, wobei zeitaufgelöste
Fluoreszenzeinstellungen von 340/612 nm (Anregung/Emission) verwendet
wurden.
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Unterschiede bei den Spiegeln von anti-Glc
(α)- und
Glc (α 1–4) Glc
(α)-IgM-Antikörpern im
Serum zwischen MS-Patienten bei einem Anfall, stabilen MS-Patienten
und einer gesunden Population.
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Serumproben
wurden von MS-Patienten erhalten, welche in eine ambulante Klinik
zur regelmäßigen Untersuchung
eingewiesen wurden, nachdem diese ein Formular für eine informierte Zustimmung
unterzeichnet hatten. Die Patientengruppe war zu 80% weiblich, was
ungefähr
das Verhältnis
der Geschlechter in der allgemeinen MS-Population widerspiegelt.
in Übereinstimmung
mit veröffentlichten
Daten (Ritchie et al., J. Clin. Lab. Anal. 12: 363–70, 1998)
wurden signifikant höhere
Spiegel von IgM-(nicht aber IgG- oder IgA)-Antikörpern in Seren von sowohl gesunden
als auch Frauen mit MS im Vergleich zu Männern beobachtet (nicht gezeigt).
Die Analyse war daher nur auf die weibliche MS- und gesunde Unterpopulation
beschränkt.
Seren von MS-Patienten wurden anfangs auf 54 Glycanen (Tabelle 1)
im Hinblick auf das Vorliegen von IgG-, IgM- und IgA-anti-Glycan-Antikörpern mit
dem Zweck gescreent, Marker, die Patienten mit einzelnen akuten
Demyelinisierungsereignissen als MS bestätigen würden, und Marker, die zwischen
Patienten während
der Verschlimmerungs- und Remissionsstadien der Krankheit unterscheiden
würden,
zu identifizieren. Das Experiment wurde zweimal wiederholt, wobei
fünf von
den 54 Glycanen, gegenüber
welchen in der Anfangsrunde einige Unterschiede zwischen den Gruppen
gefunden wurden, verwendet wurden.
-
Ein
reproduzierbarer und statistisch signifikanter Unterschied bei den
Spiegeln von IgM anti Glc (α)- und
anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörpern wurde
zwischen der gesunden und der MS-Gruppe gefunden (7A),
es wurden aber bei diesen Studien keine signifikanten Unterschiede
bei IgG- oder IgA-Spiegeln gefunden (nicht gezeigt). In Seren von
beiden Gruppen von MS-Patienten waren die Spiegel der IgM anti-Glc
(α) und
anti-Glc (α 1–4) Glc
(α) signifikant
höher als
in der gesunden Population. Ein willkürlich gesetzter optimaler Grenzwert
(das 97% Perzentilensignal der „gesunden" Population) wurde verwendet, um positive
Proben über – und negative
Proben – unter
dem Grenzwert zu identifizieren. So identifizierten anti-Glc (α)-Bindungssignale korrekt
19 aus 42 MS-Proben (45% Empfindlichkeit) und 42 aus 44 anscheinend
gesunden Serumproben (96% Spezifität). Die Messung der anti-Maltose-Bindung
identifizierte korrekt 48% der MS-Seren und 95% der anscheinend
gesunden Serumproben. Das Definieren einer Probe als positiv, deren
Signal bei entweder dem anti-Glc (α)- oder Glc (α 1–4) Glc
(α)-Assay über dem
Grenzwert liegt, verbessert die Empfindlichkeit auf 60% und lässt die
Spezifität
bei 93% (Tabelle 2). Die differentielle Verteilung von anti-Glc
(α)- und
anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-Antikörpern in
Patienten während
der Verschlimmerungs- und Remissionsstadien der Krankheit waren signifikant
höhere
Spiegel in der ersten Gruppe (7B).
Kein Unterschied wurde gefunden zwischen unbehandelten Patienten
oder Patienten, die mit Interferon-β behandelt wurden (nicht gezeigt).
Unter Verwendung der 80%-Perzentile der „stabilen" MS-Population als einem Grenzwert wurde
bestimmt, dass anti-Glc (α)-Bindungssignale
korrekt 15 aus 18 „Anfall"-Proben (83% Empfindlichkeit),
19 aus 24 „stabilen" Proben (79% Spezifität in Bezug
auf stabil als symptomfrei) und 42 aus 44 „gesunden" Proben (95% Spezifität) identifizierten. Die
Messung der anti-Maltose-Bindung identifizierte korrekt 72% der
Anfallseren, 79% der „stabilen" Seren und 97% der „gesunden
Seren". Das Definieren
einer Probe als positiv, deren Signal bei entweder dem Glc (α)- oder Maltose-Assay über dem
Grenzwert liegt, führt
zu einer Empfindlichkeit von 89% und einer Spezifität von 71%
und 95% bezogen auf „stabile" bzw. „gesunde" Proben (Tabelle
3). Die hohe Spezifität
und Empfindlichkeit der anti-Glc (α)- und anti-Glc (α 1–4) Glc
(α)-IgM-Antikörper macht
diese zu einem effizienten Werkzeug zur frühen Diagnose und Definition
von MS-Patienten. Die Tatsache, dass die Spiegel dieser Antikörper in
einer Situation eines MS-Anfalls viel höher sind als in der stabilen
Situation macht diese zu einem Werkzeug für die frühe Identifizierung und Vorhersage
von Anfällen
bei rückfallend
remittierenden MS-Patienten.
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Eine
hohe Korrelation zwischen IgM anti-Glc (α)-Antikörper-Serumspiegeln in weiblichen,
klinisch diagnostizierten (rückfallend-remittierenden)
MS-Patienten, die aufgrund des Aufweisens von IgM anti-Glc (α)-Antikörper als
positiv definiert wurden (wie oben beschrieben), und dem Wert der
EDSS (Expanded Disability Status Scale) der Frauen wurde beobachtet,
siehe 8, linker Kasten. Es gab keine Korrelation zwischen
dem EDSS und den IgM anti-Glc (α)-Antikörper-Spiegeln
im Serum für
weibliche, klinisch diagnostizierte (rückfallend-remittierende) MS-Patienten,
die aufgrund des Aufweisens von IgM anti-Glc (α)-Antikörper als negativ definiert
wurden, siehe 8, linker Kasten. Die hohe Korrelation
zeigt an, dass die Spiegel von IgM anti-Glc (α) im Serum als ein molekularer
Ersatzbiomarker zur Auswertung der Aktivität der Krankheit wirken können.
-
Temporärer Bereich von anti-Glvcan-Antikörperspiegeln
-
Wenn
man jeglichen biologischen Parameter für die Verwendung als einen
Ersatzbiomarker in Betracht zieht, ist es offensichtlich eine Vorbedingung,
dass der Biomarker in der normalen Population nicht mit der Zeit
variabel ist. So wurden die Serumspiegel von IgG, IgA und IgM anti-L-Rha
(α)-, anti-GlcNAc
(α)- und anti
Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β) (β Cellotriose)-Antikörpern in
sieben gesunden Freiwilligen für
13 Wochen verfolgt (9). Im Allgemeinen wurde gefunden,
dass die Serumantikörperkonzentrationen
zwischen den verschiedenen Individuen variieren, über die
Zeit hinweg aber sehr stabil sind. Beispielsweise weisen die Seren
#9161 und #9162 extrem hohe und zeitlich stabile relative Spiegel
von IgA anti-GlcNAc (α)-
bzw. Glc (β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β)-Antikörpern auf,
aber relativ normale Spiegel von IgA anti L-Rha (α)-Antikörpern und IgG-
und IgM-Antikörpern.
Wenn Änderungen
beim Antikörperspiegel
auftreten, sind sie oft graduell und setzen sich über mehrere
Wochen fort (z. B. Serum #9162; IgA anti-Glc (β 1–4) Glc (β 1–4) Glc (β)), können aber ebenfalls plötzlich sein,
z. B. Serum #9172; IgM anti-L-Rha (α), welches plötzlich zwischen
Woche vier und fünf ansteigt
und dann wieder langsam zu seinen Grundspiegel zurückkehrt.
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Beispiel 4. Anti-Glvcan-Antikörperprofil
(AGAP) in einer normalen menschlichen Population
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Die
Gesamt Ig-Antikörperbindung
(wie mit Protein A nachgewiesen) von 72 individuellen Seren an 34 Mono-
und Oligosaccharide (
11 und Tabelle 5) und die IgG-,
IgA- und IgM-Bindung von 200 Seren an sechs Mono- und Oligosaccharide
(
15A–C)
wurde bestimmt. Die stärksten
Signale wurden für
Antikörper gegen
GlcNAc (α)
und L-Rha (α)
aufgezeichnet, während
niedrigere Spiegel gegen β4-verknüpfte Oligosaccharide
von Glucose, GlcNAc (β),
GlcNAC (β 1–4) GlcNAC
(β), Gal
(α) und
Gal (a 1–3)
Gal (β 1–4) GlcNAc
(β) beobachtet
wurden. Dieses ist in guter Übereinstimmung
mit vorher veröffentlichten
Daten, welche die Verteilung von anti-Glycan-Antikörpern in
einem kommerziell erhältlichen
menschlichen Serumpool zeigen (
WO 02/064556 ).
Die AGAP der Unterklassen IgG und IgA waren ähnlich zu dem AGAP der gesamten
Ig, während das
von IgM niedriger und bei den verschiedenen Glycanen gleichförmiger war.
Die anti-Glycan-Antikörper
der Population neigten dazu, zu einer logarithmischen Normalverteilung
zu passen, siehe
15A–
15C.
Es ist offensichtlich, dass eine beträchtliche Variation bei den
anti-Glycan-Antikörperspiegeln
zwischen Individuen innerhalb der untersuchten Population existiert,
was eine Tatsache ist, die die Existenz von individuellen AGAPs
nahe legt, aber die Suche nach Markern auf anti-Glycan-Antikörper, die
in niedrigen Mengen vorliegen, beschränkt.
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Glycane,
die auf Affinitätskügelchen
immobilisiert wurden, sind ebenfalls verwendet worden, um Antikörper gegen β4-verknüpfte Oligosaccharide
von Glucose und L-Rha (α)
zu reinigen. Deren Bindungsprofile und Spezifität werden in den 13, 14A und 14B beschrieben.
-
Referenzbeispiel 8. Verwendung von anti-Glycan-Antikörpern, um
zwischen Patienten mit hohem Risiko für Atherosklerose mit vulnerablen
Plaques und Patienten mit niedrigem Risiko für Atherosklerose mit stabilen Plaques
zu unterscheiden
-
Spiegel
von anti-Glycan-Antikörpern
in den Seren von Atherosklerosepatienten mit vulnerablen Plaques
wurden mit Spiegeln von Glycan-Antikörpern im Serum von Atherosklerosepatienten
mit stabilen Plaques wie auch Individuen ohne Atherosklerose verglichen.
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Atherosklerose
ist eine Hauptursache von Morbidität und Mortalität in entwickelten
Ländern.
Sie ist eine systemische Störung
der Blutgefäßwände, die
zu der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques an den Blutgefäßwänden führt. Einige
dieser Plaques werden später
anfällig
für einen
Riss, was Blutgerinnsel verursacht, die zu Herzanfällen oder
Schlaganfall führen.
-
Die
Hauptkomponenten von atherosklerotischen Plaques sind Proteoglycane,
Lipide, Muskelzellen und weiße
Blutzellen (T-Zellen und Makrophagen). Zusätzlich wird Atherosklerose
als eine Autoimmunkrankheit verstanden, wobei einer ihrer Verursacher
eine Kreuzreaktivität
zwischen Antikörpern
gegen bakterielle Antigene und den Antigenen an Blutgefäßwänden ist.
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Ein
wichtiger Punkt in der Entwicklung von Atherosklerose ist die Verschiebung
von Stabilen Plaques (SP), welche mit niedrigem Risiko verbunden
sind, zu entzündeten
Vulnerablen Plaques (VP), welche mit hohem Risiko verbunden sind.
Eine Unterscheidung zwischen SP und VP ist klinisch problematisch,
da eine endgültige
Unterscheidung nur durch eine Autopsie post mortem gemacht werden
kann.
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Die
Serumproben waren Gaben von Dr. Jacob George von der Kardiologieabteilung
in dem Tel Aviv Medical Center, Israel. Alle Patienten waren nicht
diabetische Männer
mit einem Altersbereich von 30 bis 69. 39 Serumproben von Patienten
der folgenden Typen wurden getestet:
Instabile Angina – 13 Atherosklerosepatienten,
die als Akute Koronarsyndrome aufweisend charakterisiert wurden
(Q-Wellen- oder Nicht-Q-Wellen-Herzinfarkte). Von beiden wird angenommen,
dass sie sich aus einem Riss von vulnerablen Plaques entwickeln.
Mitglieder der Gruppe Instabile Angina schlossen Patienten mit akutem
Koronarsyndrom ein, die mit Schmerzen in der Brust und ECG-Veränderungen
oder Erhöhung
von Herzmarkern eingewiesen wurden. Sie klagten über ein kürzliches Einsetzen (< 3 Tage) von Angina
und wurden während
der Einweisung einer fortgesetzten telemetrischen Elektrokardiogramm
(ECG)-Überwachung
unterzogen. Es wurde wenigstens eine Episode von Ruheangina oder
eine Episode, die mehr als 20 min dauerte, während der letzten 48 h nachgewiesen,
zusammen mit einer Zunahme bei der Creatinkinase, den MB-Spiegeln
oder den Troponinspiegeln. Mitglieder dieser Gruppe hatten eine
Koronarangiographie (Katheterisierung) durchgemacht, welche das
Vorliegen einer Koronaratherosklerose belegte.
-
Stabile
Angina – 13
Atherosklerosepatienten wurden als eine Stabile Angina aufweisend
charakterisiert. Mitglieder der Gruppe Stabile Angina hatten eine
Koronarangiographie (Katheterisierung) durchgemacht, welche das
Vorliegen einer Koronaratherosklerose belegte. Es wurden keine ECG-Änderungen
nachgewiesen, noch wurden Zunahmen bei Creatinkinase, MB-Spiegeln
oder Troponinspiegeln nachgewiesen.
-
Keine
Plaques – 13
Patienten mit normalen Koronararterien. Mitglieder der Gruppe „Keine
Plaques" zeigten
kein Anzeichen von Koronaratherosklerose nach Katheterisierung.
-
Ein
anti-Glycan-Antikörperprofil
wurde erhalten, indem GlycoChip
TM-Arrays
(Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Kat.-Nr. 9100) verwendet wurden,
die unter Verwendung von in der
WO
00/49412 beschriebenen Prozeduren konstruiert wurden. Alle
Serumproben wurden unter Verwendung von GlycoChip
TM-Platten
(Glycominds Ltd., Lod, Israel, Kat.-Nr. 9100) getestet, welche ein
Array von kovalent befestigtem Mono- und Oligosaccharid in einer
Mikrotiterplatte mit einem verringerten Volumen mit 384 Vertiefungen
enthielten. Die Liste der Mono- und Oligosaccharide, die auf dem
Array präsentiert
wurden, wie auch deren Seriennummern werden in Tabelle 4 beschrieben.
-
Die
Seren wurden in TEST verdünnt
(1:20), in eine GlycoChipTM-Platte verteilt,
indem ein Tecan Genesis Workstation 200 Roboter verwendet wurde
(10 μl/Vertiefung),
und 30 min bei 25 Grad Celsius inkubiert. Jede Glycan- und Serumprobe
auf der Platte wurde 8mal getestet.
-
Die
Platten wurden mit 250 μl/Vertiefung
Hochsalzpuffer (0,15 M KNa pH 7,2, NaCl 2 M, MgSO4 0,085 M,
0,05% Tween 20) in einem automatischen Plattenwäscher (Tecan, PowerWasherTM) gewaschen. Zehn μl/Vertiefung biotinylierter
Ziegen anti-human IgG, IgM oder IgA (Jackson, PA, USA), 1 μg/ml in TBST,
wurden manuell verteilt und die Platten für 30 min bei 25°C inkubiert.
Die Platte wurde wieder mit Hochsalzpuffer gewaschen.
-
Streptavidin-konjugiertes
Europium, Wallac, AD0062 (1 μ/ml,
10 μl/Vertiefung)
wurde manuell nach Inkubation für
30 min bei 25°C
im Dunklen zugegeben. Das Waschen der Platten mit dem Hochsalzpuffer
wurde wiederholt. DelfiaTM-Verstärkungspuffer
(Wallac, 730232, 10 μl/Vertiefung)
wurde zu den Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurden für wenigstens
30 min im Dunklen inkubiert. Die Fluoreszenz der Vertiefungen wurde
mit einem Victor 1420 (Wallac) abgelesen, indem zeitaufgelöste Fluoreszenzeinstellungen
von Emi. 612 nm und Ext. 340 nm verwendet wurden.
-
Das
Glycanbindungssignal, das für
die Gruppe „Kein
Plaque" erhalten
wurde, wurde verwendet, um Grenzwerte für jedes Glycan zu berechnen, über welchen
die Patienten als positiv betrachtet wurden. Diese Grenzwerte wurden
als das durchschnittliche Signal der Gruppe „Kein Plaque" plus eine oder zwei
Standardabweichungen definiert. Gemäß dieser Definition wurde eine
Anzahl von Glycanen identifiziert, welche ein gewisses Ausmaß an Unterscheidungskraft
zwischen den Patientengruppen aufwiesen (siehe unten). Die „Unterscheidung" („separation") auf der Basis eines
bestimmten Glycans wurde definiert als wenigstens 50% (7/13) positive
Proben in den Gruppen „Instabile
Angina" oder „Stabile
Angina" und 2 oder
weniger positive Proben in der Gruppe „Kein Plaque".
-
16A ist eine Matrixdarstellung von Glycanen, die
verwendet wurde, um Seren von Patienten zu untersuchen, die an instabiler
oder stabiler Angina litten, wobei die Glycanstrukturen in Tabelle
4 beschrieben werden. Glycane, gegen welche signifikant unterschiedliche
Antikörperspiegel
bei den verschiedenen Patientengruppen gemessen wurden, sind mit
ausgefüllten
Quadraten markiert. An dem Grenzwertspiegel des Durchschnitts plus
zwei Standardabweichungen wurde eine „Unterscheidung" mit einer IgA-Bindung
an zwei verschiedene Glycane erreicht. Eines unterschied zwischen
IgG-Antikörgern,
aber keines unterschied zwischen IgM-Antikörpern.
-
Die
einzelnen Glycane, welche die besten Unterscheidungen ergaben, sind
nachstehend dargestellt:
| Glycane | Ergebnis | Instabile
Angina | Stabile
Angina | Kein
Plaque |
| Ab | Positive | 7 | 5 | 0 |
| Negative | 6 | 8 | 13 |
| Fb | Positive
Negative | 1
12 | 9
4 | 1
12 |
-
Einige
Glycane, die nicht als „unterscheidend" definiert wurden,
ergaben dennoch einen gewissen Grad der Unterscheidung. Wenn sie
in Kombinationen verwendet wurden, konnte die Unterscheidung über die einzelner
Glycane hinaus verbessert werden. Die Glycane werden nachstehend
angegeben
| Glycane
LinearCode | Ergebnis | Instabile
Angina | Stabile
Angina | Kein
Plaque |
| Aa | Positive | 6 | 2 | 0 |
| Negative | 7 | 11 | 13 |
| Xb | Negative
Positive | 1
12 | 6
7 | 0
13 |
| Fa | Negative
Positive | 5
8 | 3
10 | 1
12 |
| A[3S]b | Negative
Positive | 1
12 | 6
7 | 1
12 |
| GNb4GNb | Positive
Negative | 5
8 | 0
13 | 1
12 |
-
16B ist eine grafische Darstellung, welche Spiegel
von Antikörpern
gegen die Glycane #2 und #29 in den drei Patientengruppen zeigt.
Der Kasten beinhaltet Signale von 50% der Population. Die dicken
und dünnen
Linien in dem Kasten stehen für
die Mittel- bzw.
Medianwerte. Die Grenze des Kastens, die am nächsten zu Null liegt, zeigt
die 25. Perzentile, und die Grenze des Kastens, die von Null am
weitesten weg liegt, zeigt die 75. Perzentile. Querstriche über und
unter dem Kasten zeigen die 90. und die 10. Perzentile.
-
17 ist
ein Histogramm, welches die Anzahl von Proben in den drei Patientengruppen
zeigt, die im Hinblick auf anti-IgA-Antikörper gegen das Glycan #2 oder
das Glycan #29 positiv waren.
-
18A ist ein Histogramm, welches die Verteilung
von Antikörperspiegeln
gegen die Glycane #2 und #15 in den drei Patientengruppen zeigt.
Der Kasten beinhaltet Signale von 50% der Population. Die dicken
und dünnen
Linien in dem Kasten stehen für
die Mittel- bzw. Medianwerte. Die Grenze des Kastens, die am nächsten zu
Null liegt, zeigt die 25. Perzentile, und die Grenze des Kastens,
die von Null am weitesten weg liegt, zeigt die 75. Perzentile. Querstriche über und
unter dem Kasten zeigen die 90. und die 10. Perzentile.
-
18B ist ein Histogramm, welches die Anzahl an
Proben in den drei Patientengruppen zeigt, die im Hinblick auf anti-IgA-Antikörper gegen
das Glycan #2 oder das Glycan #15 positiv waren. An dem Grenzwertspiegel
des Durchschnitts plus einer Standardabweichung wurde eine „Unterscheidung" mit einer IgA-Bindung an
6 verschiedene Glycane erreicht. Die IgG- und IgM-Antikörperspiegel
waren in den drei Gruppen nicht verschieden.
-
Die
Unterscheidung, die mit Kombinationen erhalten wurde, ist nachstehend
gezeigt (Aa wurde verwendet, da die Anzahl an positiven Proben in
der Gruppe „Stabile
Angina" niedriger
war als bei der Verwendung von Ab, was so die Unterscheidung gegenüber der
Gruppe „Instabile
Angina" verbesserte):
| Glycane
LinearCode | Ergebnis | Instabile
Angina | Stabile
Angina | Kein
Plaque |
| Aa und
GNb4GNb | Positiv
mit einem der Glycane | 8 | 2 | 1 |
| Negativ
mit beiden | 5 | 11 | 12 |
| Aa und
Ga4Ga | Positiv
mit einem der Glycane | 8 | 5 | 0 |
| Negativ
mit beiden | 5 | 8 | 13 |
-
Die
Spezifität
und Empfindlichkeit des Tests, um unter Verwendung von Aa und GNb4GNb „instabile Angina" nachzuweisen, betrug
somit 62% (8/13) und 88% (23/26).
-
Eine
Kombination von drei Glycanen, Aa, GNb4GNb und Fb, machte es möglich, die
Spezifität
ebenfalls für
die Gruppe „Stabile
Angina" zu bestimmen,
75% (9/13). Dieses rührt
von der Tatsache her, dass Fb hauptsächlich „Stabile Angina" nachweist. Die Spezifität und Empfindlichkeit
des kombinierten Assays sind in 19 zusammengefasst.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination der Glycane (Gal (α), GlcNAc
(β 1–4) GlcNAc
(β) und Fu
(β) verwendet
werden kann, um erfolgreich zwischen Populationen mit stabiler und
instabiler Angina mit einer Spezifität von 62% und einer Empfindlichkeit
von 88% zu unterscheiden. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist,
einen Biomarker auf der Basis glycanbindender IgA-Antikörper zu
entwickeln, der zwischen Patienten mit Instabiler und Stabiler Angina
unterscheidet.
-
Referenzbeispiel 9. Verwendung von anti-Glycan-Antikörpern, um
zwischen Patienten mit hohem Risiko für Atherosklerose mit vulnerablen
Plaques und Patienten mit niedrigem Risiko für Atherosklerose mit stabilen Plaques
zu unterscheiden
-
Spiegel
von anti-Glycan-Antikörpern
in den Seren von Atherosklerosepatienten mit vulnerablen Plaques
wurden mit Spiegeln von Glycan-Antikörpern im Serum von Atherosklerosepatienten
mit stabilen Plaques wie auch Individuen ohne Atherosklerose verglichen.
-
Atherosklerose
ist eine Hauptursache von Morbidität und Mortalität in entwickelten
Ländern.
Sie ist eine systemische Störung
der Blutgefäßwände, die
zu der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques an den Blutgefäßwänden führt. Einige
dieser Plaques werden später
anfällig
für einen
Riss, was Blutgerinnsel verursacht, die zu Herzanfällen oder
Schlaganfall führen.
-
Die
Hauptkomponenten von atherosklerotischen Plaques sind Proteoglycane,
Lipide, Muskelzellen und weiße
Blutzellen (T-Zellen und Makrophagen). Zusätzlich wird Atherosklerose
als eine Autoimmunkrankheit verstanden, wobei einer ihrer Verursacher
eine Kreuzreaktivität
zwischen Antikörpern
gegen bakterielle Antigene und den Antigenen an Blutgefäßwänden ist.
-
Ein
wichtiger Punkt in der Entwicklung von Atherosklerose ist die Verschiebung
von Stabilen Plaques (SP), welche mit niedrigem Risiko verbunden
sind, zu entzündeten
Vulnerablen Plaques (VP), welche mit hohem Risiko verbunden sind.
Eine Unterscheidung zwischen SP und VP ist klinisch problematisch,
da eine endgültige
Unterscheidung nur durch eine Autopsie post mortem gemacht werden
kann.
-
Die
Serumproben waren Gaben von Dr. Jacob George von der Kardiologieabteilung
in dem Tel Aviv Medical Center, Israel. Alle Patienten waren nicht
diabetische Männer
mit einem Altersbereich von 30 bis 69. 72 Serumproben von Patienten
der folgenden Typen wurden getestet:
Instabile Angina – 24 Atherosklerosepatienten,
die als Akute Koronarsyndrome aufweisend charakterisiert wurden
(Q-Wellen- oder Nicht-Q-Wellen-Herzinfarkte). Von beiden wird angenommen,
dass sie sich aus einem Riss von vulnerablen Plaques entwickeln.
Mitglieder der Gruppe Instabile Angina schlossen Patienten mit akutem
Koronarsyndrom ein, die mit Schmerzen in der Brust und ECG-Veränderungen
oder Erhöhung
von Herzmarkern eingewiesen wurden. Sie klagten über ein kürzliches Einsetzen (< 3 Tage) von Angina
und wurden während
der Einweisung einer fortgesetzten telemetrischen Elektrokardiogramm
(ECG)-Überwachung
unterzogen. Es wurde wenigstens eine Episode von Ruheangina oder
eine Episode, die mehr als 20 min dauerte, während der letzten 48 h nachgewiesen,
zusammen mit einer Zunahme bei der Creatinkinase, den MB-Spiegeln
oder den Troponinspiegeln. Mitglieder dieser Gruppe hatten eine
Koronarangiographie (Katheterisierung) durchgemacht, welche das
Vorliegen einer Koronaratherosklerose belegte.
-
Stabile
Angina – 24
Atherosklerosepatienten wurden als eine Stabile Angina aufweisend
charakterisiert. Mitglieder der Gruppe Stabile Angina hatten eine
Koronarangiographie (Katheterisierung) durchgemacht, welche das
Vorliegen einer Koronaratherosklerose belegte. Es wurden keine ECG-Änderungen
nachgewiesen, noch wurden Zunahmen bei Creatinkinase, MB-Spiegeln
oder Troponinspiegeln nachgewiesen.
-
Keine
Plaques – 24
Patienten mit normalen Koronararterien. Mitglieder der Gruppe „Keine
Plaques" zeigten
kein Anzeichen von Koronaratherosklerose nach Katheterisierung.
-
Ein
anti-Glycan-Antikörperprofil
wurde erhalten, indem GlycoChip
TM-Arrays
(Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Kat.-Nr. 9100) verwendet wurden,
die unter Verwendung von in der
WO
00/49412 beschriebenen Prozeduren konstruiert wurden. Alle
Serumproben wurden unter Verwendung von GlycoChip
TM-Platten
(Glycominds Ltd., Lod, Israel, Kat.-Nr. 9100) getestet, welche ein
Array von kovalent befestigtem Mono- und Oligosaccharid in einer
Mikrotiterplatte mit einem verringerten Volumen mit 384 Vertiefungen
enthielten. Die Liste der Mono- und Oligosaccharide, die auf dem
Array präsentiert
wurden, wie auch deren Seriennummern werden in Tabelle 4 beschrieben.
-
Die
Seren wurden in TEST verdünnt
(1:20), in eine GlycoChipTM-Platte verteilt,
indem ein Tecan Genesis Workstation 200 Roboter verwendet wurde
(10 μl/Vertiefung),
und 30 min bei 25 Grad Celsius inkubiert. Jede Glycan- und Serumprobe
auf der Platte wurde 8mal getestet.
-
Die
Platten wurden mit 250 μl/Vertiefung
Hochsalzpuffer (0,15 M KNa pH 7,2, NaCl 2 M, MgSO4 0,085 M,
0,05% Tween 20) in einem automatischen Plattenwäscher (Tecan, PowerWasherTM) gewaschen. Zehn μl/Vertiefung biotinylierter
Ziegen anti-human IgA (Jackson, PA, USA), 1 μg/ml in TEST, wurden manuell
verteilt und die Platten für
30 min bei 25°C
inkubiert. Die Platte wurde wieder mit Hochsalzpuffer gewaschen.
-
Streptavidin-konjugiertes
Europium, Wallac, AD0062 (1 μ/ml,
10 μl/Vertiefung)
wurde manuell nach Inkubation für
30 min bei 25°C
im Dunklen zugegeben. Das Waschen der Platten mit dem Hochsalzpuffer
wurde wiederholt. DelfiaTM-Verstärkungspuffer
(Wallac, 730232, 10 μl/Vertiefung)
wurde zu den Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurden für wenigstens
30 min im Dunklen inkubiert. Die Fluoreszenz der Vertiefungen wurde
mit einem Victor 1420 (Wallac) abgelesen, indem zeitaufgelöste Fluoreszenzeinstellungen
von Emi. 612 nm und Ext. 340 nm verwendet wurden.
-
Der
Grenzwert wurde aus der 80. Perzentile der normalen Population berechnet.
Gemäß dieser
Definition wurde eine Anzahl von Glycanen identifiziert, die einen
gewissen Grad an Unterscheidungskraft zwischen den Patientengruppen
aufwiesen (siehe unten). Die „Unterscheidung" auf der Basis eines
gewissen Glycans wurde definiert als wenigstens 50% (12/24) positive
Proben in den Gruppen „Instabile
Angina" oder „Stabile
Angina" und 5 oder
weniger positive Proben in der Gruppe „Kein Plaque".
| Glycan
LinearCode | | Instabile
Angina | Stabile
Angina | Keine
Plaques |
| Ga4Ga | Positive % Positive | 12 | 2 | 5 |
| | 52 | 8 | 21 |
| Gb | Positive % Positive | 19 | 10 | 5 |
| | 83 | 42 | 21 |
| ANa | Positive % Positive | 13 | 8 | 5 |
| | 57 | 33 | 21 |
| ANb | Positive % Positive | 15 | 8 | 5 |
| | 65 | 33 | 21 |
| GNb4GNb | Positive % Positive | 13 | 8 | 5 |
| | 57 | 33 | 21 |
| Xa | Positive % Positive | 21 | 7 | 5 |
| | 100 | 29 | 21 |
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass eine Kombination der Glycane Glc (α 1–4) Glc
(α), Glc
(β), GalNAc
(α), GalNAc
(β), GlcNAc
(β 1–4) GlcNAc
(β) und
Xylose (α)
verwendet werden kann, um erfolgreich zwischen Populationen stabiler
und instabiler Angina zu unterscheiden. Diese Ergebnisse zeigen,
dass es möglich
ist, einen Biomarker auf der Basis von glycanbindenden IgA-Antikörpern zu
entwickeln, der zwischen Patienten mit Instabiler und Stabiler Angina
unterscheidet.
-
Referenzbeispiel 10. Bindung von CD4+-Zellen
an eine Mehrzahl von Glycanen, die an einem festen Substrat immobilisiert
sind
-
Es
wurde die Bindung von CD4+-Zellen aus 7 gesunden Individuen an 47
verschiedene Glycanfragmente, die auf einem Mikroarray immobilisiert
waren, untersucht.
-
Materialien und Methoden
-
20
ml frisches Blut wurde von jedem der 7 Individuen abgenommen, indem
10 ml EDTA-Vaccutainers verwendet
wurden. Proben peripherer Zellen wurden zentrifugiert (230 × g, 900
UPM, 10 Minuten bei Raumtemperatur). Das Plasma wurde dann abgetrennt
und die oberen 2 ml der zellulären
Fraktion in ein 15 ml-Röhrchen überführt. Zur
Anreicherung der CD4+-Zellen wurden 100 μl RosetteSep-Reagenz zu den
Röhrchen
zugegeben und bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Die
Proben wurden dann zweifach in PBS/2% FCS verdünnt, und 5 ml Ficoll wird unter
Verwendung einer Pasteur-Pipette aus Glas unter die Zellsuspension
geschichtet.
-
Die
Röhrchen
wurden für
30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, 2400 UPM (~700 × g), wobei die
Bremse der Zentrifuge ausgeschaltet war. Nach der Zentrifugation
wurden die Röhrchen
vorsichtig aus der Zentrifuge entfernt. Die obere Schicht wurde
behutsam unter Verwendung einer sterilen Pipette abgezogen, was
die Lymphozytenschicht unberührt
an der Grenzfläche
zurückließ. Unter
Verwendung einer sterilen Pipette wurde die Leukozytenfraktion in
ein sauberes Röhrchen überführt, und
das Röhrchen
wurde vollständig
mit PBS/2% FCS gefüllt.
Die Zellen wurden wieder zweimal durch Zentrifugation für 10 Minuten,
230 × g
(1000 UPM) gewaschen und in PBS/2% FCS resuspendiert. Nach den Zentrifugationen
werden die Zellen in 500 μl RPMI/1640
2% FCS resuspendiert.
-
Die
Zellen wurden in Türk-Lösung 1:10
verdünnt
und gezählt.
Nach dem Zählen
wurden die Zellen bis zu einer Dichte von 5 × 106 Zellen/ml
in RPMI/1640 2% FCS verdünnt,
dann in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit 1 ml/Vertiefung plattiert.
Die Zellsuspensionen werden über
Nacht in einem Inkubator mit 95% Feuchtigkeit, 37°C, 5% CO2 inkubiert.
-
Um
die Ausbeuten der Zelltrennung durch FACS-Trennung zu bestimmen,
wurden 250.000 Zellen in 1 ml FACS-Puffer suspendiert und dann 10
Minuten bei 2000 UPM, 4°C,
zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert. Die Zellen wurden in 50 μl FACS-Puffer resuspendiert
und mit 5 μl
anti-CD4-Antikörper
markiert. Die Zellen wurden für
30 Minuten auf Eis inkubiert, vor Licht geschützt. 1 ml eiskalter FACS-Puffer
wurde zugegeben und 10 Minuten bei 2000 UPM, 4°C, zentrifugiert. Die Zellen
wurden dann in 300 μl
FACS-Puffer resuspendiert, auf Eis gelagert und auf einem FACS-Gerät gezählt.
-
GlycoChips
wurden in Objektträgerhalter
in Kunststoffgefäßen platziert,
in welche feuchtes Papier eingebettet war, um die Feuchtigkeit zu
halten. Zellsuspensionen wurden bei 1,2 μl/Vertiefung auf dem GlycoChip plattiert,
dann für
eine Stunde in einem Inkubator mit 5% CO2 (95%
Feuchtigkeit, 37°C)
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Objektträger mit
dem Kopf nach unten behutsam in einer Zentrifugenkammer platziert, eingetaucht
in PBS. Die GlycoChips wurden für
zwei Minuten bei 700 UPM (minimale g-Kraft, ~50 × g) zentrifugiert. Die Objektträger wurden
durch ein Mikroskop beobachtet und in PBS/3,7% Formaldehyd bei Raumtemperatur
für wenigstens
30 Minuten fixiert. Die Objektträger
wurden dann behutsam 3 × in
DDW gewaschen und durch Luft getrocknet.
-
Propidiumiodidlösung wurde
in PBS hergestellt und mit 1,2 μl/Vertiefung
plattiert. Die GlycoChips wurden unter feuchten Bedingungen für 15 Minuten
inkubiert, dann behutsam 3 × durch
Eintauchen in DDW abgespült.
Die Objektträger
wurden im Dunklen durch Luft getrocknet und bei Propidiumiodid-Einstellungen
von Ext. 535 nm und Emi. 655 nm auf einem Arrayscanner gescannt.
Das Bild wurde analysiert, und Zelldichten wurden bestimmt.
-
Ergebnisse
-
Die
Glycane und Kontrollen, die für
die Bindungsstudien verwendet wurden, sind in 20 unten
gezeigt. Die Struktur ist in Linear CodeTM-Syntax
geschrieben; siehe Tabelle 1 für
eine Übersetzung.
-
Ein
Histogramm, welches das Bindungsprofil von CD4+-Zellen aus einem
einzelnen Individuum an verschiedene Glycane zeigt, ist in 20 gezeigt.
Gezeigt ist die Bindung in DLU/mm2 für jedes
der Glycane oder Kontrollen, die angegeben sind. Die CD4+-Zellbindung
an Glycane oder Kontrollen aus den sieben Individuen ist in 21A gezeigt. 21A zeigt
den Median der relativen Fluoreszenz für CD4+-Zellen aus jedem der
sieben Individuen.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von CD4+-Zellen zwischen den
verschiedenen Glycanen variiert. Die stärkste Bindung wurde mit den
folgenden Glycanen beobachtet, welche in ihrer Reihenfolge der relativen
Affinität
angegeben sind: CD4+-Zellen binden die folgenden Glycane, welche
in LinearCode angegeben sind: NNa3Ab4(Fa3)GNb > Mb4Gb > GNb4GNb > Ma3Ma > Ab6Ab. Eine Bindung
von CD4+-Zellen an Glycane mit terminalen Mannoseresten oder mit
Sialyl-Lewis X-Resten wurde ebenfalls nachgewiesen. Eine Variation
der CD4+-Bindung an bestimmte Glycane wurde bei den verschiedenen
Individuen ebenfalls nachgewiesen.
-
ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Man
muss verstehen, dass, während
die Erfindung im Zusammenhang mit der detaillierten Beschreibung
von dieser beschrieben wurde, die vorstehende Beschreibung dazu
gedacht ist, den Umfang der Erfindung, welcher durch den Umfang
der angefügten
Ansprüche
definiert wird, zu veranschaulichen und nicht zu beschränken.
-
Tabellen und Figuren:
-
Tabelle 1. Saccharide, die auf dem Glycanarray
präsentiert
werden
| Glycan | IUPAC | LINEARCODE® | Üblicher
Name |
| 0 | pNP-OH | pNP-0 | |
| 1 | Gal
(α) | | |
| 2 | Gal
(β) | Ab | |
| 3 | Gal
(β 1–3) GalNAc
(α) | Ab3ANa | |
| 4 | Gal
(β 1–3) GlcNAc
(β) | Ab3GNb | |
| 5 | Gal
(β 1–4) Glc
(β) | Ab4Gb | Lactose |
| 6 | Gal
(β 1–6) Gal
(β) | Ab6Ab | |
| 7 | GalNAc
(α) | ANa | |
| 8 | GalNAc
(β) | ANb | |
| 9 | Fuc
(α) | Fa | |
| 10 | Fuc
(β) | Fb | |
| 11 | Glc
(α) | Ga | |
| 12 | Glc
(α 1–4) Glc
(α) | Ga4Ga | Maltose |
| 13 | Glc
(α 1–4) Glc
(β) | Ga4Gb | |
| 14 | Glc
(β) | Gb | |
| 15 | Glc
(β 1–4) Glc
(β) | Gb4Gb | Cellobiose |
| 16 | Glc
(β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β) | Gb4Gb4Gb | Cellotriose |
| 17 | Glc
(β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc
(β 1–4) Glc | Gb4Gb4GbGb4Gb | Cellopentaose |
| 18 | Glycerol | Glycerol | |
| 19 | GlcNAc
(α) | GNa | |
| 20 | GlcNAc
(β) | GNb | |
| 21 | GlcNAc
(β 1–3) GalNAc (α) | GNb3ANa | |
| 22 | GlcNAc
(β 1–4) GlcNAc (β) | GNb4GNb | Chitobiose |
| 23 | L-Rha
(α) | Ha | |
| 24 | GalA
(β) | Lb | |
| 25 | Man
(α) | Ma | |
| 26 | Man
(β) | Mb | |
| 27 | Neu5Ac
(α) | NNa | |
| 28 | L-Araf
(α) | Ra | |
| 29 | GlcA
(β) | Ub | |
| 30 | X(α) | Xa | |
| 31 | X(β) | Xb | |
| 32 | Gal
(β 1–3) [GlcNAc
(β 1–6)] GalNAc
(α) | Ab3(GNb6)ANa | |
| 33 | Gal
(β 1–4) GlcNAc
(α) | Ab4GNa | |
| 34 | Gal
(α 1–3) Gal
(β 1–4) GlcNAc
(β) | Aa3Ab4GNb | Lineares
B-2 |
| 35 | Gal
(β 1–3) Gal
(β 1–4)GalNAc
(β) | Ab4GNb | N-Acetyl |
| 36 | Man
(β 1–4) GlcNAc
(β) | Mb4Gb | |
| 37 | GlcNAc
(β 1–6) GalNAc (α) | GNb6ANa | |
| 38 | Fuc
(α 1–2) Gal
(β) | Fa2Ab | |
| 39 | Neu5Ac
(α 2–3) Gal
(β 1–4) [Fuc
(α 1- | NNa3Ab4(Fa3)GNb | Sialyl
Lewis X |
| 40 | Man
(α 1–3) Man
(α) | Ma3Ma | |
| 41 | OlcNAc
(β) 6-sulft | GN[6S]b | |
| 42 | Glc
(β 1–3) Glc
(β) | Gb3Gb | |
| 43 | Gal
(β) 3-sulfat | A[3S]b | |
| 44 | Neu5Ac
(α 1–3) Gal
(β 1–4) GlcNAc
(β) | NNa3Ab4GNb | Sialyl
lactosamin |
| 45 | Man
(α 1–3) [Man
(α 1–6)] Man
(β) | Ma3(Ma6)Mb | |
| 46 | Neu5Ac
(α 1–3) Gal
(β 1–4) Glc
(β) | NNa3Ab4Gb | Sialyl
lactose |
| 47 | GlcNAc
(β 1–3) Gal
(α 1–4) Glc
(β) | GNb3Ab4Gb | Lacto-3 |
| 48 | Gal
(α 1–4) Gal
(β 1–4) Glc
(β) | Aa4Ab4Gb | Pk-Antigen |
| 49 | Neu5Ac
(α 1–6) Gal
(β 1–4) GlcNAc
(β) | NNa6Ab4GNb | |
| 50 | Gal
(α 1–4) [Fucp
(α 1–3)] GlcNAc
(b) | Ab4(Fa3)GNb | Lewis
X |
| 51 | Neu5Ac
(α 1–3) Gal
(β 1–4) [Fuc
(α 1–3] | NNa3Ab3(Fa4)GNb | Sialyl
Lewis A |
| 52 | Man
(α 1–6) Man α | Ma6Ma | |
| 53 | Neu5Ac
(α 1–3) Gal
(β 1–3) GlcNAc
(β) | NNa3Ab3GNb | Sialyl
Lewis c |
| 54 | Neu5Ac
(α 1–3) Gal
(β 1–3) GalNAc
(α) | NNa3Ab3ANa | SiT-Antigen |
Tabelle 2. Anzahl an positiven Proben
mit Bindungssignalen über
der 97%-Perzentile der gesunden Population.
| Glycan | Ergebnis | MS | Gesund |
| Glc (α) | Positiv | 19/42
(45%) | 2/44
(4,5%) |
| Negativ | 23/42
(55%) | 42/44
(96%) |
| Glc (α 1–4) Glc
(α) | Positiv | 20/42
(48%) | 2/44
(4,5%) |
| Negativ | 22/42
(52%) | 42/44
(96%) |
| Glc (α 1–4) Glc
(α) oder Glc
(α) | Positiv | 25/42
(60%) | 3/44
(6,8%) |
| Negativ | 17/42
(40%) | 41/44
(93%) |
Tabelle 3. Anzahl an positiven Proben
mit Bindungssignalen über
der 80%-Perzentile der „stabilen" MS-Population.
| Glycan | Ergebnis | Anfall | Stabil | Gesund |
| Glc (α) | Positiv | 15/18
(83%) | 5/24
(21%) | 2/44
(4,5%) |
| Negativ | 3/18
(17%) | 19/24
(79%) | 42/44
(96%) |
| Glc (α 1–4) Glc
(α) | Positiv | 13/18
(72%) | 5/24
(21%) | 2/44
(4,5%) |
| Negativ | 5/18
(28%) | 19/24
(79%) | 42/44
(96%) |
| Glc (α 1–4) Glc
(α) oder
Glc (α) | Positiv | 16/18
(89%) | 7/24
(29%) | 2/44
(4,5%) |
| Negativ | 2/18
(11%) | 17/24
(71%) | 42/44
(96%) |
Tabelle
4:
Tabelle 5
| Tabelle
5. Auf dem Glycanarray präsentierte
Saccharide und Spiegel des anti-Glycans |
| Glycan
Nr. | Glycan | Linear
Code®11 | Ab-Bindung(RFU)a | Relative
Ab |
| 0 | pAP | | NA | NA |
| 1 | Gal
(α) | Aa | 181,069 | 10 |
| 2 | Gal
(β) | Ab | 119,034 | 14 |
| 3 | Gal
(β 1–3) GalNAc
(α) | Ab3Ana | 52,853 | |
| 4 | Gal
(β 1–3) GlcNAc (β) | Ab3GNb | 58,239 | |
| 5 | Gal
(β 1–4) Glc
(β) | Ab4Gb | 92,170 | |
| 6 | Gal
(β 1–6) Gal
(β) | Ab6Ab | 151,313 | 11 |
| 7 | GalNAc
(α) | ANa | 64,429 | |
| 8 | GalNAc
(β) | ANb | 57,832 | |
| 10 | Fuc
(α) | Fa | 47,727 | |
| 11 | Fuc
(β) | Fb | 63,782 | |
| 12 | Glc
(α) | Ga | 109,091 | |
| 13 | Glc
(α 1–4) Glc
(α) | Ga4Ga | 80,024 | |
| 14 | Glc
(α 1–4) Glc
(β) | Ga4Gb | 127,594 | 13 |
| 15 | Glc
(β) | Gb | 112,513 | |
| 16 | Glc
(β 1–4) Glc
(β) | Gb4Gb | 239,830 | 9 |
| 17 | Glc
(β 1–4) Glc
(β 1–4) | Gb4Gb4 | 284,361 | 7 |
| 18 | Glc
(β 1–4) Glc
(β 1–4) | Gb4Gb4 | 311,235 | 5 |
| 19 | Glycerol | Glycerol | 52,884 | |
| 20 | GlcNAc
(α) | GNa | 1,031,130 | 1 |
| 21 | GlcNAc
(β) | GNb | 311,341 | 4 |
| 22 | GlcNAc
(β 1–3) GalNAc | GNb3A | 294,624 | 6 |
| 23 | GlcNAc
(β 1–4) GlcNAc | GNb4G | 433,604 | 3 |
| 24 | L-Rha
(α) | Ha | 662,337 | 2 |
| 25 | GalA
(β) | Lb | 96,801 | |
| 26 | Man
(α) | Ma | 83,647 | |
| 27 | Man
(β) | Mb | 77,533 | |
| 28 | Neu5Ac
(α) | NNa | 52,028 | |
| 29 | L-Araf
(α) | Ra | 51,230 | |
| 30 | GlcA
(β) | Ub | 56,719 | |
| 31 | X(α) | Xa | 55,808 | |
| 32 | X(α) | Xb | 78,776 | |
| 33 | Gal
(β 1–3) [GlcNAc | Ab3(GN | 84,080 | |
| 34 | Gal
(β 1–4) GlcNAc (α) | Ab4GNa | 143,036 | 12 |
| 36 | Gal
(β 1–3) Gal (β1- | Aa3Ab4 | 268,549 | 8 |
