WO2020115021A1 - Verfahren zur unterstützung einer diagnose und vorrichtung dafür - Google Patents
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- A61B5/02—Detecting, measuring or recording pulse, heart rate, blood pressure or blood flow; Combined pulse/heart-rate/blood pressure determination; Evaluating a cardiovascular condition not otherwise provided for, e.g. using combinations of techniques provided for in this group with electrocardiography or electroauscultation; Heart catheters for measuring blood pressure
- A61B5/02007—Evaluating blood vessel condition, e.g. elasticity, compliance
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Definitions
- the present invention relates to a method for
- the invention further relates to a device which is designed to carry out such a method.
- DCM Dilated cardiomyopathy
- DCMi is a common form of DCM.
- Cardiomyopathy play disorders of the cellular immune system along with activation of lymphocytes and
- Monocytes / macrophages play an important role. According to a European position paper
- Cardiomyopathy is a disease caused by the presence of left ventricular or biventricular dilatation and systolic dysfunction (left ventricular
- DCM cardiomyopathy. Eur Heart J, 2015. 36 (18): pp. 1123-35a).
- the causes of DCM can be both genetic and non-genetic. According to experimental and clinical data, viral infections and myocardial
- Chronic myocarditis together with ventricular systolic dysfunction is called “inflammatory or
- DCMi inflammatory cardiomyopathy
- myocardial viral infection induces autoimmune processes that result in activation of the cellular and humoral
- Cardiac muscle samples (endomyocardial biopsies [EMBs]) introduced.
- EMBs epicardial biopsies
- DCMi or DCM are of non-inflammatory origin.
- the clinical pictures are very similar, and it is only possible with great effort, which also requires the removal of EMBs, to distinguish between these two diseases.
- Cardiovascular disease societies published on the way of diagnosis. The working group for heart muscle and pericardial diseases of the ESC
- EMBs are only indicated in patients in life-threatening situations, such as unexplained acute cardiomyopathy with inotropic or mechanical circulatory support and / or severe cardiac arrhythmia (Yancy, CW, et al., 2013 ACCF / AHA guideline for the management of heart failure: executive summary: a report of the American College of Cardiology Foundation / American Heart Association Task Force on practice guidelines, Circulation, 2013. 128 (16): pp. 1810-52, Bozkurt, B., et al ., Current Diagnostic and
- Myocarditis (Friedrich, MG, et al., Cardiovascular magnetic resonance in myocarditis: A JACC White Paper. J Am Coli Cardiol, 2009. 53 (17): pp. 1475-87) can be very common in patients with pacemakers or defibrillators) often implanted with this disease, not
- Magnetic resonance imaging for the heart is not high enough to reliably diagnose myocarditis in chronic myocarditis and DCMi.
- Monocytes / macrophages and lymphocytes against cardiac epitopes are involved in the development of myocarditis and consecutive DCMi.
- activation of the cellular immune system can also be diagnosed by immunoprofing of peripheral leukocytes.
- Thl7 lymphocytes are significantly increased in the peripheral blood of DCMi patients (Myers, JM, et al., Cardiac myosin-Thl7 responses promote heart failure in human myocarditis. JCI Insight, 2016. 1 (9) ).
- Myers, JM, et al. Cardiac myosin-Thl7 responses promote heart failure in human myocarditis. JCI Insight, 2016. 1 (9) ).
- CD40-CD40L Blocking the CD40-CD40L interaction by CD40-Ig reduces disease progress in murine myocarditis induced by CVB3.
- NT-proBNP Oxford “N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide"
- Heart failure concerned low (Ponikowski, P., et al., 2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure: The Task Force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure of the European Society of Cardiology (ESC) Developed with the special contribution of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC. Eur Heart J, 2016. 37 (27): pp. 2129-2200, and Felker, GM, et al., Serial high sensitivity cardiac troponin T measurement in acute heart failure: insights from the RELAX-AHF study. Eur J Heart Fail, 2015. 17 (12): pp. 1262-70).
- the mechanical properties of leukocytes are an indicator for monitoring the progress of diseases in inflammation (Toepfner, N., et al., Detection of human disease conditions by single-cell morpho-rheological phenotyping of blood.
- Cardiovascular research has not yet been considered and, in particular, it has not been considered to use these properties to diagnose DCMi.
- RT-DC real-time deformability cytometry
- lymphocytes as a marker for the presence of inflammatory cardiomyopathy.
- a marker for the presence of inflammatory cardiomyopathy is suitable for distinguishing from other clinical pictures and could be used to provide a doctor with an additional new diagnostic method.
- a method according to the invention is a computer-aided method to support the diagnosis of inflammatory cardiomyopathy.
- the fact that a diagnosis is only “supported” is understood to mean that the claimed method cannot or should not serve as the sole diagnosis.
- other diagnostic methods can be used to make a final diagnosis.
- the present method only serves one purpose Doctor or a person who wants to make a diagnosis
- lymphocytes There is a mechanical property of lymphocytes in a blood sample from a patient who is to be diagnosed with DCMi.
- the size of the lymphocytes can be distinguished from other components of the blood.
- the device can be determined, for example, by directly exerting a force through it (for example using an atomic force microscope).
- a force for example using an atomic force microscope.
- the measured mechanical property is compared with a predetermined reference by means of a computer. For example, it can be checked whether the lymphocytes are firmer or less firm than a reference value. On the
- the computer decides whether an indicator of an inflammatory
- Cardiomyopathy is present.
- the mechanical properties are a good marker for distinguishing between non-inflammatory cardiomyopathy and inflammatory cardiomyopathy.
- Such a marker can be obtained easily and in particular less invasively than with EMBs.
- organ biopsies pose a risk, albeit slight, of
- a doctor will use the method according to the invention when he has to diagnose a DCMi or a DCM non-inflammatory genesis in a patient. I.e. the doctor will analyze a blood sample using the claimed method for a patient whose symptoms suggest a suspected DCM or diagnosis of DCM. This analysis then gives the doctor an indication of whether there is a DCMi or whether there is a non-inflammatory DCM.
- the Property is determined by measuring the lymphocytes due to the deformation caused by a fluid flow. Such a deformation allows controlled forces to be exerted on the lymphocytes. In particular, if the liquid flow is laminar, the forces can be accurate and
- the deformation is preferably measured optically, for example by means of a microscope.
- RT-DC was also used to identify a mechanically separate subpopulation of mesenchymal stem cells that were not using traditional methods
- An indicator of inflammatory cardiomyopathy is when there is a mechanical property of the cell
- Such deformability can, for example, by the
- Deformation of lymphocytes can be measured by increasing forces and calculated using the modulus of elasticity. It is sufficient to simply use a computer to check whether a cell is firmer or less firm than a certain limit. Such a process has proven to be particularly meaningful.
- a device which is designed for carrying out a method according to one of the preceding claims.
- a device can in particular be a modified device according to WO
- Such a device can preferably display or record the result of the method optically, acoustically and / or by recording the result on a storage medium.
- Figure 2 shows results of mechanical profiling of lymphocytes.
- the experimental setup consists of an inverted microscope, in which blood is pumped through a constriction of a microfluidic channel that is arranged on a microscope stage. As the blood passes through a detection chamber, the cells within the channel are deformed by a hydrodynamic interaction, which is recorded by a high-speed video camera.
- Figure 1b shows a time series of an initially round cell that undergoes a shape change that is essentially similar to a bullet.
- the deformation d is defined as: where A describes the area of the cell in the image and 1 the length of the cell perimeter in the image.
- RT-DC is able to measure heterogeneous samples
- a mechanical phenotype of whole blood can be obtained without having to specially prepare the sample (see Figure lc).
- This figure shows a mechanical phenotype of whole blood that shows red blood cells (highest deformation), platelets and leukocytes (bottom). The section shows leukocytes after the separation. The populations of lymphocytes (T cells and B cells) and granulocytes / monocytes were separated by negative magnetic cell sorting.
- Figure 1d shows the in vitro stimulation of granulocytes (gran) by phorbol-12-myristat-13-acetate (PMA), which leads to a clear change in the deformation.
- PMA phorbol-12-myristat-13-acetate
- RT-DC ability of RT-DC to analyze heterogeneous samples makes it possible to measure cells in whole blood directly, without having to clean them beforehand or otherwise
- Respiratory diseases show a higher deformation value for neutrophils and monocytes compared to a healthy control group, while a viral infection with the
- Epstein-Barr virus also led to an increased deformation of the lymphocyte population in peripheral blood (Toepfner et al.). These data indicate a differential immune cell response to bacterial and viral infection that is of potential diagnostic interest.
- EMBs were taken from all patients for clinical reasons to determine the etiology of the patient
- RA rheumatoid arthritis
- Citrate blood analyzed at different flow rates. The different flow rates were needed to get cells
- Figure 2a shows as examples the mechanical profile of peripheral leukocytes of a healthy participant (control), a DCM patient, a DCMi patient and an RA patient after a continuous measurement for 10 minutes each. Two populations are visible here. While
- Lymphocytes have a peak with an average cell size of 40 ym 2 , for granulocytes / monocytes there is a peak at approximately 60 ym 2 . Because lymphocytes play a critical role in DCMi, the inventors focused on analyzing the lymphocyte population by determining a relative change in mean deformation as a function of flow rate. A linear fit of this data gives a deformation index Di, which is the slope of the
- Control group, the DCM group, the DCMi group and the RA group is compared.
- the results are shown in Figure 2b.
- control group had a mean Di ⁇ standard deviation of 0.14 ⁇ 0.007, while the DCM and DCMi groups respectively increased values of 0.17 ⁇ 0.009 and 0.21 ⁇ 0.012 exhibit.
- lymphocytes from patients with rheumatoid arthritis were analyzed to determine the mechanical
- Results show that Di as a marker has great potential for the correct diagnosis of DCMi patients.
- Lymphocytes from patients with RA showed increased cell deformation comparable to the result obtained from patients with DCMi. Therefore, based on the
- Mechanoprofiling DCMi cannot be distinguished from an RA, which is an example of a systemic
- Mechanoprofiling is therefore believed to be a new method of screening patients with DCMi.
- the data from the pilot study also show that the
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose, ob eine dilatative Kardiomyopathie oder eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, mit folgenden Schritten: - Bestimmen einer mechanischen Eigenschaft von Lymphozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind, - Vergleichen der mechanischen Eigenschaft mit einer vorher definierten festgelegten Referenz, und - Entscheiden auf der Grundlage des Vergleichs, ob ein Indikator für dilatative Kardiomyopathie oder entzündliche Kardiomyopathie vorliegt.
Description
Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose und Vorrichtung dafür
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Unterstützung einer Diagnose, ob entzündliche Kardiomyopathie vorliegt. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung, die für das Durchführen eines solchen Verfahrens ausgestaltet ist .
Technisches Gebiet
Herzinsuffizienz ist eine der am weitesten verbreiteten
Ursachen für die Sterblichkeit auf der gesamten Welt und ist somit eine große Belastung für das Gesundheitssystem.
Dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist für 30-40 % aller Fälle von Herzversagen verantwortlich und ist einer der Hauptgründe für Herztransplantationen. Entzündliche Kardiomyopathie
(DCMi) ist eine häufig auftretende Form von DCM. Eine
longitudinale prospektive Untersuchung an einer größeren Patientenkohorte mit V. a. Myokarditis zeigte, dass der immunhistologische Nachweis einer myokardialen Entzündung in einer multivariaten Analyse mit einer schlechten Prognose assoziiert war, während eine eingeschränkte linksventrikuläre Pumpfunktion nur univariat mit einer schlechten Prognose assoziiert war. (Kindermann et al . Predictors of outcome in patients with suspected myocarditis. Circulation
2008;118:639-648.) Daher hat der Nachweis einer myokardialen Entzündung in der immunhistologischen Analyse von
Myokardbiopsien eine erhebliche klinische und
wissenschaftliche Bedeutung. Bei einer entzündlichen
Kardiomyopathie spielen Störungen des zellulären Immunsystems zusammen mit einer Aktivierung von Lymphozyten und
Monozyten/Makrophagen eine wichtige Rolle.
Entsprechend eines Positionspapiers der Europäischen
Gesellschaft für Kardiologie (ESC) ist die dilatative
Kardiomyopathie eine Krankheit, die durch das Vorhandensein einer linksventrikulären oder biventrikulären Dilatation und einer systolischen Dysfunktion (linksventrikuläre
Pumpfunktion von weniger als 45 %) definiert ist (Pinto, Y.M., et al . , Proposal for a revised definition of dilated cardiomyopathy, hypokinetic non-dilated cardiomyopathy, and its implications for clinical practice: a Position Statement of the ESC working group on myocardial and pericardial diseases. Eur Heart J, 2016. 37(23): S. 1850-8). Große klinische Studien haben gezeigt, dass eine DCM für viele Fälle einer Herzinsuffizienz (HI) verantwortlich und die Hauptursache für eine Herztransplantation ist (Haas, J., et al . , Atlas of the clinical genetics of human dilated
cardiomyopathy. Eur Heart J, 2015. 36(18): S. 1123-35a) . Die Ursachen für DCM können sowohl genetisch als auch nicht genetisch sein. Entsprechend experimenteller und klinischer Daten sind virale Infektionen und myokardiale
Entzündungsprozesse in der Pathogenese einer DCMi und auch einer DCM involviert (Heymans, S., et al . , The Quest for New Approaches in Myocarditis and Inflammatory Cardiomyopathy. J Am Coli Cardiol, 2016. 68(21): S. 2348-2364).
Eine chronische Myokarditis zusammen mit einer ventrikulären systolischen Dysfunktion wird als „entzündliche oder
inflammatorische Kardiomyopathie" (DCMi) bezeichnet und ist die am häufigsten auftretende Form von DCM, welche nicht durch genetische Ursachen verursacht wird (Caforio, A.L., et al . , Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a Position Statement of the European Society of Cardiology Working Group on
Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J, 2013.
34(33): S. 2636-48, 2648a-2648d) . Störungen des zellulären und humoralen Immunsystems spielen bei der Entwicklung von DCM eine kausalpathogenetisch relevante Rolle (Felix, S.B., D. Beug, and M. Dorr, Immunoadsorption therapy in dilated
cardiomyopathy . Expert Rev Cardiovasc Ther, 2015. 13(2): S. 145-52) . In vielen Fällen werden dabei nach einer
myokardialen Virusinfektion Autoimmunvorgänge induziert, die sich in einer Aktivierung des zellulären und humoralen
Immunsystems gegen kardiale Antigene manifestieren. Der
Krankheitsverlauf einer chronischen Autoantigen getriebenen myokardialen Entzündung kann im Endstadium zu einem
Herzversagen führen. In vielen Fällen kann dann den Patienten als einzige palliative Therapieoption nur eine
Herztransplantation angeboten werden. Bei Patienten mit
Verdacht auf eine DCMi wurden immunhistologische Verfahren zum Nachweis einer myokardialen Entzündung in
Herzmuskelproben (Endomyokardbiopsien [EMBs]) eingeführt. Die Diagnose einer DCMi basiert dabei auf einen Nachweis einer erhöhten Anzahl von Lymphozyten und Makrophagen im
Myokardgewebe als auch eine erhöhte Expression von
Zelladhäsionsmolekülen (Kindermann et al . , Caforio et al . ) .
Ein grundlegendes Problem bei der Diagnose von Patienten mit einer DCM ist die Frage, ob eine DCMi oder eine DCM nicht entzündlicher Genese vorliegt. Die Krankheitsbilder sind sehr ähnlich, und es ist nur mit hohem Aufwand möglich, der auch die Entnahme von EMBs erfordert, diese beiden Krankheiten zu unterscheiden .
Derzeit ist der Goldstandard für die Diagnose einer
myokardialen Entzündung eine Immunhistochemie von EMBs. Es werden unterschiedliche Aussagen der internationalen
Gesellschaften für Herz-Kreislauf-Krankheiten bezüglich der Art und Weise der Diagnose veröffentlicht. Die Arbeitsgruppe für Herzmuskel- und perikardiale Erkrankungen der ESC
empfiehlt bei Patienten mit Verdacht auf eine klinische
Myokarditis EMBs für immunhistochemische und molekulare
Analysen. Im Gegensatz dazu machen die geltenden Richtlinien zur Handhabung von Herzversagen der American Heart
Association (AHA) und des American College of Cardiology (ACC) widersprüchliche Aussagen im Hinblick auf die
Indikation von EMBs für Patienten mit Verdacht auf Myokarditis. Gemäß der Empfehlung des ACC/der AHA sind EMBs nur bei Patienten in lebensbedrohlichen Situationen wie zum Beispiel einer ungeklärten akuten Kardiomyopathie mit einer inotropen oder mechanischen Kreislaufunterstützung und/oder schweren Herzrhythmusstörungen indiziert (Yancy, C.W., et al . , 2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart failure: executive summary: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on practice guidelines, Circulation, 2013. 128(16): S. 1810-52, Bozkurt, B., et al . , Current Diagnostic and
Treatment Strategies for Specific Dilated Cardiomyopathies : A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation, 2016. 134(23): S. e579-e646). Diese divergenten Aussagen der ESC und der ACC/AHA sind Beispiele für die Unsicherheiten im Hinblick auf die Indikation von EMBs bei einer Myokarditis. Aus diesem Grund sind alternative
Verfahren, die auf eine Myokardentzündung hinweisen, klinisch und wissenschaftlich von besonderem Interesse.
Eine Magnetresonanztomografie für eine Myokarditis als eine neue Bildgebungsmethode zur Beurteilung einer
Myokardentzündung (Friedrich, M.G., et al . , Cardiovascular magnetic resonance in myocarditis: A JACC White Paper. J Am Coli Cardiol, 2009. 53(17): S. 1475-87) kann bei Patienten mit Herzschrittmachern oder Defibrillatoren) , die sehr oft bei diesem Krankheitsbild implantiert werden, nicht
eingesetzt werden. Außerdem ist die Spezifität einer
Magnetresonanztomografie für das Herz nicht hoch genug, um eine Myokardentzündung bei chronischer Myokarditis und DCMi zuverlässig zu diagnostizieren. Der diagnostische
Goldstandard zur Diagnose einer Myokardentzündung ist daher unverändert eine immunhistologische Untersuchung einer EMB (Caforio et al . ) .
Im Hinblick auf die erheblichen Auswirkungen auf den
Krankheitsverlauf bei Diagnose einer Myokardentzündung bei
Patienten mit Herzinsuffizienz und DCM und den
widersprüchlichen Aussagen der weltweiten kardiologischen Gesellschaften im Hinblick auf die Indikation von EMBs ist eine Verstärkung der Forschungsbemühungen gerechtfertigt, um nach neuen Biomarkern zu suchen, die mit einer
Myokardentzündung bei DCM einhergehen. Neben dem humoralen Immunsystem mit Produktion kardialer Autoantikörper ist das zelluläre Immunsystem mit Aktivierung von
Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten gegen kardiale Epitope bei der Entstehung einer Myokarditis und konsekutiver DCMi involviert. Zusätzlich zu der Immunhistochemie von EMBs kann die Aktivierung des zellulären Immunsystems auch durch das ImmunoprofHing von peripheren Leukozyten diagnostiziert werden. Interessanterweise sind im Vergleich zu gesunden Kontrollpatienten Thl7-Lymphozyten signifikant im peripheren Blut von DCMi-Patienten erhöht vorhanden (Myers, J.M., et al . , Cardiac myosin-Thl7 responses promote heart failure in human myocarditis. JCI Insight, 2016. 1(9)). Bei der
Myokarditis von Mäusen konnte gezeigt werden, dass die
Progression der Myokarderkrankung von der Interaktion von CD40-CD40L abhängig ist (Bo, H., L. Zhenhu, and Z. Lijian, Blocking the CD40-CD40L interaction by CD40-Ig reduces disease progress in murine myocarditis induced by CVB3.
Cardiovasc Pathol, 2010. 19(6) : S. 371-6) . Dieser Komplex ist einer der wichtigsten Faktoren bei der Aktivierung von B- Lymphozyten durch T-Lymphozyten (Parker, D.C., The functions of antigen recognition in T cell-dependent B cell activation. Semin Immunol, 1993. 5(6): S. 413-20).
Ferner konnte gezeigt werden, dass stärkere Antigensignale eine erhöhte Differenzierung von IL-17-produzierenden T- Lymphozyten durch eine Kommunikation zwischen CD40 und CD40L induzieren (Iezzi, G., et al . , CD40-CD40L cross-talk
integrates strong antigenic Signals and microbial Stimuli to induce development of IL-17-producing CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sei U S A, 2009. 106(3) : S. 876-81) . Diese Ergebnisse des Immunoprofilings sind zunächst für die
Grundlagenforschung von Interesse, aufgrund hoher Kosten und nicht vorhandener „High-Throughput" Verfahren aktuell von geringer Relevanz für die klinische Praxis.
Ferner werden BNP (natriuretisches Peptid Typ B) und NT- proBNP (engl. „N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide") als diagnostische Biomarker für die
Herzinsuffizienz verwendet. Jedoch ist die Aussagekraft dieser Marker, was die Diagnose der Ätiologie
Herzinsuffizienz angeht, gering (Ponikowski, P., et al . , 2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure: The Task Force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure of the European Society of Cardiology (ESC) Developed with the special contribution of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC. Eur Heart J, 2016. 37(27): S. 2129-2200, und Felker, G.M., et al . , Serial high sensitivity cardiac troponin T measurement in acute heart failure: insights from the RELAX- AHF study. Eur J Heart Fail, 2015. 17 (12) : S. 1262-70) .
Darstellung der Erfindung
Aus den vorgenannten Gründen wird klar, dass es von
erheblicher Relevanz ist, neue Verfahren bzw. Marker zu finden, welche die Diagnose von einer DCMi erleichtern.
Ersten Forschungsergebnissen der Erfinder zufolge sind die mechanischen Eigenschaften von Leukozyten ein Indikator zum Überwachen des Fortschritts von Krankheiten bei Entzündungen (Toepfner, N., et al . , Detection of human disease conditions by single-cell morpho-rheological phenotyping of blood.
Elife, 2018, 7, Otto, 0., et al . , Real-time deformability cytometry: on-the-fly cell mechanical phenotyping. Nat
Methods, 2015. 12(3): S. 199-202).
Wenn man diese Eigenschaften als ein Maß der Verformung einer Zelle unter einer externen Last und die Veränderung dieses
Maßes mit der Zeit definiert, stellen die mechanischen
Eigenschaften einen Indikator bereit, welcher den Zustand der Zelle und deren Funktion darstellt.
In den letzten Jahren haben diese Eigenschaften erhöhte
Relevanz bekommen, um die Wechselwirkungen des Stoffwechsels und der molekularen Struktur von Proteinen zu studieren
(Münder, M.C., et al . , A pH-driven transition of the
cytoplasm from a fluid- to a solid-like state promotes entry into dormancy. Elife, 2016, 5), um Stammzellen zu
identifizieren (Xavier, M., et al . , Mechanical phenotyping of primary human skeletal stem cells in heterogeneous
populations by real-time deformability cytometry. Integr Biol (Camb) , 2016. 8(5): S. 616-23) oder um Krankheitszustände zu charakterisieren (Gossett, D.R., et al . , Hydrodynamic
Stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sei U S A, 2012. 109(20) : S.
7630-5) .
Jedoch wurden - obwohl eine erste Studie zu den Veränderungen in der Zellsteifigkeit von Fibroblasten aus dem Herzen, die von EMBs unter Verwendung von Rasterkraftmikroskopie erhalten wurden, vielversprechend war (Glaubitz, M., et al . , Stiffness of left ventricular cardiac fibroblasts is associated with ventricular dilation in patients with recent-onset
nonischemic and nonvalvular cardiomyopathy . Circ J, 2014. 78(7): S. 1693-700) - die mechanischen Eigenschaften von Zellen als ein klinisch relevanter Parameter in der
kardiovaskulären Forschung bis jetzt noch nicht in Betracht gezogen und es wurde insbesondere noch nicht erwogen, diese Eigenschaften zur Diagnose einer DCMi zu verwenden.
Die Erfinder sind der Auffassung, dass durch die Einführung der Real-Time Deformability Cytometry (RT-DC) die
mechanischen Eigenschaften von Zellen nun mit Raten von bis zu 1000 Zellen pro Sekunde in Echtzeit analysiert werden können, welches eine Voraussetzung für eine Entwicklung eines
neuen Biomarkers ist (Golfier, S., et al . , High-throughput cell mechanical phenotyping for label-free titration assays of cytoskeletal modifications . Cytoskeleton (Hoboken) , 2017. 74 (8) : S. 283-296) .
Die Erfinder haben daher die Hypothese aufgestellt, die mechanischen Eigenschaften von Lymphozyten als ein Marker für das Vorhandensein einer entzündlichen Kardiomyopathie zu nehmen. Wie aus den weiteren Ausführungen deutlich werden wird, ist ein solcher Marker zur Unterscheidung von anderen Krankheitsbildern geeignet und könnte dazu verwendet werden, einem Arzt ein zusätzliches neues Diagnoseverfahren an die Hand zu geben.
Die Erfindung wird durch Anspruch 1 definiert. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen definiert. Die Erfindung wird ferner durch den Vorrichtungsanspruch definiert.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein computergestütztes Verfahren zur Unterstützung der Diagnose einer entzündlichen Kardiomyopathie. Darunter, dass eine Diagnose lediglich „unterstützt" wird, wird verstanden, dass das beanspruchte Verfahren nicht als alleinige Diagnose dienen kann bzw. soll. Insbesondere können andere Diagnoseverfahren verwendet werden, um eine abschließende Diagnose zu treffen. Das vorliegende Verfahren dient lediglich dazu, einem Arzt bzw. einer Person, die eine Diagnose stellen möchte, ein
(weiteres) Mittel an die Hand zu geben, um eine entzündliche Kardiomyopathie zu diagnostizieren und um dieses von anderen Krankheitsbildern (wie z.B. eine DCM ohne Myokardentzündung) zu unterscheiden. Dieses Verfahren könnte bei Patienten mit bereits in EMBs eindeutig diagnostizierter DCMi auch zur Verlaufskontrolle der myokardialen Inflammation eingesetzt werden .
Vorliegend wird eine mechanische Eigenschaft von Lymphozyten
in einer Blutprobe von einem Patienten, bei dem festgestellt werden soll, ob er an einer DCMi leidet, untersucht. Die Lymphozyten können anhand der Größe von anderen Bestandteilen des Bluts unterschieden werden. Die mechanischen
Eigenschaften dieser Lymphozyten können durch eine
Vorrichtung zum Beispiel dadurch bestimmt werden, dass durch diese direkt eine Kraft ausgeübt wird (zum Beispiel mittels eines Rasterkraftmikroskops). Es ist jedoch auch prinzipiell möglich und wird auch in dieser Patentanmeldung bevorzugt, solche Zellen durch ein Flusszytometer, wie zum Beispiel den AcCellerator® der Zellmechanik Dresden GmbH, zu verformen und die mechanische Eigenschaft der Lymphozyten so zu messen.
Die gemessene mechanische Eigenschaft wird mittels eines Computers mit einer vorher festgelegten Referenz verglichen. Zum Beispiel kann überprüft werden, ob die Lymphozyten fester oder weniger fest sind als ein Referenzwert. Auf der
Grundlage dieses Vergleichs wird dann durch den Computer entschieden, ob ein Indikator für eine entzündliche
Kardiomyopathie vorliegt.
Wie aus der weiteren Beschreibung deutlich werden wird, sind die mechanischen Eigenschaften ein guter Marker für eine Unterscheidung zwischen nicht-entzündlicher Kardiomyopathie und entzündlicher Kardiomyopathie.
Ein solcher Marker kann leicht und insbesondere weniger invasiv als mit EMBs gewonnen werden. Prinzipiell stellen Organbiopsien eine, wenn auch geringe, Gefährdung von
Patienten dar. Im Falle einer EMB sind Patienten durch
Herzrhythmusstörungen, Blutungen oder im schlimmsten Falle durch eine Perforation der Herzkammerwand gefährdet. Diese Komplikationen sind selten. Prinzipiell muss aber bei jedem dieser Eingriffe der diagnostische Nutzen gegen die
Gefährdung abgewogen werden. Insofern ist ein solcher
Biomarker bei den meisten Patienten gefahrlos zu bestimmen, da lediglich eine Blutabnahme erforderlich ist, jedoch keine
weitergehenden invasiven Eingriffe. Dies könnte nicht nur für den Komfort des Patienten, sondern könnte für dessen Prognose von Bedeutung sein, wenn dieser Biomarker eindeutig mit einer DCMi assoziiert ist. Insbesondere ist ein solcher Eingriff auch dann möglich, wenn eine EMB den Patienten aufgrund eines schlechten Allgemeinzustands gefährden würde.
Vorliegend wird ein Arzt das erfindungsgemäße Verfahren dann einsetzen, wenn er bei einem Patienten die Diagnose einer DCMi oder einer DCM nicht-entzündlicher Genese stellen muss. D.h. der Arzt wird bei einem Patienten, dessen Symptome einen Verdacht auf DCM oder eine Diagnose von DCM nahelegen, eine Blutprobe mit dem beanspruchten Verfahren analysieren. Diese Analyse gibt dann dem Arzt einen Hinweis darauf, ob eine DCMi vorliegt oder ob eine nicht-entzündliche DCM vorliegt.
Von besonderer Bedeutung ist, dass die mechanische
Eigenschaft durch die Messung der Lymphozyten aufgrund der Verformung durch einen Flüssigkeitsstrom bestimmt wird. Durch eine solche Verformung können kontrolliert Kräfte auf die Lymphozyten ausgeübt werden. Insbesondere können, wenn der Flüssigkeitsstrom laminar ist, die Kräfte genau und
zuverlässig quantifiziert werden, was bei einem turbulenten Flüssigkeitsstrom nicht oder nur mit Einschränkung der Fall wäre. Auch kann man hierdurch das Verfahren sehr gut
automatisieren, da man in dem Flüssigkeitsstrom viele
Lymphozyten untersuchen kann, die durch den Flüssigkeitsstrom quasi wie auf einem „Fließband" transportiert werden.
Bevorzugt erfolgt die Messung der Verformung optisch, zum Beispiel mittels eines Mikroskops. Eine solche optische
Messung ist leicht implementierbar, auch da es nach dem Stand der Technik verschiedene Programmierbibliotheken und
Softwarepakete zur Auswertung von elektronisch erhaltenen Bildern gibt. Eine solche Messung kann in Echtzeit erfolgen, d.h. während die Bilder erzeugt werden. Daher wurde der
Begriff Real-Time Deformability Cytometry geprägt, wie diese in der WO 2015/024690 Al beschrieben ist.
Die Relevanz von RT-DC in den Lebenswissenschaften hat sich bereits in der Grundlagenforschung und auch in der
angewandten zellbiologischen Forschung gezeigt. Unter
Verwendung von Hefe als Modellsystem konnte gezeigt werden, dass eine Veränderung des pH-Wertes innerhalb der Zelle zu einem Phasenübergang innerhalb des Zytoplasmas von flüssig zu fest führt, welcher zu einem Ruhezustand der Zelle führt (siehe Münder et al . ) . Diese Beobachtung ist sehr wichtig, um zum Beispiel die komplizierte Wechselwirkung von
Zellfunktion, Stoffwechsel und Mechanik zu verstehen.
Zusätzlich wurde RT-DC auch angewandt, um eine mechanisch separate Subpopulation von mesenchymalen Stammzellen zu identifizieren, die nicht mit klassischen Verfahren
darstellbar war (siehe Xavier et al . ) .
Die Immunfluoreszenzanalyse mittels FACS hingegen ist im Vergleich zum RT-DC eine sehr aufwendige und kostenintensive Methode. Trotz umfangreicher Färbung und Klassifizierung verschiedener Immunzellpopulation konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen DCM und DCMi Patienten gefunden werden. Die FACS-Analyse kann perspektivisch genutzt werden, um molekulare Mechanismen zu erklären, die dafür verantwortlich sind, dass Immunzellen verschiedene Verformbarkeiten in DCM und DCMi Patienten aufweisen. Für den klinischen
Routinegebrauch ist die FACS-Analyse dem RT-DC neben den erwähnten Kosten und Aufwand auch in der Handhabung klar unterlegen .
Des Weiteren haben auch Standard-Parameter keinen signifikanten Unterschied zwischen DCM und DCMi zeigen können :
festgestellt wird, die einer stärkeren Verformbarkeit als ein Grenzwert entspricht. Anders ausgedrückt ist die Zelle dann „weicher" als ein Schwellenwert. Die Entscheidung, dass kein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, erfolgt bei einer mechanischen Eigenschaft, die einer
geringeren Verformbarkeit als der Grenzwert entspricht, d.h. die Zelle ist dann „härter" als ein Schwellenwert. Somit kann mittels der Bestimmung der Verformbarkeit der Zelle
festgestellt werden, ob ein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt.
Eine solche Verformbarkeit kann zum Beispiel durch die
Verformung von Lymphozyten durch zunehmende Kräfte gemessen werden und mit Hilfe des Elastizitätsmoduls berechnet werden. Es reicht hierbei aus, lediglich durch einen Computer zu überprüfen, ob eine Zelle fester bzw. weniger fest ist als ein bestimmter Grenzwert. Ein solches Verfahren hat sich als besonders aussagekräftig herausgestellt.
Erfindungsgemäß ist weiterhin eine Vorrichtung, die für das Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche ausgestaltet ist. Eine solche Vorrichtung kann insbesondere eine modifizierte Vorrichtung gemäß der WO
2015/024690 Al sein. Eine solche Vorrichtung kann bevorzugt das Ergebnis des Verfahrens optisch, akustisch und/oder durch das Aufzeichnen des Ergebnisses auf einem Speichermedium anzeigen bzw. aufzeichnen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Abbildungen la bis c zeigen ein Verfahren zur
Durchführung der Real-Time Deformability Cytometry.
Abbildung ld zeigt eine Veränderung der Verformung von
Granulozyten .
Abbildung 2 zeigt Ergebnisse des mechanischen Profilings von Lymphozyten .
Detaillierte Beschreibung der Abbildungen
Wie in Abbildung la gezeigt besteht der experimentelle Aufbau aus einem invertierten Mikroskop, bei dem Blut durch eine Verengung eines mikrofluidischen Kanals gepumpt wird, der auf einem Mikroskoptisch angeordnet ist. Während das Blut durch eine Detektionskammer hindurchtritt, werden die Zellen innerhalb des Kanals durch eine hydrodynamische Interaktion verformt, welche durch eine Hochgeschwindigkeitsvideokamera aufgenommen wird.
Ein Beispiel einer solchen Verformung ist in Abbildung lb gezeigt, welche eine Zeitreihe einer anfänglich runden Zelle zeigt, die eine Formänderung erfährt, die im Wesentlichen einer Gewehrkugel gleicht. Mit dem von Otto et al .
beschriebenen Algorithmus werden die Zellgröße und die
Verformung in Echtzeit analysiert. Hierbei ist die Verformung d definiert als:
wobei A die Fläche der Zelle in dem Bild und 1 die Länge des Zellumfangs in dem Bild beschreibt.
Da RT-DC in der Lage ist, heterogene Proben zu vermessen, kann ein mechanischer Phänotyp von Vollblut erhalten werden, ohne dass man die Probe besonders vorbereiten muss (siehe Abbildung lc) . In dieser Abbildung wird ein mechanischer Phänotyp von Vollblut gezeigt, der Erythrozyten (höchste Deformation), Blutplättchen und Leukozyten (unten) abbildet.
Der Ausschnitt zeigt Leukozyten nach der Separation. Die Populationen von Lymphozyten (T-Zellen und B-Zellen) und Granulozyten/Monozyten wurden durch negatives magnetisches Zellensortieren separiert.
In Abbildung ld ist die in vitro Stimulation von Granulozyten (gran) durch Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) gezeigt, welche zu einer klaren Veränderung in der Deformation führt.
Die Fähigkeit von RT-DC, heterogene Proben zu analysieren ermöglicht es, Zellen im Vollblut direkt zu vermessen, ohne diese vorher aufwendig aufzureinigen oder anderweitig
verändern zu müssen. Spezielle Analyseverfahren sollen es ermöglichen, eine direkte funktionale Analyse zum Beispiel von Lymphozyten durchzuführen, und zwar unabhängig von einer Zellaktivierung mit potentiellen Veränderungen.
Wie in Abbildung ld gezeigt, resultierte die Aktivierung von Granulozyten in vitro mit PMA in einer verstärkten
Deformierung von Zellen (siehe Golfier et al . und Otto et al) .
Vorhergehende in vitro Studien von Patienten mit
Atemwegserkrankungen zeigen einen höheren Deformationswert für Neutrophile und Monozyten im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe, während eine virale Infektion mit dem
Epstein-Barr-Virus auch zu einer vergrößerten Deformation der Lymphozytenpopulation im peripheren Blut führte (Toepfner et al . ) . Diese Daten deuten auf eine differentielle Antwort der Immunzellen auf eine bakterielle und virale Infektion hin, die von potentiellem diagnostischem Interesse ist.
Im Hinblick auf die Anwendung der Analyse der mechanischen Eigenschaften von Lymphozyten wurde eine erste Pilotstudie durchgeführt, bei der Daten von Patienten mit DCM oder DCMi und einer linksventrikulären Pumpfunktion von weniger als 45 % analysiert wurden.
Die Ergebnisse einer Pilotstudie werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben, bei der Patienten mit DCM/DCMi mit Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis (RA) und einer gesunden Kontrollgruppe verglichen wurden:
Wie von der ESC empfohlen, wurden EMBs von allen Patienten aus klinischen Gründen entnommen, um die Ätiologie der
Myokarderkrankung mittels Immunhistochemie zu
diagnostizieren. Zusätzlich wurde ein MechanoprofHing der Lymphozyten von peripheren Blutproben mittels RT-DC
durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit denjenigen von gesunden Individuen verglichen. Patienten mit einer
rheumatoiden Arthritis (RA) dienten als Patientenkohorte mit einer systemischen inflammatorischen Erkrankung. Zusätzlich wurde in allen Individuen ein ImmunoprofHing mittels einer FACS-Analyse von peripheren Blutzellen durchgeführt.
Für das RT-DC der peripheren Leukozyten wurden 25 mΐ
Citratblut bei verschiedenen Flussraten analysiert. Die verschiedenen Flussraten wurden benötigt, um Zellen
verschiedenen hydrodynamischen Kräften auszusetzen, die zu verschiedenen Deformationen führen. Dieser Ansatz ermöglicht die mechanische Charakterisierung von Zellen unabhängig von deren anfänglicher Form. In der aktuellen Pilotstudie wurden selektiv nur Leukozyten im Vollblut analysiert.
Abbildung 2a zeigt als Beispiele das mechanische Profil von peripheren Leukozyten eines gesunden Teilnehmers (Kontrolle) , eines DCM-Patienten, eines DCMi-Patienten und eines RA- Patienten nach einer kontinuierlichen Messung für jeweils 10 Minuten. Hier sind zwei Populationen sichtbar. Während
Lymphozyten einen Peak bei einer mittleren Zellgröße von 40 ym2 haben, liegt für Granulozyten/Monozyten ein Peak bei ungefähr 60 ym2 vor. Da Lymphozyten eine entscheidende Rolle bei der DCMi spielen, haben sich die Erfinder auf die Analyse der Lymphozytenpopulation fokussiert, indem eine relative Veränderung in der mittleren Deformation als eine Funktion der Flussrate bestimmt wurde. Ein linearer Fit dieser Daten gibt einen Deformationsindex Di, der die Steigung der
Funktion beschreibt und der jeweils zwischen der
Kontrollgruppe, der DCM-Gruppe, der DCMi-Gruppe und der RA- Gruppe verglichen wird. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2b gezeigt .
Wie in dem linken Teil der Abbildung 2b gezeigt, weist die Kontrollgruppe einen mittleren Di±Standardabweichung von 0,14 ± 0,007 auf, während die DCM- und die DCMi-Gruppen jeweils erhöhte Werte von 0,17 ± 0,009 und 0,21 ± 0,012 aufweisen.
Die Vergleiche der Paare führen zu statistisch signifikanten Differenzen im Di der DCM-Gruppe im Vergleich zur
Kontrollgruppe (p = 0,004), der DCMi-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (p = 0,001) und der DCMi-Gruppe im Vergleich zur DCM-Gruppe (p = 0,03) . Interessant ist die Beobachtung eines erhöhten Di bei Patienten mit DCMi, was im Einklang mit den vorherigen Resultaten einer erhöhten Deformation von Leukozyten in Personen mit Atemwegsinfektionen steht
(Toepfner et al . ) .
Es wurden zusätzlich Lymphozyten von Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis analysiert, um das mechanische
Zellprofil von DCM-Patienten mit demjenigen von Patienten mit einer systemischen entzündlichen Erkrankung zu vergleichen.
Die Ergebnisse sind in dem rechten Teil der Abbildung 2b gezeigt, wo der Di der RA-Gruppe denjenigen der DCM-Gruppe übersteigt (p = 0,002).
Um die Aussagekraft des Mechanoprofilings zur Diagnose, ob ein Patient an einer DCMi leidet, einzuschätzen, wurde die Sensitivität und Spezifität für alle Di-Grenzwerte berechnet. Es wurde ein optimaler Grenzwert von Di = 0,194 mit einer Sensitivität und einer Spezifität von jeweils 0,78 gefunden, während die Receiver Operating Characteristic eine Fläche unter der Kurve von 0,83 für beide Gruppen ergab. Diese
Resultate zeigen, dass Di als Marker prinzipiell ein hohes Potenzial für die korrekte Diagnose von DCMi-Patienten hat.
Anschließend wurde als ein erster Schritt zum Immunoprofiling die Abundanz von peripheren Lymphozyten-Subpopulationen von DCM-/DCMi-Patienten über FACS-Analyse quantifiziert
(Esfandiarei , M. and B.M. McManus, Molecular biology and pathogenesis of viral myocarditis. Annu Rev Pathol, 2008. 3: S. 127-55) . Alle diese Messungen wurden mittels eines Becton Dickinson LSR II unter Verwendung einer Gruppe von neun fluorochrom markierten Antikörpern durchgeführt, und die Datenanalyse erfolgte mit der Software FlowJo. Die Zellzahlen wurden auf 100.000 CD 45+ Leukozyten normalisiert (Mittelwert [Minimalwert, Maximalwert] ) . Es wurden signifikant erhöhte Werte von CD4+ T-Zellen in DCM-Patienten (Mittelwert = 9229 [1478, 17.724]; p = 0,007) und DCMi-Patienten (Mittelwert = 4823 [486, 8512], p = 0,009) im Vergleich zu gesunden
Kontrollgruppen (Mittelwert = 1596 [42, 2684]) gefunden.
Ähnlich wurden signifikant erhöhte Mengen an CD19+ B-Zellen und CD8+ T-Zellen sowohl in DCM (CD19+ Mittel = 1964 [163, 3663], p = 0,006), (CD8+ Mittelwert = 4729 [1352, 9377], p =
0,018) als auch DCMi-Patienten (CD19+ Mittelwert = 2665 [731, 5049], p = 0,003), (CD8+ Mittelwert = 4434 [2114, 10.599], p = 0,023) im Vergleich zu gesunden Individuen gefunden (CD19+ B-Zellen Mittelwert = 596 [73, 1360]), (CD8+ T-Zellen
Mittelwert = 1627, [237, 3160]). Jedoch hat sich die Anzahl
der B- und T-Zellen nicht zwischen DCM- und DCMi-Patienten unterschieden. Trotz aufwendiger Färbung und
Zellzahlbestimmung mittels FACS ist es nicht möglich zwischen DCM und DCMi zu unterscheiden. Insofern ist das
Mechanoprofiling mittels RT-DC dem Immunoprofiling mittels FACS überlegen.
Die vorliegenden Daten zeigen zum ersten Mal, dass das
Mechanoprofiling von peripheren Lymphozyten zur Diagnose von DCMi beitragen kann. Interessanterweise zeigen auch
Lymphozyten von Patienten mit RA eine erhöhte Zelldeformation auf, die mit dem Ergebnis vergleichbar ist, das von Patienten mit DCMi erhalten wurde. Daher kann basierend auf dem
Mechanoprofiling DCMi nicht von einer RA unterschieden werden, welches ein Beispiel einer systemischen
Entzündungserkrankung ist. Jedoch ist eine Unterscheidung von DCMi und RA nicht für die klinische Praxis von Relevanz, da in Fällen eines klinischen Verdachts auf eine kardiale
Manifestation einer systemischen Immunkrankheit die
internationalen Richtlinien eindeutig EMBs empfehlen.
Anzumerken ist darüber hinaus, dass in den allermeisten
Fällen (mehr als 95 %) eine Myokarditis oder DCMi nicht mit anderen immunvermittelten Krankheiten assoziiert ist.
Diagnostische Verfahren, die eine isolierte Myokardentzündung identifizieren, können dann als klinisch relevant eingestuft werden, wenn diese mit einer schlechteren Prognose
einhergehen .
Es wird daher davon ausgegangen, dass das Mechanoprofiling ein neues Verfahren zum Screenen von Patienten mit DCMi ist. Die Daten der Pilotstudie zeigen auch, dass die
konventionelle FACS-Analyse von peripheren Blutzellen alleine ungeeignet ist, Patienten mit DCMi von Patienten mit DCM ohne Myokardentzündung zu unterscheiden. Insofern scheint das Mechanoprofiling eine neue und vielversprechende Strategie zur Anwendung in der klinischen Routine zu sein. Jedoch wird ein umfassendes Immunoprofiling nötig sein, um die
Aktivierungszustände der Lymphozyten mit ihren mechanischen Eigenschaften zu verknüpfen.
Claims
1. Verfahren zur Unterstützung einer Entscheidung, ob eine entzündliche Kardiomyopathie oder nicht-entzündliche
Kardiomyopathie vorliegt, mit folgenden Schritten:
- Bestimmen einer mechanischen Eigenschaft von
Lymphozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind,
- Vergleichen der mechanischen Eigenschaft mit einer definierten, vorher festgelegten Referenz, und
- Entscheiden auf der Grundlage des Vergleichs, ob ein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mechanische Eigenschaft durch die Messung der Verformung der Lymphozyten aufgrund eines Flüssigkeitsstrom bestimmt wird, wobei die Messung bevorzugt optisch erfolgt, wobei die Messung stärker bevorzugt mittels einer „Real-Time
Deformability Cytometry" erfolgt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Entscheidung, dass kein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, bei einer mechanischen Eigenschaft erfolgt, die einer geringeren Verformbarkeit als ein
Grenzwert entspricht, und die Entscheidung, dass ein
Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, bei einer mechanischen Eigenschaft erfolgt, die einer stärkeren Verformbarkeit als der Grenzwert entspricht.
4. Vorrichtung, die für das Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche ausgestaltet ist.
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