DE102018221232A1

DE102018221232A1 - Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose und Vorrichtung dafür

Info

Publication number: DE102018221232A1
Application number: DE102018221232.5A
Authority: DE
Inventors: Stephan Felix; Rico Feldtmann; Andreas Kümmel; Bishwas Chamling; Doreen Biedenweg; Oliver Otto
Original assignee: Universitaet Greifswald
Current assignee: Universitaet Greifswald
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-07-02
Also published as: WO2020115021A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose, ob eine dilatative Kardiomyopathie oder eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, mit folgenden Schritten:- Bestimmen einer mechanischen Eigenschaft von Lymphozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind,- Vergleichen der mechanischen Eigenschaft mit einer vorher definierten festgelegten Referenz, und- Entscheiden auf der Grundlage des Vergleichs, ob ein Indikator für dilatative Kardiomyopathie oder entzündliche Kardiomyopathie vorliegt.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterstützung einer Diagnose, ob entzündliche Kardiomyopathie vorliegt. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung, die für das Durchführen eines solchen Verfahrens ausgestaltet ist.
Technisches Gebiet
Herzinsuffizienz ist eine der am weitesten verbreiteten Ursachen für die Sterblichkeit auf der gesamten Welt und ist somit eine große Belastung für das Gesundheitssystem. Dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist für 30-40 % aller Fälle von Herzversagen verantwortlich und ist einer der Hauptgründe für Herztransplantationen. Entzündliche Kardiomyopathie (DCMi) ist eine häufig auftretende Form von DCM. Eine longitudinale prospektive Untersuchung an einer größeren Patientenkohorte mit V. a. Myokarditis zeigte, dass der immunhistologische Nachweis einer myokardialen Entzündung in einer multivariaten Analyse mit einer schlechten Prognose assoziiert war, während eine eingeschränkte linksventrikuläre Pumpfunktion nur univariat mit einer schlechten Prognose assoziiert war. (Kindermann et al. Predictors of outcome in patients with suspected myocarditis. Circulation 2008;118:639-648.) Daher hat der Nachweis einer myokardialen Entzündung in der immunhistologischen Analyse von Myokardbiopsien eine erhebliche klinische und wissenschaftliche Bedeutung. Bei einer entzündlichen Kardiomyopathie spielen Störungen des zellulären Immunsystems zusammen mit einer Aktivierung von Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen eine wichtige Rolle.
Entsprechend eines Positionspapiers der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie (ESC) ist die dilatative Kardiomyopathie eine Krankheit, die durch das Vorhandensein einer linksventrikulären oder biventrikulären Dilatation und einer systolischen Dysfunktion (linksventrikuläre Pumpfunktion von weniger als 45 %) definiert ist (Pinto, Y.M., et al., Proposal for a revised definition of dilated cardiomyopathy, hypokinetic non-dilated cardiomyopathy, and its implications for clinical practice: a position statement of the ESC working group on myocardial and pericardial diseases. Eur Heart J, 2016. 37(23): S. 1850-8). Große klinische Studien haben gezeigt, dass eine DCM für viele Fälle einer Herzinsuffizienz (HI) verantwortlich und die Hauptursache für eine Herztransplantation ist (Haas, J., et al., Atlas of the clinical genetics of human dilated cardiomyopathy. Eur Heart J, 2015. 36(18): S. 1123-35a). Die Ursachen für DCM können sowohl genetisch als auch nicht genetisch sein. Entsprechend experimenteller und klinischer Daten sind virale Infektionen und myokardiale Entzündungsprozesse in der Pathogenese einer DCMi und auch einer DCM involviert (Heymans, S., et al., The Quest for New Approaches in Myocarditis and Inflammatory Cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol, 2016. 68(21): S. 2348-2364).
Eine chronische Myokarditis zusammen mit einer ventrikulären systolischen Dysfunktion wird als „entzündliche oder inflammatorische Kardiomyopathie“ (DCMi) bezeichnet und ist die am häufigsten auftretende Form von DCM, welche nicht durch genetische Ursachen verursacht wird (Caforio, A.L., et al., Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J, 2013. 34(33): S. 2636-48, 2648a-2648d). Störungen des zellulären und humoralen Immunsystems spielen bei der Entwicklung von DCM eine kausalpathogenetisch relevante Rolle (Felix, S.B., D. Beug, and M. Dorr, Immunoadsorption therapy in dilated cardiomyopathy. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2015. 13(2): S. 145-52). In vielen Fällen werden dabei nach einer myokardialen Virusinfektion Autoimmunvorgänge induziert, die sich in einer Aktivierung des zellulären und humoralen Immunsystems gegen kardiale Antigene manifestieren. Der Krankheitsverlauf einer chronischen Autoantigen getriebenen myokardialen Entzündung kann im Endstadium zu einem Herzversagen führen. In vielen Fällen kann dann den Patienten als einzige palliative Therapieoption nur eine Herztransplantation angeboten werden. Bei Patienten mit Verdacht auf eine DCMi wurden immunhistologische Verfahren zum Nachweis einer myokardialen Entzündung in Herzmuskelproben (Endomyokardbiopsien [EMBs]) eingeführt. Die Diagnose einer DCMi basiert dabei auf einen Nachweis einer erhöhten Anzahl von Lymphozyten und Makrophagen im Myokardgewebe als auch eine erhöhte Expression von Zelladhäsionsmolekülen (Kindermann et al., Caforio et al.).
Ein grundlegendes Problem bei der Diagnose von Patienten mit einer DCM ist die Frage, ob eine DCMi oder eine DCM nicht-entzündlicher Genese vorliegt. Die Krankheitsbilder sind sehr ähnlich, und es ist nur mit hohem Aufwand möglich, der auch die Entnahme von EMBs erfordert, diese beiden Krankheiten zu unterscheiden.
Derzeit ist der Goldstandard für die Diagnose einer myokardialen Entzündung eine Immunhistochemie von EMBs. Es werden unterschiedliche Aussagen der internationalen Gesellschaften für Herz-Kreislauf-Krankheiten bezüglich der Art und Weise der Diagnose veröffentlicht. Die Arbeitsgruppe für Herzmuskel- und perikardiale Erkrankungen der ESC empfiehlt bei Patienten mit Verdacht auf eine klinische Myokarditis EMBs für immunhistochemische und molekulare Analysen. Im Gegensatz dazu machen die geltenden Richtlinien zur Handhabung von Herzversagen der American Heart Association (AHA) und des American College of Cardiology (ACC) widersprüchliche Aussagen im Hinblick auf die Indikation von EMBs für Patienten mit Verdacht auf Myokarditis. Gemäß der Empfehlung des ACC/der AHA sind EMBs nur bei Patienten in lebensbedrohlichen Situationen wie zum Beispiel einer ungeklärten akuten Kardiomyopathie mit einer inotropen oder mechanischen Kreislaufunterstützung und/oder schweren Herzrhythmusstörungen indiziert (Yancy, C.W., et al., 2013 ACCF/AHA guideline for the management of heart failure: executive summary: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on practice guidelines, Circulation, 2013. 128(16): S. 1810-52, Bozkurt, B., et al., Current Diagnostic and Treatment Strategies for Specific Dilated Cardiomyopathies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation, 2016. 134(23): S. e579-e646). Diese divergenten Aussagen der ESC und der ACC/AHA sind Beispiele für die Unsicherheiten im Hinblick auf die Indikation von EMBs bei einer Myokarditis. Aus diesem Grund sind alternative Verfahren, die auf eine Myokardentzündung hinweisen, klinisch und wissenschaftlich von besonderem Interesse.
Eine Magnetresonanztomografie für eine Myokarditis als eine neue Bildgebungsmethode zur Beurteilung einer Myokardentzündung (Friedrich, M.G., et al., Cardiovascular magnetic resonance in myocarditis: A JACC White Paper. J Am Coll Cardiol, 2009. 53(17): S. 1475-87) kann bei Patienten mit Herzschrittmachern oder Defibrillatoren), die sehr oft bei diesem Krankheitsbild implantiert werden, nicht eingesetzt werden. Außerdem ist die Spezifität einer Magnetresonanztomografie für das Herz nicht hoch genug, um eine Myokardentzündung bei chronischer Myokarditis und DCMi zuverlässig zu diagnostizieren. Der diagnostische Goldstandard zur Diagnose einer Myokardentzündung ist daher unverändert eine immunhistologische Untersuchung einer EMB (Caforio et al.).
Im Hinblick auf die erheblichen Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf bei Diagnose einer Myokardentzündung bei Patienten mit Herzinsuffizienz und DCM und den widersprüchlichen Aussagen der weltweiten kardiologischen Gesellschaften im Hinblick auf die Indikation von EMBs ist eine Verstärkung der Forschungsbemühungen gerechtfertigt, um nach neuen Biomarkern zu suchen, die mit einer Myokardentzündung bei DCM einhergehen. Neben dem humoralen Immunsystem mit Produktion kardialer Autoantikörper ist das zelluläre Immunsystem mit Aktivierung von Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten gegen kardiale Epitope bei der Entstehung einer Myokarditis und konsekutiver DCMi involviert. Zusätzlich zu der Immunhistochemie von EMBs kann die Aktivierung des zellulären Immunsystems auch durch das Immunoprofiling von peripheren Leukozyten diagnostiziert werden. Interessanterweise sind im Vergleich zu gesunden Kontrollpatienten Th17-Lymphozyten signifikant im peripheren Blut von DCMi-Patienten erhöht vorhanden (Myers, J.M., et al., Cardiac myosin-Th17 responses promote heart failure in human myocarditis. JCI Insight, 2016. 1(9)). Bei der Myokarditis von Mäusen konnte gezeigt werden, dass die Progression der Myokarderkrankung von der Interaktion von CD40-CD40L abhängig ist (Bo, H., L. Zhenhu, and Z. Lijian, Blocking the CD40-CD40L interaction by CD40-Ig reduces disease progress in murine myocarditis induced by CVB3. Cardiovasc Pathol, 2010. 19(6): S. 371-6). Dieser Komplex ist einer der wichtigsten Faktoren bei der Aktivierung von B-Lymphozyten durch T-Lymphozyten (Parker, D.C., The functions of antigen recognition in T cell-dependent B cell activation. Semin Immunol, 1993. 5(6): S. 413-20).
Ferner konnte gezeigt werden, dass stärkere Antigensignale eine erhöhte Differenzierung von IL-17-produzierenden T-Lymphozyten durch eine Kommunikation zwischen CD40 und CD40L induzieren (Iezzi, G., et al., CD40-CD40L cross-talk integrates strong antigenic signals and microbial stimuli to induce development of IL-17-producing CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106(3): S. 876-81). Diese Ergebnisse des Immunoprofilings sind zunächst für die Grundlagenforschung von Interesse, aufgrund hoher Kosten und nicht vorhandener „High-Throughput“ Verfahren aktuell von geringer Relevanz für die klinische Praxis.
Ferner werden BNP (natriuretisches Peptid Typ B) und NT-proBNP (engl. „N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide“) als diagnostische Biomarker für die Herzinsuffizienz verwendet. Jedoch ist die Aussagekraft dieser Marker, was die Diagnose der Ätiologie Herzinsuffizienz angeht, gering (Ponikowski, P., et al., 2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure: The Task Force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure of the European Society of Cardiology (ESC) Developed with the special contribution of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC. Eur Heart J, 2016. 37(27): S. 2129-2200, und Felker, G.M., et al., Serial high sensitivity cardiac troponin T measurement in acute heart failure: insights from the RELAX-AHF study. Eur J Heart Fail, 2015. 17(12): S. 1262-70).
Darstellung der Erfindung
Aus den vorgenannten Gründen wird klar, dass es von erheblicher Relevanz ist, neue Verfahren bzw. Marker zu finden, welche die Diagnose von einer DCMi erleichtern.
Ersten Forschungsergebnissen der Erfinder zufolge sind die mechanischen Eigenschaften von Leukozyten ein Indikator zum Überwachen des Fortschritts von Krankheiten bei Entzündungen (Toepfner, N., et al., Detection of human disease conditions by single-cell morpho-rheological phenotyping of blood. Elife, 2018, 7, Otto, O., et al., Real-time deformability cytometry: on-the-fly cell mechanical phenotyping. Nat Methods, 2015. 12(3): S. 199-202).
Wenn man diese Eigenschaften als ein Maß der Verformung einer Zelle unter einer externen Last und die Veränderung dieses Maßes mit der Zeit definiert, stellen die mechanischen Eigenschaften einen Indikator bereit, welcher den Zustand der Zelle und deren Funktion darstellt.
In den letzten Jahren haben diese Eigenschaften erhöhte Relevanz bekommen, um die Wechselwirkungen des Stoffwechsels und der molekularen Struktur von Proteinen zu studieren (Munder, M.C., et al., A pH-driven transition of the cytoplasm from a fluid- to a solid-like state promotes entry into dormancy. Elife, 2016, 5), um Stammzellen zu identifizieren (Xavier, M., et al., Mechanical phenotyping of primary human skeletal stem cells in heterogeneous populations by real-time deformability cytometry. Integr Biol (Camb), 2016. 8(5): S. 616-23) oder um Krankheitszustände zu charakterisieren (Gossett, D.R., et al., Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA, 2012. 109(20): S. 7630-5).
Jedoch wurden - obwohl eine erste Studie zu den Veränderungen in der Zellsteifigkeit von Fibroblasten aus dem Herzen, die von EMBs unter Verwendung von Rasterkraftmikroskopie erhalten wurden, vielversprechend war (Glaubitz, M., et al., Stiffness of left ventricular cardiac fibroblasts is associated with ventricular dilation in patients with recent-onset nonischemic and nonvalvular cardiomyopathy. Circ J, 2014. 78(7): S. 1693-700) - die mechanischen Eigenschaften von Zellen als ein klinisch relevanter Parameter in der kardiovaskulären Forschung bis jetzt noch nicht in Betracht gezogen und es wurde insbesondere noch nicht erwogen, diese Eigenschaften zur Diagnose einer DCMi zu verwenden.
Die Erfinder sind der Auffassung, dass durch die Einführung der Real-Time Deformability Cytometry (RT-DC) die mechanischen Eigenschaften von Zellen nun mit Raten von bis zu 1000 Zellen pro Sekunde in Echtzeit analysiert werden können, welches eine Voraussetzung für eine Entwicklung eines neuen Biomarkers ist (Golfier, S., et al., High-throughput cell mechanical phenotyping for label-free titration assays of cytoskeletal modifications. Cytoskeleton (Hoboken), 2017. 74(8): S. 283-296) .
Die Erfinder haben daher die Hypothese aufgestellt, die mechanischen Eigenschaften von Lymphozyten als ein Marker für das Vorhandensein einer entzündlichen Kardiomyopathie zu nehmen. Wie aus den weiteren Ausführungen deutlich werden wird, ist ein solcher Marker zur Unterscheidung von anderen Krankheitsbildern geeignet und könnte dazu verwendet werden, einem Arzt ein zusätzliches neues Diagnoseverfahren an die Hand zu geben.
Die Erfindung wird durch Anspruch 1 definiert. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen definiert. Die Erfindung wird ferner durch den Vorrichtungsanspruch definiert.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Verfahren zur Unterstützung der Diagnose einer entzündlichen Kardiomyopathie. Darunter, dass eine Diagnose lediglich „unterstützt“ wird, wird verstanden, dass das beanspruchte Verfahren nicht als alleinige Diagnose dienen kann bzw. soll. Insbesondere können andere Diagnoseverfahren verwendet werden, um eine abschließende Diagnose zu treffen. Das vorliegende Verfahren dient lediglich dazu, einem Arzt bzw. einer Person, die eine Diagnose stellen möchte, ein (weiteres) Mittel an die Hand zu geben, um eine entzündliche Kardiomyopathie zu diagnostizieren und um dieses von anderen Krankheitsbildern (wie z.B. eine DCM ohne Myokardentzündung) zu unterscheiden. Dieses Verfahren könnte bei Patienten mit bereits in EMBs eindeutig diagnostizierter DCMi auch zur Verlaufskontrolle der myokardialen Inflammation eingesetzt werden.
Vorliegend wird eine mechanische Eigenschaft von Lymphozyten in einer Blutprobe von einem Patienten, bei dem festgestellt werden soll, ob er an einer DCMi leidet, untersucht. Die Lymphozyten können anhand der Größe von anderen Bestandteilen des Bluts unterschieden werden. Die mechanischen Eigenschaften dieser Lymphozyten können zum Beispiel dadurch bestimmt werden, dass durch diese direkt eine Kraft ausgeübt wird (zum Beispiel mittels eines Rasterkraftmikroskops). Es ist jedoch auch prinzipiell möglich und wird auch in dieser Patentanmeldung bevorzugt, solche Zellen durch ein Flusszytometer, wie zum Beispiel den AcCellerator® der Zellmechanik Dresden GmbH, zu verformen und die mechanische Eigenschaft der Lymphozyten so zu messen.
Die gemessene mechanische Eigenschaft wird mit einer vorher festgelegten Referenz verglichen. Zum Beispiel kann überprüft werden, ob die Lymphozyten fester oder weniger fest sind als ein Referenzwert. Auf der Grundlage dieses Vergleichs wird dann entschieden, ob ein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt.
Wie aus der weiteren Beschreibung deutlich werden wird, sind die mechanischen Eigenschaften ein guter Marker für eine Unterscheidung zwischen nicht-entzündlicher Kardiomyopathie und entzündlicher Kardiomyopathie.
Ein solcher Marker kann leicht und insbesondere weniger invasiv als mit EMBs gewonnen werden. Prinzipiell stellen Organbiopsien eine, wenn auch geringe, Gefährdung von Patienten dar. Im Falle einer EMB sind Patienten durch Herzrhythmusstörungen, Blutungen oder im schlimmsten Falle durch eine Perforation der Herzkammerwand gefährdet. Diese Komplikationen sind selten. Prinzipiell muss aber bei jedem dieser Eingriffe der diagnostische Nutzen gegen die Gefährdung abgewogen werden. Insofern ist ein solcher Biomarker bei den meisten Patienten gefahrlos zu bestimmen, da lediglich eine Blutabnahme erforderlich ist, jedoch keine weitergehenden invasiven Eingriffe. Dies könnte nicht nur für den Komfort des Patienten, sondern könnte für dessen Prognose von Bedeutung sein, wenn dieser Biomarker eindeutig mit einer DCMi assoziiert ist. Insbesondere ist ein solcher Eingriff auch dann möglich, wenn eine EMB den Patienten aufgrund eines schlechten Allgemeinzustands gefährden würde.
Vorliegend wird ein Arzt das erfindungsgemäße Verfahren dann einsetzen, wenn er bei einem Patienten die Diagnose einer DCMi oder einer DCM nicht-entzündlicher Genese stellen muss. D.h. der Arzt wird bei einem Patienten, dessen Symptome einen Verdacht auf DCM oder eine Diagnose von DCM nahelegen, eine Blutprobe mit dem beanspruchten Verfahren analysieren. Diese Analyse gibt dann dem Arzt einen Hinweis darauf, ob eine DCMi vorliegt oder ob eine nicht-entzündliche DCM vorliegt.
Von besonderer Bedeutung ist, dass die mechanische Eigenschaft durch die Messung der Lymphozyten aufgrund der Verformung durch einen Flüssigkeitsstrom bestimmt wird. Durch eine solche Verformung können kontrolliert Kräfte auf die Lymphozyten ausgeübt werden. Insbesondere können, wenn der Flüssigkeitsstrom laminar ist, die Kräfte genau und zuverlässig quantifiziert werden, was bei einem turbulenten Flüssigkeitsstrom nicht oder nur mit Einschränkung der Fall wäre. Auch kann man hierdurch das Verfahren sehr gut automatisieren, da man in dem Flüssigkeitsstrom viele Lymphozyten untersuchen kann, die durch den Flüssigkeitsstrom quasi wie auf einem „Fließband“ transportiert werden. Bevorzugt erfolgt die Messung der Verformung optisch, zum Beispiel mittels eines Mikroskops. Eine solche optische Messung ist leicht implementierbar, auch da es nach dem Stand der Technik verschiedene Programmierbibliotheken und Softwarepakete zur Auswertung von elektronisch erhaltenen Bildern gibt. Eine solche Messung kann in Echtzeit erfolgen, d.h. während die Bilder erzeugt werden. Daher wurde der Begriff Real-Time Deformability Cytometry geprägt, wie diese in der WO 2015/024690 A1 beschrieben ist.
Die Relevanz von RT-DC in den Lebenswissenschaften hat sich bereits in der Grundlagenforschung und auch in der angewandten zellbiologischen Forschung gezeigt. Unter Verwendung von Hefe als Modellsystem konnte gezeigt werden, dass eine Veränderung des pH-Wertes innerhalb der Zelle zu einem Phasenübergang innerhalb des Zytoplasmas von flüssig zu fest führt, welcher zu einem Ruhezustand der Zelle führt (siehe Munder et al.). Diese Beobachtung ist sehr wichtig, um zum Beispiel die komplizierte Wechselwirkung von Zellfunktion, Stoffwechsel und Mechanik zu verstehen. Zusätzlich wurde RT-DC auch angewandt, um eine mechanisch separate Subpopulation von mesenchymalen Stammzellen zu identifizieren, die nicht mit klassischen Verfahren darstellbar war(siehe Xavier et al.).
Die Immunfluoreszenzanalyse mittels FACS hingegen ist im Vergleich zum RT-DC eine sehr aufwendige und kostenintensive Methode. Trotz umfangreicher Färbung und Klassifizierung verschiedener Immunzellpopulation konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen DCM und DCMi Patienten gefunden werden. Die FACS-Analyse kann perspektivisch genutzt werden, um molekulare Mechanismen zu erklären, die dafür verantwortlich sind, dass Immunzellen verschiedene Verformbarkeiten in DCM und DCMi Patienten aufweisen. Für den klinischen Routinegebrauch ist die FACS-Analyse dem RT-DC neben den erwähnten Kosten und Aufwand auch in der Handhabung klar unterlegen.

Des Weiteren haben auch Standard-Parameter keinen signifikanten Unterschied zwischen DCM und DCMi zeigen können:

	DCM (N=9)	DCMi (N=9)	p-Wert

Alter [Jahre]	54.5 (35.8;61.9)	44.8 (24.4;59.3)	0.086
Anteil Frauen [N (%)]	4 (44.4)	1 (11.1)
LVEF [%]	33.7 (20;43)	27,9 (15;42)	0.142
LVEDD [mm]	58.2 (49;74)	66.9 (51;81)	0.051
LVEDV (Simpson)	196 (170;276)	263 (71;477)	0.222
LVEDVI - indiziert nach BSA Du Bois	97.5 (77;124)	118 (40;195)	0.330
LVESV (Simpson)	121 (87;170)	184 (42;378)	0.155
LVESVI indiziert nach BSA Du Bois	60 (39;77)	83 (24;150)	0.207
LVESD (Teichholtz)	51 (36;60)	62 (49;74)	0.045
BSA (DuBois)	2.0 (1.5;2.2)	2.2 (1.8;2.5)	0.151
NYHA	2 [2;4]	3 [2;3]	0.134

Routinelaborwerte
Leukozyten [Gptl/L]	6.0 [4.7;8.3]	8.2 [4.4;16]	0.106
Hämatokrit	0.44 [0.36;0.50]	0.44 [0.35;0.51]	0.908
Natrium [mmol/L]	138 [134;141]	139.1 [135;142]	0.329
NT-proBNP [pg/mL]	595.7 [53;2356]	2674.3 [374;5827]	0.008
C-reaktives Protein [mg/L]	7,2 [3,1;24,6]	18,4 [3,1;96,2]	0.287

Herzkreislauf-Risikofaktoren
Body Mass Index [kg/m²]	31.3 (18.6;42.4)	32.8 (25.7;40.3)	0.638
Systolischer Blutdruck [mmHg]	123.3 (90;145)	130.3 (104;200)	0.692
Diastolischer Blutdruck[mmHg]	78.5 (70;88)	90.8 (75;130)	0.204

Medikation
ß-Blocker [N]	9	7
ACEInhibitoren [N]	4	3
AT1-Antagonist [N]	4	5
Aldosteron-Antagonisten [N]	7	6
Statine [N]	4	4

Virus [N]	2	3

Ein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie liegt dann vor, wenn eine mechanische Eigenschaft der Zelle festgestellt wird, die einer stärkeren Verformbarkeit als ein Grenzwert entspricht. Anders ausgedrückt ist die Zelle dann „weicher“ als ein Schwellenwert. Die Entscheidung, dass kein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, erfolgt bei einer mechanischen Eigenschaft, die einer geringeren Verformbarkeit als der Grenzwert entspricht, d.h. die Zelle ist dann „härter“ als ein Schwellenwert. Somit kann mittels der Bestimmung der Verformbarkeit der Zelle festgestellt werden, ob ein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt.
Eine solche Verformbarkeit kann zum Beispiel durch die Verformung von Lymphozyten durch zunehmende Kräfte gemessen werden und mit Hilfe des Elastizitätsmoduls berechnet werden. Es reicht hierbei aus, lediglich zu überprüfen, ob eine Zelle fester bzw. weniger fest ist als ein bestimmter Grenzwert. Ein solches Verfahren hat sich als besonders aussagekräftig herausgestellt.
Erfindungsgemäß ist weiterhin eine Vorrichtung, die für das Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche ausgestaltet ist. Eine solche Vorrichtung kann insbesondere eine modifizierte Vorrichtung gemäß der WO 2015/024690 A1 sein. Eine solche Vorrichtung kann bevorzugt das Ergebnis des Verfahrens optisch, akustisch und/oder durch das Aufzeichnen des Ergebnisses auf einem Speichermedium anzeigen bzw. aufzeichnen.
Figurenliste

Die bis zeigen ein Verfahren zur Durchführung der Real-Time Deformability Cytometry. zeigt eine Veränderung der Verformung von Granulozyten.
zeigt Ergebnisse des mechanischen Profilings von Lymphozyten.

Detaillierte Beschreibung der Abbildungen
Wie in gezeigt besteht der experimentelle Aufbau aus einem invertierten Mikroskop, bei dem Blut durch eine Verengung eines mikrofluidischen Kanals gepumpt wird, der auf einem Mikroskoptisch angeordnet ist. Während das Blut durch eine Detektionskammer hindurchtritt, werden die Zellen innerhalb des Kanals durch eine hydrodynamische Interaktion verformt, welche durch eine Hochgeschwindigkeitsvideokamera aufgenommen wird.
Ein Beispiel einer solchen Verformung ist in gezeigt, welche eine Zeitreihe einer anfänglich runden Zelle zeigt, die eine Formänderung erfährt, die im Wesentlichen einer Gewehrkugel gleicht. Mit dem von Otto et al. beschriebenen Algorithmus werden die Zellgröße und die Verformung in Echtzeit analysiert. Hierbei ist die Verformung d definiert als: $d = 1 - \frac{2 \sqrt{π A}}{l}$
wobei A die Fläche der Zelle in dem Bild und 1 die Länge des Zellumfangs in dem Bild beschreibt.
Da RT-DC in der Lage ist, heterogene Proben zu vermessen, kann ein mechanischer Phänotyp von Vollblut erhalten werden, ohne dass man die Probe besonders vorbereiten muss (siehe ). In dieser Abbildung wird ein mechanischer Phänotyp von Vollblut gezeigt, der Erythrozyten (höchste Deformation), Blutplättchen und Leukozyten (unten) abbildet. Der Ausschnitt zeigt Leukozyten nach der Separation. Die Populationen von Lymphozyten (T-Zellen und B-Zellen) und Granulozyten/Monozyten wurden durch negatives magnetisches Zellensortieren separiert.
In ist die in vitro Stimulation von Granulozyten (gran) durch Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) gezeigt, welche zu einer klaren Veränderung in der Deformation führt.
Die Fähigkeit von RT-DC, heterogene Proben zu analysieren ermöglicht es, Zellen im Vollblut direkt zu vermessen, ohne diese vorher aufwendig aufzureinigen oder anderweitig verändern zu müssen. Spezielle Analyseverfahren sollen es ermöglichen, eine direkte funktionale Analyse zum Beispiel von Lymphozyten durchzuführen, und zwar unabhängig von einer Zellaktivierung mit potentiellen Veränderungen.
Wie in gezeigt, resultierte die Aktivierung von Granulozyten in vitro mit PMA in einer verstärkten Deformierung von Zellen (siehe Golfier et al. und Otto et al) .
Vorhergehende in vitro Studien von Patienten mit Atemwegserkrankungen zeigen einen höheren Deformationswert für Neutrophile und Monozyten im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe, während eine virale Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus auch zu einer vergrößerten Deformation der Lymphozytenpopulation im peripheren Blut führte (Toepfner et al.). Diese Daten deuten auf eine differentielle Antwort der Immunzellen auf eine bakterielle und virale Infektion hin, die von potentiellem diagnostischem Interesse ist.
Im Hinblick auf die Anwendung der Analyse der mechanischen Eigenschaften von Lymphozyten wurde eine erste Pilotstudie durchgeführt, bei der Daten von Patienten mit DCM oder DCMi und einer linksventrikulären Pumpfunktion von weniger als 45 % analysiert wurden.

Die Ergebnisse einer Pilotstudie werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben, bei der Patienten mit DCM/DCMi mit Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis (RA) und einer gesunden Kontrollgruppe verglichen wurden:

	DCM (N=9)	DCMi=9	RA (N=11)	Gesunde (N=9)
Mittleres Alter [Jahre]	50 (25, 62)		57 (19, 77)	44 (31, 62)
Anzahl Männer [N]	13		4	7
LVEF [%]	30 (15, 42)
Deformationsindex D_i +/i SEM	0,17 ± 0,009	0,21 ± 0,012	0,23 ± 0,012	0,14 ± 0, 007

Wie von der ESC empfohlen, wurden EMBs von allen Patienten aus klinischen Gründen entnommen, um die Ätiologie der Myokarderkrankung mittels Immunhistochemie zu diagnostizieren. Zusätzlich wurde ein Mechanoprofiling der Lymphozyten von peripheren Blutproben mittels RT-DC durchgeführt und die Ergebnisse wurden mit denjenigen von gesunden Individuen verglichen. Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis (RA) dienten als Patientenkohorte mit einer systemischen inflammatorischen Erkrankung. Zusätzlich wurde in allen Individuen ein Immunoprofiling mittels einer FACS-Analyse von peripheren Blutzellen durchgeführt.
Für das RT-DC der peripheren Leukozyten wurden 25 µl Citratblut bei verschiedenen Flussraten analysiert. Die verschiedenen Flussraten wurden benötigt, um Zellen verschiedenen hydrodynamischen Kräften auszusetzen, die zu verschiedenen Deformationen führen. Dieser Ansatz ermöglicht die mechanische Charakterisierung von Zellen unabhängig von deren anfänglicher Form. In der aktuellen Pilotstudie wurden selektiv nur Leukozyten im Vollblut analysiert.
zeigt als Beispiele das mechanische Profil von peripheren Leukozyten eines gesunden Teilnehmers (Kontrolle), eines DCM-Patienten, eines DCMi-Patienten und eines RA-Patienten nach einer kontinuierlichen Messung für jeweils 10 Minuten. Hier sind zwei Populationen sichtbar. Während Lymphozyten einen Peak bei einer mittleren Zellgröße von 40 µm² haben, liegt für Granulozyten/Monozyten ein Peak bei ungefähr 60 µm² vor. Da Lymphozyten eine entscheidende Rolle bei der DCMi spielen, haben sich die Erfinder auf die Analyse der Lymphozytenpopulation fokussiert, indem eine relative Veränderung in der mittleren Deformation als eine Funktion der Flussrate bestimmt wurde. Ein linearer Fit dieser Daten gibt einen Deformationsindex D_i, der die Steigung der Funktion beschreibt und der jeweils zwischen der Kontrollgruppe, der DCM-Gruppe, der DCMi-Gruppe und der RA-Gruppe verglichen wird. Die Ergebnisse sind in gezeigt.
Wie in dem linken Teil der gezeigt, weist die Kontrollgruppe einen mittleren D_i±Standardabweichung von 0,14 ± 0,007 auf, während die DCM- und die DCMi-Gruppen jeweils erhöhte Werte von 0,17 ± 0,009 und 0,21 ± 0,012 aufweisen. Die Vergleiche der Paare führen zu statistisch signifikanten Differenzen im D_i der DCM-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (p = 0,004), der DCMi-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (p = 0,001) und der DCMi-Gruppe im Vergleich zur DCM-Gruppe (p = 0,03). Interessant ist die Beobachtung eines erhöhten D_i bei Patienten mit DCMi, was im Einklang mit den vorherigen Resultaten einer erhöhten Deformation von Leukozyten in Personen mit Atemwegsinfektionen steht (Toepfner et al.).
Es wurden zusätzlich Lymphozyten von Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis analysiert, um das mechanische Zellprofil von DCM-Patienten mit demjenigen von Patienten mit einer systemischen entzündlichen Erkrankung zu vergleichen. Die Ergebnisse sind in dem rechten Teil der gezeigt, wo der D_i der RA-Gruppe denjenigen der DCM-Gruppe übersteigt (p = 0,002).
Um die Aussagekraft des Mechanoprofilings zur Diagnose, ob ein Patient an einer DCMi leidet, einzuschätzen, wurde die Sensitivität und Spezifität für alle D_i-Grenzwerte berechnet. Es wurde ein optimaler Grenzwert von D_i = 0,194 mit einer Sensitivität und einer Spezifität von jeweils 0,78 gefunden, während die Receiver Operating Characteristic eine Fläche unter der Kurve von 0,83 für beide Gruppen ergab. Diese Resultate zeigen, dass D_i als Marker prinzipiell ein hohes Potenzial für die korrekte Diagnose von DCMi-Patienten hat.
Anschließend wurde als ein erster Schritt zum Immunoprofiling die Abundanz von peripheren Lymphozyten-Subpopulationen von DCM-/DCMi-Patienten über FACS-Analyse quantifiziert (Esfandiarei, M. and B.M. McManus, Molecular biology and pathogenesis of viral myocarditis. Annu Rev Pathol, 2008. 3: S. 127-55). Alle diese Messungen wurden mittels eines Becton Dickinson LSR II unter Verwendung einer Gruppe von neun fluorochrom markierten Antikörpern durchgeführt, und die Datenanalyse erfolgte mit der Software FlowJo. Die Zellzahlen wurden auf 100.000 CD 45⁺ Leukozyten normalisiert(Mittelwert [Minimalwert, Maximalwert]). Es wurden signifikant erhöhte Werte von CD4⁺ T-Zellen in DCM-Patienten (Mittelwert = 9229 [1478, 17.724]; p = 0,007) und DCMi-Patienten (Mittelwert = 4823 [486, 8512], p = 0,009) im Vergleich zu gesunden Kontrollgruppen (Mittelwert = 1596 [42, 2684]) gefunden. Ähnlich wurden signifikant erhöhte Mengen an CD19⁺ B-Zellen und CD8⁺ T-Zellen sowohl in DCM (CD19⁺ Mittel = 1964 [163, 3663], p = 0,006), (CD8⁺ Mittelwert = 4729 [1352, 9377], p = 0,018) als auch DCMi-Patienten (CD19⁺ Mittelwert = 2665 [731, 5049], p = 0,003), (CD8⁺ Mittelwert = 4434 [2114, 10.599], p = 0,023) im Vergleich zu gesunden Individuen gefunden (CD19⁺ B-Zellen Mittelwert = 596 [73, 1360]), (CD8⁺ T-Zellen Mittelwert = 1627, [237, 3160]). Jedoch hat sich die Anzahl der B- und T-Zellen nicht zwischen DCM- und DCMi-Patienten unterschieden. Trotz aufwendiger Färbung und Zellzahlbestimmung mittels FACS ist es nicht möglich zwischen DCM und DCMi zu unterscheiden. Insofern ist das Mechanoprofiling mittels RT-DC dem Immunoprofiling mittels FACS überlegen.
Die vorliegenden Daten zeigen zum ersten Mal, dass das Mechanoprofiling von peripheren Lymphozyten zur Diagnose von DCMi beitragen kann. Interessanterweise zeigen auch Lymphozyten von Patienten mit RA eine erhöhte Zelldeformation auf, die mit dem Ergebnis vergleichbar ist, das von Patienten mit DCMi erhalten wurde. Daher kann basierend auf dem Mechanoprofiling DCMi nicht von einer RA unterschieden werden, welches ein Beispiel einer systemischen Entzündungserkrankung ist. Jedoch ist eine Unterscheidung von DCMi und RA nicht für die klinische Praxis von Relevanz, da in Fällen eines klinischen Verdachts auf eine kardiale Manifestation einer systemischen Immunkrankheit die internationalen Richtlinien eindeutig EMBs empfehlen. Anzumerken ist darüber hinaus, dass in den allermeisten Fällen (mehr als 95 %) eine Myokarditis oder DCMi nicht mit anderen immunvermittelten Krankheiten assoziiert ist. Diagnostische Verfahren, die eine isolierte Myokardentzündung identifizieren, können dann als klinisch relevant eingestuft werden, wenn diese mit einer schlechteren Prognose einhergehen.
Es wird daher davon ausgegangen, dass das Mechanoprofiling ein neues Verfahren zum Screenen von Patienten mit DCMi ist. Die Daten der Pilotstudie zeigen auch, dass die konventionelle FACS-Analyse von peripheren Blutzellen alleine ungeeignet ist, Patienten mit DCMi von Patienten mit DCM ohne Myokardentzündung zu unterscheiden. Insofern scheint das Mechanoprofiling eine neue und vielversprechende Strategie zur Anwendung in der klinischen Routine zu sein. Jedoch wird ein umfassendes Immunoprofiling nötig sein, um die Aktivierungszustände der Lymphozyten mit ihren mechanischen Eigenschaften zu verknüpfen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2015/024690 A1 [0025, 0031]

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Claims

Verfahren zur Unterstützung einer Entscheidung, ob eine entzündliche Kardiomyopathie oder nicht-entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, mit folgenden Schritten: - Bestimmen einer mechanischen Eigenschaft von Lymphozyten, die in einer Blutprobe enthalten sind, - Vergleichen der mechanischen Eigenschaft mit einer definierten, vorher festgelegten Referenz, und - Entscheiden auf der Grundlage des Vergleichs, ob ein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mechanische Eigenschaft durch die Messung der Verformung der Lymphozyten aufgrund eines Flüssigkeitsstrom bestimmt wird, wobei die Messung bevorzugt optisch erfolgt, wobei die Messung stärker bevorzugt mittels einer „Real-Time Deformability Cytometry“ erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Entscheidung, dass kein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, bei einer mechanischen Eigenschaft erfolgt, die einer geringeren Verformbarkeit als ein Grenzwert entspricht, und die Entscheidung, dass ein Indikator für eine entzündliche Kardiomyopathie vorliegt, bei einer mechanischen Eigenschaft erfolgt, die einer stärkeren Verformbarkeit als der Grenzwert entspricht.
Vorrichtung, die für das Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche ausgestaltet ist.