MXPA05001270A - Metodo para diagnostico de esclerosis multiple. - Google Patents

Abstract

Se expone un metodo para el diagnostico de esclerosis multiples y en forma mas particular se expone un metodo para diagnosticar de esclerosis multiples a traves de la medicion en una muestra biologica de los niveles de anticuerpos para glicanos. De preferencia, los anticuerpos son anti-maltosa IgN. En una modalidad especifica, los niveles de anticuerpo frente a un conjunto de diferentes glicanos, se miden por medio de "chips" de carbohidratos.

Description

MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona en general con un método para el diagnóstico de esclerosis múltiple y de manera más particular con un método para el diagnóstico de esclerosis múltiple a través de la medición de los niveles de anticuerpos de glicanos en una muestra biológica.

ANTECEDENTES DE LA. INVENCIÓN La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria autoinmune y crónica del sistema nervioso central. Es una causa común de incapacidad persistente en adultos jóvenes. En los pacientes que sufren de EM, el sistema inmune destruye la vaina de mielina de los axones del cerebro y la médula espinal y esto da lugar a una diversidad de patologías neurológicas . En la forma más común de EM la de remisión-recaída, a episodios agudos de deterioro de la función neurológica (exacerbaciones, ataques) les siguen períodos de recuperación parcial o completa (remisiones) en los que no hay progresión de la enfermedad (estable) . Se ha reportado que noventa por ciento de pacientes con EM se presentan al principio con un síndrome clínicamente aislado debido una lesión desmielinizante inflamatoria del nervio óptico, el tallo cerebral o la médula espinal . Aproximadamente treinta por ciento de estos pacientes con síndrome clínicamente aislado avanzan a una EM clínicamente definida en los 12 meses posteriores a la presentación. La progresión de la enfermedad puede variar de paciente a paciente de manera significativa. La progresión puede variar desde un curso benigno a un curso de remisión-recaída, progresivo crónico o fulminante y raro. Un método para el diagnóstico de EM que facilite la detección temprana de la EM clínicamente definida sería valioso tanto para el manejo de la enfermedad como para aconsejar al paciente. Por ejemplo, a los pacientes a los que se les diagnostica temprano la EM clínicamente definida, se les podrían ofrecer tratamientos para modificar la enfermedad que recientemente han mostrado beneficios en la EM temprana. Los métodos actuales para la evaluación y seguimiento de la EM tienen como base la evaluación y calificación de la función de los pacientes en los ataques y las incapacidades acumuladas durante los ataques. Una evaluación comúnmente utilizada para la EM es la Escala de Estado de Incapacidad Expandida (EDSS por sus siglas en inglés) . Sin embargo, la EDSS tiene como base una evaluación subjetiva de la función del paciente. Los métodos de diagnóstico también pueden incluir el seguimiento de lesiones cerebrales por imagen de resonancia magnética (MRI por sus siglas en inglés) o la prueba de bandas oligoclonales (OCB por sus siglas en inglés) en liquido cerbroespinal (CSF por sus siglas en inglés) . La MRI es un método fisico para evaluación de lesiones cerebrales y es costoso para pruebas de rutina. Por otra parte, la correlación entre los resultados de MRI y la actividad de la enfermedad es escasa. La punción cerebroespinal es un procedimiento invasivo ' y desagradable que no es adecuado para utilizarlo de manera rutinaria. Además, los dos métodos sólo evalúan el daño después de que se ha generado; ninguno de los métodos puede predecir la aparición de los ataques. Otra desventaja de las pruebas de OCB en CSF y de MRI como diagnóstico de la EM, es que un resultado negativo de OCB o MRI no excluye la existencia de EM. Existe la necesidad de un método que use marcadores que se evalúen objetivamente para diagnosticar la EM y predecir la aparición de los ataques en pacientes que la padecen.

SUMARIO DE IA INVENCIÓN En parte, la invención tiene como base el descubrimiento de que en los pacientes con EM tienen elevados niveles séricos de autoanticuerpos de IgG, IgA, IgM que se unen a estructuras glicano Glc (a) o Glc(a 1-4)Glc(a) o Glc (a 1-4) Glc (ß) en comparación con los niveles séricos de estos autoanticuerpos en individuos sanos . Por otra parte, los mismos autoanticuerpos específicos para estas estructuras glicano, se elevan durante el estado de exacerbación en comparación con los niveles observados en pacientes en estado de remisión y en individuos sanos. También se ha observado una correlación elevada entre los niveles séricos de anticuerpo IgM anti-Glc (a) en pacientes mujeres con EM (remisión-recaída) clínicamente diagnosticada y la calificación EDSS (Escala de Estado de Incapacidad Expandida) en mujeres. La elevada correlación indica que los niveles séricos de IgM anti-ct-glucosa pueden funcionar como un marcador clínico de punto final subrogado de la actividad de la enfermedad y una manera de rastrear la eficacia de un medicamento en ensayos clínicos. El monitoreo de los niveles de estos anticuerpos en . la sangre de pacientes con presunta EM, facilita el diagnóstico temprano rápido y económico de pacientes con EM y la prescripción temprana de medicamentos que modifican la enfermedad. El monitoreo de los niveles sanguíneos de estos anticuerpos en pacientes con EM definida también permitirá el monitoreo rápido y económico de los efectos de los medicamentos recetados, detección temprana de los ataques y un tratamiento profiláctico oportuno.

Una de las ventajas adicionales de la invención es que la presencia de EM en los pacientes se puede determinar en las primeras etapas, cuando los síntomas, pueden parecerse a los de muchas otras enfermedades análogas a la EM. El diagnóstico temprano permite a los médicos tratar la EM en las primeras etapas del curso de la enfermedad, por lo cual se reduce al mínimo o se evita el daño producido por la destrucción de la mielina y las incapacidades debidas a esta causa. Además, los métodos que aquí se exponen permiten a los médicos dar seguimiento regular a los pacientes con EM para evaluar la gravedad de la enfermedad, monitorear la terapia y cambiar el tratamiento una vez que aparecen los signos de próximos ataques. Por ejemplo, un aumento de los biomarcadores indicativo de un ataque de EM puede justificar la administración de metilprednisona al paciente, un agente antiinflamatorio general que comúnmente se administra durante los ataques . Los métodos expuestos en la presente también se pueden usar para seleccionar el mejor tratamiento con medicamentos para un paciente específico. Por ejemplo, un paciente puede comenzar el curso de tratamiento con un determinado medicamento y el cambio en los niveles de marcador será indicativo de su eficacia. El cambio regresivo de los niveles del marcador a un estado de enfermedad indicarán que el medicamento está perdiendo eficacia y podrá reemplazarse por un segundo medicamento después de un corto periodo de tiempo. De otro modo, un médico tendría que esperar los próximos ataques para determinar si el medicamento es eficaz para el paciente específico . Los biomarcadores aquí expuestos también pueden actuar como un punto final subrogado para evaluar a bajo costo la respuesta de un paciente al medicamento de prueba. Un punto final subrogado que tenga como base pruebas serológicas, facilita la evaluación eficiente de nuevos medicamentos potenciales para EM. En un aspecto, la invención describe un método de diagnóstico para esclerosis múltiple en un sujeto. El método incluye proporcionar una muestra de prueba tomada a un sujeto y detectar en esa muestra al menos un biomarcador que es un anticuerpo que se une específicamente a una estructura glicano. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, anticuerpo anti-Glc (a) , anticuerpo anti-Glc(a l-4)Glc(a), anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc( ), anticuerpo anti-Glc (ß), anticuerpo anti-Gal (ß); anticuerpo anti-Glc (ß l-4)Glc(P 1-4)Glc(P), anticuerpo anti-GlcNAc (ß 1-4 ) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-L-Araf (a) , anticuerpo anti-L-Rha ( ) , anticuerpo anti-Gal (ß1-3 ) [GlcNAc (ß1-6) ] GalNAc (a) , anticuerpo anti-Gal (ß1-4 ) GlcNAc (a) , anticuerpo anti-Gal (ß?-3)GalNAc(ct), anti-Gal (ß1-3) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-GlcA(P), anticuerpo anti-GlcA(P) o anticuerpo anti-Xyl (a) . Los niveles de anticuerpos en la muestra de prueba se comparan con una muestra de control que proviene de uno o más individuos que muestren sintomas de esclerosis múltiple y de los que tienen sintomas de esclerosis múltiple con estatus de esclerosis múltiple conocido o de uno o más individuos, que no muestren sintomas de esclerosis múltiple. El estatus de la EM puede incluir, por ejemplo, exacerbaciones, ataques, remisiones y etapas estables de la enfermedad. En varias modalidades, se detectan por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 de estos anticuerpos. En algunas modalidades, el anticuerpo detectado en la muestra de prueba es un anticuerpo anti-Glc(a) o un anticuerpo anti-Glc(a l-4)Glc(a) o los dos. En algunas modalidades, la muestra de control básicamente consiste en una población de uno o más individuos que no muestran sintomas de esclerosis múltiple. En otras modalidades, la muestra de control consiste básicamente en una población que no muestra síntomas de esclerosis múltiple. La presencia de EM en la muestra de control se puede determinar mediante técnicas conocidas en el campo técnico, por ejemplo, una evaluación por la Escala de Estado de Incapacidad Expandida (EDSS) o una evaluación por imagen de resonancia magnética (MRI) o las dos. La muestra de prueba puede ser, por ejemplo, un fluido biológico. Entre los ejemplo de fluidos biológicos se incluyen sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, orina o saliva. El sujeto puede ser una mujer o un hombre. El anticuerpo detectado puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgM, IgA o IgG. En algunas modalidades, el tipo de esclerosis múltiple detectada es esclerosis múltiple temprana. La invención también proporciona un método para diagnosticar en un. sujeto una exacerbación de esclerosis múltiple. El método incluye disponer de una muestra de prueba proveniente de un sujeto y detectar en la muestra de prueba un anticuerpo tipo IgM anti-Glc(ct) y/o un anticuerpo tipo IgM anti-Glc(a l-4)Glc(a) . Los niveles del anticuerpo en la muestra de prueba se comparan con una muestra de control proveniente de uno o más individuos cuyo estatus de esclerosis múltiple es conocido. En algunas modalidades, la muestra de control consiste básicamente en una población de uno o más individuos que no muestran síntomas' de excacerbación de esclerosis múltiple y ' cuyo estatus de esclerosis múltiple está en remisión. Se diagnostica en el paciente una exacerbación de esclerosis múltiple si en la muestra de prueba hay más anticuerpo anti-Glc(a) o anticuerpo anti-Glc( 1-4) que en la muestra de control. En otras modalidades, la muestra de control consiste básicamente en una población de uno o más' individuos que muestran síntomas de una exacerbación de esclerosis múltiple; en el sujeto se diagnostica una exacerbación de esclerosis múltiple si los anticuerpos tipo IgM anti-Glc(a) y/o anti-Glc(cc 1-4) están presentes en cantidades iguales en la muestra de prueba y en la muestra de control. La muestra de prueba puede ser, por ejemplo, un fluido biológico. Entre los ejemplos de fluidos biológicos se incluyen sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, orina o saliva. El sujeto puede ser una mujer o un hombre. El anticuerpo detectado puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgM, IgA o IgG. En algunas modalidades, el diagnóstico es un diagnóstico temprano de exacerbación de esclerosis múltiple . En algunas modalidades, el sujeto se ha tratado con un agente terapéutico para EM, por ejemplo, beta interferón o acetato de glitamerer administrado por vía subcutánea . También se incluye en la invención un método para evaluar en un sujeto la gravedad de la EM. El método incluye proporcionar una muestra de prueba proveniente de un sujeto y determinar si la muestra de prueba contiene un anticuerpo tipo IgM anti-Glc (a) y/o un anticuerpo tipo Ig anti-Glc(oc l-4)Glc(a). La cantidad de anticuerpo en la muestra de prueba se compara con la cantidad de anticuerpo en la muestra de control que se deriva de .uno o más individuos cuya gravedad de esclerosis múltiple se conoce. En algunas modalidades, la muestra de control básicamente consiste en una población de uno o más individuos cuya gravedad de la esclerosis múltiple está definida por la Escala de Estado de Incapacidad Expandida (EDSS) , cambios en una calificación de la Escala de Estado de Incapacidad Expandida (EDSS) o una evaluación por imagen de resonancia magnética (MRI) . La muestra de prueba puede ser, por ejemplo, un fluido biológico. Entre los ejemplos de fluidos biológicos se incluyen sangre, suero, plasma, fluido' cerebroespinal, orina o saliva. Si se. desea, el método también puede incluir el seleccionar un agente terapéutico para tratar la esclerosis múltiple y un régimen de dosificación basado en los niveles relativos del anticuerpo o anticuerpos en la muestra de prueba y en la de control. En algunas modalidades, los niveles mayores de anticuerpos en la muestra de prueba con relación de la muestra de control señalan la selección de un agente terapéutico y un régimen de dosificación que consiste en la administración subcutánea de beta interferón (BETAFERON®, AVONEX®, REBIF®) o la administración subcutánea de acetato de glitamerer (COPAXONE®) . El sujeto puede ser una mujer o un hombre. La invención también proporciona un kit para el diagnóstico de sintonías asociados con la esclerosis múltiple. El kit incluye un primer reactivo que de manera especifica detecta un anticuerpo anti-Glc (a) , un segundo reactivo que de manera especifica detecta un anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(a) e instrucciones de uso. Como opción, el kit incluye un reactivo que de manera especifica detecta un anticuerpo tipo IgM. También dentro de la invención se encuentran sustratos que incluyen reactivos que de manera especifica detectan los anticuerpos que aquí se exponen, por ejemplo, anticuerpo anti-Glc (a), anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(a), anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(P) , anticuerpo anti-Glc (ß) , anticuerpo anti-Gal (ß) ; anticuerpo anti-Glc (ß l-4)Glc(P 1-4)Glc(P), anticuerpo anti-GlcNAc (ß1-4 ) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-L-Araf (a) , anticuerpo anti-L-Rha (a) , anticuerpo anti-Gal (ß1-3) [GlcNAc (ß1-6) ] GalNAc ( ) , anticuerpo anti-Gal (ß?-4) GlcNAc (a), anticuerpo anti-Gal (ß1-3 ) GalNAc (a) , anti-Gal (ß1-3) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-GlcA (ß) , anticuerpo anti-GlcA (ß) o anticuerpo anti-Xyl( ) . El sustrato puede ser plano, por ejemplo. En otro aspecto, la invención proporciona un método para seleccionar un agente terapéutico destinado al tratamiento de esclerosis múltiple. El método incluye disponer de una muestra de prueba proveniente de un sujeto al que se le ha diagnosticado esclerosis múltiple o se encuentra en riesgo de desarrollarla, y determinar si la muestra de prueba contiene un anticuerpo anti-Glc (a) . Los niveles de anticuerpo en la muestra de prueba se comparan con los niveles de anticuerpo en la muestra de control que básicamente consiste en uno o más individuos cuya gravedad de la esclerosis múltiple se conoce. El agente terapéutico y el régimen de dosificación se seleccionan con base en los niveles relativos del anticuerpo en la muestra del sujeto y en la muestra de control . En algunas modalidades, el método también incluye el determinar si la muestra de prueba contiene' un anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(a) y comparar sus niveles con los niveles en una muestra de control que básicamente consiste en uno o más individuos cuya gravedad de esclerosis múltiple se conoce. En algunas modalidades, la muestra de control básicamente consiste en uno o más individuos cuyo estatus es la ausencia de esclerosis múltiple o esclerosis múltiple estable . A menos que se defina de cualquier otra forma, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado que conoce una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque para llevar a la práctica o ensayar la presente invención, se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, más adelante se. describen métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias aquí mencionadas, se incorporan en su totalidad como referencia. En el caso de conflicto, la presente especificación incluye definiciones que servirán de control. Por otra parte, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos . Otras particularidades y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un árbol de decisión para determinar si un paciente sospechoso de padecer EM realmente la tiene. La Figura 2 muestra el árbol de decisión para seleccionar un medicamento y una dosis para un paciente con EM, con base en los niveles de anticuerpos anti-Glc (a 1-4) Glc (a) o Glc (a) . La Figura 3 muestra el árbol de decisión para el pronóstico y el diagnóstico temprano de ataques en pacientes con EM. La Figura 4 es un cuadro que muestra la fluorescencia relativa derivada de la unión de diferentes anticuerpos antiglicanos en pacientes con EM y también en individuos normales. Las estructuras de glicanos se presentan en la linea superior del cuadro en sintaxis LINEARCODE®. La Figura 5 muestra la señal promedio y mediana para anticuerpos antiglicanos frente a varios glicanos de suero extraídos de pacientes con EM comparados con suero de control normal. Las e structuras de glicanos se presentan en sintaxis LINEARCODE®. La Figura 6 es una gráfica que muestra las diferencias entre señales promedio de individuos con EM e individuos sanos, las barras representan la desviación estándar. Las estructuras de glicanos se presentan en sintaxis LINEARCODE®. La Figura 7? es una gráfica que muestra la señal promedio derivada de la unión de anti-Glc (a), (Glicano #11) y Glc (a 1-4) Glc (a), (Glicano #12)IgM en poblaciones con EM y poblaciones sanas. La Figura 7B es una gráfica que muestra la señal promedio derivada de la unión de anti-Glc (a) Glicano #11 y Glc(a 1- ) Glc (a) Glicano #12lgM en pacientes con ataque, pacientes con EM estable y poblaciones sanas. La Figura 8 es una gráfica que muestra la correlación entre la fluorescencia relativa derivada de la adhesión de anticuerpos IgM anti glucosa alfa en muestras de pacientes con EM y Glc (a) positivo (cuadro izquierdo), pacientes con EM negativos (cuadro derecho) y sus niveles de EDSS. La Figura 9 s una gráfica u que muestra la estabilidad temporal de la señal derivada de la unión de anticuerpos IgM, IgG e IgA anti glicano durante 13 semanas en 7 individuos sanos . Las Figuras 10A-10E rrnaestran la disposición de los glicanos; estructura química, especificidad de la interacción con lectina y la reproducibilidad . La Figura 10A muestra un p-aminofenil P-sacárido unido por covalencia en su extremo reductor a una superficie sólida a través de un ligante . La Figura 10B muestra la reproducibilidad lote por lote de la unión de WGA biotinilado a la matriz glicanos. Tres lotes de matrices separadas se evaluaron en forma simultánea con WGA biotinilado.

La Figura 10C muestra un ensayo de competencia de la unión de ConA con Ma (a). Concentraciones crecientes de mañosa soluble o Gal(P l-4)Glc se incubaron durante 1 hora-con ConA (1.5µg/ml) biotinilado y se hizo la detección con estreptavidina conjugada con europio. La Figura 10D muestra la especificidad de la unión de lectina a diferentes anómeros. Unión de ConA a control negativo de glicerol (19) , Man(cc) (26) y Man(P) (27). La unión de GSI a -Gal(aHl), Gal(p) (2), GalNAc(a) (7) y GalNAc( ) (8) . · La Figura 10E muestra la reproducibilidad placa con placa, de la matriz de glicanos . Cinco placas idénticas que presentan GlcNac(P) se sondearon con WGA biotinilado. La Figura 11 muestra el perfil de unión a glicano de una población humana sana. Unión de anticuerpo anticarbohidrato a glicanos clasificados (véase el Cuadro 5 de las estructuras de glicanos) en muestras de suero de 72 individuos , determinada con proteina A biotinilada. Cada punto representa el promedio de dos experimentos, cada uno realizado por cuadruplicado. El cuadro incluye señales de 50% de la población. En el cuadro las lineas gruesas y delgadas representan los valores de la media y la mediana, respectivamente. El limite del cuadro más cercano a cero indica el 25°porcentil y el limite del cuadro más alejado de cero indica el 75 °porcentil . Las lineas arriba y abajo del cuadro indican el 90° y el 10° porcentiles. El nivel de señal no especifica medida se definió en forma empírica; Los glicanos frente a los cuales se encontraron niveles relativamente bajos y muy variables entre los experimentos, se designaron como la definición del nivel de referencia (no se muestra) . Se calculó el valor promedio de la señal para estos glicanos y se restó de la señal obtenida para cada muestra de suero y glicano particular. La referencia promedio fue 3X105 RFU. TBST son las siglas en inglés de Tris-solución salina amortiguada con Tween 20 (véase el protocolo experimental) . La Figura 12 muestra las señales de los sueros individuales frente a una matriz de glicanos. La unión del anticuerpo anti-glicano determinada en unidades de fluorescencia relativa (RFU) se transformó mediante un método análogo al de compensación de histogramas que emplea mapeo no lineal y monotónico. De esta manera los valores RFU se reasignaron en un intervalo entre 0 (azul) y 255 (rojo) . Los datos se agruparon utilizando un- algoritmo de recocido simulado (simulated annealing algorithm) . Las Figuras 13A-13C muestran el perfil de afinidad de unión de anticuerpos purificados (A) anti-L-Rha (a) (B) nti-GlcNAc (a) y anti-GlcNAc (ß 1-4 ) GlcNAc (ß) y (C) anti-Glc( l-4)Glc(p l-4)Glc(p) y anti-GlcNAc (ß 1-4) GlcNAc (ß) frente a una matriz de 33 glicanos. Las estructuras de los glicanos se describen en el Cuadro 5. La cantidad de anticuerpo unido se determinó mediante anticuerpo de cabra anti-IgG humana biotinilado. Las Figuras 14A y 14B muestran la especificidad del anticuerpo anti-Glc(p ' l-4)Glc(P l-4)Glc(p). (A) Inhibición competitiva de la unión del anticuerpo anti-Glc(p l-4)Glc(P l-4)Glc(p). Inhibición de la unión de afinidad del anticuerpo anti-Glc(P l-4)Glc(P l-4)Glc(p) purificado frente a p-aminofenil-p-Glc (P l-4)Glc(P 1-4)Glc(p) inmovilizado en la superficie del pozo, en función de la concentración de Glc(p l-4)Glc(p 1-4) Glc o Gal (ß 1-4)Glc. La cantidad de anticuerpo unido se determinó mediante anticuerpo de cabra anti-IgG humana biotinilado. (B) Unión de anticuerpos anti-Glc(P 1-4) Glc (p 1-4) Glc (P) (A) y anti L-Rha (a) (B) a sus sacáridos similares después de incubación con celulosa amorfa o cristalina. La cantidad de anticuerpo unido se determinó mediante anticuerpo de cabra anti-IgG humana biotinilado. Las Figuras 15A-15C son representaciones gráficas de las uniones de isotipos IgG, IgA e IgM a los glicanos mencionados en individuos sanos . La Figura 16A es una representación matricial de los glicanos utilizados para examinar los sueros de pacientes ateroescleróticos que padecen de angina estable o inestable. Los glicanos frente a los cuales se determinaron niveles de anticuerpos significativamente diferentes en los distintos grupos de pacientes, se marcaron con cuadrados llenos. Los glicanos se enlistan en el Cuadro 4. La Figura 16B es una representación gráfica que muestra los niveles de anticuerpos frente a los glicanos #2 y #29 en los . tres grupos de pacientes; inestables, estables y no ateroescleróticos . El cuadro incluye señales de 50% de la población. En el cuadro las lineas gruesas y delgadas representan los valores de la media y la mediana, respectivamente. El limite del cuadro más cercano a cero indica el 25°porcentil y el limite del cuadro más alejado de cero indica el 75 "porcentil . Las lineas arriba y abajo del cuadro indican el 90° y el 10° porcentiles . La Figura 17 es un histograma que muestra el número de muestras positivas para anticuerpos anti-IgA frente a glicano #2 o glicano #29, en los tres grupos de pacientes . La Figura 18A es un histograma que muestra la distribución de los niveles de anticuerpos frente a los glicanos #2 y #15 en los tres grupos de pacientes. El cuadro incluye señales de 50% de la población. En el cuadro las lineas gruesas y delgadas representan los valores de la media y la mediana, respectivamente. El limite del cuadro más cercano a cero indica el 25 "porcentil y el limite del cuadro más alejado de cero indica el 75°porcentil . Las lineas arriba y abajo del cuadro indican el 90° y el 10° porcentiles . La Figura 18B es un histograma que muestra el número de muestras positivas para los anticuerpos IgA frente al glicano #2 o al glicano #15, en los tres grupos de pacientes . La Figura 19 es una representación gráfica de especificidad y sensibilidad con base en los niveles de anticuerpos anti-IgA frente a glicano #2, glicano #15, glicano #17 y glicano #49. A - ateroesclerosis; S Estable; US - Inestable; NA - No ateroesclerosis. La Figura 20 es un histograma que muestra el perfil de unión a varios glicanos de células CD4+ provenientes de un solo individuo. Las estructuras de los glicanos se representan en sintaxis LINEARCODE®. La Figura 21A es una gráfica que muestra la mediana de la fluorescencia relativa para células CD4+ de cada una de las siete estructuras de los glicanos individuales representados en sintaxis LINEARCODE®. La Figura 21B muestra las señales de sueros individuales frente a una matriz de glicanos. La unión del anticuerpo anti-glicano determinada en unidades de fluorescencia relativa (RFU) se transformó mediante un método análogo al de compensación de histogramas que emplea mapeo no lineal y monotónico. De esta manera los valores RFÜ se reasignaron en un intervalo entre 0 (azul) y 255 (rojo) . Los datos se agruparon utilizando un algoritmo de recocido simulado (simulated annealing algorithm) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos que aquí se proporcionan permiten el diagnóstico temprano de la esclerosis múltiple inicial y recurrente utilizando niveles de biomarcadores objetivamente evaluados. El actual árbol de decisión para diagnosticar EM en un paciente, se describe en la Figura 1. Un paciente con deterioro agudo de la función neurológica en principio tiene que diagnosticarse como un paciente con EM definida, antes de considerarlo elegible para el tratamiento con medicamentos para modificar la enfermedad. El médico tendrá que determinar si el paciente tiene síntomas análogos a los de EM (por ejemplo, accidente cerebrovascular precoz, lupus, deficiencia de vitamina B-12, síndrome de anti-fosfolípido, migraña severa) o si en realidad padece EM. El paciente tendrá que experimentar un segundo agravamiento agudo de la función neurológica (ataque) antes de que se diagnostique como un paciente con EM y pueda comenzar un tratamiento crónico con un agente terapéutico para EM como el beta interferon o el acetato de glitamerer . En la actualidad, los médicos están utilizando la RI para identificar la existencia de lesiones cerebrales y/o la prueba de bandas oligoclonales (OCB) en fluido cerebroespinal (CSF) . Si la MRI da un claro resultado con respecto a la existencia de lesiones cerebrales o la presencia de OCB en el CSF, el médico podrá iniciar de inmediato el tratamiento a fin de prevenir lesiones cerebrales silenciosas. En la actualidad el diagnóstico de EM total se hace sólo después del segundo ataque. En el caso de que la MRI no proporcione un resultado claro o no haya OCB en el CSF del paciente, no se diagnostica la EM y el tratamiento se pospone hasta después del segundo ataque. El método que aquí se expone se puede realizar extrayendo sangre de un paciente que presente agravamiento agudo de la función neurológica y del cual se sospeche que tenga EM. El método puede identificar la existencia de EM al medir el nivel de IgM anti-Glc (a) y anti-Glc(a 1-4)Glc(a) . Si el nivel de al menos uno de estos anticuerpos es significativamente mayor que el nivel promedio de estos anticuerpos en suero de individuos sanos, el paciente se diagnostica como un paciente con EM sin necesidad de esperar a un segundo ataque. Por otra parte, el diagnóstico rápido permite que el tratamiento comience de inmediato . Una primera línea de tratamiento para la EM es el ß-interferón (por ejemplo, INFp-la y INFp-lb) . La evaluación actual de la eficacia y dosis requerida del medicamento tiene como base el monitoreo continuo de varias calificaciones clínicas. En la actualidad, la calificación EDSS y sus cambio a través del tiempo (por ejemplo, comparando la diferencia en las EDSS cada 3-6 meses) es el principal parámetro clínico para el manejo de la enfermedad, ün importante componente de la evaluación es el nivel de fatiga y la depresión experimentadas por el paciente. La fatiga y/o la depresión pueden ser un síntoma de EM, de una enfermedad autoinmune o un efecto secundario derivado del uso de ß-interferón . Identificar la causa de la fatiga es importante para el manejo de la enfermedad. Por ejemplo, si la fatiga es el resultado de un efecto secundario del interferón, el médico considerará la disminución de la dosis o incluso el cambio a otro medicamento. Sin embargo, si la fatiga se debe a los síntomas de la EM, el médico tendrá que considerar el aumento de la dosis del medicamento (véase la Figura 2) . El tamizaje de la sangre del paciente y la determinación del nivel de los biomarcadores expuestos en la presente, por ejemplo, los anticuerpos IgM anti-Glc (a) y anti-Glc(a l-4)Glc (a), permite un monitoreo preciso de la terapia. La disminución significativa de los niveles de anticuerpos indica que el paciente responde bien al medicamento.

Detección temprana de los ataques En la actualidad no hay forma de predecir la aparición de los ataques en pacientes con E . La MRI y la evaluación clínica de los pacientes puede revelar sólo el daño ya ocurrido en los pacientes. La medición periódica del nivel de unos cuantos anticuerpos anti-glicanos (por ejemplo, anti-Glc (a) IgM o anti-Glc (a 1-4 ) Glc (a) IgM) en la sangre del paciente conforme al método descrito en la presente, permite a los médicos identificar próximos ' ataques, con base en un aumento de los niveles de estos anticuerpos. Los niveles de estos anticuerpos son significativamente mayores en la sangre de los pacientes en situaciones de ataque de EM en comparación con los pacientes que se encuentran en un estado estable (véase la Figura 7) . Al detectar un aumento de estos anticuerpos, el médico puede comenzar un tratamiento agresivo con esferoides para reducir la inflamación y prevenir el daño a la mielina (véase la Figura 3) . También se proporcionan aquí métodos para identificar y evaluar a los individuos con ateroesclerosis que están en riesgo de angina estable e inestable, mediante el uso de biomarcadores de anticuerpos específicos para glicanos y también el uso de glicanos inmovilizados para detectar células de interés.

En esta solicitud se describen varias estructuras de glicanos. Los glicanos se presentan ya sea en la forma condensada de nomenclatura y representación de carbohidratos según la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) o en sintaxis LINEARCODE®, para bases sobre sintaxis "linearcode" véase (Banin E., Neuberger Y., Altshuler Y., Halevi A., Inbar 0., Dotan N. y Dukler A. (2002) A Noval Linear Code Nomenclature for complex Carbohydrates . Trends in Glycoscience and Glycotechnology Volumen. 14 No. 77 pp. 127-137) . La traducción del LINEARCODE a la representación de la IUPAC se presenta en el Cuadro 1. A menos que se mencione de otra forma, todas las estructuras de glicanos que se describen en esta exposición, están conectadas en la anomericidad indicada o ß a través de un ligante a la fase sólida tal como se describe en la Figura 10A. La invención se ilustrará con los siguientes ejemplos no restrictivos.

Ejemplo 1. Comparación entre anticuerpos antiglicano en el suero de pacientes con esclerosis múltiple (E ) y en población normal Se obtuvo un perfil de anticuerpo anti-glicano (Igs) utilizando matrices de GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, No. Cat. 9100) . Las matrices se construyeron mediante los procedimientos descritos en el documento WO00/49412. Se compararon los perfiles de anticuerpos anti-glicanos de 40 pacientes con esclerosis múltiple y 40 donadores de sangre normal de sexo y edades correspondientes . Todas las muestras de suero se analizaron utilizando placas GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, No. Cat. 9100), que es una matriz de mono y oligosacárido unido por enlace covalente a 384 pozos de volumen reducido de una placa de microtitulación. Los mono y oligosacáridos que se exponen en la matriz se enlistan en la Figura 4. En el Cuadro 1 se encuentra una traducción a la nomenclatura de la IUPAC de la sintaxis LinearCode® utilizada para describir la estructura de los glicanos . El suero proveniente de voluntarios sanos y de pacientes voluntarios con EM que tenían consentimiento informado y firmado, se recolectó en tubos con gel y recubrimiento de silicona, evacuados (Estar Technolgies Núm. de catálogo 616603GLV) . El suero se separó de las células sanguíneas y se mantuvo congelado a -25 °C hasta que se utilizó. Se analizó en dos experimentos por separado, cada uno se repitió dos veces en días distintos. El suero proveniente de voluntarios se diluyó (1:20) en TBST suministrado en una placa de GlycoChip® utilizando un robot Tecan Génesis Workstation 200 (10 µ?/????) y se incubó 30 min a 25 °C. Hubo 4 repeticiones para cada glicano y cada muestra de suero en la placa. Las placas se lavaron con 250 µ?/???? de un amortiguador con alto contenido de sal (KNa 0.15 pH 7.2, NaCl 2M, MgS04 0.085M, Tween 20 0.05%) en un lavador de placas automático (Tecan, PowerWasherMR) . En forma manual se suministraron diez µ?/???? de proteína ? biotinilada (ICN 62-265) , ?µ?/p?? en TBST, las placas se incubaron durante 30 min a 25 °C. La placa se lavó otra vez con amortiguador salino. En forma manual se ¦ adicionó estreptavidina conjugada con europio, Wallac, AD0062 (?µ?/ml, ??µ?/????) y posteriormente se incubó durante 30 min a 25 °C en la obscuridad. Se repitió el lavado de las placas con el amortiguador de alto contenido de sal. Se adicionó amortiguador de refuerzo DelfiaMR, (Wallac, 730232, 10 µ?/????) a los pozos y las placas se incubaron al menos durante 30 min en la obscuridad. La fluorescencia de los pozos se leyó con un lector de placas Victor 1420 (Wallac) utilizando fluorescencia de tiempo de resolución en condiciones de emisión a 612nm y extinción a 340nm. Los perfiles de todos los pacientes analizados se muestran en la Figura 4. Las 40 líneas superiores (E ) describen el nivel de anti-carbohidratos de las muestras EM y las 40 líneas inferiores (NC) describen el nivel de anti-carbohidratos de las muestras provenientes de la población de control normal. Los valores presentados son valores absolutos sin reducción del fondo. Puesto que la detección de anticuerpos unidos se hizo con proteina A biotinilada, que se une a IgG, IgA e IgM, la señal representa la unión total de los anticuerpos de todos los subtipos IgG, IgA e IgM. Una comparación entre los valores promedio y mediana de los anticuerpos anti-carbohidratos en las poblaciones EM y normal, revelan diferencias significativas entre las muestras de pacientes con EM y las muestras de la población normal, véase la Figura 5. Un ejemplo de una diferencia mayor observada entre los dos grupos, es la señal promedio para el glicano Ga4Gb. Una prueba t mostró que la diferencia es estadísticamente bastante significativa (a = 0.05; p<0.001). Otro ejemplo es Ab3 (GNb6) Na, (a = 0.05; p<0.001). Hay 'diferencias significativas entre las medianas de la población EM y la población normal con respecto a los anticuerpos unidos a los siguientes glicanos: Glc (a), Glc (a 1-4 ) Glc (a), Glc (a 1-4)Glc(P), Glc(P),Gal(P), Glc (ß 1-4) Glc (ß 1-4) Glc(P),GlcNAc (ß 1-4) GlcNAc (ß), L-Araf (a), L-Rha (a) , Gal(pl-3) [GlcNAc (ß?-6) ] GalNAc (a), Gal (ß 1-4 ) GlcNAc (a) , Gal (ß1-3 ) GalNAc (a), Gal (ß?-3) GlcNAc (ß), GlcA(p), GlcA (ß), Xyl (a). La señal de los anticuerpos unidos en el grupo EM es mayor que la señal en el grupo de control normal . La Figura 6 presenta la diferencia de los valores de unión promedio de los anticuerpos anti-glicano, entre las poblaciones.

Ejemplo 2.· Diferencias en los niveles de anticuerpos IgM anti-Glc(a) y anti-Glc (a l-4)Glc(a), en el suero de pacientes con E en estado de ataque, pacientes con EM estable y población sana. Se usó una matriz de glicanos para buscar biomarcadores entre el repertorio de anticuerpos de unión a glicanos en suero humano, para diferenciar entre una población sana y un grupo de pacientes con esclerosis múltiple (EM) y entre pacientes con EM en estados de exacerbación y remisión. Este ejemplo demostró que dos anticuerpos IgM, anti-Glc (a) y anti-Glc (a l-4)Glc(a) estaban en niveles significativamente mayores en los pacientes con EM que en las personas sanas (sensibilidad y especificidad de 60% y 93%, respectivamente) y en pacientes con EM en estado de exacerbación en comparación con los pacientes en estado de remisión (sensibilidad y especificidad de 89% y 71%, respectivamente) . También se obtuvo el perfil de anticuerpo anti-glicano de una población sana, que incluye un intervalo de variación durante un periodo de 13 semanas.

La estabilidad temporal del perfil de anticuerpos anti-glicanos a través de 13 semanas en individuos evidentemente sanos, fue alta. Los bajos niveles de anti- Glc(a) y anti-Glc (a l-4)Glc(a) IgM en la población normal, los altos niveles en los pacientes con EM y la elevada estabilidad temporal de los anticuerpos anti-glicanos, sugieren los anticuerpos anti-Glc (a) y anti-Glc (a 1- 4)Glc(a) IgM pueden servir como biomarcadores para el diagnóstico temprano, la prescripción temprana de los medicamentos, el monitoreo de los efectos del medicamento y la detección oportuna de los ataques. Todas las muestras de suero se analizaron utilizando GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel). Los glicanos se unieron mediante enlace covalente a la - superficie de plástico a través de un ligante en la forma descrita previamente en el documento (WO02/064556) . En el Cuadro 1 se proporciona una lista que describe los mono y oligosacáridos . Las muestras de sangre se obtuvieron de donadores evidentemente sanos conforme al protocolo de consentimiento informado aprobado por el comité ético de estudios en humanos de Helsinki del Belinson Medical Center e Tel-Aviv, Israel y el Carmel Medical Center de Haifa, Israel. Se recolectaron muestras de sangre de pacientes con EM admitidos en la clínica de esclerosis múltiple del Carmel Medical Center de Haifa, Israel. Las muestras de sangre se recolectaron en tubos evacuados recubiertos con silicona que contenían gel, para separar el suero del coágulo sanguíneo (Estar Technologies) . Después de la coagulación de la sangre, el suero se separó por centrifugación y se recolectó. Las muestras se almacenaron congeladas a -25 °C hasta que se utilizaron. El volumen de todas las soluciones que se agregaron a la matriz de glicanos fue de 10 µ?/????. Los sueros se diluyeron (1:20; concentración de saturación) en Tris-HCl 0.15M pH 7.2, Mg2S04 0.085M, Tween 20 0.05% (TBST) con un contenido de BSA 1% (Sigma) , se suministraron a las placas que tenían la matriz de glicanos, mediante un sistema de manejo automatizado Tecan Génesis Workstation 200, se incubaron durante 60 min a 37°C. Las placas se lavaron con 250 µ?/???? de solución salina amortiguada de fosfato con 0.05% de Tween 20 (PBST, Sigma) en un lavador de placas automático (Tecan, PowerWasher1111) . En este punto se adicionaron los siguientes reactivos diluidos en TBST con BSA 1%, por medio de un dispensador Multidrop 384 (Thermo Labsystems), se incubó durante 60 min a 37°C: para la determinación de IgG, IgA e IgM, el respectivo anticuerpo de cabra anti-Ig humana biotinilada específico de la subclase (Jackson, PA, USA) a 2.8µg/ml, 3 g/ml y 0.9µg/ml, respectivamente; para la determinación de Ig total, proteína A biotinilada (?µ?/p??, ICN Biomedicals) . Después de lavar con PBST, se agregó en cada pozo estreptavidina conjugada con europio (?.?µ?/p??) diluida en TBST con BSA 1%, se incubó durante 30 min a 37 °C en la obscuridad y se lavó con PBST. Luego se adicionó a los pozos solución de refuerzo Delfia1^ y las placas se incubaron durante 30 a 45 min en la obscuridad y a temperatura ambiente. La fluorescencia de los pozos se leyó con un lector de placas Víctor 1420 (Wallac, Finlandia) utilizando fluorescencia de tiempo de resolución en condiciones de 340/612 nm (excitación/emisión) .

Diferencias en los niveles séricos de anticuerpos IgM anti-61c (a) y Glc(a l-4)Glc(cc) entre pacientes con EM en estado de ataque, pacientes con EM estable y población sana. Las muestras de suero se obtuvieron de pacientes con EM admitidos en una clínica externa para examen regular después de firmar la forma de consentimiento informado. En el grupo de pacientes 80% eran mujeres, reflejo aproximado de la relación de género en la población de EM general. Según datos publicados (Ritchie et al.,J. Clin. Laboratorio. Anal. 12:363-70, 1998), se observaron niveles significativamente mayores de anticuerpos IgM (pero no de Ig6 o IgA) en sueros provenientes tanto de mujeres sanas como de mujeres con EM en comparación con los hombres (no se muestra) . Por lo tanto, el análisis se limitó sólo a las subpoblaciones de mujeres con EM y sanas. Los sueros de las pacientes con EM inicialmejite se tamizaron con respecto a 54 glicanos (Cuadro 1) para detectar la presencia de anticuerpos IgG, IgM e IgG anti-glicanos con el . fin de identificar marcadores que confirmaran pacientes EM con eventos únicos de desmielinización aguda y marcadores que distinguieran a los pacientes durante las etapas de exacerbación y remisión de la enfermedad. El experimento se repitió dos veces utilizando cinco de los 54 glicanos frente a los cuales se encontraron algunas diferencias entre los grupos en la ronda inicial. Se encontró una diferencia reproducible y estadísticamente significativa en los niveles de anticuerpos IgM anti Glc (a) y anti-Glc (a l-4)Glc(a) entre los grupos sanos y los grupos EM (Figura 7A) , pero no se encontraron en estos estudios diferencias significativas en los niveles de IgG o IgA (no se muestran) . En los sueros de los dos grupos de pacientes con EM, los niveles de IgM anti Glc (a) y anti-Glc (a 1-4) Glc (a) fueron significativamente mayores que en la población sana. Se utilizó un valor discriminante óptimo establecido de manera arbitraria (la señal 97% porcentil de la población "sana"), para identificar las muestras positivas y negativas, arriba y abajo del valor discriminante, respectivamente. De este modo, las señales de unión anti-Glc (ce) identificaron correctamente 19 de 42 muestras E (45% de sensibilidad) y 42 de 44 muestras de sueros evidentemente sanos (96% de especificidad) . La medición de unión anti-maltosa identificó correctamente 48% de los sueros EM y 95% de las muestras de sueros evidentemente sanos. Se definió positiva una muestra cuya señal está por arriba del valor discriminante en cualquiera de los ensayos de anti-Glc (a) o Glc(a l-4)Glc(a), mejora la sensibilidad a 60% y deja la especificidad a 93% (Cuadro 2) . La distribución diferencial de anticuerpos anti-Glc (a) y anti-Glc (a -l-4)Glc(a) en los pacientes, durante las fases de exacerbación y remisión de la enfermedad presentó niveles significativamente mayores en el primer grupo (Figura 7B) . No se encontró diferencia entre los pacientes sin tratar y los pacientes tratados con ß-interferón (no se muestra) . Utilizando como discriminante el 80% porcentil de la población "EM" estable, se determinó que las señales de la unión anti-Glc ( ) v identificaron correctamente 15 de 18 muestras de "ataque" (83% de sensibilidad), 19 de 24 muestras "estables" (79% de especificidad relativa a estable como libre se síntomas) y 42 de 44 muestras "sanas" (95% de especificidad) . La medición de unión de anti-maltosa identificó correctamente 72% de los sueros de "ataque", 79% de los sueros "estables" y 97% de los sueros "sanos". Se definió como positiva una muestra cuya señal está por arriba del valor discriminante en los ensayos ya sea de Glc (a) o de maltosa y que da como resultado una sensibilidad de 89% y una especificidad, de 71% y 95% relativa a muestras "estables" o "sanas", respectivamente (Cuadro 3) . La elevada sensibilidad y especificidad de los anticuerpos IgM anti-Glc (a) y anti-Glc(ct 1-4) Glc (a) los hacen una eficiente herramienta para el diagnóstico temprano y la definición de pacientes con EM. El hecho de que los niveles de estos anticuerpos en situación de ataque de EM sean mucho más altos que en situación estable, hace que sean una herramienta para la identificación temprana y la predicción de ataques en pacientes con EM de remisión-recaída. Se observó una elevada correlación entre los niveles séricos de anticuerpos IgM anti-Glc (a) , en pacientes femeninas con EM (remisión-recaída) clínicamente diagnosticada, definidas como positivas con respecto a la presencia de anticuerpo IgM anti-Glc (a) (tal como se describió antes) y la calificación EDSS (Escala de Estado de Incapacidad Expandida (EDSS) ) en mujeres, véase la Figura 8, cuadro izquierdo. No hubo correlación entre las EDSS y los niveles séricos de anticuerpo IgM anti-Glc (a) en pacientes femeninas con EM (remisión-recaída) clínicamente diagnosticada, definidas como positivas con respecto a la presencia de anticuerpo IgM anti-Glc (a) , véase la Figura 8, cuadro izquierdo. La elevado correlación indica que los niveles séricos de IgM anti-Glc(oc) pueden actuar como un biomarcador molecular subrogado para evaluar la actividad de la enfermedad.

Intervalo temporal de los niveles de anticuerpos anti-glicanos Al considerar el uso de cualquier parámetro biológico como biomarcador subrogado, es obvio que cumpla con el prerrequisito de no ser variable con el tiempo en la población normal. De este modo, los niveles séricos de anticuerpos IgG, IgA e IgM anti-LRha (a) , anti-GlcNAc (a) y anti-Glc(P l-4)Glc(P l-4)Glc(P)(P celotriosa) , en siete voluntarios sanos se observaron durante 13 semanas (Figura 9) . En general, se encontró que las concentraciones séricas de anticuerpos variaban entre los diferentes individuos pero eran totalmente estables a través del tiempo. Por ejemplo, los sueros #9161 y #9162 tienen niveles relativos muy altos y temporalmente estables de anticuerpos anti-GlcNAc(a) y Glc(P l-4)Glc(P l-4)Glc(P), respectivamente, pero niveles relativamente normales de anticuerpos IgA anti-L-Rha (a) e IgG e IgM. Cuando se presentan cambios en el nivel de anticuerpos, con frecuencia son graduales y continuos durante varias semanas (por ejemplo, el suero#9162; IgA anti-Glc(P l-4)Glc(P 1-4) Glc (ß) ) , pero también pueden ser repentinos, por ejemplo, el suero #9172; IgM anti-L-Rha (a) , que en forma súbita aumentó entre la semana cuatro y la cinco y luego regresó lentamente a su nivel básico.

E emplo . Perfil de anticuerpo anti-glicano (AGAP) en una población humana normal Se determinó la unión de anticuerpo Ig total (detectada con proteina ?) de 72 sueros individuales a 34 mono y oligosacáridos (Figura 11 y Cuadro 5) y la unión de IgG, IgA e IgM de 200 sueros a seis mono y oligosacáridos (Figura 15A-C) . Las señales más intensas de los anticuerpos se registraron frente a GlcNAc (a) y L-Rha ( ) , mientras que las señales menores se observaron frente a los oligosacáridos de glucosa ligados en ß4, GlcNAc (ß), GlcNAc (ß ' 1-4) GlcNAc (ß), Gal (a) y Gal (a l-3)Gal(p 1-4 ) GlcNAc (ß). Esto es congruente con datos publicados con anterioridad que muestran la distribución de anticuerpos anti-glicano en una mezcla comercial de suero humano (WO02/064556) . Los AGAP de las subclases IgG e IgA fueron similares al AGAP de Ig total, mientras que el del IgM fue menor y más uniforme entre los diferentes glicanos. Los anticuerpos anti-glicano de la población tendieron a una distribución logarítmica normal, véanse las Figuras 15A-15C. Es evidente que existe una variación considerable de los niveles de anticuerpos anti-glicano en los individuos de la población examinada, hecho que sugiere la existencia de AGAP individuales, pero que limita la búsqueda de marcadores para anticuerpos anti-glicano presentes en bajas cantidades. Los glicanos inmovilizados en glóbulos también se han utilizado para purificar anticuerpos frente a oligosacáridos de glucosa con enlace ß4 y L-Rha (a) . Su perfil de unión y especificidad se describen en las Figuras 13, 14A y 14B.

Ejemplo 8. Uso de anticuerpos anti-glicano para diferenciar entre pacientes con ateroesclerosis de alto riesgo y con placas vulnerables y pacientes con ateroesclerosis de bajo riesgo con placas estables Los niveles de anticuerpos anti-glicano en el suero de pacientes ateroescleróticos con placas vulnerables, se compararon con los niveles de anticuerpos de glicano en suero de pacientes ateroescleróticos con placas estables, asi como individuos sin ateroesclerosis. La ateroesclerosis es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. Es un trastorno sistémico de las paredes de los vasos sanguíneos que conduce al desarrollo de placas ateroescleróticas en las paredes de los vasos sanguíneos. Algunas de estas placas se vuelven vulnerables a la ruptura y provocan la formación de coágulos que dan lugar a infartos o accidentes cerebrovasculares . Los principales componentes de las placas ateroescleróticas son proteoglicanos , lípidos, células musculares y linfocitos (células T y macrofagos) . Por otra parte, la ateroesclerosis se percibe como una enfermedad autoinmune en la que uno de sus iniciadores presenta reactividad cruzada entre los anticuerpos de antigenos bacterianos y los antigenos en las paredes de los vasos sanguíneos. 1 Un punto importante en el desarrollo de la ateroesclerosis, es el cambio de las. placas estables (SP) , asociadas con bajo riesgo, hacia las placas vulnerables inflamadas (VP) , asociadas co'n alto riesgo. La diferenciación entre las SP y VP es clínicamente problemática, ya que una distinción concluyente sólo se puede hacer a través de una autopsia post-mortem. Las muestras de suero fueron suministradas por el Dr. Jacob George del departamento de cardiología del Tel Aviv Medical Center, Israel. Todos los pacientes eran hombres no diabéticos con edades entre 30 y 69 años. Se analizaron 39 muestras de pacientes clasificados en los siguientes tipos: Angina inestable - 13 pacientes con ateroesclerosis caracterizados por tener síndromes coronarios agudos (infartos al miocardio de onda Q o sin onda Q) . Ambos considerados como provenientes de la ruptura de placas vulnerables. Entre los miembros del grupo de angina inestable se incluyeron pacientes con síndrome coronario agudo admitidos con dolor en el pecho y cambios en el ECG o elevación de los marcadores cardiacos. Ellos se quejaron de la aparición reciente (<3 días) de angina y se sometieron durante la admisión a un monitoreo telemétrico continuo del electrocardiograma (ECG) . Al menos se detectó un episodio de angina en reposo o un episodio que duró más de 20 minutos durante las últimas 48 horas, junto con un aumento en los niveles de creatina cinasa, MB o troponina. Los miembros de este grupo habían tenido angiografía coronaria (cateterismo) que documentó la presencia de ateroesclerosis coronaria. Angina estable - 13 pacientes con ateroesclerosis se caracterizaron por tener angina estable. Los miembros del grupo de angina estable se habían sometido a angiografía coronaria (cateterismo) documentando la presencia de ateroesclerosis coronaria. No se detectaron cambios en el ECG ni se detectaron aumentos en los niveles de creatina cinasa, MB o troponina. Ausencia de placas - 13 pacientes con arterias coronarias normales. Los miembros del grupo "ausencia de placas" no mostraron evidencia de ateroesclerosis coronaria posterior al cateterismo. Se obtuvo un perfil de anticuerpo anti-glicano utilizando matrices de GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, No. Cat. 9100) construidos mediante los procedimientos descritos en el documento WO00/49412. Todas las muestras de suero se analizaron utilizando placas de GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, No. Cat. 9100), las cuales contenían una matriz de mono y oligosacáridos unidos por enlace covalente en una placa .de microtitulación de 384 pozos de volumen reducido. La lista de los mono y oligosacáridos presentada en la matriz y también los números de serie, se describen en el Cuadro 4. Los sueros se diluyeron (1:20) en TBST suministrado en las placas GlycoChip® mediante un robot Tecan Génesis Workstation 200 (??µ?/????) y se incubaron 30 min a 25 grados Celsius . Cada glicano y cada muestra de suero en la placa se determinó 8 veces. Las placas se lavaron con 250 µ?/???? de un amortiguador con alto contenido de sal (KNa 0.15M pH 7.2, NaCl 2M, MgS04 0.085M, T een 20 0.05%) en un lavador de placas automático (Tecan, PowerWasherMR) . En forma manual se suministraron diez µ?/???? de anticuerpo de cabra anti-IgG, IgM o IgA humanas biotinilado (Jackson, PA, EE.UU.), ^g/ml en TBST, las placas se incubaron durante 30 min a 25°C. La placa se lavó otra vez con amortiguador salino. En forma manual se adicionó estreptavidina conjugada con europio, Wallac, AD0062 (?µ?/ml, ??µ?/????) y posteriormente se incubó durante 30 irtin a 25 °C en la obscuridad. Se repitió el lavado de las placas con el amortiguador de alto contenido de sal. Se adicionó amortiguador de refuerzo DelfiaMR, (Wallac, 730232, ??µ?/????) a los pozos y las placas se incubaron al menos durante 30 min en la obscuridad. La fluorescencia de los pozos se leyó con un lector de placas Víctor 1420 (Wallac) utilizando fluorescencia de tiempo de resolución en condiciones de emisión a 612nm y extinción a 340nm. La señal de unión a glicano obtenida para el grupo "ausencia de placas" se utilizó para calcular los valores discriminantes para cada glicano arriba de los cuales se consideró al paciente como positivo. Estos valores discriminantes se definieron como la señal promedio del grupo "ausencia de placas" más uno o dos de desviación estándar. Según esta definición, entre los grupos de pacientes se identificaron varios glicanos que tenían cierto grado de fuerza de separación (véase más adelante) . La "separación" con base en un cierto glicano se definió como un mínimo de 50% (7/13) muestras positivas en los grupos de "angina inestable" o "angina estable" y 2 o menos muestras positivas en el grupo "ausencia de placa" .

La Figura 16A es una representación matricial de los glicanos utilizados para examinar los sueros de pacientes que tienen angina estable o inestable, las estructura de los glicanos se describen en el Cuadro 4. Los glicanos frente a los cuales se determinaron niveles de anticuerpos significativamente diferentes en los distintos grupos de pacientes, se marcaron con cuadrados llenos. Al nivel discriminante del promedio más dos desviaciones estándar, se logró la "separación" con la unión de IgA a dos diferentes glicanos. Se separó uno entre los anticuerpos IgG, pero ninguno entre los anticuerpos IgM. Los glicanos solos que dieron las mejores separaciones, se presentan a continuación: Algunos glicanos que no se definieron como "de separación" presentaron cierto grado de separación. Cuando se usaron en combinación, la separación se pudo mejorar más allá de la lograda con los glicanos simples. Los glicanos se presentan a continuación: Glicanos Resultado Angina Angina Ausencia de LinearCode inestable estable placas Aa positivos 6 2 0 negativos 7 11 13 Xb positivos 1 6 · 0 negativos 12 7 13 Fa positivos 5 3 1 negativos 8 10 12 A[3S]b positivos 1 6 1 negativos 12 7 12 GNb4GNb positivos 5 0 1 negativos 8 13 12 Figura 16B es una representación gráfica que muestra los niveles de anticuerpos frente a los glicanos #2 y #29, en los tres grupos de pacientes. El cuadro incluye señales de 50% de la población. Las lineas delgadas y gruesas en el cuadro representa los valores de la media y la mediana, respectivamente. El limite del cuadro más cercano a cero indica el 25°porcentil y el límite del cuadro más alejado de cero indica el 75°porcentil . Las líneas arriba y abajo del cuadro indican el 90° y el 10° porcentiles . La Figura 17 es un histograma que muestra el número de muestras en los tres grupos .de pacientes, positivas para anticuerpos anti-IgA frente al glicano #2 o al glicano #29. La Figura 18A es un histograma que muestra la distribución de los niveles de anticuerpos frente a los glicanos "2 y "15 en los tres grupos de pacientes. El cuadro incluye señales de 50% de la población. Las lineas delgadas y gruesas en el cuadro representa los valores de la media y la mediana, respectivamente. El limite del cuadro más cercano a cero indica el 25°porcentil y el limite del cuadro más alejado de cero indica el 75 "porcentil . Las lineas arriba y abajo del cuadro indican el 90° y el 10° porcentiles. La Figura 18B es un histograma que muestra el número de muestras en los tres grupos de pacientes positivos para los anticuerpos anti-glicanos frente al glicano #2 o al glicano #15. Al nivel discriminante del promedio más una desviación estándar, se logró la "separación" con la unión de IgA a 6 diferentes glicanos. Los niveles de anticuerpos IgG e IgM no fueron diferentes en los tres grupos. La separación obtenida con combinaciones se muestra a continuación (se usó Aa porque el número de muestras positivas en el grupo de "angina estable" fue menor que al usar Ab, de este modo se mejoró la separación con respecto al grupo de "angina inestable") : Glicanos Resultado Angina Angina Ausencia LinearCode inestable estable de placas Aa y GNb4GNb Positivo con uno 8 2 1 de los glicanos Negativo con los 5 11 12 dos Aa y Ga4Ga Positivo con uno 8 5 0 de los glicanos Negativo con los 5 8 13 dos La especificidad y sensibilidad de la prueba para detectar "angina inestable" utilizando Aa y GNb4GNb fue de 62% (8/13) y 88% (23/26), respectivamente. Una combinación de los tres glicanos Aa, GNb4GNb y Fb, hizo posible determinar también la especificidad para el grupo de "angina estable" 75% (9/13) . Esto se deriva del hecho de que Fb detecta principalmente "angina estable". La especificidad y sensibilidad de los ensayos combinados se resumen en la Figura 19. Estos resultados demuestran que se puede usar una combinación de glicanos (Gal (a), GlcNAc(P 1-4) GlcNAc (ß) y Fu(P) para distinguir satisfactoriamente entre las poblaciones de angina estable e inestable con una especificidad de 62% y una sensibilidad de 88%. Este resultado muestra que es posible desarrollar un marcador con base en anticuerpos IgA que se unen a glicanos, que distinga entre pacientes con angina estable e inestable.

Ejemplo 9. Uso de anticuerpos anti-glicano para diferenciar entre pacientes con ateroesclerosis de alto riesgo con placas vulnerables y pacientes con ateroesclerosis de bajo riesgo con placas estables Los niveles de anticuerpos anti-glicanos en sueros de pacientes ateroescleróticos con . placas vulnerables, se compararon con los niveles de anticuerpos de glicanos en el suero de pacientes ateroescleróticos con placas estables, asi como individuos sin ateroesclerosis. La ateroesclerosis es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. Es un trastorno sistémico de las paredes de los vasos sanguíneos que conduce al desarrollo de placas ateroescleróticas en las paredes de los vasos sanguíneos. Algunas de estas placas se vuelven vulnerables a la ruptura y provocan la formación de coágulos que dan lugar a infartos o accidentes cerebrovasculares . Los principales componentes de las placas ateroescleróticas son proteoglicanos , lípidos, células musculares y linfocitos (células T y macrófagos) . Por otra parte, la ateroesclerosis se percibe como una enfermedad autoinmune en la que uno de sus iniciadores presenta reactividad cruzada entre los anticuerpos de antigenos bacterianos y los antigenos en las paredes de los vasos sanguíneos. Un punto importante en el desarrollo de la ateroesclerosis , es el cambio de las placas estables (SP) , asociadas con bajo riesgo, hacia las placas vulnerables inflamadas (VP) , asociadas con alto riesgo. La diferenciación entre las SP y VP es clínicamente problemática, ya que una distinción concluyente sólo se puede hacer a través de una autopsia post-mortem. Las muestras de suero fueron suministradas por el Dr. Jacob George del departamento de cardiología del Tel Aviv Medical Center, Israel. Todos los pacientes eran hombres no diabéticos con edades entre 30 y 69 años. Se analizaron 72 muestras de pacientes clasificados en los siguientes tipos: Angina inestable - 24 pacientes con ateroesclerosis caracterizados por tener síndromes coronarios agudos (infartos al miocardio de onda Q o sin onda Q) . Ambos considerados como provenientes de la ruptura de placas vulnerables. Entre los miembros del grupo de angina inestable se incluyeron pacientes con síndrome coronario agudo admitidos con dolor en el pecho y cambios en el ECG o elevación de los marcadores cardiacos. Ellos se quejaron de la aparición reciente (<3 días) de angina y se sometieron durante la admisión a un monitoreo telemétrico continuo del electrocardiograma (ECG) . Al menos se detectó un episodio de angina en reposo o un episodio que duró más de 20 minutos durante las últimas 48 horas, junto con un aumento en los niveles de creatina cinasa, MB o troponina . Los miembros de este grupo habían tenido angiografía coronaria (cateterismo) que documentó la presencia de ateroesclerosis coronaria. Angina estable - 24 pacientes con ateroesclerosis se caracterizaron por tener angina estable. Los miembros del grupo de angina estable se habían sometido a angiografía- coronaria (cateterismo) documentando la presencia de ateroesclerosis coronaria. No se detectaron cambios en el ECG ni se detectaron aumentos en los niveles de creatina cinasa, MB o troponina. Ausencia de placas - 24 pacientes con arterias coronarias normales. Los miembros del grupo "ausencia de placas" no mostraron evidencia de ateroesclerosis coronaria posterior al cateterismo. Se obtuvo un perfil de anticuerpo anti-glicano utilizando matrices de GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, No. Cat. 9100) construidos mediante los procedimientos descritos en el documento WOOO/49412. Todas las muestras de suero se analizaron utilizando placas de GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, No. Cat . 9100), las cuales contenían una matriz de mono y oligosacáridos unidos por enlace covalente en una placa de microtitulación de 384 pozos de volumen reducido. La lista de los mono y oligosacáridos presentada en la matriz y también los números de serie, se describen en el Cuadro 4. Los sueros se diluyeron (1:20) en TBST suministrado en las placas GlycoChip® mediante un robot Tecan Génesis Workstation 200 (??µ?/????) y se incubaron 30 min a 25 grados Celsius. Cada glicano y cada muestra de suero en la placa se determinó 8 veces. Las placas se lavaron con 250 µ?/???? de un amortiguador con alto contenido de sal (KNa 0.15M pH 7.2, NaCl 2M, MgS0 0.085M, Tween 20 0.05%) en un lavador de placas automático (Tecan, PowerWasherR) . En forma manual se suministraron diez µ?/???? de anticuerpo de cabra anti-IgG, IgM o IgA humanas biotinilado (Jackson, PA, EE.UU.), ^g/ml en TBST, las placas se incubaron durante 30 min a 25°C. La placa se lavó otra vez con amortiguador salino. En forma manual se adicionó estreptavidina conjugada con europio, Wallac, AD0062 (?µ?/ml, ??µ?/????) y posteriormente se incubó durante 30 min a 25 °C en la obscuridad. Se repitió el lavado de las placas con el amortiguador de alto contenido de sal. Se adicionó amortiguador de refuerzo DelfiaMR, (Wallac, 730232, ??µ?/????) a los pozos y las placas se incubaron al menos durante 30 min en la obscuridad. La fluorescencia ' de los pozos se leyó con un lector de placas Víctor 1420 (Wallac) utilizando fluorescencia de tiempo de resolución en condiciones de emisión a 612nm y extinción a 340nm. El valor discriminante se calculó a partir del 80° porcentil de la población normal. Según esta definición, entre los grupos de pacientes se identificaron varios glicanos que tenían cierto grado de fuerza de separación (véase más adelante) . La "separación" con base en un cierto glicano se definió como un mínimo de 50% (12/24) muestras positivas en los grupos de "angina inestable" o "angina estable" y 5 ó menos muestras positivas en el grupo "ausencia de placa".

Glicano Angina Angina Ausencia LinearCode inestable estable de placas Ga4Ga Positivos 12 2 5 % de positivos 52 8 21 Gb Positivos 19 10 5 % de positivos 83 42 21 ANa Positivos 13 8 5 % de positivos 57 33 21 ANb Positivos 15 8 5 % de positivos 65 33 21 GNb4GNb Positivos 13 8 5 % de positivos 57 33 21 Xa Positivos 21 7 5 % de positivos 100 29 21 Estos resultados demuestran que se puede usar una combinación de glicanos Glc (a l-4)Glc(a), Glc(P), GalNac(a), GalNac (ß) , ¦ GlcNAc (ß 1-4) GlcNAc (ß) y Xilosa(a), para distinguir satisfactoriamente entre las poblaciones de angina estable e inestable. Este resultado muestra que es posible desarrollar un biomarcador con base en anticuerpos IgA que se unen a glicanos , que distinga entre pacientes con angina estable e inestable.

Ejemplo 10. Unión de células CD4+ a una pluralidad de glicanos inmovilizados en un sustrato sólido Se examinó la unión dé células CD4+ de 7 individuos sanos a 47 diferentes fragmentos de glicanos inmovilizados en una micromatriz. Materiales y métodos 20ml de sangre recién extraída de cada uno de los 7 individuos utilizando vacutainers con 10 mL de EDTA. Las muestras de células periféricas se centrifugaron (230 x g, 900 RPM) , 10 minutos a temperatura ambiente) . El plasma se separó y 2mi de la parte superior de la fracción celular se transfirieron a un tubo de 15ml. Se adicionaron a los tubos ???µ? de reactivo RosetteSep para enriquecimiento de las células CD4+ y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las muestras se diluyeron dos veces en PBS (solución salina amortiguada de fosfato) /CFS 2% y se depositaron 5ml de Ficoll debajo de la suspensión celular mediante una pipeta Pasteur de vidrio. Los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, a 2400 RPM (~700 x g) de inicio de la centrifuga. Después de la centrifugación, los tubos se retiraron con cuidado de la centrifuga. La capa superior se extrajo cuidadosamente con una pipeta estéril, dejando sin tocar la capa de linfocitos en la interfaz. Con una pipeta estéril se transfirió la fracción de leucocitos a un tubo limpio que se lleno totalmente con PBS/FCS 2%. Las células se lavaron dos veces otra vez centrifugando durante 10 minutos, 230 x g (1000 RPM) y se resuspendieron en PBS/FCS 2%. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en 500µ1 RPMI/1640 FCS 2%. Las células se diluyeron en solución Türk 1:10 y se contaron. Después del conteo se diluyeron a una densidad de 5xl06 células/ml en RPMI/1640 FCS 2%, luego se depositaron en una placa de 24 pozos, Iml/pozo. Las suspensiones de células se incubaron durante la noche a 95% de humedad, 37 °C y 5% C02. Para determinar los rendimientos de separación de células, se suspendieron 250,000 células en lml de amortiguador FACS y luego se centrifugaron 10 minutos a 2000 RPM, a 4°C. El sobrenadante se decantó. Las células se resuspendieron en 50 µ? de amortiguador FACS y se marcaron con 5 µ? de anticuerpo anti-CD4. Las células se incubaron 30 minutos en hielo y. se cubrieron para protegerlas de la luz. Se adicionó lml de amortiguador FACS enfriado en hielo y se centrifugó durante 10 minutos, a 2000 RPM y a 4°C. Luego las células se resuspendieron en 300 µ? de amortiguador FACS, se almacenaron en hielo y se clasificaron en un equipo FACS. Se colocaron GlycoChips en portaobjetos y en recipientes plástico envueltos con papel húmedo para retener la humedad. Las suspensiones de células se depositaron a 1.2µ1/???? sobre el GlycoChip, luego se incubaron en un incubador con C02 5% (95% de humedad, 37 °C) durante una hora. Después de la incubación, los portaobjetos suavemente se colocaron al revés en la cámara de centrifugación sumergida en PBS. Los GlycoChips se centrifugaron durante dos minutos a 700 RPM (fuerza de gravedad mínima, ~50 x g) . Los portaobjetos se observaron al microscopio y se fijaron en PBS/formaldehído 3.7% a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Luego, los portaobjetos se lavaron suavemente 3 veces en DDW y se secaron con aire. Se preparó una solución de yoduro de propidio en PBS y se depositó a 1.2 µ?/????. Los GycoChips se incubaron en ambiente húmedo durante 15 minutos, luego se enjuagaron suavemente 3 veces sumergiéndolos en DDW. Los portaobjetos se secaron con aire en la obscuridad y se corrieron en yoduro de propidio en condiciones de extinción 535 nm y emisión 655nm en un escáner de matrices "array scanner". La imagen se analizó y se determinó la densidad celular. Resultados Los glicanos y controles utilizados en los estudios de unión se muestran en la Figura 20. La estructura está escrita en sintaxis LinearCodeMR, véase el Cuadro 1 para la traducción. En la Figura 20 se presenta un histograma que muestra en perfil de unión de células CD4+ provenientes de un solo individuo a varios glicanos. Se muestra la unión en DLU/mm2 para cada uno de los glicanos o controles. La unión de células CD4+ a glicanos o controles provenientes de siete individuos, se muestra en la Figuras 21A. La Figura 21A muestra la fluorescencia relativa mediana para células CD4+ provenientes de cada uno de los siete individuos. Estos resultados demuestran que la unión de células CD4+ varia entre los diferentes glicanos . La unión más fuerte se observó para los siguientes glicanos en orden de afinidad relativa: células CD4+ unidas a los siguientes glicanos, presentado en LinearCode : Nna3Ab (Fa3) GNb > Mb4Gb > GNb4GNb > Ma3Ma > Ab6Ab. También se detectó la unión de células CD4+ a glicanos con residuos de mañosa terminal o con residuos Sialyl Lewis X. También se detectó la variación de la unión CD4+ a glicanos particulares, entre los diversos individuos .

OTRAS MODALIDADES Se entiende que aun cuando la invención se ha expuesto junto con la descripción detallada de la misma, ésta pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, la cual se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones quedan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones .

Claims (57)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para el diagnóstico de esclerosis múltiple en un sujeto, el método consiste en proporcionar una muestra de prueba proveniente de un sujeto; detectar en la muestra un anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(a); y comparar los niveles de los anticuerpos en la muestra de prueba con los de una muestra de control, en donde la muestra de control se selecciona a partir del grupo que consiste en uno o más individuos que tienen síntomas de esclerosis múltiple y tienen un estatus de esclerosis múltiple conocido, y uno o más individuos que no muestran síntomas de esclerosis múltiple, mediante lo cual se diagnostica esclerosis múltiple en el sujeto.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde el método también consiste en detectar un segundo anticuerpo seleccionado a partir del grupo formado por: anticuerpo anti-Glc (a) , anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(P), anticuerpo anti-Glc (ß), anticuerpo anti-Gal (ß) , anticuerpo anti-Glc (ß l-4)Glc(p l-4)Glc(P), anticuerpo anti-GlcNAc (ß 1-4 ) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-L-Araf (a) , anticuerpo anti-L-Rha(a), anticuerpo anti-Gal (ß1-3 } [GlcNAc (ß1-6) ] GalNAc (a) , anticuerpo anti-Gal (ß1-4 ) GlcNAc (a) , anticuerpo anti-Gal (ß?-3)GalNAc( ), anticuerpo anti-Gal (ß1-3) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-GlcA (ß) , anticuerpo anti-GlcA^) y anticuerpo anti-Xyl(ct); y comparar los niveles del segundo anticuerpo en la muestra de prueba con los niveles del segundo anticuerpo en una muestra de control, en donde la muestra de control se selecciona a partir del grupo formado por uno o más individuos que tienen síntomas de esclerosis múltiple y tienen un estatus conocido de esclerosis múltiple, y uno o más individuos que no muestran síntomas de esclerosis múltiple, mediante lo cual se diagnostica esclerosis múltiple en el sujeto.
3. 3. El método según la reivindicación 2, en donde el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-Glc(a).
4. 4. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra de control básicamente consiste en una población de uno o más individuos que no muestran síntomas de esclerosis múltiple.
5. 5. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra de control básicamente consiste en una población de uno o más individuos que síntomas de tienen esclerosis múltiple con un estatus de esclerosis múltiple conocido.
6. 6. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra de prueba es un fluido biológico.
7. 7. El método según la reivindicación 6, en donde el fluido biológico es sangre entera, suero, plasma, líquido cerebroespinal, orina o saliva.
8. 8. El método según la reivindicación 1, en donde el fluido biológico es suero.
9. 9. El método según la reivindicación 1, en donde el sujeto es una mujer.
10. 10. El método según la reivindicación 1, en donde el sujeto es un honíbre.
11. 11. El método según la reivindicación 1, en donde uno de los anticuerpos es un anticuerpo tipo IgM.
12. 12. El método según la reivindicación 1, en donde uno de los anticuerpos es un anticuerpo tipo IgA.
13. 13. El método según la reivindicación 1, en donde uno de los anticuerpos es un anticuerpo tipo IgG.
14. 14. El método según la reivindicación 2, en donde el anticuerpo anti-Glc(a) es un anticuerpo tipo IgM.
15. 15. El método según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-Glc(ot l-4)Glc(a) es un anticuerpo tipo IgM.
16. 16. El método según la reivindicación 1, en donde el diagnóstico es un diagnóstico temprano de esclerosis múltiple.
17. 17. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra de control se determina mediante evaluación con Escala de Estado de Incapacidad Expandida (EDSS) o evaluación por imagen de resonancia magnética (MRI) .
18. 18. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra de control se determina mediante evaluación Escala de Estado de Incapacidad Expandida (EDSS) .
19. 19. El método según la reivindicación 1, en donde el método consiste en detectar al menos dos de los anticuerpos .
20. 20. El método según la reivindicación 1, en donde el método consiste en detectar al menos cuatro de los anticuerpos.
21. 21. El método según la reivindicación 1, en donde el método consiste en detectar al menos seis de los anticuerpos .
22. 22. Un método de diagnóstico de exacerbación de esclerosis múltiple en un sujeto, el método consiste en: proporcionar una muestra de prueba proveniente de un sujeto; detectar en la muestra de prueba un anticuerpo anti-Glc( l-4)Glc(oc) tipo IgM; y comparar los niveles del anticuerpo en la muéstra de prueba con una muestra de control, en donde la muestra de control se deriva de uno o más individuos cuyo estatus de esclerosis múltiple se conoce, mediante lo cual se diagnostica la exacerbación de la esclerosis múltiple en el sujeto.
23. 23. El método según la reivindicación 22, en donde la muestra de control básicamente consiste en una población de uno o más individuos que tienen síntomas de esclerosis múltiple con un estatus de esclerosis múltiple conocido.
24. 24. El método según la reivindicación 22, en donde el método consiste en detectar en la muestra de prueba un anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(a) tipo a IgM y un anticuerpo anti-Glc (a) tipo IgM; y comparar los niveles del anticuerpo en la muestra de prueba con la muestra de control.
25. 25. El método según la reivindicación 22, en donde el método consiste en detectar en la muestra de prueba un anticuerpo anti-cc-Glucosa tipo IgM y un anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(a) tipo a IgM; y comparar los niveles del anticuerpo en la muestra de prueba con la muestra de control.
26. 26. El método según la reivindicación 22, en donde la muestra de control básicamente consiste en una población de uno o más individuos con esclerosis múltiple en estado de remisión que no muestran síntomas de exacerbación de esclerosis múltiple y en donde se diagnostica en el sujeto una exacerbación de esclerosis múltiple si en la muestra de prueba están presentes más anticuerpos anti-Glc (a) o anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(a) que en la muestra de control.
27. 27. El .método según la reivindicación 22 , en donde la muestra de control básicamente consiste en una población de uno o más individuos con esclerosis múltiple en estado de exacerbación y que muestran síntomas de exacerbación de esclerosis múltiple y en donde se diagnostica en el sujeto una exacerbación de esclerosis múltiple si los niveles de anticuerpos anti-Glc(a) o anticuerpo anti-Glc(a l-4)Glc(oc) son similares en la muestra de prueba y en la muestra de control.
28. 28. El método según la reivindicación 22, en donde la muestra de prueba es un fluido biológico.
29. 29. El método según la reivindicación 28, en donde el fluido biológico es sangre entera, suero, plasma, liquido cerebroespinal, orina o saliva.
30. 30. El método según la reivindicación 28, en donde el fluido biológico es suero.
31. 31. El método según la reivindicación 22, en donde el sujeto es una mujer.
32. 32. El método según la reivindicación 22, en donde el sujeto es un hombre.
33. 33. El método según la reivindicación 22, en donde el diagnóstico es un diagnóstico temprano de exacerbación de esclerosis múltiple.
34. 34. El método según la reivindicación 22, en donde el sujeto se ha tratado mediante la administración subcutánea de beta interferón.
35. 35. El método según la reivindicación 22, en donde el sujeto se ha tratado mediante la administración subcutánea de acetato de glitamerer.
36. 36. Un método para evaluar en un sujeto la gravedad de la enfermedad de esclerosis múltiple, el método consiste en: proporcionar una muestra de prueba proveniente de un sujeto; determinar si la muestra de prueba contiene anticuerpos anti-Glc(a l-4)Glc(oc) tipo IgM; y comparar el nivel de uno o más anticuerpos en la muestra de prueba con el de una muestra de control, en donde la muestra de control se deriva de uno o más individuos cuya gravedad de esclerosis múltiple se conoce, mediante lo cual se evalúa en el sujeto la gravedad de la esclerosis múltiple.
37. 37. El método según la reivindicación 36, en donde la muestra de control básicamente consiste en una población de uno o más individuos que tienen síntomas de esclerosis múltiple con un estatus de esclerosis múltiple conocido .
38. 38. El método según la reivindicación 36, en donde el método consiste en detectar en la muestra de prueba un anticuerpo anti-Glc(a l-4)Glc(oc) tipo IgM y un anticuerpo anti-Glc(a) tipo IgM; y comparar los niveles de los anticuerpos en la muestra de prueba con los de la muestra de control.
39. 39. El método según la reivindicación 37, en donde el método consiste en detectar en la muestra de prueba un anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc(a) tipo IgM y un anticuerpo anti-Glc (a) tipo IgM; y comparar los niveles de los anticuerpos en la muestra de prueba con los de la muestra de control.
40. 40. El método según la reivindicación 36, en donde la muestra de control consiste básicamente en una ¦ población de uno o más individuos cuya gravedad de esclerosis múltiple está definida por la evaluación Escala de Estado de Incapacidad Expandida (EDSS) , cambios en la calificación de EDSS o imagen de resonancia magnética (MRI) .
41. 41. El método según la reivindicación 36, en donde la muestra de prueba es un fluido biológico.
42. 42. El método según la reivindicación 41, en donde el fluido biológico es sangre entera, suero, plasma, liquido cerebroespinal, orina o saliva.
43. 43. El método según la reivindicación 41, en donde el fluido biológico es suero.
44. 44. El método según la reivindicación 36, en donde el sujeto es una mujer.
45. 45. El método según la reivindicación 36, en donde el sujeto es un hombre.
46. 46. El método según la reivindicación 36, que también consiste en seleccionar un agente terapéutico para tratar la esclerosis múltiple, el método consiste en: determinar si la muestra de prueba contiene anticuerpo anti Glucosa a; y seleccionar un agente terapéutico y un régimen de dosificación con base en los niveles relativos del anticuerpo en la muestra del sujeto y en la muestra de control .
47. 47. El método según la reivindicación 46, en donde el método también consiste en determinar si la muestra de prueba contiene anticuerpo anti-Glc (a 1-4)Glc(a); y comparar los niveles del anticuerpo anti-Glc (a l-4)Glc( ) en la muestra de prueba con los niveles de anticuerpo en una muestra de control que básicamente consiste en uno o más individuos cuyo estatus de esclerosis múltiple se conoce.
48. 48. Un kit para el diagnóstico de síntomas asociados con esclerosis múltiple, el kit consta de: un primer reactivo que específicamente detecta un anticuerpo anti-Glc (a 1-4 ) Glc (a) ; un segundo reactivo que específicamente detecta un segundo anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste de: anticuerpo anti-Glc (a) , anticuerpo anti-Glc (a 1-4 ) Glc (ß), anticuerpo anti-Glc (ß), anticuerpo anti-Gal (ß), anticuerpo anti-Glc (ß 1-4) Glc (ß 1-4) Glc (ß), anticuerpo anti-GlcNAc (ß 1- ) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-L-Araf (a) , anticuerpo antí-L-Rha (a) , anticuerpo anti-Gal (ß?- 3) [GlcNAc (ß1-6) ] GalNAc (a) , anticuerpo anti-Gal (ß?- 4 ) GlcNAc (a), anticuerpo anti-Gal (ß1-3) GalNAc (a) , anti-Gal (ß1-3) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-GlcA (ß) , anticuerpo anti-GlcA( ) y anticuerpo anti-Xyl (a) ; e instrucciones para el uso del kit.
49. 49. El uso del kit según la reivindicación 48, que también consta de un reactivo que específicamente detecta un anticuerpo tipo IgM.
50. 50. Un sustrato que comprende un reactivo , que detecta un anticuerpo específico para Glc (a 1-4) Glc (a).
51. 51. El sustrato según la reivindicación 50, que también comprende un reactivo que detecta un anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste de: anticuerpo anti-Glc (a 1-4) Glc (a), anticuerpo anti-Glc (a 1-4) Glc (ß), anticuerpo anti-Glc (ß), anticuerpo anti-Gal (ß) ; anticuerpo anti-Glc (ß 1-4) Glc (ß 1- ) Glc (ß), anticuerpo anti-GlcNAc (ß 1-4 ) GlcNAc (ß) , anticuerpo anti-L-Araf (a) , anticuerpo anti-L-Rha(oc), anticuerpo anti-Gal (ß1-3) [GlcNAc (ß1-6) ] GalNAc (a) , anticuerpo anti-Gal (ß1-4 ) GlcNAc ( ) , anticuerpo anti-Glc (a) , anticuerpo anti-Gal (ß1-3) GalNAc (a) , anticuerpo anti-Gal (ß?-3)GalNAc(P), anticuerpo anti-GlcA(P) o anticuerpo anti-GlcA(P) y anticuerpo anti-Xyl (a) .
52. 52. El sustrato según la reivindicación 50, que también comprende un reactivo que detecta un anticuerpo anti-Glc (a) .
53. 53. El sustrato según la reivindicación 50, que también comprende un reactivo que detecta un anticuerpo anti-L-Rha (a) .
54. 54. El sustrato según la reivindicación 52, que también comprende un reactivo que detecta un anticuerpo anti-L-Rha (a) .
55. 55. El sustrato según la reivindicación 50, en donde el sustrato es plano.
56. 56. El sustrato según la reivindicación 50, en donde el sustrato se proporciona como un pozo de una placa de microtitulación.
57. 57. El sustrato según la reivindicación 50, en donde el reactivo es un monosacárido o un oligosacárido.