ES2297248T3 - Procedimiento para diagnosticar esclerosis multiple. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para diagnosticar la esclerosis múltiple en un sujeto, el procedimiento comprendiendo: detectar un anticuerpo anti-Glc(alfa 1-4)Glc(alfa) en una muestra de ensayo obtenida de un sujeto; y comparar los niveles de dicho anticuerpo en dicha muestra de ensayo con una muestra de control; en el que dicha muestra de control se selecciona de uno o más individuos que tienen síntomas de esclerosis múltiple y tienen un estado de esclerosis múltiple conocido y uno o más individuos que no muestran síntomas de esclerosis múltiple; diagnosticando de esta forma la esclerosis múltiple a dicho sujeto.
Description
Procedimiento para diagnosticar esclerosis
múltiple.
La invención se refiere en general a un
procedimiento para el diagnóstico de la esclerosis múltiple y más
en particular a un procedimiento para el diagnóstico de la
esclerosis múltiple midiendo los niveles de anticuerpos contra
glucanos en una muestra biológica.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad
inflamatoria autoinmune crónica del sistema nervioso central. Es
una causa común de discapacidad crónica en adultos jóvenes. En los
pacientes que padecen EM el sistema inmunitario destruye la
cubierta de mielina de los axones en el cerebro y la médula espinal,
produciendo una variedad de patologías neurológicas. En la forma
más común de la EM, reincidente-remitente, a los
episodios de empeoramiento agudo de la función neurológica
(exacerbaciones, ataques) le siguen los periodos de recuperación
parcial o completa (remisiones) en los que no hay avance de la
enfermedad (estable). Se ha descrito que el noventa por ciento de
los pacientes con EM inicialmente presentan un síndrome clínicamente
aislado debido a una lesión desmielinizante inflamatoria en el
nervio óptico, tallo cerebral o médula espinal. Aproximadamente el
treinta por ciento de esos pacientes con un síndrome clínicamente
aislado evolucionan a la EM clínicamente confirmada en los 12 meses
siguientes después de la presentación. El posterior avance de la
enfermedad puede variar significativamente de un paciente a otro.
El avance puede ir desde un curso benigno a un curso de
reincidencia-remisión, progresivo crónico o
fulminante raro.
Un procedimiento de diagnóstico de la EM que
facilitara la detección precoz de la EM clínicamente confirmada
sería valioso tanto para tratar la enfermedad como para proporcionar
asesoramiento para el paciente. Por ejemplo, a los pacientes con
diagnóstico precoz de la EM clínicamente confirmada, se les podría
ofrecer tratamientos de modificación de la enfermedad que
recientemente se ha mostrado que son beneficiosos en la EM
precoz.
Los procedimientos actuales para la evaluación y
el seguimiento del avance de la EM se basan en la evaluación y
puntuación de la función de los pacientes en los ataques y las
discapacidades acumuladas durante los ataques. Una evaluación usada
para evaluar la EM es la Escala Ampliada del Estado de Discapacidad
(EDSS, por sus siglas en inglés) usada habitualmente. No obstante,
la EDSS se basa en una evaluación subjetiva de la función del
paciente.
Los procedimientos de diagnóstico también pueden
incluir el seguimiento de las lesiones cerebrales mediante Imágenes
por Resonancia Magnética (IRM) o el ensayo de Bandas OligoClonales
(BOC) en el Líquido Cefalorraquídeo (LCR). La IRM es un
procedimiento físico para evaluar las lesiones cerebrales y es caro
para el uso rutinario. Además, la correlación entre los resultados
de la IRM y la actividad de la enfermedad es pobre. La Punción
Cerebroespinal es un procedimiento invasivo desagradable que no es
adecuado para el uso rutinario. Además, ambos procedimientos
evalúan el daño sólo después de que se haya producido; ninguno de
los procedimientos puede predecir el inicio de ataques. Otra
desventaja del ensayo de las BOC en el LCR y de la IRM como modo de
diagnóstico de la EM es que las BOC o la IRM negativos no excluyen
la existencia de EM.
Se pone de manifiesto la necesidad de un
procedimiento que usa marcadores evaluados de forma objetiva para
el diagnóstico de la EM y para predecir el inicio de ataques en
pacientes que padecen EM.
La invención se basa en parte en el
descubrimiento de que los pacientes con EM tienen niveles elevados
en el suero de autoanticuerpos IgG, IgA, IgM que se unen a las
estructuras de glucanos Glc(\alpha) o Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) o
Glc(\alpha 1-4)Glc(\beta)
comparado con los niveles en el suero de estos autoanticuerpos en
individuos sanos. Además, los mismos autoanticuerpos específicos
para estas estructuras de glucanos son elevados durante el estado
de exacerbación comparado con el nivel observado en pacientes en
remisión y en individuos sanos. También se ha observado una
correlación alta entre los niveles en el suero de anticuerpo IgM
anti-Glc(\alpha) en mujeres con EM
(reincidente-remitente) clínicamente diagnosticadas
y la puntuación de la EDSS (Escala Ampliada del Estado de
Discapacidad) de las mujeres. La alta correlación indica que los
niveles de IgM anti-\alpha-Glucosa
en el suero pueden actuar como un marcador indirecto de criterio de
valoración clínico de la actividad de la enfermedad y como una
forma de seguir la eficacia de un fármaco en ensayos clínicos.
El seguimiento de los niveles de estos
anticuerpos en la sangre de pacientes que se sospecha que tienen EM
facilita el diagnóstico precoz rápido y barato de pacientes con EM y
la prescripción temprana de fármacos modificadores de la
enfermedad. El seguimiento de los niveles de esos anticuerpos en la
sangre de pacientes con EM confirmada también permitirá el
seguimiento rápido y barato de los efectos de los fármacos
prescritos y la detección precoz de ataques, permitiendo el
tratamiento profiláctico temprano.
Entre las ventajas adicionales de la invención
están que la existencia de EM en pacientes se puede determinar en
una etapa temprana de la enfermedad, cuando sus síntomas se pueden
parecer a muchas otras enfermedades de tipo EM. El diagnóstico
precoz permite a los médicos tratar la EM más pronto en el curso de
la enfermedad, minimizando o previniendo de esta forma el daño
causado por la destrucción de la mielina y las discapacidades
causadas por esta destrucción. Además, los procedimientos descritos
en la presente invención permiten a los médicos hacer el
seguimiento de los pacientes con EM de forma regular, con el fin de
evaluar la gravedad de la enfermedad, hacer el seguimiento de la
terapia y cambiar el tratamiento cuando aparecen los signos de que
se acercan ataques. Por ejemplo, un aumento de los biomarcadores
indicativo de un ataque de EM puede justificar la administración de
metilprednisona al paciente, que es un agente antiinflamatorio
general administrado habitualmente durante los ataques.
Los procedimientos descritos en el presente
documento también se pueden usar para seleccionar el mejor
tratamiento con fármacos para un paciente específico. Por ejemplo,
un paciente puede empezar el curso del tratamiento con un fármaco
determinado y el cambio en los niveles de marcadores será indicativo
de la eficacia del fármaco. El retroceso de los niveles de
marcadores a un estado de enfermedad indica que el fármaco está
perdiendo eficacia y el fármaco se puede sustituir por un segundo
fármaco después de un periodo de tiempo corto. De lo contrario, un
médico tendría que esperar a los siguientes ataques para determinar
si el fármaco es eficaz para el paciente específico.
Los biomarcadores descritos en el presente
documento pueden actuar además como criterios de valoración
indirectos para evaluar la respuesta de un paciente al fármaco
ensayado de una forma barata. Un criterio de valoración indirecto
basado en un ensayo serológico facilita el ensayo eficaz de
potenciales fármacos nuevos para la EM.
En un aspecto, la invención se caracteriza por
un procedimiento de diagnóstico de la esclerosis múltiple en un
sujeto. El procedimiento incluye proporcionar una muestra de ensayo
de un sujeto y detectar en la muestra de ensayo al menos un
biomarcador que es un anticuerpo que se une específicamente a una
estructura de glucano. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un
anticuerpo anti-Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\beta), un anticuerpo
anti-Glc(\beta), un anticuerpo
anti-Gal(\beta); un anticuerpo
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta), un anticuerpo
anti-GlcNAc(\beta
1-4)GlcNAc(\beta), un anticuerpo
anti-L-Araf(\alpha), un
anticuerpo
anti-L-Rha(\alpha), un
anticuerpo anti-Gal(\beta
1-3)[GlcNAc(\beta
1-6)]GalNAc (\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-4)GlcNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-3)GalNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-3)GlcNAc(\beta), un anticuerpo
anti- GlcA(\beta), o un anticuerpo
anti-GlcA(\beta), o un anticuerpo
anti-Xyl(\alpha). Los niveles de anticuerpo
o anticuerpos en la muestra de ensayo se comparan con una muestra
de control que se obtiene de uno o más individuos que muestran
síntomas de esclerosis múltiple y de los que tienen síntomas de
esclerosis múltiple con un estado de esclerosis múltiple conocido o
de un individuo o individuos que no muestran síntomas de esclerosis
múltiple. El estado de EM puede incluir, por ejemplo,
exacerbaciones, ataques, remisiones y etapas estables de la
enfermedad.
En diferentes realizaciones, se detectan al
menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18
de estos anticuerpos. En algunas realizaciones, el anticuerpo
detectado en la muestra de ensayo es un anticuerpo
anti-Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Glc(\alpha1-4)Glc(\alpha)
o tanto un anticuerpo anti-Glc(\alpha)
como un anticuerpo anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha).
En algunas realizaciones, la muestra de control
consiste en una población de uno o más individuos que no muestran
síntomas de una esclerosis múltiple. En otras realizaciones, la
muestra de control consiste en una población que no muestra
síntomas de una esclerosis múltiple. La presencia de EM en la
muestra de control se puede determinar usando técnicas conocidas en
la técnica, p. ej., una evaluación de la Escala Ampliada del Estado
de Discapacidad (EDSS) o una evaluación mediante Imagen por
Resonancia Magnética (IRM), o ambas.
La muestra de ensayo puede ser, p. ej., un
fluido biológico. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen, p.
ej., sangre entera, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina o
saliva.
El sujeto puede ser una mujer o un hombre.
El anticuerpo detectado puede ser, p. ej., un
anticuerpo de tipo IgM o de tipo IgA o IgG.
En algunas realizaciones, el tipo de esclerosis
múltiple detectada es la esclerosis múltiple precoz.
También se describe un procedimiento para
diagnosticar una exacerbación de la esclerosis múltiple en un
sujeto. El procedimiento incluye proporcionar una muestra de ensayo
de un sujeto y detectar un anticuerpo de tipo IgM
anti-Glc(\alpha) y/o un anticuerpo de tipo
IgM anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) en la muestra de
ensayo. Los niveles del anticuerpo en la muestra de ensayo se
comparan con una muestra de control, que se obtiene de uno o más
individuos cuyo estado de esclerosis múltiple es conocido.
La muestra de control consiste en una población
de uno o más individuos que no muestran síntomas de una exacerbación
de la esclerosis múltiple y cuyo estado de la esclerosis múltiple
está en remisión. Se diagnostica en el sujeto una exacerbación de
la esclerosis múltiple si se encuentra más anticuerpo
anti-Glc(\alpha) o anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) en la muestra de
ensayo que en la muestra de control. La muestra de control consiste
en una población de uno o más individuos que muestran síntomas de
una exacerbación de la esclerosis múltiple, y se diagnostica una
exacerbación de la esclerosis múltiple en el sujeto si los niveles
de anticuerpo de tipo IgM anti-Glc(\alpha)
y/o anticuerpo de tipo IgM anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) están presentes en
cantidades similares en la muestra de ensayo y la muestra de
control.
La muestra de ensayo puede ser, p. ej., un
fluido biológico. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen, p.
ej., sangre entera, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo o
saliva.
El sujeto puede ser una mujer o un hombre.
El anticuerpo detectado puede ser, p. ej., un
anticuerpo de tipo IgM o IgA o de tipo IgG.
El diagnóstico es un diagnóstico precoz de la
exacerbación de la esclerosis múltiple.
El sujeto se ha tratado con un agente
terapéutico para la EM, p. ej., interferón beta o acetato de
glatirámero administrado por vía subcutánea.
También se describe un procedimiento para
evaluar la gravedad de la enfermedad esclerosis múltiple en un
sujeto. El procedimiento incluye proporcionar una muestra de ensayo
de un sujeto y determinar si la muestra de ensayo contiene un
anticuerpo de tipo IgM anti-Glc(\alpha) y/o
un anticuerpo de tipo IgM anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha). La cantidad de
anticuerpo en la muestra de ensayo se compara con la cantidad del
anticuerpo en la muestra de control, la cual se obtiene de uno o
más individuos cuya gravedad de la enfermedad esclerosis múltiple se
conoce.
La muestra de control consiste en una población
de uno o más individuos cuya gravedad de la enfermedad esclerosis
múltiple está definida por la evaluación de Escala Ampliada del
Estado de Discapacidad (EDSS), cambios en la puntuación de la EDSS
o una evaluación mediante Imagen por Resonancia Magnética (IRM).
La muestra de ensayo puede ser, p. ej., un
fluido biológico. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen, p.
ej., sangre entera, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina o
saliva.
Si se desea el procedimiento puede incluir
además seleccionar un agente terapéutico para tratar la esclerosis
múltiple seleccionando un agente terapéutico y un régimen de
dosificación basados en los niveles relativos del anticuerpo o
anticuerpos en la muestra de ensayo y la muestra de control.
Los niveles más altos de anticuerpos en la
muestra de ensayo respecto a la muestra de control indican la
selección de un agente terapéutico y un régimen de dosificación que
es la administración subcutánea de interferón beta (BETAFERON®,
AVONEX®, REBIF®) o la administración subcutánea de acetato de
glatirámero (COPAXONE®).
El sujeto puede ser una mujer o un hombre.
La invención también proporciona un kit para
diagnosticar síntomas asociados con la esclerosis múltiple. El kit
incluye un primer reactivo que detecta específicamente un anticuerpo
anti-Glc(\alpha), un segundo reactivo que
detecta específicamente un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) y indicaciones para
usar el kit. El kit incluye opcionalmente un reactivo que detecta
específicamente un anticuerpo de tipo IgM.
Dentro de la invención también están los
sustratos que incluyen reactivos que detectan específicamente los
anticuerpos descritos en el presente documento, p. ej., un
anticuerpo anti-Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\beta), un anticuerpo
anti-Glc(\beta), un anticuerpo
anti-Gal(\beta); un anticuerpo
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta), un anticuerpo
anti-GlcNAc(\beta
1-4)GlcNAc(\beta), un anticuerpo
anti-L-Araf(\alpha), un
anticuerpo
anti-L-Rha(\alpha), un
anticuerpo anti-Gal(\beta
1-3)[GlcNAc(\beta
1-6)]GalNAc (\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-4)GlcNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-3)GalNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-3)GlcNAc(\beta), un anticuerpo
anti-GlcA(\beta) o un anticuerpo
anti-GlcA(\beta) o un anticuerpo
anti-Xyl(\alpha). El sustrato puede ser,
p. ej., plano.
Además se describe un procedimiento para
seleccionar un agente terapéutico para tratar la esclerosis
múltiple. El procedimiento incluye proporcionar una muestra de
ensayo de un sujeto diagnosticado con, o con riesgo de esclerosis
múltiple y determinar si la muestra de ensayo contiene un anticuerpo
anti-Glc(\alpha). Los niveles del
anticuerpo en la muestra de ensayo se comparan con los niveles de
anticuerpo en la muestra de control que consiste en uno o más
individuos cuya gravedad de la enfermedad esclerosis múltiple se
conoce. Se selecciona un agente terapéutico y un régimen de
dosificación basados en los niveles relativos del anticuerpo en la
muestra del sujeto y la muestra de
control.
control.
El procedimiento incluye además determinar si la
muestra de ensayo contiene un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) y comparar los
niveles del anticuerpo anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) en la muestra de
ensayo con los niveles de anticuerpo en una muestra de control que
consiste en uno o más individuos cuya gravedad de la enfermedad
esclerosis múltiple se conoce.
La muestra de control consiste en uno o más
individuos cuyo estado no es esclerosis múltiple o esclerosis
múltiple estable.
Salvo que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado como lo entiende normalmente una
persona experta en la materia a la que pertenece esta invención.
Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o
equivalentes a los descritos en el presente documento en la
práctica o en el ensayo de la presente invención, a continuación se
describen procedimientos y materiales adecuados. En el caso de
conflicto, controlará la presente memoria descriptiva, incluidas las
definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son
sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y
reivindicaciones.
La Fig. 1 muestra el árbol de decisión para
determinar que un paciente que se sospecha que tiene EM tiene
realmente EM.
La Fig. 2 muestra el árbol de decisión para
seleccionar un fármaco y dosis para un paciente con EM basado en
los niveles de anticuerpos anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) o
anti-Glc(\alpha).
La Fig. 3 muestra el árbol de decisión para la
predicción y un diagnóstico precoz de ataques en pacientes con
EM.
La Fig. 4 es una Tabla que muestra la
fluorescencia relativa de la unión de diferentes anticuerpos
antiglucanos en pacientes con EM así como en individuos normales.
Las estructuras de glucanos se presentan en la línea superior de la
Tabla en sintaxis de LINEARCODE®.
La Fig. 5 muestra la señal media y mediana para
los anticuerpos antiglucanos contra diferentes glucanos de sueros
extraídos de pacientes con EM frente a sueros de control normales.
Las estructuras de glucanos se presentan en sintaxis de
LINEARCODE®.
La Fig. 6 es una gráfica que muestra las
diferencias entre las señales medias de individuos con EM y sanos,
las barras representan la desviación típica. Las estructuras de
glucanos se presentan en sintaxis de LINEARCODE®.
La Fig. 7A es una gráfica que muestra la señal
media de la unión de IgM anti-Glc(\alpha)
(Glucano nº 11) y Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) (Glucano nº 12) en
poblaciones con EM y sanas.
La Fig. 7B es una gráfica que muestra la señal
media de la unión de IgM anti-Glc(\alpha)
(Glucano nº 11) y Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) (Glucano nº 12) en
poblaciones de pacientes con EM con ataque, pacientes con EM
estables y sanos.
La Fig. 8 es una gráfica que muestra la
correlación entre la fluorescencia relativa de la adhesión de
anticuerpos IgM anti-glucosa alfa en muestras de
pacientes con EM positivos para
anti-Glc(\alpha) (cuadro izquierdo),
pacientes con EM negativos (cuadro derecho) y sus niveles de
EDSS.
La Fig. 9 es una gráfica que muestra la
estabilidad temporal de la señal de la unión de anticuerpos
antiglucanos IgM, IgG e IgA a lo largo de 13 semanas en 7
individuos sanos.
La Fig. 10A-10B muestran la
ordenación del glucano; estructura química, especificidad de la
interacción con lectina y reproducibilidad. La Fig. 10A muestra un
p-amino-fenil-\beta-sacárido
covalentemente unido por su extremo reductor a una superficie
sólida mediante un conector.
La Fig. 10B muestra la reproducibilidad de un
lote a otro de la unión de WGA biotinilado a la cadena de glucano.
Se ensayaron simultáneamente tres lotes separados de matrices con
WGA biotinilado.
La Fig. 10C muestra un ensayo de competición
con ConA para unir Man(\alpha). Se incubaron
concentraciones crecientes de Manosa o Gal(\beta
1-4)Glc solubles con ConA biotinilado (1,5
\mug/ml) durante 1 h, y se detectaron con Estreptavidina
conjugada con Europio.
La Fig. 10D muestra la especificidad de la
unión de la lecitina a diferentes anómeros. Unión de ConA al control
negativo de glicerol (19), Man(\alpha) (26) y
Man(\beta) (27). Unión de GSI a -Gal(\alpha) (1),
Gal(\beta) (2), GalNAc(\alpha) (7), y
GalNac(\beta) (8).
La Fig. 10E muestra la reproducibilidad de una
placa a otra de la matriz de glucanos. Se pusieron sondas con WGA
biotinilado en 5 placas idénticas que presentaban
GlcNac(\beta).
La Fig. 11 muestra el perfil de unión de
glucanos de una población humana sana. Unión de anticuerpo
anti-carbohidrato a variados glucanos (véase la
Tabla 5 para las estructuras de los glucanos) en muestras de suero
de 72 individuos medido con Proteína A biotinilada. Cada punto
representa la media de dos experimentos, cada uno hecho por
cuadruplicado. La caja incluye señales de 50% de la población. Las
líneas gruesas y finas en la caja representan los valores medio y
mediano, respectivamente. El límite de la caja más cercano a cero
indica el percentil 25, y el borde de la caja más lejano de cero
indica el percentil 75. Los bigotes encima y debajo de la caja
indican los percentiles 90 y 10. El nivel de señal no específica
medido se definió empíricamente; los glucanos contra los cuales se
encontró que los niveles de anticuerpo eran relativamente bajos y
muy variables entre experimentos se designaron para definir el
nivel de fluorescencia de fondo (no se muestra). Se calculó el
valor de la señal media para estos glucanos y se restó de la señal
obtenida para cada muestra de suero y glucano particular. La
fluorescencia de fondo media era 3x10^{5} URF (unidades relativas
de fluorescencia). TBST es una solución salina tamponada Tris con
Tween 20 (véase el protocolo experimental).
La Fig. 12 muestra las señales de sueros
individuales frente a una serie de glucanos. La unión del anticuerpo
anti-glucano medida en unidades relativas de
fluorescencia (URF) se transformó usando un procedimiento de tipo
ecualización de histograma que usa una cartografía monotónica, no
lineal. De este modo, los valores de URF se reasignaron a un
intervalo entre 0 (azul) y 255 (rojo). Los datos se agruparon usando
un algoritmo de templado simulado.
La Fig. 13A-13C muestran el
perfil de afinidad de unión de los anticuerpos purificados (A)
anti-L-Rha(\alpha), (B)
anti-GlcNAc(\alpha) y anti-
GlcNAc(\beta 1-4)GlcNAc (\beta) y
(C) anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta) y
anti-GlcNAc(\beta
1-4)GlcNAc(\beta) a una matriz de 33
glucanos. Las estructuras de glucanos se describen en la Tabla 5.
La cantidad de anticuerpo unido se midió usando anticuerpo IgG
anti-humano de cabra biotinilado.
Las Figs.14A y 14B muestran la especificidad del
anticuerpo anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta). (A) Inhibición
competitiva de la unión del anticuerpo
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta). Inhibición de la
unión de afinidad del anticuerpo purificado
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta) a
p-amino-fenil-\beta-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta) inmovilizado en la
superficie del pocillo, en función de la concentración de
Glc(\beta 1-4)Glc(\beta
1-4)Glc o Gal(\beta
1-4)Glc. La cantidad de anticuerpo unido se
midió usando anticuerpo IgG anti-humano de cabra
biotinilado. (B) Unión de los anticuerpos
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta) (A) y
anti-L-Rha(\alpha) (B) a su
sacárido cognado después de incubación con celulosa cristalina o
amorfa. La cantidad de anticuerpo unido se midió usando anticuerpo
IgG anti-humano de cabra biotinilado.
Las Figs. 15A-15C son
representaciones gráficas de las uniones de los isotipos IgG, IgA e
IgM de individuos sanos a los glucanos indicados.
La Fig. 16A es una representación de la matriz
de glucanos usada para examinar los sueros de pacientes con
aterosclerosis que padecen angina inestable o estable. Los glucanos
contra los cuales se midieron niveles de anticuerpos
significativamente diferentes en los diferentes grupos de pacientes
se marcan con cuadrados negros. Los glucanos se listan en la Tabla
4.
La Fig. 16B es una representación gráfica que
muestra los niveles de anticuerpos contra los glucanos nº 2 y nº 29
en tres grupos de pacientes; inestables, estables y no
ateroscleróticos. La caja incluye señales de 50% de la población.
Las líneas gruesas y finas en la caja representan los valores medio
y mediano, respectivamente. El límite de la caja más cercano a cero
indica el percentil 25 y el límite de la caja más lejano de cero
indica el percentil 75. Los bigotes por encima y debajo de la caja
indican los percentiles 90 y 10.
La Fig. 17 es un histograma que muestra el
número de muestras en los tres grupos de pacientes positivos para
los anticuerpos anti-IgA contra el glucano nº 2 y
glucano nº 29.
La Fig. 18A es un histograma que muestra la
distribución de los niveles de anticuerpos contra los glucanos nº 2
y nº 15 en los tres grupos de pacientes. La caja incluye señales de
50% de la población. Las líneas gruesas y finas en la caja
representan los valores medio y mediano, respectivamente. El límite
de la caja más cercano a cero indica el percentil 25 y el límite de
la caja más lejano de cero indica el percentil 75. Los bigotes por
encima y debajo de la caja indican los percentiles 90 y 10.
La Fig. 18B es un histograma que muestra el
número de muestras en los tres grupos de pacientes positivos para
los anticuerpos anti-IgA contra el glucano nº 2 o el
glucano nº 15.
La Fig. 19 es una representación gráfica de la
especificidad y sensibilidad basados en los niveles de anticuerpos
anti-IgA contra el glucano nº 2, el glucano nº 15,
el glucano nº 17 y el glucano nº 49. A - aterosclerosis; S -
estable; US - inestable; NA - no aterosclerosis.
La Fig. 20 es un histograma que muestra el
perfil de unión de células CD4+ de un solo individuo a diferentes
glucanos. Las estructuras de glucanos se representan en sintaxis de
LINEARCODE®.
La Fig. 21A es una gráfica que muestra la
fluorescencia relativa mediana para las células CD4+ de cada uno de
siete individuos a las estructuras de glucanos representadas en
sintaxis de LINEARCODE®.
La Fig. 21B muestra las señales de los sueros
individuales contra una serie de glucanos. La unión del anticuerpo
antiglucano medida en unidades relativas de fluorescencia (URF) se
transformaron usando un procedimiento de tipo ecualización de
histograma que usa una cartografía monotónica, no lineal. De esta
forma, los valores de URF se reasignaron a un intervalo entre 0
(azul) y 255 (rojo). Los datos se agruparon usando un algoritmo de
templado simulado.
Los procedimientos proporcionados en la presente
invención permiten el diagnóstico precoz de la esclerosis múltiple
inicial y recurrente usando niveles de biomarcadores evaluados de
forma objetiva. El árbol de decisión actual para el diagnóstico de
un paciente con EM se describe en la Fig. 1. Un paciente con un
empeoramiento agudo de la función neurológica debe ser
diagnosticado inicialmente como un paciente con EM confirmada antes
de poder ser elegido para un tratamiento con fármacos modificadores
de la enfermedad. El médico deberá determinar si el paciente tiene
síntomas parecidos a los de la EM (tales como accidente
cerebrovascular en joven, lupus, deficiencia de vitamina
B-12, síndrome anti-fosfolípido,
migraña grave) o si realmente tiene EM. El paciente tendrá que
experimentar un segundo empeoramiento agudo de la función
neurológica (ataque) antes de ser diagnosticado como un paciente
con EM y poder empezar con el tratamiento crónico con un agente
terapéutico para la EM tal como interferón beta o acetato de
glatirámero.
Actualmente, los médicos están usando la IRM
para identificar la existencia de lesiones cerebrales y/o ensayando
las bandas oligoclonales (BOC) en el líquido cefalorraquídeo (LCR).
Si la IRM da un resultado claro relacionado con la existencia de
lesiones cerebrales o la presencia de BOC en el LCR, el médico puede
iniciar el tratamiento inmediatamente con el fin de prevenir
lesiones cerebrales silenciosas. Actualmente un diagnóstico de EM
completo sólo se hace después del segundo ataque. En el caso de que
la IRM no de un resultado claro o no haya BOC en el LCR de los
pacientes, no se diagnostica EM y el tratamiento se retrasa hasta
después de un segundo
ataque.
ataque.
El procedimiento descrito en el presente
documento se puede realizar extrayendo sangre de un paciente con
empeoramiento agudo de la función neurológica y que se sospecha que
tiene EM. El procedimiento puede identificar la existencia de EM
midiendo el nivel de IgM anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha). Si el nivel de al
menos uno de estos anticuerpos es significativamente mayor que el
nivel medio de estos anticuerpos en el suero de individuos sanos,
el paciente se diagnostica como un paciente con EM sin necesidad de
esperar un segundo ataque. Además, el diagnóstico rápido permite
que el tratamiento empiece inmediatamente.
Una primera línea del tratamiento para la EM es
el interferón \beta (p. ej., INF\beta-1a e
INF\beta-1b). La evaluación actual de la eficacia
y la dosificación requerida del fármaco se basa en el seguimiento
continuado de varias puntuaciones clínicas. Actualmente, la
puntuación de EDSS y su cambio con el tiempo (p. ej., comparando la
diferencia de la EDSS cada 3-6 meses) es el
parámetro clínico principal para la gestión de la enfermedad. Un
componente importante de la evaluación es el nivel de fatiga y
depresión experimentados por el paciente. La fatiga y/o depresión
pueden ser un síntoma de la EM, como enfermedad autoinmune, o un
efecto secundario del uso de interferón beta. Identificar la causa
de la fatiga es importante para gestionar el tratamiento. Por
ejemplo, si la fatiga es un resultado de un efecto secundario del
interferón, el médico tendrá que considerar la disminución de la
dosificación o incluso el cambio por otro fármaco. Sin embargo, si
la fatiga se debe a los síntomas de la EM, el médico tendrá que
considerar el aumento de la dosificación de fármaco (véase la
Figura 2).
El cribado de la sangre del paciente y la
determinación del nivel de biomarcadores descritos en el presente
documento, p. ej., los anticuerpos IgM
anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) del presente
documento, permite el seguimiento preciso de la terapia. Las
disminuciones significativas de los niveles de anticuerpos indican
que el paciente está respondiendo bien al fármaco dado.
\vskip1.000000\baselineskip
Actualmente no hay forma de predecir la
aparición de ataques en los pacientes con EM. La IRM y la evaluación
clínica de los pacientes sólo pueden poner de manifiesto el daño
que ya se ha producido. La medición periódica del nivel de algunos
anticuerpos antiglucanos (por ejemplo IgM
anti-Glc(\alpha) o IgM anti
Glc(\alpha 1-4)) en la sangre del
pacientes de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente
documento, permite que los médicos identifiquen ataques que van a
venir basándose en un aumento de los niveles de estos anticuerpos.
Los niveles de estos anticuerpos son significativamente mayores en
la sangre de pacientes con situaciones de ataques de EM frente a
pacientes en un estado estable (véase la Fig. 7). Tras la detección
de un aumento de estos anticuerpos, el médico puede iniciar un
tratamiento agresivo con esteroides para reducir la inflamación y
prevenir el daño a la mielina (véase la
Fig. 3).
Fig. 3).
También se proporcionan en el presente documento
procedimientos para identificar y evaluar individuos con
aterosclerosis con riesgo de angina estable e inestable, usando
anticuerpos biomarcadores específicos para glucanos, así como el
uso de glucanos inmovilizados para detectar células de interés.
En esta solicitud se discuten diferentes
estructuras de glucanos. Los glucanos se presentan en la forma
condensada de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada
(IUAC) para la nomenclatura y representación de carbohidratos o en
la sintaxis de LINEARCODE®, para los principios de la sintaxis de
LinearCode (Véase Banin E. Neuberger Y. Altshuler Y. Halevi A.
Inbar O. Dotan N. and Dukler A. (2002) "A Noval Liner Code
Nomenclature for complex Carbohydrates". Trends in
Glycoscience and Glycotechnology Vol. 14 No. 77 pp.
127-137). La traducción de la representación de
LINEARCODE a IUPAC está en la Tabla 1. Todas las estructuras de
glucanos que se discuten en esta descripción, salvo que se mencione
lo contrario, están conectadas en la forma anomérica \alpha o
\beta indicada por el conector a una fase sólida como se describe
en la Fig. 10A.
La invención se ilustrará en los siguientes
ejemplos no limitantes.
\newpage
Ejemplo
1
Se obtuvo un perfil de anticuerpos antiglucanos
(Igs) usando matrices de GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel,
nº de cat. 9100). Las matrices se construyeron usando procedimientos
descritos en el documento WO00/49412. Se compararon los perfiles de
anticuerpos antiglucanos de 40 pacientes con esclerosis múltiple y
40 donantes de sangre normales de sexo y edades acorde con los
anteriores.
Todas las muestras de suero se ensayaron usando
placa GlycoChip® (Glycominds Ltd., Lod, Israel, nº de cat. 9100),
que era una matriz de mono y oligosacáridos unidos covalentemente a
una placa de microvaloración de 384 pocillos de volumen reducido.
Los mono y oligosacáridos presentados en la matriz se listan en la
Fig. 4. En la Tabla 1 se puede encontrar una traducción de la
sintaxis de LinearCode^{TM} usada para describir la estructura de
glucanos a la nomenclatura IUPAC.
El suero de los voluntarios sanos y los
pacientes voluntarios con EM que habían firmado un consentimiento
informado, se recogieron en tubos que contenían gel, revestidos de
silicona y al vacío (Estar Technologies nº cat. 616603GLV). Se
separó el suero de las células sanguíneas y se mantuvo congelado a
-25ºC hasta su uso. Se analizaron en dos experimentos separados,
cada uno repetido dos veces en días separados.
Los sueros de los voluntarios se diluyeron
(1:20) en TBST dispensado en una placa GlycoChip® usando un robot
Tecan Genesis Workstation 200 (10 \mul/pocillo) y se incubaron 30
min a 25ºC. Había 4 repeticiones para cada glucano y muestra de
suero en la placa.
Las placas se lavaron con 250 \mul/pocillo de
tampón de alta concentración salina (KNa 0,15 M pH 7,2, NaCl 2 M,
MgSO_{4} 0,085 M, Tween 20 al 0,05%) en un lavador de placa
automático (Tecan, PowerWasher^{TM}). Se dispensaron manualmente
10 \mul/pocillo de proteína A biotinilada (ICN
62-265), en TBST 1 \mug/ml, y las placas se
incubaron durante 30 min a 25ºC. La placa se lavó otra vez con
tampón de alta concentración salina.
Se añadió manualmente europio conjugado con
estreptavidina, Wallac, AD0062 (1 \mul/ml, 10 \mul/pocillo)
seguido de una incubación durante 30 min a 25ºC en la oscuridad. Se
repitió el lavado de las placas con tampón de alta concentración
salina. Se añadió tampón de potenciación Delfia^{TM} (Wallac,
730232, 10 \mul/pocillo) a los pocillos y las placas se incubaron
al menos 30 min en la oscuridad. Se leyó la fluorescencia de los
pocillos con Victor 1420 (Wallac) usando los ajustes de
fluorescencia resuelta en el tiempo Emi. 612 nm y Exc. 340 nm.
Los perfiles de todos los pacientes ensayados se
muestran en la Fig. 4. Las 40 líneas superiores (EM) describen el
nivel de anti-carbohidratos de las muestras de EM, y
las 40 líneas inferiores (CN) describen el nivel de
anti-carbohidrato de muestras de población de
control normal. Los valores presentados son valores absolutos sin
reducción del valor de fondo. Puesto que la detección de anticuerpos
unidos se hizo con proteína A biotinilada, que se une a IgG, IgA e
IgM, la señal representa la unión total de los anticuerpos de todos
los subtipos IgG, IgA e
IgM.
IgM.
Una comparación entre los valores medio y
mediano de los anticuerpos anti-carbohidratos en las
poblaciones con EM y normal pone de manifiesto diferencias
significativas entre las muestras de los pacientes con EM y las
muestras de la población normal, véase la Fig. 5. Un ejemplo de una
diferencia principal observada entre los dos grupos es la señal
media contra el glucano Ga4Gb. Un ensayo t mostró que la diferencia
es estadísticamente muy significativa (\alpha=0,05; p<0,001).
Otro ejemplo es Ab3(GNb6)ANa (\alpha=0,05;
p<0,001). Hay diferencias significativas entre las medianas de
las señales de población con EM y normal en relación con los
anticuerpos unidos a los siguientes glucanos: Glc(\alpha),
Glc(\alpha 1-4)Glc(\alpha),
Glc(\alpha 1-4) Glc(\beta),
Glc(\beta), Gal(\beta), Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta),
GlcNAc(\beta 1-4) GlcNAc(\beta),
L-Araf(\alpha),
L-Rha(\alpha), Gal(\beta
1-3)[GlcNAc(\beta1-6)]GalNAc(\alpha),
Gal(\beta
1-4)GlcNAc(\alpha),
Gal(\beta
1-3)GalNAc(\alpha),
Gal(\beta
1-3)GlcNAc(\beta),
GlcA(\beta), GlcA(\beta), Xyl(\alpha).
La señal de los anticuerpos unidos en el grupo de EM es mayor que la
señal en el grupo de control normal.
La Fig. 6 presenta la diferencia entre los
valores de unión medios de anticuerpos antiglucanos entre las
poblaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
2
Se usó una matriz de glucanos para buscar
biomarcadores entre el repertorio de anticuerpos de unión a glucanos
del suero humano para diferenciar entre una población sana y un
grupo de pacientes con esclerosis múltiple (EM), y entre pacientes
con EM en etapas de exacerbación y de remisión. Este ejemplo
demuestra que se encuentran dos anticuerpos IgM,
anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha), con niveles
significativamente superiores en pacientes con EM que en gente sana
(sensibilidad de 60% y 93%, respectivamente, y en pacientes con EM
en una etapa de exacerbación con respecto a pacientes en una etapa
de remisión (sensibilidad y especificidad de 89% y 71%,
respectivamente). También se proporciona un perfil de anticuerpos
antiglucanos para una población sana, que incluye un intervalo de
variación durante un intervalo de 13 semanas.
La estabilidad temporal del perfil de los
anticuerpos antiglucanos a lo largo de 13 semanas en individuos
aparentemente sanos era alta. Los niveles bajos de IgM
anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) en una población
normal, y sus niveles altos en pacientes de EM, y la alta
estabilidad temporal de anticuerpos antiglucanos sugiere que estas
IgM anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) pueden servir como
biomarcador para el diagnóstico precoz, la prescripción temprana de
fármacos, el seguimiento de los efectos del fármaco y la detección
precoz de ataques.
Todas las muestras de suero se ensayaron usando
GlycoChip® (Glycominds Ltd., Lod, Israel). Los glucanos se unieron
covalentemente a la superficie de plástico por un espaciador como se
ha descrito previamente (documento WO 02/064556). En la Tabla 1 se
proporciona una lista que describe los mono y oligosacáridos
ensayados.
Se obtuvieron muestras de sangre de donantes de
sangre aparentemente sanos en un protocolo de consentimiento
informado aprobado por los comités éticos de estudios humanos de
Helsinki del Belinson Medical Center en Tel-Aviv,
Israel, y el Carmel Medical Center en Haifa, Israel. Se recogieron
muestras de sangre de pacientes con EM admitidos en el Multiple
Sclerosis Clinic en el Carmel Medical Center en Haifa, Israel. Las
muestras de sangre se recogieron en tubos recubiertos de silicona
al vacío que contenían gel para la separación del suero del coágulo
de sangre (Estar Technologies). Después de la coagulación de la
sangre, el suero se separó por centrifugación y se recogió. Las
muestras se almacenaron congeladas a -25ºC hasta su uso.
El volumen de todas las soluciones añadidas a la
matriz de glucanos era 10 \mul/pocillo. Los sueros se diluyeron
(1:20; concentración de saturación) en Tris-HCl 0,15
M pH 7,2, MgSO_{4} 0,085 M, Tween 20 al 0,05% (TBST) que contenía
BSA al 1% (Sigma), se dispensaron en las placas de matrices de
glucanos usando un sistema de manejo automático Tecan Genesis
Workstation 200, y se incubaron durante 60 min a 37ºC. Después las
placas se lavaron con 250 \mul/pocillo de solución salina
tamponada de fosfato con Tween 20 al 0,05% (PBST, Sigma) en un
lavador de placa automático (Tecan, PowerWasher^{TM}). En este
punto se añadieron los siguientes reactivos, diluidos en TBST con
BSA al 1%, usando un dispensador Multidrop 384 (Thermo Labsystems) y
se incubaron durante 60 min a 37ºC: para la determinación de IgG,
IgA e IgM - la respectiva subclase específica del anticuerpo Ig
anti-humano de cabra biotinilado (Jackson, PA,
EE.UU.) con 2,8 \mug/ml, 3 \mug/ml y 0,9 \mug/ml,
respectivamente; para la determinación total de Ig - Proteína A
biotinilada (1 \mug/ml, ICN Biomedicals). Después del lavado con
PBST, se añadió europio conjugado con estreptavidina (0,1 \mug/ml)
diluido en TBST con BSA al 1% a cada pocillo seguido de una
incubación durante 30 min a 37ºC en la oscuridad, y se lavó con
PBST. Después se añadió la solución de potenciación Delfia^{TM} a
los pocillos y las placas se incubaron durante 30 a 45 min en la
oscuridad a temperatura ambiente. La fluorescencia de los pocillos
se leyó con un lector de placas Victor 1420 (Wallac, Finlandia)
usando los parámetros de fluorescencia resuelta en el tiempo de
340/612 nm (Excitación/Emisión).
Se obtuvieron muestras de suero de pacientes con
EM admitidos en un ambulatorio para el examen regular después de
firmar los formularios de consentimiento informado. El grupo de
pacientes era 80% mujeres, lo que reflejaba aproximadamente la
relación de género en la población general con EM. De acuerdo con
los datos publicados (Ritchie y col., J. Clin. Lab. Anal.
12:363-70, 1998), se observaron niveles
significativamente superiores de IgM (pero no de IgG ni de IgA) en
los sueros tanto de mujeres sanas como con EM, comparado con hombres
(no se muestra). Por lo tanto, el análisis se limitó a
subpoblaciones de mujeres sanas y con EM. Los sueros de los
pacientes con EM se cribaron primero con 54 glucanos (Tabla 1) para
la presencia de anticuerpos antiglucanos IgG, IgM e IgA, con el
propósito de identificar marcadores que confirmarían los pacientes
con sólo sucesos de desmielinización aguda en el entorno de la EM,
y marcadores que distinguirían entre pacientes durante las etapas
de exacerbación y remisión de la enfermedad. El experimento se
repitió dos veces usando 5 de los 54 glucanos entre los cuales se
encontraron algunas diferencias entre los grupos en la ronda
inicial.
Se encontró una diferencia estadísticamente
significativa y reproducible en los niveles de anticuerpos IgM
anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) entre los grupos
sanos y con EM (Fig. 7A), pero no se encontraron diferencias
significativas en los niveles de IgG o de IgA en estos estudios (no
se muestra). En los sueros de ambos grupos de pacientes con EM los
niveles de IgM anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) eran
significativamente superiores que en la población sana. Se usó un
valor discriminante óptimo fijado de forma arbitraria (la señal del
percentil 97% de la población "sana") para identificar las
muestras positivas por encima, y las muestras negativas por debajo,
del valor discriminante. Así pues, las señales de unión de
anti-Glc(\alpha) identificaron
correctamente 19 de 42 muestras de EM (45% de sensibilidad) y 42 de
44 muestras de sueros aparentemente sanas (96% de especificidad).
La medición de la unión de anti-Maltosa identificó
correctamente 48% de los sueros de EM y 95% de las muestras de
sueros aparentemente sanas. Definiendo como positiva una muestra
cuya señal está por encima del valor discriminante en los ensayos
de anti-Glc(\alpha) o de
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha), mejora la
sensibilidad al 60% y deja la especificidad en 93% (Tabla 2). La
distribución diferencial de anticuerpos
anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) en pacientes
durante las etapas de exacerbación y remisión de la enfermedad tenía
niveles significativamente superiores en el primer grupo (Fig. 7B).
No se encontró diferencia entre los pacientes no tratados o
pacientes tratados con interferón \beta (no se muestra). Usando
como un valor discriminante el percentil 80 de la población con EM
"estable", se determinó que las señales de unión de
anti-Glc(\alpha) identificaban
correctamente 15 de 18 muestras de "ataque" (83% de
sensibilidad), 19 de 24 muestras "estables" (79% de
especificidad referido a estable como sin síntomas), y 42 de 44
muestras "sanas" (95% de especificidad). La medición de la
unión de anti-Maltosa identificaba correctamente
72% de los sueros de ataque, 79% de los sueros "estables" y 97%
de los "sueros sanos". La definición como positiva de una
muestra cuya señal está por encima del valor discriminante en
cualquiera de los ensayos de Glc(\alpha) o de Maltosa, da
como resultado una sensibilidad de 89% y especificidad de 71% y 95%
respecto a las muestras "estables" o "sanas",
respectivamente (Tabla 3). La alta especificidad y sensibilidad de
los anticuerpos IgM anti-Glc(\alpha) y
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) los hace una
herramienta eficaz para el diagnóstico precoz y definición de
pacientes con EM. El hecho de que los niveles de estos anticuerpos
en la situación de ataque de EM sean mucho más altos que en la
situación estable los hace una herramienta para la identificación
temprana y predicción de ataques en pacientes con EM
reincidente-remitente.
Se observó una correlación alta entre niveles en
el suero de anticuerpo IgM anti-Glc(\alpha)
en pacientes mujeres diagnosticadas clínicamente con EM
(reincidente-remitente), que se definieron positivas
por tener unanticuerpo IgM
anti-Glc(\alpha) (como se ha descrito
antes), y la puntuación EDSS (Escala Ampliada del Estado de
Discapacidad) de mujeres, véase la Figura 8, cuadro izquierdo. No
había correlación entre la EDSS y los niveles del anticuerpo IgM
anti-Glc(\alpha) en sueros de pacientes
mujeres diagnosticadas clínicamente con EM
(reincidente-remitente), que se definieron negativas
por tener el anticuerpo IgM
anti-Glc(\alpha), véase la Figura 8,
cuadro izquierdo. La alta correlación indica que los niveles de IgM
anti-Glc(\alpha) en el suero pueden actuar
como biomarcador molecular indirecto para evaluar la actividad de la
enfermedad.
Cuando se considera cualquier parámetro
biológico para usar como un biomarcador indirecto, evidentemente un
requisito previo es que el biomarcador no sea variable en el tiempo
en la población normal. Así pues, se hizo el seguimiento de los
niveles en el suero de anticuerpos IgG, IgA, e IgM
anti-L-Rha(\alpha),
anti-GlcNAc(\alpha), y
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta1-4)Glc(\beta)
(\beta-Celotriosa) de 7 voluntarios sanos durante
13 semanas (Fig. 9). En general, se encontró que las
concentraciones de anticuerpos en el suero variaban entre los
diferentes individuos, pero eran bastante estables a lo largo del
tiempo. Por ejemplo, los sueros nº 9161 y nº 9162 tienen niveles
relativos extremadamente altos y temporalmente estables de los
anticuerpos IgA anti-GlcNAc(\alpha) y
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta), respectivamente,
pero niveles relativamente normales de anticuerpos IgA
anti-L-Rha(\alpha) y
anticuerpos IgG e IgM. Cuando se producen cambios en el nivel de
anticuerpos normalmente son graduales y continúan a lo largo de
varias semanas (p. ej., suero nº 9162; IgA
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta)), pero también pueden
ser repentinos, p. ej., suero nº 9172; IgM
anti-L-Rha(\alpha), que
aumenta de repente entre la semana cuatro y cinco y después vuelve
lentamente a su nivel
básico.
básico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se determinó la unión de anticuerpos Ig totales
(detectado con Proteína A) de los sueros de 72 individuos a 34 mono
y oligosacáridos (Figura 11 y Tabla 5), y la unión de IgG, IgA e IgM
de 200 sueros a 6 mono y oligosacáridos (Figura
15A-C). Las señales más fuertes se registraron para
los anticuerpos contra GlcNAc(\alpha) y
L-Rha(\alpha), mientras que se observaron
niveles menores contra los oligosacáridos de glucosa unidos por
enlaces \beta-4, GlcNAc(\beta),
GlcNAC(\beta
1-4)GlcNAC(\beta),
Gal(\alpha) y Gal(\alpha
1-3)Gal(\beta 1-4)
GlcNAc(\beta). Esto está de acuerdo con los datos
previamente publicados que muestran la distribución de anticuerpos
antiglucanos en un banco de sueros humanos disponibles
comercialmente (Documento WO 02/064556). Los AGAP (perfiles de
anticuerpos antiglucanos, por sus siglas en inglés) de las
subclases IgG e IgA eran similares a los AGAP de las Ig totales,
mientras que los de IgM eran menores y más uniformes entre los
diferentes glucanos. Los anticuerpos antiglucanos de la población
tendían a ajustarse a una distribución logarítmica normal, véase la
Fig. 15A-15C. Es evidente que existe una variación
considerable en los niveles de anticuerpos antiglucanos entre
individuos dentro de la población examinada, un hecho que sugiere
la existencia de AGAP individuales, pero limita la búsqueda de
marcadores a anticuerpos antiglucanos presentes en cantidades
bajas.
También se han usado glucanos inmovilizados
sobre perlas de afinidad para purificar anticuerpos contra
oligosacaridos de glucosa unidos por enlaces \beta4, y
L-Rha(\alpha). Su perfil de unión y la
especificidad se describen en las Figuras 13, 14A y 14B.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
8
Se compararon los niveles de anticuerpos
antiglucanos en los sueros de pacientes con aterosclerosis con
placas vulnerables, con los niveles de anticuerpos de glucanos en
el suero de pacientes con aterosclerosis con placas estables, así
como de individuos sin aterosclerosis.
La aterosclerosis es una causa principal de
morbosidad y mortalidad en los países desarrollados. Es un trastorno
sistémico de las paredes de los vasos sanguíneos que conduce al
desarrollo de placas ateroscleróticas en las paredes de los vasos
sanguíneos. Algunas de estas placas más tarde se vuelven vulnerables
a la rotura produciendo coágulos de sangre que conducen a ataques
cardiacos o accidentes cerebrovasculares.
Los componentes principales de las placas
ateroscleróticas son proteoglucanos, lípidos, células musculares y
leucocitos (células T y macrófagos). Además, la aterosclerosis se
percibe como una enfermedad autoinmune en la que uno de sus
iniciadores es la reactividad cruzada entre anticuerpos contra
antígenos bacterianos y los antígenos en las paredes de los vasos
sanguíneos.
Un punto importante en el desarrollo de la
aterosclerosis es el cambio de placas estables (PE), que se asocian
con riesgo bajo, a placas vulnerables (PV) inflamadas, que se
asocian con riesgo alto. La diferenciación entre las PE y PV es
clínicamente problemática, ya que sólo se puede hacer una distinción
concluyente mediante una autopsia
post-mortem.
Las muestras de suero fueron suministradas por
el Dr. Jacob George del departamento de cardiología en el Tel Aviv
Medica Center, Israel. Todos los pacientes eran hombres no
diabéticos con un intervalo de edades de 30 a 69. Se ensayaron 39
muestras de suero de pacientes de los siguientes tipos:
Angina inestable - 13 pacientes con
aterosclerosis caracterizados por tener síndromes coronarios agudos
(infartos de miocardio con ondas Q o sin ondas Q). Se considera que
ambos se desarrollan a partir de la rotura de placas vulnerables.
Los miembros del grupo de angina inestable incluían pacientes con
síndrome coronario agudo admitidos con dolor en el pecho y cambios
en el ECG o elevación del marcador cardiaco. Se quejaban de la
aparición reciente (<3 días) de angina y se sometieron al
seguimiento telemétrico del electrocardiograma (ECG) continuado
durante la admisión. Se detectó al menos una angina de reposo o un
episodio que duró más de 20 min durante las últimas 48 h, junto con
un aumento de la creatina quinasa, niveles de MB o niveles de
troponina. Los miembros de este grupo se habían sometido a
angiografía (cateterización), la cual documentaba la presencia de
aterosclerosis coronaria.
Angina estable - 13 pacientes con
aterosclerosis se caracterizaban por tener angina estable. Los
miembros del grupo de angina estable se habían sometido a
angiografía (cateterización) que documentaba la presencia de
aterosclerosis coronaria. No se detectaron cambios en el ECG, ni se
detectaron aumentos en la creatina quinasa, niveles de MB o niveles
de troponina.
Sin placas - 13 pacientes con arterias
coronarias normales. Los miembros del grupo de "sin placas" no
mostraban pruebas de aterosclerosis coronaria después de
cateterización.
Se obtuvo un perfil de anticuerpos antiglucanos
usando matrices de GlycoChip^{TM} (Glycominds, Ltd., Lod, Israel,
nº de cat. 9100) construidas usando procedimientos descritos en el
documento WO 00/49412. Todas las muestras de suero se ensayaron
usando placas de GlycoChip^{TM} (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, nº
de cat. 9100), que contenían una matriz de mono y oligosacáridos
covalentemente unidos en una placa de microvaloración de 384
pocillos de volumen reducido. En la Tabla 4 se describe la lista de
mono y oligosacáridos presentados en la matriz, así como sus
números de serie.
Los sueros se diluyeron (1:20) en TBST, se
dispensaron en una placa GlycoChip^{TM} usando una robot Tecan
Genesis Workstation 200 (10 \mul/pocillo) y se incubaron 30 min a
25 grados Celsius. Cada muestra de glucano y suero en la placa se
ensayó 8 veces.
Las placas se lavaron con 250 \mul/pocillo de
tampón de alta concentración salina (KNa 0,15 M pH 7,2, NaCl 2 M,
MgSO_{4} 0,058 M, Tween 20 al 0,05%) en un lavador de placa
automático (Tecan, PowerWasher^{TM}). Se dispensaron manualmente
10 \mul/pocillo de IgG, IgM o IgA antihumana de cabra biotinilada
(Jackson, PA, EE.UU.), 1 \mug/ml en TBST, y las placas se
incubaron durante 30 min a 25ºC. La placa se lavó otra vez con
tampón de alta concentración salina.
Se añadió manualmente europio conjugado con
estreptavidina, Wallac, AD0062 (1 \mul/ml, 10 \mul/pocillo)
seguido de una incubación durante 30 min a 25ºC en la oscuridad. Se
repitió el lavado de las placas con el tampón de alta concentración
salina. Se añadió tampón de potenciación Delfia^{TM} (Wallac,
730232, 10 \mul/pocillo) a los pocillos y las placas se incubaron
al menos 30 min en la oscuridad. Se leyó la fluorescencia de los
pocillos con Victor 1420 (Wallac) usando los ajustes de
fluorescencia resuelta en el tiempo Emi. 612 nm y Exc. 340 nm.
La señal de unión de glucano obtenida para el
grupo "sin placa" se usó para calcular los valores
discriminantes para cada glucano por encima de los cuales se
consideraba que los pacientes eran positivos. Estos valores
discriminantes se definieron como la señal media del grupo "sin
placa" más una o dos desviaciones típicas. De acuerdo con esta
definición, se identificaron una serie de glucanos que tenían algún
grado de poder de separación entre los grupos de pacientse (véase a
continuación). La "separación" basada en un glucano determinado
se definió como al menos 50% (7/13) muestras positivas en los
grupos de "angina inestable" o "angina estable", y 2 o
menos muestras positivas en el grupo "sin placa".
La Fig. 16A es una representación de la matriz
de glucanos usada para examinar los sueros de los pacientes que
padecen angina inestable o estable, las estructuras de glucanos se
describen en la Tabla 4. Los glucanos contra los cuales se midieron
niveles de anticuerpos significativamente diferentes en los
diferentes grupos de pacientes se marcan con cuadrados negros. Con
el nivel del valor discriminante de la media más dos desviaciones
típicas, la "separación" se consiguió con la unión de IgA a dos
glucanos diferentes. Uno se separó entre los anticuerpos IgG, pero
ninguno se separó entre los anticuerpos IgM.
A continuación se presentan los glucanos solos
que dan las mejores separaciones:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Algunos glucanos que no se definieron como
"separadores" todavía dieron algún grado de separación. Cuando
se usaban en combinaciones, se podía mejorar la separación más que
la de los glucanos solos. Los glucanos se presentan a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 16B es una representación gráfica que
muestra niveles de anticuerpos contra los glucanos nº 2 y nº 29 en
los tres grupos de pacientes. La caja incluye señales de 50% de la
población. Las líneas gruesas y finas en la caja representan los
valores medio y mediano, respectivamente. El límite de la caja más
cercano a cero indica el percentil 25 y el límite de la caja más
lejano de cero indica el percentil 75. Los bigotes encima y debajo
de la caja indican los percentiles 90 y 10.
La Fig. 17 es un histograma que muestra el
número de muestras en los tres grupos de pacientes positivas para
anticuerpos anti-IgA contra el glucano nº 2 y el
glucano nº 29.
La Fig. 18A es un histograma que muestra la
distribución de los niveles de anticuerpos contra los glucanos nº 2
y nº 15 en los tres grupos de pacientes. La caja incluye señales de
50% de la población. Las líneas gruesas y finas en la caja
representan los valores medio y mediano, respectivamente. El límite
de la caja más cercano a cero indica el percentil 25 y el límite de
la caja más lejano de cero indica el percentil 75. Los bigotes
encima y debajo de la caja indican los percentiles 90 y 10.
La Fig. 18B es un histograma que muestra el
número de muestras en los tres grupos de pacientes positivas para
anticuerpos anti-IgA contra el glucano nº 2 y el
glucano nº 15. En el nivel del valor discriminante de la media más
una desviación típica, la "separación" se consiguió con la
unión de IgA a 6 glucanos diferentes. Los niveles de anticuerpos
IgG e IgM no eran diferentes en los tres grupos.
La separación obtenida con combinaciones se
muestra a continuación (se usó Aa porque el número de muestras
positivas en el grupo de "angina estable" era menor que usando
Ab, mejorando de esta forma la separación en relación con el grupo
de "angina inestable"):
La especificidad y sensibilidad del ensayo para
detectar la "angina inestable" usando Aa y GNb4GNb era por
tanto 62% (8/13) y 88% (23/26), respectivamente.
Una combinación de tres glucanos, Aa, GNb4GNb y
Fb hicieron posible determinar la especificidad también para el 75%
(9/13) del grupo de "angina estable". Esto surge a raíz del
hecho de que Fb detecta en su mayor parte la "angina estable".
La especificidad y sensibilidad del ensayo combinado se resumen en
la Fig. 19.
Estos resultados demuestran que se puede usar
una combinación de glucanos (Gal(\alpha),
GlcNAc(\beta1-4)GlcNAc(\beta)
y Fu(\beta)) para distinguir satisfactoriamente entre las
poblaciones de angina estable e inestable con una especificidad de
62% y sensibilidad de 88%. Estos resultados muestran que se puede
desarrollar un biomarcador basado en anticuerpos IgA que se unen a
glucanos que distinguen entre pacientes con angina inestable y
estable.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
9
Se compararon los niveles de anticuerpos
antiglucanos en los sueros de pacientes con aterosclerosis con
placas vulnerables con los niveles de anticuerpos contra glucanos
en el suero de pacientes con aterosclerosis con placas estables,
así como de individuos sin aterosclerosis.
La aterosclerosis es una causa principal de
morbosidad y mortalidad en países desarrollados. Es un trastorno
sistémico de las paredes de los vasos sanguíneos que conduce al
desarrollo de placas ateroscleróticas en las paredes de los vasos
sanguíneos. Algunas de estas placas después se vuelven vulnerables a
la rotura, produciendo coágulos de sangre que conducen a ataques al
corazón y accidentes cerebrovasculares.
Los componentes principales de las placas
ateroscleróticas son proteoglucanos, lípidos, células musculares y
leucocitos (células T y macrófagos). Además, la aterosclerosis se
percibe como una enfermedad autoinmune en la que uno de sus
iniciadores es la reactividad cruzada entre anticuerpos contra
antígenos bacterianos y los antígenos en las paredes de los vasos
sanguíneos.
Un punto importante en el desarrollo de la
aterosclerosis es el cambio de placas estables (PE), que se asocian
con riesgo bajo, a placas vulnerables (PV) inflamadas, que se
asocian con riesgo alto. La diferenciación entre las PE y PV es
clínicamente problemática, ya que sólo se puede hacer una distinción
concluyente mediante una autopsia
post-mortem.
Las muestras de suero fueron suministradas por
el Dr. Jacob George del departamento de cardiología en el Tel Aviv
Medical Center, Israel. Todos los pacientes eran hombres no
diabéticos con un intervalo de edades de 30 a 69. Se ensayaron 72
muestras de suero de pacientes de los siguientes tipos:
Angina inestable - 24 pacientes con
aterosclerosis caracterizados por tener síndromes coronarios agudos
(infartos de miocardio con ondas Q o sin ondas Q). Se considera que
ambos se desarrollan a partir de la rotura de placas vulnerables.
Los miembros del grupo de la angina inestable incluían pacientes con
síndrome coronario agudo admitidos con dolor en el pecho y cambios
en el ECG o elevación del marcador cardiaco. Se quejaban de la
aparición reciente (<3 días) de angina y se sometieron al
seguimiento telemétrico del electrocardiograma (ECG) continuado
durante la admisión. Se detectó al menos una angina de reposo o un
episodio que duró más de 20 min durante las últimas 48 h, junto con
un aumento de la creatina quinasa, niveles de MB o niveles de
troponina. Los miembros de este grupo se habían sometido a
angiografía (cateterización), la cual documentaba la presencia de
aterosclerosis coronaria.
Angina estable - 24 pacientes con
aterosclerosis se caracterizaban por tener angina estable. Los
miembros del grupo de angina estable se habían sometido a
angiografía (cateterización) que documentaba la presencia de
aterosclerosis coronaria. No se detectaron cambios en el ECG, ni se
detectaron aumentos en la creatina quinasa, niveles de MB o niveles
de troponina.
Sin placas - 24 pacientes con arterias
coronarias normales. Los miembros del grupo de "sin placas" no
mostraban pruebas de aterosclerosis coronaria después de
cateterización.
Se obtuvo un perfil de anticuerpos antiglucanos
usando matrices de GlycoChip^{TM} (Glycominds, Ltd., Lod, Israel,
nº de cat. 9100) construidas usando procedimientos descritos en el
documento WO 00/49412. Todas las muestras de suero se ensayaron
usando placas de GlycoChip^{TM} (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, nº
de cat. 9100), que contenían una matriz de mono y oligosacáridos
covalentemente unidos en una placa de microvaloración de 384
pocillos de volumen reducido. En la Tabla 4 se describe la lista de
mono y oligosacáridos presentados en la matriz, así como sus
números de serie.
Los sueros se diluyeron (1:20) en TBST, se
dispensaron en una placa GlycoChip^{TM} usando una robot Tecan
Genesis Workstation 200 (10 \mul/pocillo) y se incubaron 30 min a
25 grados Celsius. Cada muestra de glucano y suero en la placa se
ensayó 8 veces.
Las placas se lavaron con 250 \mul/pocillo de
tampón de alta concentración salina (KNa 0,15 M pH 7,2, NaCl 2 M,
MgSO_{4} 0,058 M, Tween 20 al 0,05%) en un lavador de placa
automatico (Tecan, PowerWasher^{TM}). Se dispensaron manualmente
10 \mul/pocillo de IgG, IgM o IGA antihumana de cabra biotinilada
(Jackson, PA, EE.UU.), 1 \mug/ml en TBST, y las placas se
incubaron durante 30 min a 25ºC. La placa se lavó otra vez con
tampón de alta concentración salina.
Se añadió manualmente europio conjugado con
estreptavidina, Wallac, AD0062 (1 \mul/ml, 10 \mul/pocillo)
seguido de incubación durante 30 min a 25ºC en la oscuridad. Se
repitió el lavado de las placas con el tampón de alta concentración
salina. Se añadió tampón de potenciación Delfia^{TM} (Wallac,
730232, 10 \mul/pocillo) a los pocillos y las placas se incubaron
al menos 30 min en la oscuridad. Se leyó la fluorescencia de los
pocillos con Victor 1420 (Wallac) usando los ajustes de
fluorescencia resuelta en el tiempo Emi. 612 nm y Exc. 340 nm.
El valor discriminante se calculó a partir del
percentil 80 de la población normal. De acuerdo con esta definición
se identificaron una serie de glucanos que tenían algún grado de
poder de separación entre los grupos de paciente (véase a
continuación). La "separación" basada en un determinado glucano
se definió como al menos 50% (12/24) de muestras positivas en los
grupos de "angina inestable" o "angina estable", y 5 o
menos muestras positivas en el grupo "sin placa".
Los resultados demuestran que se puede usar una
combinación de glucanos Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha),
Glc(\beta), GalNAc(\alpha),
GalNAc(\beta), GlcNAc(\beta
1-4)GlcNAc(\beta) y
Xilosa(\alpha) para distinguir satisfactoriamente entre
las poblaciones con angina estable e inestable. Estos resultados
demuestran que se puede desarrollar un biomarcador basado en
anticuerpos IgA que se unen a glucanos que distinguen entre
pacientes con angina inestable y estable.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
10
Se examinó la unión de células CD4+ de 7
individuos sanos a 47 fragmentos de glucanos diferentes
inmovilizados en una micomatriz.
Se extrajeron 20 ml de sangre de cada uno de los
7 individuos usando tubos Vacutainer con 10 ml de EDTA. Las
muestras de células periféricas se centrifugaron (230 x g, 900 rpm,
10 min a temperatura ambiente). Después se separó el plasma y los 2
ml superiores de la fracción celular se transfirieron a un tubo de
15 ml. Para el enriquecimiento de las células CD4+, se añadieron
100 \mul del reactivo RossetteSep a los tubos y se incubaron a
temperatura ambiente durante 20 minutos. Después las muestras se
diluyeron dos veces en PBS/FSC al 2% y se puso una capa de 5 ml de
Ficoll bajo la suspensión celular usando una pipeta Pasteur de
vidrio.
Los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a
temperatura ambiente, 2400 rpm (-700 x g) con desaceleración de la
centrífuga. Después de centrifugación, los tubos se sacaron de la
centrífuga con cuidado. La capa superior se extrajo suavemente
usando una pipeta estéril, dejando la capa de linfocitos sin alterar
en la interfase. Usando una pipeta estéril la fracción de
leucocitos se transfirió a un tubo limpio, y el tubo se llenó
completamente con PBS/FCS al 2%. Las células se lavaron dos veces
otra vez por centrifugación durante 10 minutos, 230 x g (1000 rpm)
y se volvieron a suspender en PBS/FSC al 2%. Después de las
centrifugaciones, las células se vuelven a suspender en 500 ml de
RPMI-1640/FCS al 2%.
Las células se diluyeron en solución de Türk
1:10 y se contaron. Después del recuento las células se diluyeron a
una densidad de 5x10^{6} células/ml en
RPMI-1640/FCS al 2%, y después se pusieron en una
placa de 24 pocillos, 1 ml/pocillo. Las suspensiones de células se
incuban toda la noche en incubador al 95% de humedad, 37ºC,
CO_{2}
al 5%.
al 5%.
Para determinar los rendimientos de la
separación de células por separación FACS, se suspendieron 250.000
células en 1 ml de tampón de FACS y después se centrifugaron 10
minutos a 2000 rpm, 4ºC. El líquido sobrenadante se decantó. Las
células se volvieron a suspender en 50 \mul de tampón de FACS y se
marcaron con 5 \mul de anticuerpo anti-CD4. Las
células se incubaron durante 30 minutos sobre hielo, tapadas de la
luz. Se añadió 1 ml de tampón de FACS enfriado con hielo y se
centrifugaron 10 minutos, 2000 rpm, 4ºC. Después las células se
volvieron a suspender en 300 \mul de tampón de FACS, se
almacenaron sobre hielo y se puntuaron en una máquina FACS.
Se pusieron GlycoChips en soportes de
portaobjetos en recipientes de plásticos con papel húmedo para
retener la humedad. La suspensiones de células se pusieron en
placas con 1,2 \mul/pocillo en el GlycoChip, después se incubaron
en incubador con CO_{2} al 5% (95% de humedad, 37ºC) durante una
hora. Después de la incubación, los portaobjetos se pusieron
suavemente con la cara superior hacia abajo en la cámara de
centrifugación inmersos en PBS. Las Glyc Chips se centrifugaron
durante 2 minutos a 700 rpm (fuerza g mínima, \sim50 x g). Los
portaobjetos se observaron por microscopio y se fijaron en
PBS/formaldehído al 3,7% a temperatura ambiente durante al menos 30
minutos. Después los portaobjetos se lavaron ligeramente x3 en DDW y
se secaron al aire.
Se preparó una solución de yoduro de propidio en
PBS y se puso en placa con 1,2 \mul/pocillo. Se incubaron
GlycoChips en condiciones de humedad durante 15 minutos, y después
se aclararon delicadamente x3 sumergiéndolas en DDW. Después los
portaobjetos se secaron al aire en la oscuridad y se hizo un barrido
a los parámetros del yoduro de propidio de Exc. 535 nm, Emi. 655 nm
en un escáner de matriz. Se analizó la imagen y se determinaron las
densidades de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Los glucanos y controles usados para los
estudios de unión se muestran a continuación en la Fig. 20. Las
estructuras están escritas en sintaxis de LinerCode^{TM}, véase
la Tabla 1 para la traducción.
En la Fig. 20 se muestra un histograma que
muestra el perfil de unión de células CD4+ de un solo individuo a
diferentes glucanos. Se muestra la unión en DLU/mm^{2} y se indica
para cada uno de los glucanos o controles. En la Fig. 21A se
muestra la unión de células CD4+ a glucanos o controles de los siete
individuos. La Fig. 21A muestra la fluorescencia relativa mediana
para las células CD4+ de cada uno de los siete individuos.
Estos resultados demuestran que la unión de las
células CD4+ varía entre los diferentes glucanos. La unión más
fuerte se observó en los siguientes glucanos, en orden de su
afinidad relativa: las células CD4+ se unen a los siguientes
glucanos, presentados en LinearCode; NNa3Ab4(Fa3)GNb
> Mb4Gb > GNb4GNb > Ma3Ma > Ab6Ab. También se detectó
la unión de células CD4+ a glucanos con restos de manosa terminales
o con restos Sialyl Lewis X. También se detectó la variación de
unión de CD4+ a glucanos particulares entre los diferentes
individuos.
\newpage
Hay que entender que aunque la invención se ha
descrito junto con su descripción detallada, se pretende que la
descripción anterior ilustre y no limite el alcance de la invención,
la cual se define por el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Un procedimiento para diagnosticar la
esclerosis múltiple en un sujeto, el procedimiento
comprendiendo:
detectar un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) en una muestra de
ensayo obtenida de un sujeto; y
comparar los niveles de dicho anticuerpo en
dicha muestra de ensayo con una muestra de control;
en el que dicha muestra de control se selecciona
de uno o más individuos que tienen síntomas de esclerosis múltiple
y tienen un estado de esclerosis múltiple conocido y uno o más
individuos que no muestran síntomas de esclerosis múltiple;
diagnosticando de esta forma la esclerosis múltiple a dicho
sujeto.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho procedimiento comprende además detectar al menos
otro anticuerpo más, cuyo al menos dicho otro anticuerpo más se
selecciona de un anticuerpo
anti-Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Glc(\alpha1-4)Glc(\beta),
un anticuerpo anti-Glc(\beta), un
anticuerpo anti-Gal(\beta); un anticuerpo
anti-Glc(\beta1-4)Glc(\beta1-4)Glc(\beta),
un anticuerpo
anti-GlcNAc(\beta1-4)GlcNAc(\beta),
un anticuerpo
anti-L-Araf(\alpha), un
anticuerpo
anti-L-Rha(\alpha), un
anticuerpo
anti-Gal(\beta1-3)[GlcNAc(\beta1-6)]GalNAc(\alpha),
un anticuerpo
anti-Gal(\beta1-4)GlcNAc(\alpha),
un anticuerpo
anti-Gal(\beta1-3)GalNAc(\alpha),
un anticuerpo
anti-Gal(\beta1-3)GlcNAc(\beta),
un anticuerpo anti- GlcA(\beta), un anticuerpo
anti-GlcA(\beta) y un anticuerpo
anti-Xyl(\alpha), y
comparar los niveles de dicho al menos otro
anticuerpo más en dicha muestra de ensayo con los niveles del al
menos otro anticuerpo más en dicha muestra de control.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que dicho procedimiento comprende detectar al menos tres de
dichos otros anticuerpos.
4. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que dicho procedimiento comprende detectar al menos cinco de
dichos otros anticuerpos.
5. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que dicho al menos otro anticuerpo más es un anticuerpo
anti-Glc(\alpha).
6. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha muestra de control consiste en una población de uno
o más individuos que no muestran síntomas de esclerosis
múltiple.
7. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha muestra de control consiste en una población de uno
o más individuos que tienen síntomas de esclerosis múltiple con un
estado conocido de la esclerosis múltiple.
8. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha muestra de ensayo es un fluido biológico.
9. Un procedimiento según la reivindicación 6,
en el que dicho fluido biológico es sangre entera, suero, plasma,
líquido cefalorraquídeo, orina o saliva.
10. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho fluido biológico es suero.
11. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho sujeto es una mujer.
12. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho sujeto es un hombre.
13. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho anticuerpo anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) es un anticuerpo de
tipo IgM.
14. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho anticuerpo anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) es un anticuerpo de
tipo IgA.
15. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho anticuerpo anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) es un anticuerpo de
tipo IgG.
16. Un procedimiento según la reivindicación 5,
en el que dicho anticuerpo anti-Glc(\alpha)
es un anticuerpo de tipo IgM.
17. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho anticuerpo anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha) es un anticuerpo de
tipo IgM.
18. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho diagnóstico es un diagnóstico precoz de la
esclerosis múltiple.
19. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha muestra de control se determina usando una
evaluación por la Escala Ampliada del Estado de Discapacidad (EDSS)
o una evaluación por Imagen por Resonancia Magnética (IRM).
20. Un kit para diagnosticar síntomas asociados
con la esclerosis múltiple, el kit comprendiendo:
un primer reactivo que detecta específicamente
un anticuerpo anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha);
un segundo reactivo que detecta específicamente
un segundo anticuerpo seleccionado de un anticuerpo
anti-Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\beta), un anticuerpo
anti-Glc(\beta), un anticuerpo
anti-Gal(\beta), un anticuerpo
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta), un anticuerpo
anti-GlcNAc(\beta
1-4)GlcNAc(\beta), un anticuerpo
anti-L-Araf(\alpha), un
anticuerpo
anti-L-Rha(\alpha), un
anticuerpo anti-Gal(\beta
1-3)[GlcNAc(\beta
1-6)]GalNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-4)GlcNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-3)GalNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-3)GlcNAc(\beta), un anticuerpo
anti-GlcA(\beta), un anticuerpo
anti-GlcA(\beta) y un anticuerpo
anti-Xyl(\alpha), y
indicaciones para usar dicho kit.
21. Un kit según la reivindicación 20, que
además comprende un reactivo que detecta específicamente un
anticuerpo de tipo IgM.
22. Un sustrato que comprende un reactivo que
detecta específicamente un anticuerpo específico para
Glc(\alpha
1-4)Glc(\alpha).
23. Un sustrato según la reivindicación 22, que
además comprende otro reactivo que detecta un anticuerpo
seleccionado de un anticuerpo
anti-Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Glc(\alpha
1-4)Glc(\beta), un anticuerpo
anti-Glc(\beta), un anticuerpo
anti-Gal(\beta); un anticuerpo
anti-Glc(\beta
1-4)Glc(\beta
1-4)Glc(\beta), un anticuerpo
anti-GlcNAc(\beta
1-4)GlcNAc(\beta), un anticuerpo
anti-L-Araf(\alpha), un
anticuerpo
anti-L-Rha(\alpha), un
anticuerpo anti-Gal(\beta
1-3)[GlcNAc(\beta
1-6)]GalNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-4)GlcNAc(\alpha), anticuerpo
anti-Glc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-3)GalNAc(\alpha), un anticuerpo
anti-Gal(\beta
1-3)GlcNAc(\beta), un anticuerpo
anti-GlcA(\beta), o un anticuerpo
anti-GlcA(\beta) y un anticuerpo
anti-Xyl(\alpha).
24. Un sustrato según la reivindicación 23, que
además comprende un reactivo que detecta un anticuerpo
anti-
Glc(\alpha) y un reactivo que detecta un anticuerpo anti-L-Rha(\alpha).
Glc(\alpha) y un reactivo que detecta un anticuerpo anti-L-Rha(\alpha).
25. El sustrato de la reivindicación 22, en el
que dicho sustrato es plano.
26. Un sustrato según la reivindicación 22, en
el que dicho sustrato se proporciona como un pocillo de una placa
de microvaloración.
27. El sustrato de la reivindicación 22, en el
que dicho reactivo es un monosacárido u oligosacárido.
Applications Claiming Priority (8)
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|---|---|---|---|
| US40091402P | 2002-08-02 | 2002-08-02 | |
| US400914P | 2002-08-02 | ||
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