PT1529216E - Método para diagnosticar esclerose múltipla - Google Patents

Description

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Descrição '"Método para diagnosticar esclerose múltipla"

Campo da Invenção A invenção diz respeito de um modo geral a um método para diagnosticar esclerose múltipla e mais particularmente a um método para diagnosticar esclerose múltipla medindo os níveis de anticorpos em relação a glicanos numa amostra biológica.

Antecedentes da Invenção A esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória autoimunitária crónica do sistema' nervoso central. É uma causa comum de deficiência persistente em adultos jovens. Nos doentes que sofrem de MS o sistema imunitário destrói a camada de mielina dos axões no cérebro e na medula espinal, provocando uma variedade de patologias neurológicas. Na forma mais comum de MS surto - remissão, episódios de agravamento agudo da função neurológica (exacerbações, ataques), são seguidos por períodos de recuperação parcial, ou completa (remissões) que estão isentos da progressão da doença (estável). Foi reportado que noventa por cento dos doentes com' MS inicialmente presente com um síndroma clínico isolado é devido a uma lesão inflamatória desmielinizante no nervo óptico, tronco cerebral, ou medula espinal. Cerca de trinta por cento daqueles doentes com um síndroma clinicamente isolado progridem até um estado clinicamente definido de MS em 12 meses após a apresentação. A progressão posterior da doença pode variar significativamente· de doente para doente. A progressão pode variar de uma progressão benigna a uma progressão clássica 2 surto - remissão, progressiva crónica ou progressão rara fulminante.

Um método para diagnosticar MS que facilite uma detecção precoce da MS clinicamente definida seria valioso tanto para o acompanhamento da doença, como para aconselhamento do doente. Por exemplo, a doentes-diagnosticados precocemente com MS definida clinicamente poderiam ser oferecidos tratamentos que modificam a doença em que foi recentemente constatado que seriam benéficos na MS precoce.

Os métodos correntes para avaliação e seguimento do processo de MS encontram-se baseados na avaliação - e classificação da' função dos doentes em ataques e deficiências acumuladas durante os ataques. Uma avaliação utilizada para avaliar a MS é a Escala Expandida do Estado de Incapacidade (EDSS - do inglês Expanded Disability Status Scale) geralmente utilizada. Contudo, a EDSS encontra-se baseada numa avaliação subjectiva da função do doente.

Métodos de diagnóstico também podem incluir o seguimento de lesões cerebrais por Ressonância Magnética de Imagem (MRI -do inglês Magnetic Resonance Imaging), ou o teste do Fluido Cerebroespinal (CSF -do inglês Cerebrospinal Fluid) para determinar a presença de bandas oligoclonais(OCB -do inglês Oligo-Clonal Banding). 0 MRI é um método físico para avaliar lesões cerebrais e .é caro para uma utilização de rotina. Além disso, a correlação entre estes resultados de MRl e actividade da doença é pobre. Uma punção cerebroespinal é um processo invasivo desagradável que não é adequado a uma utilização de rotina. Além disso, ambos os métodos avaliam os danos 'apenas após eles terem ocorrido; nenhum dos métodos pode prever o inicio dos ataques. Uma outra desvantagem para testar OCB 3 no CSF e MRI como um modo de diagnosticar MS é que um OCB ou MRI negativos não exclui a existência de MS.

Existe a necessidade de um método que utiliza marcadores objectivamente avaliados para diagnosticar a MS e para prever o inicio dos ataques nos doentes que sofrem de MS.

Sumário da Invenção A invenção encontra-se baseada na descoberta de que doentes de MS possuem níveis de autoanticorpos de IgG, IgA, IGM elevados que se ligam a estruturas de glicanos de Glc (a) ou Glc (a 1-4) Glc (a) ou Glc (a 1-4) Glc (β) quando comparado com os níveis de soro destes autoanticorpos em indivíduos saudáveis. Além disso, os mesmos autoanticorpos específicos para estas estruturas de· glicano são elevados durante o estado de exacerbação, quando comparados com o nível observado para os doentes em remissão e indivíduos saudáveis. Foi observada também uma elevada correlação entre os níveis no soro do anticorpo IgM anti-Glc (a) em doentes do sexo feminino com diagnóstico clínico de MS (surto - remissão) e a EDSS (Escala Expandida do Estado de Incapacidade) das mulheres. A elevada correlação indica que os .níveis de IgM anti-a-glucose no soro pode -actuar como marcador de substituição do ponto final clínico para a actividade da doença e como um modo de seguir a eficácia de um fármaco nos ensaios clínicos. A monitorização dos níveis destes anticorpos no sangue de doentes que se suspeita terem MS facilita e acelera um diagnóstico precoce eficaz do ponto de vista de custos de doentes com MS e a prescrição precoce destes fármacos que modificam a doença. A monitorização dos níveis destes anticorpos no sangue de doentes de MS definidos irá também possibilitar uma monitorização rápida e eficaz do ponto de 4 vista de custos dos efeitos dos fármacos prescritos, e a detecçâo precoce de ataques, possibilitando um tratamento profiláctico precoce.

Entre as vantagens adicionais da invenção está o facto da existência da MS em doentes poder ser determinada numa fase mais inicial da doença, quando os seus sintomas podem assemelhar-se aos dos sintomas de muitas doenças semelhantes à MS. O diagnóstico precoce permite aos médicos tratar a MS mais cedo no decurso da doença minimizando ou evitando deste modo os danos provocados pela destruição da mielina e deficiências provocadas por esta destruição. Além disso, os métodos aqui revelados permitem aos médicos seguir os doentes de MS regularmente para avaliar a severidade da doença, ou para monitorizar a terapia, e alterar o tratamento, assim que surgem sinais do aparecimento de um ataque. Por exemplo, um aumento nos biomarcadores indicativos de um ataque por MS pode garantir a administração ao doente de metilpredisona que é um agente anti-inflamatório administrado habitualmente durante os ataques.

Os métodos aqui revelados podem também ser utilizados para seleccionar o melhor tratamento com fármacos para um doente especifico. Por exemplo, um doente pode iniciar o tratamento com um determinado fármaco, e a alteração nos níveis dos marcadores será indicativa da eficácia de um fármaco. Reversão dos níveis do marcador para um estado de doença indica que o fármaco perde eficácia e o fármaco pode ser substituído por um segundo fármaco após um curto período de tempo. De outro modo, o médico terá que esperar pelos próximos ataques para determinar se o fármaco é eficaz no doente específico.

Os biomarcadores aqui revelados podem actuar adicionalmente como ponto final de substituição para avaliar a resposta de um doente ao fármaco testado de uma 5 forma eficiente do ponto de vista de custos. Um ponto final de substituição baseado num teste serológico facilita o teste eficiente de potenciais novos fármacos para a MS.

Num aspecto, a invenção caracteriza um método para o diagnóstico da esclerose múltipla num sujeito. 0 método inclui a disponibilizaçâo de uma amostra teste de um sujeito e a detecção na amostra de pelo menos um biomarcador, i.e. um anticorpo que se liga especificamente a uma estrutura glicano. 0 anticorpo pode ser' por ex. um anticorpo anti-Glc (a), um anticorpo anti-Glc {a 1-4) anti-Glc (a) , um anticorpo anti-Glc (a 1-4) fGlc (β) , um anticorpo anti-Glc (β); um anticorpo anti-Gal (β); um anticorpo anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) , um anticorpo anti-GlcNAc {β 1-4) GlcNAc (β) , um anticorpo anti-L-Araf(a), um anticorpo anti-L-Rha (a) , um anticorpo anti-Gal (β1-3) [GlcNAc (βΐ — 6)] GalNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-4 GalNAc (a), anti-Gal (β 1-3) GalNAc (a), um anti-Gal (β 1-3) GlcNAc (β),anti-GlcA (β), ou um anticorpo anti-GlcA (β) , ou um anticorpo anti-Xyl (a) . Os níveis do anticorpo ou anticorpos na amostra teste são comparados com uma amostra de controlo, que deriva de um ou vários indivíduos que apresentam múltiplos sintomas de esclerose múltipla e que possuem sintomas de esclerose múltipla com um estado conhecido de esclerose múltipla, ou de um indivíduo, ou indivíduos que não apresentam sintomas de esclerose múltipla. 0 estado MS pode incluir por ex. exacerbações, ataques, remissões, e fases estáveis da doença.

Em várias concretizações, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 destes anticorpos são detectados. Nalgumas concretizações o anticorpo detectado na amostra teste é um anticorpo anti- 6

Glc (a), ura anti-Glc (a 1-4) Glc (a) ou tanto um anticorpo anti-Glc (a) como um anticorpo anti-Glc (a 1-4) Glc (a).

Nalgumas concretizações a amostra de controlo consiste numa população de ura ou vários indivíduos que não apresentam sintomas de esclerose múltipla. Noutras concretizações, a amostra de controlo consiste numa população que apresenta sintomas de esclerose múltipla. A presença de MS na amostra de controlo pode ser determinada utilizando técnicas conhecidas no estado da técnica, por ex. uma avaliação por Escala Expandida de Estado de Incapacidade (EDSS), ou por Imagem de Ressonância Magnética ,{MRI) , ou ambas . A amostra teste pode ser por ex. um fluido biológico. Exemplos de fluidos biológicos incluem por ex., sangue completo, soro, plasma, fluido da medula espinal, urina, ou saliva. 0 sujeito pode ser do sexo feminino, ou do sexo masculino. 0 anticorpo detectado pode ser por ex. um anticorpo do tipo IgM, do tipo IgA, ou do tipo IgG.

Nalgumas concretizações, o tipo de esclerose múltipla detectada é esclerose múltipla precoce.

Também é revelado um método para diagnosticar exacerbação de esclerose múltipla num sujeito. 0 método inclui a disponibilização de uma amostra teste de um sujeito e a detecção de um anticorpo do tipo anti-Glc(a) IgM e/ ou um anticorpo do tipo anti-Glc (a 1-4) Glc(a) IgM na amostra teste. Os níveis do anticorpo na amostra teste são comparados com uma amostra de controlo, que é derivada de um ou vários indivíduos, cujo estado de esclerose múltipla é conhecido. A amostra de controlo consiste numa população de um ou vários indivíduos que não apresentam sintomas de uma exacerbação de esclerose múltipla e cujo estado de 7 esclerose múltipla se encontra em remissão. Uma exacerbação de esclerose múltipla é diagnosticada no sujeito se se encontram presentes na amostra teste mais anticorpo anti-Glc(a), ou anticorpo anti-Glc(a 1-4) Glc (a) do que na amostra de controlo. A amostra de controlo consiste numa população de um ou vários indivíduos que apresentam sintomas de uma exacerbação de esclerose múltipla, e uma exacerbação de esclerose múltipla é diagnosticada no sujeito se níveis de anticorpo do tipo anti-Glc(a) IgM e/ ou do tipo anti-Glc(a 1-4) Glc(a) IgM encontram-se presentes em quantidades semelhantes na amostra teste e na amostra de controlo. A amostra teste pode ser por ex. um fluido biológico. Exemplos de fluidos biológicos incluem por ex. sangue completo, soro, plasma, fluido da medula espinal, ou saliva. 0 sujeito pode ser do sexo feminino, ou masculino. 0 anticorpo detectado pode ser por ex. um anticorpo do tipo IgA ou do tipo IgG. 0 diagnóstico é um diagnóstico precoce da exacerbação de esclerose múltipla. 0 sujeito foi tratado com um agente terapêutico de MS, por ex. um interferão beta, ou acetato de glitamerer administrado por via subcutânea. É também revelado um método para avaliar a gravidade da esclerose múltipla num sujeito. 0 método inclui a disponibilização de uma amostra teste de um sujeito e a determinação se uma amostra teste contém um anticorpo do tipo anti“Glc(a) IgM e/ ou do tipo anti-Glc{oc 1-4) Glc (a) IgM. A quantidade de anticorpo na amostra teste é comparada com a amostra do anticorpo na amostra de controlo que é derivada de um ou vários indivíduos, cuja gravidade da esclerose múltiplas seja conhecida. 8 A amostra de controlo consiste numa população de um ou vários indivíduos cuja severidade da doença da esclerose múltipla é definida numa avaliação pela Escala Expandida do Estado de Incapacidade (EDSS), alterações numa classificação EDSS, ou numa Imagem por Ressonância Magnética (MRI). A amostra teste pode ser por ex. um fluido biológico. Exemplos de fluidos biológicos incluem por ex., sangue completo, soro, plasma, fluido da medula espinal, urina, ou saliva.

Se desejado, o método pode ainda incluir a selecção de um’ agente terapêutico para tratar a esclerose múltipla seleccionando um agente 'terapêutico e regime de dosagem baseado nos níveis relativos do anticorpo ou anticorpos na amostra teste e na amostra de controlo. Níveis mais elevados de anticorpos na amostra teste relatívamente à amostra de controlo indicam a selecção de um agente terapêutico e regime de dosagem que é a administração subcutânea do interferão beta (BETAFERON ®, AVONEX ®, REBIF®) ou a administração subcutânea de acetato de glitamerer (COPAXONE®). 0 sujeito pode ser do sexo feminino, ou masculino.

Também é disponibilizado pela invenção um kit para diagnosticar sintomas associados com a esclerose múltipla. 0 kit inclui um primeiro reagente que detecta especificamente um anticorpo anti-Glc(a), um segundo reagente que detecta especificamente um anticorpo antí-Glc(a 1-4) Glc(a), e instruções para utilizar o kit. O kit inclui opcionalmente um reagente que detecta especificamente um anticorpo do tipo IgM.

Também na invenção estão substractos que incluem reagentes que detectam especificamente os anticorpos aqui revelados por ex. um anticorpo anti-Glc (a), um anticorpo anti-Glc (a 1-4)Glc (a), um anticorpo anti-Glc (a 1-4) Glc 9 (β) , um anticorpo anti-Glc (β); um anticorpo anti-Gal (β); um anticorpo anti-Glc (β 1-4) Glc {β 1-4) Glc (β) , um anticorpo anti-GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) , um anticorpo anti-L-Araf(a), um anticorpo anti-L-Rha (a) , um anticorpo anti-Gal (β1 — 3) [GlcNAc (β1-6)] GalNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-4) GalNAc (a), um anti-Gal (β 1-3) GalNAc (a), ou um anticorpo anti-Gal {β 1-3) Glc Nac (β) , um anticorpo anti-GlcA (β), ou um anticorpo anti-GlcA (β), ou um anticorpo anti-Xyl (a) . 0 substracto pode ser por ex. planar. É ainda revelado um método para seleccionar um agente terapêutico para tratar á esclerose múltipla. 0 método inclui a disponibilização de uma amostra teste de um sujeito diagnosticado, ou em risco de ter esclerose múltipla e determinar se a amostra teste contém um anticorpo anti-Glc (a) . Os níveis de anticorpo na amostra teste são comparados com os níveis de anticorpo numa amostra de controlo . que consiste num ou mais indivíduos, cuja gravidade da doença de esclerose múltipla é conhecida.

Um agente terapêutico e um regime de dosagem ' é seleccíonado com base nos níveis relativos do anticorpo na amostra do sujeito e na amostra de controlo. 0 método inclui ainda a determinação se a amostra teste contém um· anticorpo anti-Glc (a 1-4)Glc (a) e a comparação dos níveis de anticorpo anti-Glc (a 1-4)Glc (a) na amostra teste com os níveis de anticorpo numa amostra de controlo que consiste num ou mais indivíduos, cuja gravidade da doença de esclerose múltipla é conhecida. A amostra de controlo consiste num ou mais indivíduos, cujo estado não é de esclerose múltipla ou é esclerose múltipla estável. 10 A não ser quando definido de outro· modo, todos os termos científicos e técnicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como habitualmente entendido por um vulgar perito no estado da técnica a que esta invenção pertence. Apesar de métodos e materiais semelhantes, ou equivalentes aos aqui descritos poderem ser utilizados na prática de testar a presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo.

Em caso de conflito a presente memória descritiva, incluindo as definições irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são meramente ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

Outras cãracterísticas e vantagens da invenção tornar-se-ão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 apresenta a árvore de decisão para determinar que um doente suspeito de ter MS tem realmente MS. A Fig. 2 apresenta a árvore de decisão para seleccionar um fármaco e uma dose para um doente de MS baseado nos níveis de anticorpos anti GLC (a l-4)Glc (a) ou Glc (a). A Fig 3 apresenta a árvore de decisão para prever e para um diagnóstico precoce de ataques em doentes de MS. A Fig. 4 é uma tabela que indica a fluorescência relativa da ligação de diferentes anticorpos anti-glicano em doentes de MS, assim como em indivíduos normais. As estruturas de glicanos encontram-se presentes na linha superior da tabela em sintaxe LINEARCODE®. 11 A Fig. 5 apresenta o sinal médio e da mediana de anticorpos anti glicano para vários glicanos do soro extraído de doentes de MS em relação a' soro normal de controlo. As estruturas de glicanos são apresentadas na sintaxe LINEARCODE®. A Fig. 6 é um gráfico que apresenta as diferenças entre sinais médios de indivíduos com MS e saudáveis, as barras apresentam o desvio padrão. As estruturas de glicanos são apresentadas em sintaxe LINEARCODE®. A Fig. 7A é uma gráfico que apresenta o .sinal médio da ligação de anti Glc (a), (Glicano #11) e Glc(a l-4)Glc (a)., (Glican #12) IgM em populações com MS e saudáveis. · A Fig. 7B é um gráfico que apresenta o sinal médio da ligação de Glc (a), (Glicano #11) e Glc (a l-4)Glc (a), (Glican #12) IgM em doentes de MS com ataque, doentes com MS estáveis e populações saudáveis. A Fig. 8 é um gráfico que apresenta a correlação entre a fluorescência relativa da adesão de anticorpos anti Glucose alfa IgM em amostras de doentes de anti-MS Glc (a) positivos (gráfico à esquerda), doentes de MS negativos (gráfico à direita) e os seus níveis de EDSS. A Fig. 9 é um gráfico que apresenta a estabilidade temporal do sinal da ligação de anticorpos IgM, IgG e IgA anti glicano ao longo de 13 semanas em 7 indivíduos saudáveis.

As figuras 10A e 10B apresentam a matriz de glicanos; estrutura química, especificidade da interacção da lectina e reprodutibilidade. A Fig. 10A mostra um p-amino fenil P- 12 sacarideo ligado covalentemente na sua extremidade redutora a uma superfície sólida através de um espaçador. A Fig. 10B apresenta a reprodutibilidade lote a lote da ligação de WGA biotinilado à matriz de glicanos. Três diferentes lotes das matrizês foram ensaiados simultaneamente com WGA biotinilado. A Fig. 10C apresenta a competição com ConA à Man (a) ligada. Concentrações crescentes de manose solúvel ou Gal (β 1-4) foram incubadas com ConA biotinilada (1,5 μg/ml) durante lhe detectada com estreptavidina conjugada com európio. A Fig. 10D apresenta a especificidade da ligação da lectina a diferentes anómeros, a ligação de ConA ao controlo negativo do glicerol (19), Man (a) (26) e Man (β) (27). A ligação de GSI a Gal(a)(l), Gal (β) (2), GalNAc (a) (7), e GalNac (β) (8) . A Fig. 10E apresenta reprodutibilidade placa a placa 'da matriz de glicanos. Cinco pla-cas idênticas que apresentam GlcNac (β)foram sondados com WGA biotinilado. A Fig. 11 apresenta o perfil de ligação do glicano de uma população humana saudável. Ligação do anticorpo anti-hidrato de carbono a glicanos seleccionados (ver estruturas de glicanos na Tabela 5) em amostras de soro de 72 indivíduos medidos com Proteína A biotinilada. Cada ponto representa a média de duas experiências, cada uma efectuada em quadruplicado. 0 gráfico inclui sinais de 50% da população. As linhas espessas e finas no gráfico representam os valores médios é da mediana, 13 respectivamente. Os limi.tes do gráfico mais perto de zero indicam o percentil 25 e o limite do gráfico mais longe de zero indica o percentil 75. Os intervalos acima e abaixo indicam o percentil 90 e 10. O nível de sinal não específico medido foi definido empiricamente; nos glicanos contra os quais foram encontrados níveis de anticorpos que se verificou serem relativamente baixos e altamente variáveis entre experiências foram desenhados para definir o nível de base {não apresentado) . O valor do sinal médio destes glicanos foi calculado e subtraído do sinal obtido para cada amostra de soro e glicano em particular. A linha de base média foi de 3xl05 RFU. TBST é tampão salino Tris com Tween 20 (ver Protocolo Experimental). A Fíg. 12 apresenta sinais de soros individuais contra uma série de glicanos. A ligação do anticorpo anti glicano medida em unidades de fluorescência relativas (RFU) foram transformadas utilizando um método semelhante à igualização do histograma que utiliza um mapeamento monotónico não linear. Deste modo, os valores RFU foram reatribuídos para variar entre 0 (azul) e 255 (vermelho) . Os dados foram agrupados utilizando um algoritmos de emparelhamento simulado.

As Figs. 13A-13C apresentam o perfil de ligação de anticorpos purificados por afinidade de (A) anti-L-Rha (a) (B) anti-GlcNAc (a) e anti-GlcNAc (β 1-4) GlcNAc(P) e (C) anti-Glc (J3 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) e'anti-GlcNAc (β 1-4) GlcNAc^) a uma matriz de 33 glicanos. As estruturas de glicanos são descritas na Tabela 5. A quantidade de anticorpo ligada foi medida utilizando anticorpo IgG biotinilado de cabra anti-humano. 14

As Figs 14A e 14B apresentam a especificidade do anticorpo anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β). (A) Inibição competitiva da ligação ao anticorpo anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β). Inibição da afinidade de ligação do anticorpo purificado por afinidade anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) ao p-amino fenil β Glc (β 1-4) Glc (β l-4)Glc (β) imobilizado à superfície do poço como função da concentração de Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc ou Gal (β 1-4) Glc. A quantidade de anticorpo ligada foi medida utilizando anticorpo IgG biotinilado de cabra anti-humano. (B) Ligação de anticorpos anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) (A) e antí-L-Rha (α) (B) ao seu sacarídeo cognato após incubação com celulose amorfa, ou cristalina. A quantidade de anticorpo ligado foi medida utilizando anticorpo IgG biotinilado de cabra anti-humano.

As Figs 15A-15C são representações gráficas da ligação dos isotipos IgG, IgA, e IgM de indivíduos saudáveis aos glicanos indicados. A Fig. 16A é uma representação matricial de glicanos utilizados para examinar o soro de doentes de arterosclerose que sofrem de angina estável, ou instável. Os glicanos para os quais foram medidos níveis de anticorpos significativamente diferentes em diferentes grupos de doentes estão marcados com quadrados a cheio. Os glicanos são listados na tabela 4. A Fig. 16B é uma representação gráfica que apresenta níveis de anticorpos contra glicanos #2 e #29 nos três grupos de doentes; instáveis, estáveis e não arteroscleróticos. 0 gráfico inclui sinais de 50% da população. As linhas espessas e finas do gráfico representam os valores médios e 15 da mediana, respectivamente. 0 limite do gráfico mais próximo de zero indica o percentil 25, e o limite do gráfico mais longe do zero indica o percentil 75. Os intervalos acima e abaixo do gráfico indicam os percentis 90 e 10. A Fig. 17 é um histograma que apresenta o número de amostras nos três grupos de doentes positivos para os anticorpos anti-IgA contra o glicano #2 ou o glicano #29. A Fig. 18A é um histograma que apresenta a distribuição de níveis de anticorpo contra os glicanos #2 e #15 nos três grupos de doentes. O gráfico inclui sinais de 50% da população. As linhas espessas e finas no gráfico representam os valores médios e da mediana respectivamente. 0 limite do gráfico mais próximo de zero indica o percentil 25, e o limite do gráfico mais longe do zero indica o percentil 75. Os intervalos acima e abaixo do gráfico indicam os percentis 90 e 10. A Fig. 18B é um histograma que apresenta o número de amostras nos três grupos de doentes positivos para os anticorpos anti-IgA contra o glicano #2 ou o glicano #15. A Fig. 19· é uma representação gráfica da especificidade e sensibilidade baseada em níveis de anticorpos anti-IgA contra o glicano #2, glicano #15, glicano #17, e glicano #49. A- arterosclerose; S-estável; US - instável; NA -não arterosclerótico. A Fig 20 representa um histograma que apresenta o perfil de ligação de células CD4+ a partir de um indivíduo único a vários glicanos. As estruturas de glicano estão representadas na sintaxe LINEARCODE®. 16 A Fig. 21A é um gráfico que representa a fluorescência mediana relativa para células CD4+ de cada uma das sete estruturas individuais do glicario representadas em sintaxe LINEARCODE®. A Fig. 21B apresenta sinais de soros individuais contra uma série de glicanos. A ligação ao anti-corpo anti-glicano medida em unidades de fluorescência relativas (RFU) foram transformadas utilizando um método semelhante à igualização de um histograma que utiliza um mapeamento monotónico, não linear. Desta forma, os valores de RFU foram reatribuidos entre 0 (azul) e 255 (vermelho) . Os dados foram agrupados utilizando um algoritmos de emparelhamento simulado.

Descrição Detalhada da Invenção

Os métodos aqui disponibilizados permitem um diagnóstico precoce da esclerose múltipla inicial e recorrente utilizando niveis de biomarcadores avaliados objectivamente. A árvore de decisão actual para diagnosticar um doente com MS é descrita na Fig. 1. Um doente com uma função neurológica a piorar de forma aguda inicialmente tem de ser diagnosticado como um doente de MS definida antes de ser elegível para o tratamento com fármacos modificadores da doença. 0 médico terá de determinar se o doente possui sintomas semelhantes aos da MS (tal como o ataque de Younger, Lupus, deficiência em vitamina B-12, síndroma anti-fosfolípido, enxaqueca grave), ou se têm realmente MS. 0 doente terá que passar por um segundo agravamento da função neurológica (ataque) antes de ser diagnosticado como um doente de MS e ser capaz de iniciar o tratamento crónico com um agente terapêutico da MS, tal como o interferão beta, ou o acetato de. glatíramer. 17

Correntemente, os médicos utilizam MRI para identificar a existência de lesões cerebrais e/ ou o teste do fluido cerebroespinal (CSF) ou de determinação da presença de bandas oligoclonais (OCB) . Se a MRI der um resultado claro no que toca a existência de lesões cerebrais ou a presença de OCB no CSF, o médico pode iniciar o tratamento imediatamente para evitar lesões cerebrais silenciosas. Um diagnóstico de diagnóstico de MS completa é actualmente feito apenas depois do segundo ataque. No caso de MRI não dar um resultado claro ou de não haver OCB no CSF dos doentes a MS não é diagnosticada e o tratamento é atrasado para depois de um segundo ataque. 0 método aqui descrito pode ser efectuado extraindo sangue de um doente com um agravamento agudo da função neurológica e suspeito de ter MS. 0 método pode identificar a existência de MS medindo o nível de anti-Glc (a) e anti-Glc (a 1-4) (a) Glc IgM. Se o nível de pelo menos um destes anticorpos for significativamente mais elevado do que o nível médio destes anticorpos no soro de indivíduos saudáveis, o doente é diagnosticado como um doente MS sem a necessidade de esperar por um segundo ataque. Adicionalmente o diagnóstico rápido permite começar o tratamento imediatamente.

Uma primeira linha para o tratamento por MS é o interferão beta (por ex. IIVFp-la e INFp-lb). A avaliação corrente da eficácia e dosagem necessária do fármaco é baseada na monitorização continuada de várias classificações clínicas. Actualmente a classificação EDSS e a sua alteração ao longo do tempo (por. ex. comparando a diferença na EDSS cada 3-6 meses) é o parâmetro clínico principal para a gestão da doença. Um importante componente da avaliação é o nível de fadiga e depressão experimentado pelo doente. A fadiga e ou a depressão pode ser tanto um sintoma de MS, como de uma doença auto-imunitária, ou um 18 efeito lateral devido à utilização do interferão beta. A identificação da causa da fadiga pode ser importante para gerir o tratamento. Por exemplo, se a fadiga for um resultado de um efeito secundário do interferão, o médico irá considerar uma diminuição da dosagem, ou mesmo a sua substituição por outro fármaco. Contudo se a fadiga for devida aos sintomas de MS, o médico terá de considerar aumentar dosagem do fármaco (ver Fig. 2). A pesquisa do sangue do doente e a determinação do nível dos biomarcadores aqui revelados, por ex. os anticorpos IgM anti Glc (a) e anti Glc (a 1-4) Glç(a) permite uma monitorização exacta da terapia. Descidas significativas nos níveis de anticorpos indicam que o doente está a responder bem a um determinado fármaco.

Detecção precoce dos ataques

Actualmente não existe nenhuma maneira de prever o início dos ataques em doentes de MS. MRI e avaliação clínica dos doentes pode apenas revelar danos que já ocorreram. A medição periódica do nivel de alguns anticorpos anti-glicanos (por exemplo anti-Glc (a) IgM ou anti-Glc (a 1-4) Glc (a) IgM) no sangue do doente de acordo com o método aqui descrito permite ao médico identificar o aparecimento de ataques baseado no aumento nos níveis destes anticorpos. Os níveis destes anticorpos são significativamente mais elevados no sangue dos doentes em situações de ataques de MS em comparação com doentes num estado estável (ver Fig. 7) . Na detecção de um aumento naqueles anticorpos, o médico pode começar um tratamento agressivo com esteroides para reduzir a inflamação e evitar danos na mielina (ver Fig. 3).

Também são aqui disponibilizados métodos para identificar e avaliar indivíduos com arterosclerose em 19 risco de angina estável e instável utilizando biomarcadores de anticorpos específicos para glicanos, assim como a utilização de glicanos imobilizados para detectar as células de interesse. Várias estruturas de glicanos são discutidas neste documento. Os glicanos são apresentados na forma condensada da nomenclatura para a representação dos hidratos· de carbono da International Union of Pure and Applied

Chemistry (IUPAC) ou numa sintaxe LINEARCODE®, para os princípios da sintaxe de código linear ver (Banin E. Neuberger Y. Altshuler Y.' Halevi A Inbar 0 Dotan N. e Dukler A (2002) A Noval Liner Code Nomenclature for complex Carbohydrates. Trends in Glycoscience and Glycotecnology vol. 14 N° 77 pág. 127-137). A tradução da representação LINEARCODE para IUPAC encontra-se na Tabela 1. Todas as

estruturas de glicanos discutidas nesta memória descritiva a não ser que mencionado de outro modo encontram-se ligadas â anomericidade indicada α ou β através de agentes de ligação à fase sólida como descrito na. Figura 10 A A invenção será ilustrada nos exemplos seguintes não limitativos.

Exemplo 1. Comparação entre anticorpos antiglicano no soro de doentes de esclerose múltipla (MS) e na população normal

Foi obtido um perfil de anticorpo anti-glicano (Igs) utilizando matrizes GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cal N° 9100). As matrizes foram construídas utilizando procedimentos descritos na WOOO/49412. Foram comparados perfis de anticorpos anti-glicanos de 40 doentes de esclerose múltipla e de 40 doadores normais de sexo e idade equivalentes.

Todas as amostras de soro foram testadas utilizando placas de GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cal N° 20 9100), que eram uma matriz de mono e oligossacarídeos ligados covalentemente a uma placa microtituladora de volume reduzido de 384 poços. Os mono e olissacarideos exibidos na matriz são listados na Fig. 4. Uma tradução da sintaxe do LinearCodeTl11 utilizada para descrever a estrutura glicano para a nomenclatura IUPAC pode ser encontrada na Tabela 1.

Os soros de voluntários saudáveis e de voluntários de doentes MS que tinham assinado um formulário de consentimento foram recolhidos em tubos evacuados contendo gel revestidos com silício (Estar Technologies Cat# 616603GLV). O soro foi separado das células de sangue e mantido congelado a -25°C até ser utilizado. Foram analisados em duas experiências diferentes repetidas duas vezes em dias diferentes.

Os soros dos voluntários foram diluídos (1:20) em TBST aplicado numa placa GlycoChip® utilizando uma estação robot Tecan Genesis Workstation 200 (10 pL/poço) e incubados durante 30 min a 25°C. Houve 4 repetições para cada glicano e amostras de soro na placa.

As placas foram lavadas com 250 μΐ,/ρορο de tampão com de sal elevado (KNa 0,15 M pH 7,2, NaCl 2M, MgS04 0,085 M, 0,05% de Tween 20) num lavador de placa automático (Tecan PowerWasher™) .Dez μΐ/poço de proteína A biotinilada (ICN 62-265), 1 μ/ml em TBST, foi aplicada manualmente e as placas foram incubadas durante 30 min a 25°C. A placa foi novamente lavada com tampão de sal elevado.

Estreptavidina conjugada com európio, Wallac, AD0062 (1 μ/ml, ΙΟμΙ/poço) foi adicionado manualmente por incubação durante 30 min a 25°C no escuro. A lavagem das placas com o tampão de sal elevado foi repetida. 0 tampão de reforço Delfia™, (Wallac, 730232, 10 μΐ/poço) foi adicionado aos poços e as placas foram incubadas durante 21 pelo meno.s 30 min no escuro. A fluorescência dos poços foi lida por um Victor 1420 (Wallac) utilizando os parâmetros resolvidos no tempo Emi.612 nm e Ext. 340 nm.

Os perfis de todos os doentes testados são apresentados na Fig. 4. As 40 linhas superiores (MS) descrevem o nivel do hidrato de carbono de amostras MS e as 40 linhas mais baixas (NC) descrevem o nivel anti-hidratos de carbono das amostras da população de controlo normal. Os valores apresentados são valores absolutos sem redução da linha de base. Uma vez que a detecção dos anticorpos ligados foi efectuada com proteína A biotinilada que se liga a IgG, IgA e IgM, o sinal representa a ligação total de anticorpos de todos os subtipos IgG, IgA e IgM. A comparação entre os valores médios e da mediana dos anticorpos anti-hidratos de carbono nas populações com MS e normais revelam diferenças significativas entre amostras de doentes MS e as amostras da população normal, ver Fig. 5. Um exemplo entre uma grande diferença observada entre estes dois grupos é o sinal médio para o glicano Ga4Gb. Um teste t mostrou que a diferença é estatisticamente altamente significativa (a=0,05; p<0,001). Outro exemplo é Ab3(GNb6)ANa, (a=0,05; p<0,001). Existem diferenças significativas entre as medianas dos sinais de MS e a população normal no que diz respeito a anticorpos ligados aos seguintes glicanos: Glc (a), Glc (a 1-4) Glc (a), Glc (a 1-4) Glc (β) , Gel (β), Glc {β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) , GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β), L-Araf(a), L-Rha (a), Gal (β1-3) [GlcNAc (β1-6) ] GalNAc (a), Gal (β 1-4) GlcNAc (a), Gal (β 1-3) GalNAc (a), Gal (β -1-3) GlcNAc (P),GlcA (β) , GleA (β) , Xyl (a). O sinal dos anticorpos ligados no grupo MS é mais elevado do que o sinal no grupo de controlo normal. 22 A Fig. 6 apresenta a diferença entre os valores médios de ligação de anticorpos anti-glicano entre populações.

Exemplo de Referência 2. Diferenças nos niveis de anticorpos anti-Glc(a) e anti-Glc (a l-4)Glc(a) a IgM no soro entre doentes de MS durante o ataque, doentes de MS estáveis e população saudável.

Foi utilizado uma matriz de glicanos para pesquisar biomarcadores entre o repertório de anticorpos que se ligam ao glicano do soro humano para diferenciar entre uma população saudável e um grupo de doentes de esclerose múltipla (MS), e entre doentes de MS num estado de exacerbação e de remissão. Este exemplo demonstra que dois anticorpos .IgM, anti-Glc(a) e anti-Glc (a l-4)Glc(a), são encontrados em níveis significativamente mais elevados em doentes de MS do que em pessoas saudáveis (sensibilidade e especificidade 60% e 93%, respectivamente), e em doentes de MS num estado de exacerbação relativamente a doentes num estado de remissão (sensibilidade e especificidade 89% e 71%, respectivamente). É também disponibilizado um perfil de anticorpos anti-glicanos para uma população saudável, incluindo uma gama de variação durante um intervalo de 13 semanas. A estabilidade temporal do perfil de anticorpos anti-glicano durante 13 semanas em indivíduos aparentemente saudáveis foi elevada.

Os níveis baixos e de anti-Glc(a) e anti-Glc (α 1-4)Glc(a) IgM numa população normal, e o seu nível elevado em doentes de MS e a elevada estabilidade temporal de anticorpos anti-glicano sugerem que este anti-Glc (a) e anti-Glc (a 1-4)Glc(a)IgM pode servir como biomarcador no diagnóstico precoce, na prescrição precoce de fármacos, na 23 monitorização de efeitos de fármacos e detecção precoce de ataques.

Todas as amostras de soro foram testadas utilizando GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel). Os glicanos encontravam-se ligados covalentemente à superfície plástica, através de um agente de ligação como previamente descrito em (WO02/064556). Uma listagem descrevendo os mono e oligossacarídeos testados é disponibilizada na Tabela 1.

Foram obtidas amostras de sangue a partir de doadores aparentemente saudáveis sob um protocolo de informação de consentimento aprovado pelos comités éticos do Helsinki Human Studies do Belinson Medicai Center Tel-Aviv, Israel, e Carmel Medicai Center em Haifa, Israel. Foram recolhidas amostras de sangue de doentes de MS admitidos na Clinica de Esclerose múltipla no Carmel Medicai Center em Haifa, Israel. As amostras de sangue foram colhidas em tubos evacuados revestidos com silício contendo gel para a separação do soro do coágulo sanguíneo (Estar Technologies). Após coagulação do sangue, o soro foi separado por centrifugação e recolhido. As amostras foram armazenadas congeladas a -25°C até serem utilizadas. 0 volume de todas as soluções adicionadas à matriz de glicanos foi de 10 μΐ/poço. O soro foi diluído (1:20; concentração de saturação) em Tris-HCl 0,15 M pH 7,2, Mg2S04 0,085 M, Tween 20 0, 05% (TBST) contendo 1% de BSA (Sigma), aplicado em placas de uma matriz de glicanos utilizando um sistema automatizado de manipulação da Tecan Genesis Workstation 200, e incubado durante 60 min a 37°C. As placas foram então lavadas com 250 pL/poço de tampão fosfato salino com 0,05% de Tween 20 (PBST, Sigma) num lavador automático de placas (Tecan, PowerWasher™) . Neste ponto foram adicionados os reagentes seguintes diluídos em TBST com 1% de BSA utilizando um dispensador Multidrop 384 (Thermo Labsystems) e incubado durante 60 min a 37°C: para 24 a determinação de IgG, IgA, e IgM -foi utilizada a subclasse respectiva de anticorpo Ig biotinilado de cabra anti-humano (Jackson, PA, EUA) a 2,8 μg/ml, 3 μq/ml, e 0,9 μg/ml, respectivamente; para a. determinação de Ig total -foi utilizada a Proteína A biotinilada (1 μg/ml, ICN Biomedicals). A seguir à lavagem com PBST, estreptavidina conjugada com európio (0,1 μ9/ηα1) diluída em TÇST com 1% de BSA foi adicionada a cada poço seguindo-se incubação durante 30 min a 37 °C no escuro, e lavagem com PBST, Foi então adicionada aos poços a solução de reforço Delfia™ e as placas foram incubadas durante 30 a 45 min no escuro à temperatura ambiente. Foi lida a fluorescência dos poços com um leitor de placas Victor 1420 {Wallac, Finlândia) utilizando parâmetros de fluorescência resolvidos no tempo de 340/612 nm (excitação/ emissão).

As Diferenças nos níveis de anticorpos anti-Glc(a) e Glc(a 1-4) Glc(a)a IgM no soro entre doentes de MS no ataque, doentes de MS estáveis e população saudável.

As amostras de soro foram obtidas a partir de doentes de MS admitidos numa clínica ambulatória para exames regulares após terem assinado formulários de consentimento. O grupo de doentes tinha 80% de pessoas do sexo feminino reflectindo a proporção de sexos na população de MS geral. De acordo com os dados publicados (Ritchie et ai., J. Clin. Lab. Anal. 12:363-70, 1998), foram observados no soro níveis significativamente mais elevados de IgM (mas não para anticorpos IgG ou IgA) tanto em mulheres saudáveis como mulheres com MS, quando comparadas com homens (não apresentado). As análises foram por isso limitadas apenas a sub-populações de mulheres saudáveis e com MS. O soro de doentes MS foram inicialmente rastreados em 54 giicanos 25 {Tabela 1), quanto à presença de anticorpos IgG, IgM e igA com o objectivo de identificar marcadores que iriam confirmar os doentes com eventos de desmielinízação aguda, tal como MS e marcadores que iriam distinguir entre doentes durante fases de exacerbação e de remissão da doença. A experiência foi repetida duas vezes utilizando 5 dos 54 glican-os contra os quais foram encontradas diferenças entre os grupos na volta inicial.

Foi encontrada uma diferença reprodutível e estatisticamente significativa nos niveis de anticorpos IgM anti Glc (a) e antí-Glc(a 1-4) Glc(a) entre os grupos saudáveis e grupos MS (Fig. 7A), mas não foram encontradas diferenças significativas nos niveis de IgG ou IgA nestes estudos (não apresentado). Em soros de ambos os grupos de doentes de MS os níveis de IgM anti Glc (a) e Glc (a 1-4) Glc(a) foram significativamente maiores do que na população saudável. Um valor de corte de um conjunto arbitrário ( o sinal do percentil de '97% da "população saudável") foi utilizado para identificar amostras positivas acima - e amostras negativas - abaixo do valor de corte. Assim, os sinais de ligação a anti- Glc (a) identificaram correctamente 19 das 42 amostras de MS (45% de sensibilidade) e 42 de 44 amostras de soro aparentemente saudáveis (96% de especificidade). Medição da ligação anti-maltose identificou correctamente 48% do soro MS e 95% das amostras do soro aparentemente saudável. Definindo positiva como uma amostra, cujo sinal está acima do valor de corte tanto nos ensaios com anti- Glc (a) como com Glc (a 1-4) Glc(a) melhora a sensibilidade para 60% e deixa a especificidade a 93% (Tabela 2). A distribuição diferencial dos anticorpos anti Glc (a) e Glc(a 1-4) Glc (a) em doentes durante as fases de exacerbação e de remissão da doença era de níveis significativamente mais elevados no 26 primeiro grupo (Fig. 7B). Nao foi encontrada nenhuma diferença entre doentes não tratados, ou doentes tratados com interferão β (não apresentado). Utilizando como valor de corte o percentil 80% da população de MS "estável" foi determinado que os sinais de ligação de anti Glc (a) identificados correctamente 15 de 18 amostras de "ataque" (83% de sensibilidade), 19 de 24 amostras "estáveis" (79% de especificidade relacionadas com estabilidade como livre de sintomas), e 42 de 44 amostras "saudáveis" (95% de especificidade) . A medição da ligação anti-maltose identificou correctamente 72% dos soros de ataque, 79% dos soros "estáveis", e 97% dos "soros saudáveis". Definindo positivo como uma amostra, cujo sinal se encontra acima do valor de corte em cada um dos ensaios Glc(a)OR maltose, resulta na sensibilidade de 89%, e especificidade de 71% e 95% relativamente a amostras "estáveis", ou "saudáveis", respectivamente (Tabela 3) . A elevada especificidade e sensibilidade dos anticorpos anti Glc (a) e anti-Glc(a 1-4) Glc(a)IgM tornam-nos um instrumento eficiente para o diagnóstico precoce e definição de doentes MS. O facto dos níveis destes anticorpos numa situação de ataque por MS serem muito mais elevados do que numa situação estável tornam-nos um instrumento para a identificação precoce e previsão de ataques em doentes de MS surto - remissão.

Foi observada uma elevada correlação entre níveis de soro de anticorpo IgM anti Glc (a) em soros de mulheres diagnosticadas clinicamente como doentes de MS (surto -remissão) que foram definidas como positivas por terem anticorpo IgM anti Glc (a) (como descrito acima) e a escala de EDSS das mulheres (Escala Expandida do Estado de Incapacidade) foi observada, ver Fig. 8, gráfico esquerdo. Não existia correlação entre EDSS e os níveis de IgM anti Glc (a) no soro de mulheres, diagnosticadas clinicamente 27 como doentes de MS (surto - remissão), que foram definidos como negativos por terem anticorpo IgM anti Glc (a) , ver Fig. 8 gráfico esquerdo. A elevada correlação indica que os níveis de IgM anti Glc (a) no soro podem actuar como um biomarcador molecular de substituição para avaliar a actívidade da doença.

Alcance temporal dos níveis de anticorpos anti-glicano

Quando se considera qualquer parâmetro biológico para utilizar como biomarcador de substituição é obvíamente um pré-requisito que o biomarcador não seja variável no tempo na população normal. Assim, os níveis dos anticorpos IgG, IgA, e IgM anti-LRha(a), e anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β)(β celotriose) em sete voluntários saudáveis foram seguidos durante 13 semanas (Fig. 9). Em geral foi constatado que as concentrações de anticorpo no soro variam entre os diferentes indivíduos, mas são bastante estáveis ao longo do tempo. Por exemplo o soro #9161 e #9162 possuem níveis relativos extremamente elevados e temporalmente estáveis de anticorpos IgA anti-GlcNAc (a) e Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) respectivamente, mas possuem níveis relativamente normais de anticorpos IgA anti-LRha(a) e IgG e IgM. Quando ocorrem alterações no nível de anticorpos são frequentemente graduais e continuam ao longo de várias semanas (por ex. soro #9162; IgA anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) , mas pode também ser repentino, por ex. soro #9172; IgM anti-LRha(a), que aumenta repentinamente entre a semana quatro e cinco e depois novamente volta lentamente ao seu nível básico.

Exemplo 4 . Perfil de anticorpo anti-glicano (AGAP) numa população humana normal 28

Foi determinada a ligação do anticorpo Ig total (detectada com a proteína A) de soros de 72 indivíduos a 34 mono e oligossacarídeos (Figura 11 e Tabela 5), e a ligação de IgG, IgA e IgM de 200 soros a seis mono e oligossacarídeos (Fig 15A-C). Os sinais mais fortes foram registados contra anticorpos contra GlcNAc(a) e LRha(a), enquanto que foram observados níveis mais baixos contra olissacarídeos de glucose ligados como β4, GlcNAc (β) , GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) , Gal (α) e Gal (a l-3)Gal^ 1-4)GlcNAc^). Isto apresenta uma boa concordância com os dados publicados anteriormente que apresentam a distribuição de anticorpos anti-glicano num conjunto de soro humano comercialmente disponível (WO02/064556). 0 AGAP das subclasses de IgG e IgA eram semelhantes ao AGAP de Ig total, enquanto que o do IgM era mais baixo e mais uniforme entre os diferentes glicanos. Os anticorpos anti-glicano da população tende a ajustar-se a uma distribuição lognormal ver Fig. 15A-15C. É evidente que uma variação considerável nos niveis do anticorpo anti-glicano existem entre indivíduos na população examinada, um facto que sugere a existência de AGAPs individuais, mas que limita a pesquisa de marcadores de anticorpos anti-glicano presentes em pequenas quantidades.

Glicanos imobilizados em esferas de afinidade foram também utilizados para purificar anticorpos de olissacarídeos de glucose ligados como β4 e LRha(a). O seu perfil de ligação e especificidade são descritos nas Figs. 13, 14A e 14B.

Exemplo de Referência 8. Utilização de anticorpos anti-glicano para diferenciar entre doentes de arterosclerose de alto risco com placas vulneráveis e arterosclerose de baixo risco com placas estáveis 29 Níveis de anticorpos antiglicano no soro de doentes de arterosclerose com placas vulneráveis foram comparados com os níveis de anticorpos de glicano no soro de doentes de arterosclerose com placas estáveis, assim como em indivíduos sem arterosclerose. A arterosclerose é uma grande causa de morbilidade e mortalidade em países desenvolvidos. É uma desordem sistémica das paredes dos vasos sanguíneos que conduz ao desenvolvimento de placas arteroscleróticas nas paredes dos vasos sanguíneos. Algumas destas placas tornam-se mais tarde vulneráveis à ruptura, provocando coágulos sanguíneos dando origem a ataques cardíacos, ou acidentes vasculares.

Os principais componentes das placas arteroscleróticas são proteoglicanos, lípidos, células musculares, e glóbulos brancos (células T e macrófagos) . Além disso, a arterosclerose é considerada como uma doença autoimunitária em que um dos seus iniciadores é a reactividade ' cruzada entre anticorpos a antigénios bacterianos e a antigénios nas paredes dos vasos sanguíneos.

Um ponto . importante no desenvolvimento da arterosclerose é o desvio das placas estáveis (SP) que estão associadas com baixo risco, a placas inflamáveis vulneráveis (VP) que estão associadas com alto risco. A diferenciação entre SP e VP é clinicamente problemática, uma vez que uma distinção conclusiva só pode apenas ser efectuada numa autópsia pós-mortem.

Foram fornecidas amostras de soro pelo Dr. Jacob Georg do departamento de cardiologia do Centro Médico de- Tel Aviv, Israel. Todos os doentes eram homens não diabéticos com uma gama de idades de 30 a 69 anos. Foram testadas amostras de 39 soros de doentes dos tipos seguintes:

Angina instável -13 doentes de arterosclerose caracterizados por terem síndromas coronários agudos 30 (enfartes do miocárdi.o de onda Q, ou de não onda Q) . Consideram-se que ambos se desenvolvem a partir da ruptura de placas vulneráveis. Membros do grupo da angina instável incluem doentes de síndroma coronário agudo admitidos com dor no peito e alterações no ECG, ou com uma elevação do marcador cardíaco. Queixaram-se de um início de angina recente (< 3 dias) e foram sujeitos a uma monitorização telemétrica de electrocardiograma (ECG) contínua durante a admissão. Foi detectado pelo menos um episódio de angina em repouso, ou um episódio com uma duração de mais do que 20 min durante as últimas 48 h simultaneamente com um aumento na creatina cinase, níveis de MB, ou níveis de Troponina. Os membros deste grupo tinham sido sujeitos a angiografia coronária (cateterização), que documentou a presença de arterosclerose coronária.

Angina estável -13 doentes de .arterosclerose foram caracterizados como tendo angina estável. Membros do grupo da angina estável tinham sido submetidos a angiografia coronária (cateterização) documentando a presença de arterosclerose coronária. Não foram detectadas alterações no ECG, nem foram detectados aumentos na creatinina cinase, níveis de MB, ou de Troponina.

Sem placas - 13 doentes com artérias coronárias normais.. Membros do grupo "sem placas" não apresentaram evidência de arterosclerose coronária após cateterização.

Um perfil de anticorpo anti-glicano foi obtido utilizando matrizes GlycoChip™ {Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat N°. 9100), construído utilizando os procedimentos descritos na WOOO/49412. Todas as amostras de soro foram testadas utilizando placas GlycoChip™ que continham uma matriz de mono e oligossacarídeos ligados covalentemente num volume reduzido de uma placa de microtitulação de 384 poços. A lista de mono e 31 oligossacarídeos exibidos pela matriz, assim como os seus números de série são descritos na Tabela 4.

Os soros foram diluídos de (1:20) em TBST dispensados numa placa GlycoChio™ utilizando um robot Tecan Genesis Workstation 200 (10 μΐ,/ροςο) e incubados durante 30 min a 25°C. Cada amostra de glicano e soro na placa foi testada 8 vezes.

As placas foram lavadas com 250 μΒ/poço de tampão de sal elevado (KNa 0,15 M pH 7,2, NaCl 2M, MgS04 0, 085 M, 0,05% de Tween 20) num lavador de placas automático (Tecan, PowerWasher™) . (dez μΐ/poço de IgG, IgM ou IgA biotinilados de cabra anti- humano (Jackson, PA, EUA), 1 μ/ml em TBST, foi aplicada manualmente e as placas foram incubadas durante 30 min a 25°C. A placa foi novamente lavada com tampão com muito sal.

Estreptavidina conjugada com európio, Wallac, AD0062 (1 μ/ml, ΙΟμΙ/poço) foi adicionada manualmente, seguindo-se uma incubação durante 30 min a 25°C no escuro. A lavagem das placas com o tampão de sal elevado foi repetida. O tampão de reforço Delfia™, (Wallac, 730232, 10 μΐ/poço) foi adicionado aos poços e as placas foram incubadas durante pelo menos 30 min no escuro. A fluorescência dos poços foi lida pór um Victor 1420 (Wallac) utilizando os parâmetros resolvidos no tempo Emi.612 nm e Ext. 340 nm. O sinal de ligação do glicano obtido para o grupo "Sem placa" foi utilizado para calcular valores de corte para cada glicano acima, para os quais os doentes foram considerados positivos. Estes valores de corte foram definidos como o sinal médio do grupo "Sem placa" mais um ou dois desvios padrão. De acordo com esta definição foram identificados vários glicanos que tinham algum poder de separação entre os grupos de doentes (ver abaixo). "Separação" baseada, num determinado glicano foi definida 32 como pelo menos do 50% (7/13) amostras positivas nos grupos "Angina Instável", ou "Angina Estável" e 2 ou menos amostras positivas no grupo "Sem placa". A Fig. ISA é uma representação matricial de glicanos utilizados para examinar o soro de doentes que sofrem de angina instável, ou estável, as estruturas de glicano são descritas na Tabela 4. Glicanos contra os quais níveis de anticorpos significativamente diferentes foram medidos em grupos de doentes diferentes foram marcados com quadrados a cheio. O nível de corte da média mais dois desvios padrão "Separação" foi conseguida com a ligação de IgA a dois glic anos diferentes. Um separou entre anticorpos IgG, mas nenhum separou entre anticorpos IgM.

Os glicanos individuais que dão as melhores separações são apresentados abaixo:

Glicanos Resultado Angina Instável Angina estável Sem Placa Positivos 7 5 0 Ab Negativos 6 8 13 Positivos 1 9 1 Fb Negativos 12 4 12

Alguns glicanos que não foram definidos como "separando" deram ainda algum grau de separação. Quando utilizados em combinações, a separação poude ser melhorada para além daquela obtida com os glicanos individuais. Os glicanos são apresentados abaixo 33 Código linear dos glicanos Resultado Angina Instável Angina estável Sem Placa Aa Positivos 6 2 0 Negativos 7 11 13 Xb Positivos 1 6 0 Negativos 12 7 13 Fa Positivos 5 3 1 Negativos 8 10 12 A[3S]b Positivos 1 5 1 Negativos 12 7 12 GNb4GNb Positivos 5 0 1 Negativos 8 13 12 A Fig. 16B é uma representação gráfica que mostra os níveis de anticorpos contra os glicanos #2 e #29 nos três grupos de doentes. 0 gráfico inclui sinais de 50% da população. As linhas espessas e finas no gráfico representam os valores médios e da mediana, respectivamente. Os limites do gráfico mais perto de zero indicam o percentil 25 e os limites do gráfico mais . longe de zero indicam o percentil 75. Os intervalos acima e abaixo indicam o percentil 90 e 10. A Fig. 17 é um histograma que apresenta o número de amostras nos três grupos de doentes positivos para os anticorpos anti-IgA contra o glicano #2 ou glicano #29. A Fig. 18A é um histograma que apresenta a distribuição de níveis de anticorpos contra os glicanos #2 e #15 nos 3 grupos de doentes. O gráfico inclui os sinais de 50% da população. As linhas espessas e finas no gráfico representam os valores médios e da mediana, respectivamente. Os limites do gráfico mais perto de zero indicam o percentil 25 e o limite do gráfico mais longe de zero indica o percentil 75. Os intervalos acima e abaixo indicam o percentil 90 e 10. 34 A Fig. 18B é um histograma que apresenta o número de amostras nos três grupos de doentes positivos pará os anticorpos anti-IgA contra o glicano #2, ou o glicano #15. No nível de corte da média mais um desvio padrão, a "Separação" foi conseguida com a ligação de IgA a 6 diferentes glicanos. Os níveis de anticorpo IgG e IgM não eram diferentes nos três grupos. A separação obtida com combinações é indicada a seguir. (Aa foi utilizado porque o número de amostras positivas no grupo de "Angina Estável" foi mais baixo do que quando se utiliza Ab, melhorando deste modo a separação em relação ao grupo de "Angina Instável"):

Glicanos Resultado Angina Instável Angina estável Sem Placa Aa e GNb4GNb Positivo com um dos glicanos 8 2 1 Negativos com ambos 5 11 12 As 8 Ga4Ga Positivo com um dos glicanos 8 5 0 Negativos com ambos 5 8 13 A especificidade e sensibilidade do teste para detectar "Angina Instável" utilizando Aa e GNb4GNb foi assim de 62% (8/13) e 88% (23/26), respectivamente.

Uma combinação de três glicanos , Aa, GNb4GNb, e Fb tornou possível determinar a especificidade também para o grupo de "Angina estável" 75% (9/13). Isto tem origem no facto de que Fb detecta na maior parte "Angina estável". A 35 especifícidade e a sensibilidade do ensaio combinado são sumarizadas na Fig. 19.

Estes resultados demonstram que a combinação de glicanos (Gal (oo) , GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) e Fu^) pode ser utilizada para distinguir com êxito entre populações de angina estável e instável com uma especificidade de 62% e sensibilidade de 88%. Estes resultados mostram que é possível desenvolver um biomarcador baseado na ligação a glicanos de anticorpos IgA que distingue entre doentes de angina estável e angina instável.

Exemplo de referência 9. Utilização de anticorpos anti-glicano para diferenciar doentes de arterosclerose de elevado risco com placas vulneráveis e doentes de arterosclerose de baixo risco com placas estáveis Níveis de anticorpos anti-glicano no soro de doentes de arterosclerose com placas vulneráveis foram comparados com os níveis de anticorpos de glicano no soro de doentes de arterosclerose com placas estáveis, assim como em indivíduos sem arterosclerose. A arterosclerose é uma causa majoritária de morbilidade e mortalidade em países desenvolvidos. É uma desordem sistémica das paredes dos vasos sanguíneos que conduz ao desenvolvimento de placas arteroscleróticas nas paredes dos vasos sanguíneos. Algumas destas placas tornam-se mais tarde vulneráveis à ruptura, provocando coágulos sanguíneos dando origem a ataques cardíacos, ou acidentes vasculares.

Os principais componentes das placas arteroscleróticas são proteoglícanos, lípidos, células musculares, e glóbulos brancos (células T e macrófagos). Além disso, a arterosclerose é considerada como uma doença autoimunitária em que um dos seus iniciadores é a reactividade cruzada 36 entre anticorpos a antigénios bacterianos e a antigénios nas paredes dos vasos sanguíneos.

Um ponto importante no desenvolvimento da arterosclerose é o desvio das placas estáveis (SP) que estão associadas com baixo risco, a placas inflamáveis vulneráveis (VP) que estão associadas com alto risco. A diferenciação entre SP e VP é clinicamente problemática, uma vez que uma distinção conclusiva só pode ser efectuada numa autópsia pós-mortem.

Foram fornecidas amostras de soro pelo Dr. Jacob Georg do departamento de cardiologia do Centro Médico de Tel Aviv, Israel. Todos os doentes eram·homens não diabéticos com uma gama de idades de 30 a 69 anos. Foram testadas amostras de 72 soros de doentes dos tipos seguintes:

Angina instável -24 doentes de arterosclerose caracterizados por terem sindromas coronários agudos (enfartes do miocárdio de onda Q, ou de não onda Q) . Consideram-se que ambos se desenvolvem a partir da ruptura de placas vulneráveis. Membros do grupo da angina instável incluem doentes de síndroma coronário agudo admitidos com dor no peito e alterações no ECG, ou com uma elevação do marcador cardíaco. Queixaram-se 'de um início de angina recente (< 3 dias) e foram sujeitos a uma monitorização telemétrica de electrocardiograma (ECG) contínua durante a admissão. Foi detectado pelo menos um episódio de angina em repouso, ou um episódio com uma duração de mais do que 20 min durante as últimas 48 h simultaneamente com um aumento na creatina cinase, níveis de MB, ou níveis de Troponina. Os membros deste grupo tinham sido sujeitos a angiografia coronária (cateterização), que documentou a presença de arterosclerose coronária. 37

Angina estável -24 doentes de arterosclerose foram caracterizados como tendo angina estável. Membros do grupo da angina estável tinham sido submetidos a angiografia coronária (cateterização} documentando a presença de arterosclerose coronária. Não foram detectadas alterações no ECG, nem foram detectados aumentos na creatinina cinase, níveis de MB, ou de Troponina.

Sem placas - 24 doentes com artérias coronárias normais. Membros do grupo "sem placas" não apresentaram evidência de arterosclerose após cateterização.

Um perfil de anticorpo anti-glicano foi obtido utilizando matrizes GlycoChip™ (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat N°. 9100), construído utilizando os procedimentos descritos na WOOO/49412. Todas as amostras de soro foram testadas utilizando placas GlycoChip™ (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat N°. 9100), que continham uma matriz de mono e oligossacarídeos ligados covalentemente num volume reduzido de uma placa de microtitulação de 384 poços. A lista de mono e oligossacarídeos exibidos pela matriz, assim como os seus números de série são descritos na Tabela 4.

Os soros foram diluídos de (1:20) em TBST dispensados numa placa GlycoChip™ utilizando um robot Tecan Genesis Workstation 200 (10 pL/poço) e incubados durante 30 min a 25 graus Celsius. Cada amostra de glicano e soro na placa foi testada 8 vezes.

As placas foram lavadas com 250 pL/poço de tampão de sal elevado (KNa 0,15 M pH 7,2, NaCl 2M, MgS04 0, 085 M, 0,05% de Tween 20) num lavador de placas automático (Tecan, PowerWasher™) . (dez μΐ/poço de IgA biotinilada de cabra anti-humano (Jackson, PA, EUA), 1 μ/ml em TBST, foi aplicada manualmente e as placas foram incubadas durante 30 38 min a 25°C. A placa foi novamente lavada com tampão de sal elevado.

Estreptavidina conjugada com európio, Wallac, AD0062 (1 μ/ml, ΙΟμΙ/poço) foi adicionada manualmente, seguindo-se uma incubação durante .30 min a 25°C no escuro. A lavagem das placas com o tampão de sal elevado foi repetida. O tampão de reforço Delfia™, (Wallac, 730232, 10 μΐ/poço) foi adicionado aos poços e as placas foram incubadas durante pelo menos 30 min no escuro. A fluorescência dos poços foi lida por um Victor 1420 (Wallac) utilizando os parâmetros resolvidos no tempo Emi.612 nm e Ext. 340 nm. 0 valor de corte foi calculado a partir do percentil 80 da população normal. De acordo com esta definição foram identificados vários glicanos que possuíam algum grau de poder de separação entre grupos de doentes (ver abaixo). "Separação" baseada num determinado glicano foi definida como pelo menos 50% (12/2,4) amostras positivas nos grupos de "Angina Instável", ou "Angina estável", e 5 ou menos amostras positivas no grupo "Sem Placa". Código linear dos glicanos Angina Instável Angina estável Sem Placa Gs 4 Gâ Positivos %Positivos 12 2 5 52 8 21 Gb Positivos %Positivos 19 10 5 83 42 21 ANa Positivos %Positivos 13 8 5 57 33 21 ANb Positivos IPositivos 15 8 5 65 33 21 GNb4GNb Positivos %Positivos 13 8 5 57 33 21 Xa Positivos %Positivos 21 7 5 100 29 21

Estes resultados demonstram que a combinação de glicanos (Glc(a 1-4), Glc(oc), Glc(p) GalNAc(a) GalNAc(p) 39

GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) e Xilose (α) pode ser utilizada com êxito para distinguir entre populações de angina estável e instável. Estes resultados demonstram que é possível desenvolver um biomarcador baseado na ligação ao glicano de anticorpos IgA que distingue entre doentes de angina estável e angina instável.

Exemplo de Referência 10. Ligação de células CD4+ a uma pluralidade de glicanos imobilizados num substracto sólido

Foi . examinada a ligação de células CD4+ de -7 indivíduos saudáveis a 47 fragmentos de glicanos diferentes imobilizados numa micromatriz.

Materiais e Métodos

Foi retirado 20 ml de sangue fresco de cada um dos 7 indivíduos utilizando tubos EDTA-Vaccutainers de 10 ml. Amostras de células periféricas foram centrifugadas (230 x g, 900 RPM, 10 minutos à temperatura ambiente) . 0 plasma foi então separado e 2 ml da fracção celular de topo foi transferida para um tubo de 15 ml. Para enriquecimento das células CD4+ foi adicionado 100 μΐ do reagente RosetteSep aos tubos e incubado à temperatura ambiente durante 20 minutos. As amostras foram então diluídas duas vezes em PBS/ 2% FCS e 5 ml de Ficoll foi colocado debaixo da suspensão celular utilizando uma pipeta Pasteur de vidro.

Os tubos foram centrifugados durante 30 min à temperatura ambiente, 2400 RPM (-700 x g) com o travão da centrífuga desligado. Após centrifugação, os tubos foram removidos cuidadosamente da centrífuga, a camada superior foi retirada cuidadosamente utilizando uma pipeta estéril deixando a camada de linfócitos não perturbada na interface. Utilizando uma pipeta estéril a fracção de 40 leucócitos foi transferida para um tubo limpo, e o tubo foi completamente cheio com PBS/2% FCS. As células foram lavadas novamente duas vezes por centrifugação durante 10 minutos, 230xg (1000 RPM) e novamente suspensas em PBS/2% FCS. Após as centrifugações as células foram novamente suspensas em 500 μΐ RPMI/1640 2% FCS.

As células foram diluídas na solução de Tiirk 1:10 e contadas. Após contagem as células foram diluídas para uma densidade de 5xlOs células/ ml em RPMI/1640 2% FCS e depois aplicada numa placa de 24 poços de lml/poço. As suspensões celulares foram incubadas de um dia para o outro num incubador com 95% de humidade, 37°C, 5% de CO2 -

Para determinar o rendimento de separação das células por separação por FACS, 250000 células foram suspensas em 1 ml de tampão FACS e depois centrifugadas 10 minutos a 2000 RPM a 4°C. O sobrenadante foi decantado. As células foram novamente suspensas em 50 μΐ de tampão de FACS e marcadas com 5 μΐ de anticorpo anti-CD4. As células foram incubadas durante 30 minutos em gelo, protegidas da luz, adicionou-se 1 ml de tampão FACS arrefecido com gelo e centrifugou-se durante 10 minutos, 2000 RPM, 4°C. As células foram então novamente suspensas em 300 μΐ de tampão FACS, guardado sobre gelo e avaliado numa máquina de FACS.

GlycoChips foram colocadas em porta-lâminas em recipientes de plástico embebidos com papel humedecido para reter a humidade. 1,2 μΐ/ poço de suspensão celular foi aplicado na GlycoChip e depois incubada em incubador com 5% de CO2 (95% de humidade, 37°C) durante uma hora. Após a incubação as lâminas foram colocadas cuidadosamente com o lado superior para baixo na câmara de centrifugação imersa em PBS. Os GlycoChips foram centrifugados durante dois minutos a 700 RPM (força g mínima, ~50 x g) . As lâminas foram observadas ao microscópio e fixadas em PBS/3,7% à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos. As 41 lâminas foram então lavadas cuidadosamente 3x em água destilada e secas ao ar.

Foi preparada uma solução de iodeto de propidio em PBS e aplicada a 1,2 μΐ/ poço. Os GlycoChips foram incubados em condições de humidade durante 15 minutos e depois lavados suavemente 3x mergulhando em água destilada. As lâminas foram secas ao ar, no. escuro e analisadas com os parâmetros do iodeto de propidio Ext. 535 nm Emi. 655 nm numa matriz de varrimento. A imagem foi analisada e as densidades celulares foram determinadas.

Resultados

Os glicanos e‘ controlos utilizados para os estudos de ligação são apresentados na Fig. 20 abaixo. As estruturas são escritas na sintaxe LINEARCODE™, ver tabela 1 para a tradução.

Na Fig. 20 é apresentado um perfil de ligação de células CD4+ de um único indivíduo a vários glicanos. É indicada a ligação em DLU/mm2 para cada glicano, ou controlos. A ligação de células CD4+ de sete indivíduos é apresentada nas Figs. 21A. A Fig.21A apresenta a fluorescência relativa mediana para células CD4+ de cada um dos sete indivíduos.

Estes resultados demonstram que a ligação de células CD4+ varia entre vários glicanos. A ligação maís forte foi observada nos glicanos seguintes, na sua ordem relativa de afinidade: células CD4+ ligam-se aos seguintes glicanos apresentados no código linear; NNa3Ab4(Fa3)GNb> Mb4Gb > GNb4GNb> Ma3Ma > Ab6Ab. A ligação de células CD4+ a glicanos com resíduos terminais de manose, ou com resíduos X sialilo de Lewis foi também detectada. A variação da ligação de células CD4+ a determinados glicanos foi também detectada entre vários indivíduos. 42

Outras Concretizações

Deverá ser entendido que enquanto que a invenção foi descrita conjuntamente com a sua descrição detalhada, é objectivo da descrição anterior ilustrar e não limitar o âmbito da invenção que é definido pelo âmbito das reivindicações em anexo.

Tabelas e Figuras: 43

Tabela 1. Sacarideos apresentados pela matriz de glicanos

Glicano IUPAC LINEARCODE® Nome Comum 0 PNP-OH PNP-0 1 Gd. 1 (ct) Aa 2 Gal (β) Ab 3 Gal(β 1-3)GalNAc(α) Ab3ANa 4 Gal(p 1-3) GlcNAc (β) Ab3GNb 5 Gal (β l-4)Glc(p) Ab4Gb Lactose 6 Gal(β 1-6)Gal(β) Ab 6 Ab 7 GalNAc(a) ANa 8 GalNAc(β) ANb 9 Fuc(a) Fa 10 Fuc(β) Fb 11 Glc(a) Gci 12 Glc(a l-4}Glc(a) Ga 4 Ga Maltose 13 . Glc(a 1-4)Glc{β) Ga 4 Gb 14 Ο1ο(β) Gb 15 Glc(p 1-4)ΰ1ο(β) Gb4Gb Gelobiose 16 Gic(p ι-4)σΐο(β ι-4)gic(β) Gb4Gb4Gb Celotriose 17 Glc^ 1-4 ) Glc (β l-4)Glc^ 1-4) Glc Gb4Gb4GbGb4 Gb Celopentao- se 18 Glicerol Glicerol 19 GlcNAc(a) GNa .20 GlcNAc(β) GNb 21 GlcNAc{β 1-3)GalNAc(a) GNb3ANa 22 GlcNAc(β 1-4)GlcNAc(β) GNb4GNb Quitobiose 23 L-Rha(a) Ha 24 GalA(P) Lb 25 Man(a) Ma 26 Man(β) Mb 44Tabela 1. (Continuação)

Glicano IUPAC linearcode®- Nome Comum 27 Neu5Ac(a} NNa 28 L-Axaf(a) Ra 29 GlcA(p) Ub · 30 X(a) Xa 31 x (P) Xb ' 32 Gal (β 1-3)[GlcNAc(β 1-6)] GalNAc(a) Ab3(GNb6)AN a 33 Gal(β 1-4)GlcNAc(α) Ab4GNa 34 Gal(al-3) Glc (β1 — 4) GlcNAc(β) Aa3Ab4GNb Linear B-2 35 Gal(al-3) Gal(pl-4) GalNAc(β) Ab 4 GNb N-acetil 36 Man C β1 — 4) GlcNAc(P) Mb 4 Gb 37 GlcNAc< β1-6) GalNAc(α) GNb6ANa 38 Fuc(a 1-2)Gal(β) Fa2Ab 39 Neu5Ac(a 2-3)θ3ΐ(β 1-4)[Fuc(a 1 NNa3Ab4(Fa3 ) GNb Sialil Lewis X 40 Man(a 1-3) Man(a) Ma3Ma 41 GlcNAc(β)6-sulfato GN[6S]b 42 Glc^ 1-3) Glc (β) Gb3Gb 43 Gal(β) 3-sulfato A[3S]b 44 Nsu5Ac(a 1-3)Gal(β 1-4)GlcNAc(β) NNa3Ab4GNb Sialil lactosami- na 45 Man(a 1-3) [Man(a 1-6)] Man(β) 46 Neu5Ac(a 1-3)Gal(β 1-4)Glc(β) NNa3Ab4Gb Sialil lactose 47 GlcNAc(β 1-3)Gal(al-4)σΐο(β) GNb3Ab4Gb Lacto-3 48 Gal(al-4)Gal(β1-4) Glc(p) Aa4Ab4Gb Antigénio Pk 49 Neu5Ac(a 1-6)Gal(β 1-4)GleNAc(β) NNa6Ab4GNb 50 Gal{a 1-4 ) [Fucp(al-3)] GlcNAc(b) Ab4(Fa3) GNb Lewis X 51 Neu5Ac(a l-3)Gal(p 1-4) [Fuc (al-31 NNa3Ab3(Fa4 ) GNb Sialil Lewis A 52 Man(β1-6) Mania) Ma6MaNNa3Ab 3 GNb Sialil Lewis C 53 Neu5Ac(a 1-3)Gal(β 1-3)GlcNAc(β) 54 Neu5Ac(a l-3)Gal^ 1-3)GlcNAc(a) NNa3Ab3ANa Antigénio SiT 45

Tabela 2. Número de amostras . positivas que têm sinais de ligação acima do percentil 97% da população saudável

Glicano Resultado MS Saudável Glc(a) Positivo 19/42 (45%) 2/44 (4,5%) Negativo 23/42(55%) 42/44 (96%) Glc(al-4) Positivo 20/42 (48%) 2/44 (4,5%) Glc(a) Negativo 22/42 (52%) 42/44 (96%) Glc(al-4) Positivo 25/42 (60%) 3/44 (6,8%) Glc(a)OR Glc(a) Negativo 17/42 (40%) 41/44 (93%)

Tabela 3. Número de amostras positivas possuindo sinais de ligação acima do percentil 80% da população de MS "estável"

Glicano Resultado Ataque Estável Saudável Glc(a) Positivos 15/18 5/24 (21%) 2/44 (83%) (4,5%) Negativos 3/18 (17%) 19/24 42/44 (79%) (96%) Glc(al-4) Glc(a) Positivos 13/18 (72%) 5/24 (21%) 2/44 (4,5%) Negativos 5/18 (28%) 19/24 (79%) 42/44 (96%) Glc(al-4) Glc(a) ORGlc(a) Positivos 16/18 (89%) 7/24 (29%) 2/44 (4,5%) Negativos 2/18 (11%) 17/24 (71%) 42/44 (96%)

Tabela 4 N° Linear Code ™ 1 A[3S]b 2 Aa 3 Aa3Ab4GNb 4 Aa4Ab4Gb 5 Ab 6 Ab3(GNb6)ANa 7 Ab3ANa S Ab3GWh 9 Ab4(Fa3)GNb 10 Ab4Gb 11 Ab4GNb 12 AbSAb 13 ANa 14 ANb 15 Fe 16 Fa2Ab 17 Fb 18 Ga 19 Ga4Ga 20 Ga4Ga 21 Gb 22 GbSGb 23 Gb4Gb4Gb 24 GN[6S]b 25 GNa 26 GNb 27 GNb3Ab4Gb 28 GWb3ANa 29 GNb4GNb 30 GNbSANa 31 Ha 32 Lb 33 Ma 34 Ma3(Ma6)Mb 35 Ma3Ma 36 MaõMa 37 Mb 38 Mb4Gb 47 (continuação) N° LinearCode™ 39 NNa3Ab3(Fa4)GNb 40 NNa3Ab3ANa 41 NNa3Ab3GNb 42 NNfa3Ah4Gb 43 NNa3Ab4GNb 44 NNa6Ab43Nb 45 OH 46 Ra. 47 NNa3Ab4(Fa3)GNb 43 Ub 49 Xa 50 Xb 48

Tabela 5

Tabela 5. Sacarideos apresentados na matriz de glicanos e nivel de anti-glicano N° do Glicano Glicano LinearCode® 11 Ligação de Ab (RFU)a Ab Relativo 0 pAP - NA NA t Gaí (a) Aa 131,069 10 2 Gal m Ab 119,034 14 3 Gal φ 1-3) GalNAc (a) Ab3Ana 52.853 4 Gaí (p 1 -3) GlcNAc (β) Ab3GNb 56,239 5 Gal ([11 -4) QIC (β) AMGb 92,170 3 Gal (β 1-6} Gal (β) AbSAb 151,313 11 7 GalNAc (a) ANa 64,429 B GalNAc (β) ANb 57,832 10 Fuc («.) Fa 47,727 11 Fuc (fj) Fb 63,782 12 Glc [a] Ga 109,091 13 Glc [a 1-4} Glc (a) Ga4Ga 80,024 14 Glc (a 1-4) Glc (β) Ga4Gb 127,594 13 15 Glc (β) Gb 112,513 16 Glc (β 1 -4) Glc (p) Gb4Gb 239,330 9 17 Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Gb4Gb4 284,361 7 13 Glc {p 1-4) Glc {β 1-4) Gb4Gb4 311,235 5 19 Glycero! Glycerol 52,884 20 . QicNAc (a) GNa 1,031,130 1 21 GlcNAc (β) GNb 311,341 22 GlcNAc (β 1-3) GalNAc GNb3A 294,624 6 49 (continuação) 23 GlcNAc (β 1-4) GlcNAc GNb4G 433,604 3 24 L-Rha (ix) Ha 662,337 2 25 GalA φ) Lb 96,801 26 . Man (a) Ma 83,647 27 Man (P) Mb 77,533 28 NeuSAc («) NMa 52,028 29 L-Araf (cx) fla 51,230 30 GlcA (P) Ub 56,719 31 Χ(°0 Xa 55,806 32 X{«) Xb 78,776 33 Gal (p1 -3) [GlcNAc Ab3(GN 84,080 34 Gal (p 1-4) GicNAc (nt) Ab4GNa 143,036 12 36 Gal (β1-3) Gal (JJ1- Aa3Ab4 268,549 8

Tabela 5. Sacarideos apresentados na matriz de glicanos e nivel de anti-glicano N° do Glicano LinearCode® Ligação de Ab Glicano Ab (RFU)a Relativo

Lisboa, 21 de Janeiro de 2008

Claims (27)

1 Reivindicações 1. Método para diagnosticar esclerose múltipla num sujeito compreendendo o método: a detecção de um anticorpo anti-Glc (ccl-4) Glc (a) numa amostra teste obtida de um sujeito; e a comparação dos niveis do dito anticorpo na dita amostra teste com uma amostra de controlo em que a dita amostra de controlo é seleccionada a partir de um ou mais indivíduos que possuem sintomas de esclerose múltipla e possuem um estado de esclerose múltipla conhecido e um ou vários indivíduos que não apresentam sintomas de esclerose múltipla; diagnosticando deste modo esclerose múltipla no dito sujeito.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito método compreender ainda a detecção de pelo menos um outro anticorpo, em que pelo menos um outro anticorpo é seleccionado a partir de um anticorpo anti-Glc (a), um anticorpo anti-Glc (a 1-4) Glc (β) , um anticorpo anti-Glc (β); um anticorpo anti-Gal (β); um anticorpo anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) , um anticorpo anti-GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β), um anticorpo anti-L-Araf(a) , um anticorpo anti-L-Rha (a), um anticorpo anti-Gal (β1-3) [GlcNAc (βΐ—6)] GalNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-4) GlcNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-3) GalNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-3) GlcNAc (β) , um anticorpo anti-GlcA (β), um anticorpo anti-GlcA (β), ou um anticorpo anti-Xyl (a) 2 e comparando os níveis de pelo menos um outro dito anticorpo na dita amostra teste com os níveis do pelo menos outro anticorpo na dita amostra de controlo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o dito método compreender a detecção de pelo menos três dos ditos outros anticorpos.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o dito método compreender pelo menos cinco dos ditos outros anticorpos.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por pelo menos um outro dito anticorpo ser anti-Glc(a).

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita amostra de controlo consistir numa população de um ou vários indivíduos que não apresentam sintomas de esclerose múltipla.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita amostra de controlo consistir numa população de um ou vários indivíduos que possuem sintomas de esclerose múltipla com um estado conhecido de esclerose múltipla.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita amostra teste ser um fluido biológico.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o dito fluido biológico ser sangue completo, soro, plasma, fluido da medula espinal, urina, ou saliva.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fluido biológico ser soro. 3

11.. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito sujeito ser do sexo feminino.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito sujeito ser do sexo masculino.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito anticorpo anti-Glc (a 1-4) Glc (a) ser um anticorpo do tipo IgM.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito anticorpo anti-Glc (a 1-4) Glc (a) ser um anticorpo do tipo IgA.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito anticorpo anti-Glc (a 1-4) Glc (a) ser um anticorpo do tipo IgG.

16. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o dito anticorpo anti-Glc (a) ser um anticorpo do tipo IgM.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito anticorpo anti-Glc (a 1-4) Glc (a) ser um anticorpo do tipo IgM.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito diagnóstico ser um diagnóstico precoce da esclerose múltipla.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita amostra de controlo ser determinada utilizando uma avaliação através da Escala Expandida do Estado de 4 Incapacidade (EDSS) ou por avaliação por Imagem de Ressonância Magnética (MRI).

20. Kit para diagnosticar sintomas associados com a esclerose múltipla compreendendo o kit: um primeiro reagente que detecta especificamente um anticorpo anti-Glc(a 1-4)Glc(a); um segundo reagente que detecta especificamente um segundo anticorpo seleccionado a partir de um anticorpo anti-Glc (a), um anticorpo anti-Glc (a 1-4) Glc (β) , um anticorpo anti-Glc (β); um anticorpo anti-Gal (β); um anticorpo anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) , um anticorpo anti-GleNAc (β 1-4) GlcNAc (β), um anticorpo anti-L-Araf(a) , um anticorpo anti-L-Rha (a) , um anticorpo anti-Gal (β1-3) [GlcNAc Cβ1 — 6)] GalNAc (a) , um anticorpo anti-Gal (β 1-4} GlcNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-3) GaiNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-3) GlcNAc (β) , um anticorpo anti-GlcA (β) ,um anticorpo anti-GlcA (β),e um anticorpo anti-Xyl (a) ; e instruções para utilizar o dito kit.

21. Kit de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender ainda um reagente que detecta especificamente um anticorpo do tipo IgM.

22. Substracto compreendendo o reagente que detecta especificamente um anticorpo especifico para anti-Glc (a 1-4) Glc (a) .

23. Substracto ' de acordo com a reivindicação 22, compreendendo ainda um outro reagente que detecta um anticorpo seleccionado a partir de um anticorpo anti-Glc 5 (α) , um anticorpo anti-Glc (α 1-4) Glc (β) r um anticorpo anti-Glc (β); um anticorpo anti-Gal (β); um anticorpo anti-Glc (β 1-4) Glc (β 1-4) Glc (β) , um anticorpo anti-GlcNAc (β 1-4) GlcNAc (β) , um anticorpo anti-L-Araf(a), um anticorpo anti-L-Rha (a) , um anticorpo anti-Gal (β1—3) [GlcNAc (β1-6)] GalNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-4) GlcNAc (a) , um anticorpo Glc(a), um anticorpo anti-Gal (β 1-3) GalNAc (a), um anticorpo anti-Gal (β 1-3) GlcNAc (β), um anticorpo anti-GlcA (β) , um anticorpo anti-GlcA (β), e um anticorpo anti-Xyl (a).

24. Substracto de acordo com a reivindicação 23, compreendendo ainda um reagente que detecta um anticorpo anti-Glc(a) e um reagente que detecta um anticorpo anti-L-Rha (a) .

25. Substracto de acordo com a reivindicação 22, çaracterizado por o dito substracto ser planar.

26. Substracto de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o dito substracto se apresentar na forma de um poço de uma placa microtituladora.

27. Substracto de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o dito reagente ser um monossacárído ou oligossacárido. Lisboa, 21 de Janeiro de 2008