DE60034480T2

DE60034480T2 - Diagnostischer assay für schlaganfall

Info

Publication number: DE60034480T2
Application number: DE60034480T
Authority: DE
Inventors: Denis Francois Hochstrasser; Jean-Charles Sanchez; Catherine Gabrielle Zimmermann
Original assignee: Electrophoretics Ltd
Current assignee: Electrophoretics Ltd
Priority date: 1999-12-10
Filing date: 2000-12-04
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2020-12-05
Also published as: JP2003516541A; ES2281363T3; DK1238284T3; AU1707201A; DE60034480D1; US20030100038A1; US7754436B2; WO2001042793A3; AU773595B2; US7144705B2; GB9929140D0; WO2001042793A2; ATE360211T1; CA2393127C; EP1238284B1; CA2393127A1; US20070134726A1; JP4751555B2; EP1238284A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Bereich der Erfindung
Diese Erfindung ist in dem Bereich eines diagnostischen Assays unter Verwendung eines Proteins oder eines Antikörpers dafür.
Beschreibung des Stands des Technik
Der Schlaganfall hat die dritthöchste Todesrate in den Industrieländern. Er ergibt sich aus entweder einer permanenten oder einem transienten Verminderung des zerebralen Blutflusses. Diese Verminderung in dem Fluss wird in den meisten Fällen durch eine arterielle Verstopfung auf Grund eines Embolus oder einer lokalen Thrombose verursacht. Abhängig von dem Ort der Hirnverletzung und der Intensität der nekrotischen Neuronen können die Schlaganfallsymptome für die Patienten zu einer Lebensbehinderung werden und die Todesrate aus den Schlaganfallereignissen erreicht 30%.
Kürzlich wurde S100B als ein potentieller biochemischer Marker für die Schlaganfalldiagnose beschrieben, siehe U. Missler et al., „S100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarct volume and prognosis in acute ischemia stroke", Stroke 1997; 28: 1956–60. Es wurde jedoch auch berichtet, dass S100B ein nützlicher Marker für den frühen Nachweis von Melanommetastasen und zerebralen Komplikationen durch Kopfversetzungen und Herzoperationen ist. Folglich waren die Sensitivität und Spezifität des S100B-Tests auf 44% beziehungsweise 67% beschränkt, siehe M. Takahashi et al., „Rapid and sensitive immunoassay for the measurement of serum S100B using isoform-specific monoclonal antibody", Clin. Chem. 1999; 45: 1307–11. Die Entwicklung von neuen Schlaganfallmarkern würde Krankenhausärzten helfen eine frühe Diagnose zu erstellen und folglich einen potentiellen Rückfall des Patienten zu vermeiden.
WO 98 45440 A offenbart ein humanes Fettsäure-bindendes Protein und die Vorbeugung, Behandlung und Diagnose von Erkrankungen, die mit der Expression davon assoziiert sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass zwei Fettsäure-bindende Proteine (FABP), bekannt als Herz- (H-FABP) und Hirn (B-FABP), Marker für den Schlaganfall sind. Folglich stellt die Erfindung ein Verfahren für einen diagnostischen Assay für den Schlaganfall oder die Möglichkeit davon in einer Körperflüssigkeitsprobe bereit, die von einem Patienten entnommen ist, der in Verdacht steht an einem Schlaganfall zu leiden, welcher die Bestimmung der Konzentration des Herz- oder Hirn-Fettsäure-bindenden Proteins (H-FABP oder B-FABP) in der Probe umfasst. Die auf diese Weise bestimmte Konzentration wird verwendet um eine Diagnose zu erstellen oder bei der Erstellung einer Diagnose zu helfen.
Das Verfahren wird in geeigneter Weise unter Verwendung eines Antikörpers gegen H-FABP oder B-FABP durchgeführt, wobei das Ausmaß der Reaktion zwischen dem Antikörper und dem FABP in der Probe untersucht und auf die Konzentration des FABP in der Probe bezogen wird.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Durchführung eines Assays mit einer hohen Sensitivität, Spezifität und einem prädiktiven positiven Wert für den Schlaganfall. „Sensitivität" ist als der Prozentsatz an wahren Positiven definiert, die sich durch den Assay an Proben ergeben, die von Patienten entnommen wurden, bei welchen eine klinische Untersuchung einen Schlaganfall bestätigt hat. Er wird als % wahre Positive/(wahre Positive + falsch Negative) berechnet. „Spezifität" meint den Prozentsatz an wahren Negativen, die sich durch den Assay an Kontrollproben ergeben, das heißt von Patienten, bei welchen durch eine klinische Untersuchung keinen Schlaganfall aufgedeckt hat. Er berechnet sich als die % wahre Negative/(falsch Positive + wahre Negative). „Prädiktiver positiver Wert" meint das Verhältnis % wahre Positive/(wahre Positive + falsch Positive).
H-FABP ist ein bekannter Marker für den akuten Myokardinfarkt (AMI), siehe J. Ishii et al., „Serum concentrations of myoglobin vs human heart-type cytoplasmic fatty-acid Bindung protein in early detection of acute myocardial infarction", Clinical Chemistry 1997; 43: 1372–1378. Deshalb ist es wünschenswert, um einen Assay für H-FABP für den Schlaganfall zu einem besseren Vorteil zu nutzen, eine andere Sorte Assay für den AMI durchzuführen (einen, in welchem der Marker nicht FABP ist), um aus der Diagnose für einen Schlaganfall jene Patienten zu entfernen, die in dem AMI-Assay positiv sind.
Folglich stellt die Erfindung in einer bestimmten Ausführungsform ein Verfahren bereit, welches die Bestimmung der H-FABP-Konzentration in einem ersten Assay wie oben definiert umfasst, wobei ein positives Ergebnis die Möglichkeit für entweder einen Schlaganfall oder einen akuten Myokardinfarkt anzeigt, und welches ferner die Durchführung eines zweiten diagnostischen Assays umfasst, nur für den akuten Myokardinfarkt (AMI), wobei ein positives Ergebnis in dem H-FABP-Assay und ein negatives Ergebnis in dem Assay für den AMI anzeigt, dass der Patient an einem Schlaganfall leiden könnte. Die Assays, die Troponin-I und Creatinkinase-MB (CK-MB) als frühe biochemische Marker für den akuten Myokardinfarkt (AMI) verwenden, sind gut bekannt und für den oben genannten Zweck geeignet. Sie können in Plasma, Serum oder Blut durchgeführt werden. Natürlich sind die Begriffe „erster" und „zweiter" lediglich angenehme Bezeichnungen: Die Assays können in jeder Reihenfolge durchgeführt werden.
Es wurde ein ähnliches H-FABP und auch ein hirnspezifisches Fettsäure-bindendes Protein (B-FABP) in dem Hirn von Mäusen gefunden, siehe L. Pu et al., Molecular and Cellular Biochemistry 1999; 198: 69–78. Von dem Hirn-H-FABP (nicht zu verwechseln mit B-FABP) wird angenommen, dass es sich von dem Herz-H-FABP durch eine einzige Aminosäuresubstitution unterscheidet. B-FABP unterscheidet sich jedoch wesentlich. P. A. Sellner et al., „Development role of fatty acid bindung proteins in mouse brain" Dev. Brain Res. 1995; 89; 33–46 bestimmte die DNA-Homologie mit 69%, während A. Schreiber et al., „Recombinant human heart-type fatty acid binding protein as standard in immunochemical assays" 64% Aminosäuresequenzhomologie erwähnen und dass ein monoklonaler Antikörper gegen humanes H-FABP mit dem humanen B-FABP in einem Ausmaß von nur 1,7% kreuzreagiert.
Nun, da die vorliegenden Erfinder gefunden haben, dass das H-FABP ein Marker für den Schlaganfall ist, ist es eine sehr begründete Vorhersage, dass B-FABP auch einer sein wird. Da B-FABP spezifisch für Hirngewebe ist und scheinbar nicht signifikant mit einem monoklonalen Antikörper gegen H-FABP reagiert, wird es keine Positiven für den AMI geben, was einen separaten Assay für den AMI unnötig macht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die einzige Figur ist eine graphische Darstellung der H-FABP-Konzentration, repräsentiert durch die Messung der optischen Dichte bei 405 nm, wie sie durch das Verfahren der Erfindung bestimmt wird, auf der y- Achse für (a) die Kontrollgruppe, die weder einen Schlaganfall noch einen AMI hat, (b) die Gruppe, die einen AMI hat, und (c) die Schlaganfallgruppe zu vier Zeitpunkten nach der Einweisung (0 Stunden, 1 Tag, 3 Tage und 7 Tage).
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Für das Assayverfahren kann die Probe aus dem Blut, Plasma oder Serum des Patienten entnommen werden. Der Marker, H-FABP oder B-FABP, wird vorzugsweise durch einen Immunassay gemessen, wobei ein spezifischer Antikörper gegen H-FABP verwendet wird und das Ausmaß der Antigen (H-FABP oder B-FABP)/Antikörper-Interaktion gemessen wird. Für die Diagnose von menschlichen Patienten ist der Antikörper vorzugsweise ein anti-human H-FABP oder B-FABP. Ähnlich sollte, wenn der Patient ein Tier ist, der Antikörper gegen das H-FABP oder B-FABP derselben Tierart sein, z.B. anti-Pferd H-FABP oder B-FABP, wenn der Patient ein Pferd ist. Es kann ein monoklonaler Antikörper oder ein technischer Antikörper sein. Es wird in geeigneter Weise ein Maus anti-human, anti-Pferd ect. monoklonaler Antikörper verwendet. Die Antikörper gegen H-FABP sind bekannt, z.B. sind 66E2 und 67D3, beschrieben von W. Roos et al., „Monoclonal antibodies to human heart type fatty acid-binding protein", J. Immunol. Methods 1995; 183: 149–153, kommerziell erhältlich. Es kann auch das gewöhnliche Köhler-Milstein-Verfahren verwendet werden, um H-FABP- oder B-FABP-Antikörper herzustellen. Die Proteinquelle für diesen Zweck kann das natürlich erlangte oder das mittles rekombinanter DNA-hergestellte Protein sein. Das rekombinante humane H-FABP und B-FABP ist von A. Schreiber supra beziehungsweise F. Shimizu et al., „Isolation and expression of cDNA for human brain fatty acid binding protein (B-FABP)", Biochem. Biophys. Acta 1997; 1354: 24–28, beschrieben worden. Weniger vorzugsweise kann der Antikörper polyklonal sein.
Es kann irgendein bekanntes Immunassayverfahren verwendet werden. Ein Sandwichassay ist bevorzugt. In diesem Verfahren wird ein Antikörper (z.B. polyklonal) gegen FABP an die feste Phase wie an das Loch einer Plastikmikrotiterplatte gebunden und mit der Probe und einem zweiten markierten Antikörper inkubiert, der für das nachzuweisende H-FABP oder B-FABP spezifisch ist. Alternativ kann ein Antikörper-Capture-Assay (auch „indirekter Immunassay" genannt) verwendet werden. Hier wird der Testprobe ermöglicht an eine feste Phase zu binden und der anti-FABP-Antikörper (polyklonal oder monoklonal) wird dann zugegeben und eine Bindung ermöglicht. Wenn ein polyklonaler Antikörper in diesem Kontext verwendet wird, sollte es wünschenswerterweise einer sein, der eine geringe Kreureaktivität mit andern FABP-Formen aufweist. Nach dem Abwaschen des nichtgebundenen Materials wird die Menge des Antikörpers bestimmt, der an die feste Phase gebunden hat, wobei ein markierter zweiter Antikörper verwendet wird, der anti- dem ersten Antikörper ist.
Ein direkter Assay kann unter Verwendung eines markierten anti-FABP-Antikörpers durchgeführt werden. Der Testprobe wird eine Bindung an die feste Phase ermöglicht und der anti-FABP-Antikörper zugegeben. Nachdem das nichtgebundene Material abgewaschen wurde, wird die Menge des Antikörpers bestimmt, der an die feste Phase gebunden hat. Der Antikörper kann eher direkt markiert sein als durch einen zweiten Antikörper.
In einer anderen Ausführungsform kann ein kompetitiver Assay zwischen der Probe und einem markierten FABP oder einem davon abgeleiteten Peptid durchgeführt werden, wobei diese zwei Antigene in Konkurrenz um eine beschränkte Menge an anti-FABP-Antikörper stehen, der an den festen Träger gebunden ist. Das markierte FABP oder Peptid kann mit dem Antikörper auf der festen Phase präinkubiert sein, wodurch das FABP in der Probe einen Teil des FABPs oder Peptids davon, das an den Antikörper gebunden ist, verdrängt.
In noch einer anderen Ausführungsform wird den zwei Antigenen in einer einzigen Coinkubation erlaubt mit dem Antikörper zu kompetitieren. Nach dem Entfernen mittels Waschen von ungebundenem Antigen von dem Träger, wird die Menge an Markierung, die an den Träger gebunden ist, bestimmt und die Menge an Protein in der Probe durch die Referenz zu Standardtitrationskurven, die zuvor ermittelt wurden, gemessen.
Durchwegs ist die Markierung vorzugsweise ein Enzym. Das Substrat für das Enzym kann farbbildend, fluoreszent oder chemilumineszent sein. Alternativ kann die Markierung ein Radioisotop oder Fluoreszenzmittel sein, z.B. unter Verwendung von konjugiertem Fluoreszein.
Das Enzym ist vorzugsweise die alkalische Phasphatase oder die Meerrettichperoxidase und kann in geeigneter Weise kolorimetrisch verwendet werden, z.B. unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als ein gelbtonbildendes Substrat mit der alkalischen Phosphatase.
Für den Chemilumineszenzassay kann der Antikörper mit einem Acridiniumester oder der Meerrettichperoxidase markiert sein. Die Letztere wird ein dem verstärkten Chemilumineszenz (ECL)-Assay verwendet. Hier nimmt der Antikörper, der mit der Meerretichperoxidase markiert ist, an einer Chemilumineszenzreaktion mit Luminol teil, einem Peroxidasesubstrat und eine Verbindung, welche die Intensität und die Dauer des emittierten Lichts erhöht, typischerweise 4-Iodphenol oder 4-Hydroxyzimtsäure.
Es kann ein amplifizierter Immunassay wie eine Immun-PCR verwendet werden. Bei dieser Technik wird der Antikörper kovalent an ein beliebiges DNA-Molekül gebunden, das PCR-Oligonukleotide umfasst, wodurch die DNA mit dem daran gebundenen Antikörper durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird. Siehe E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 1995; 23: 522–529 (1995) oder T. Sano et al., „Molecular Biology and Biotechnology", Herausgeber A. Meyers, VHC Publishers, Inc. (1995), Seiten 458–460. Das Signal wird wie zuvor ausgelesen.
In einem besonders bevorzugten Verfahren wurde ein Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) entwickelt, um H-FABP nachzuweisen. Da H-FABP auch ein Marker für den AMI ist, wurden auch die Troponin-I oder CK-MB-Konzentrationen untersucht, um eine Herzschädigung auszuschließen. Wie in den Beispielen beschrieben wurden diese Assays in seriellen Plasmaproben aus 22 Patienten, die keinen AMI oder Schlaganfall haben, 20 Patienten mit einem AMI und 22 Patienten mit einem bestätigten Schlaganfall zu vier Zeitpunkten nach der Einweisung in das medizinische Zentrum beurteilt. Die Sensitivität, Spezifität und der prädiktive positive Wert für das H-FABP beim Schlaganfall waren 59,1%, 90,9% beziehungsweise 86,7%. Nur einer von 22 Schlaganfallpatienten hatte eine erhöhte H-FABP- und Troponin-I-Expression. Folglich stellt der H-FABP-Nachweis kombiniert mit dem Troponin-I- oder CK-MB-Assay einen nützlichen Marker für die Schlaganfalldiagnose oder eine Hirnschädigung bereit.
Die Verwendung eines rapiden micropartikelverstärkten turbidimetrischen Immunassays, der für H-FABP in dem Fall des AMI entwickelt wurde, M. Robers et al., „Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immunassay for plasma fatty acid-bindung protein, an early marker of acute myocardial infarction", Clin, Chem. 1998; 44: 1564–1567, sollte die Zeit für den Assay drastisch verkürzen. Folglich sollte die volle Automatisierung in einem weit verbreitet verwendetem Analysegerät für klinische Chemie, wie dem COBAS^TM MIRA Plus-System von Hoffmann-La Roche, beschrieben von M. Robers et al., supra, oder dem AxSYM^TM-System von Abbott Laboratories, möglich sein und für die routinemäßige klinische Diagnose von Schlaganfall angewendet werden.
Die Konzentrationen für das H-FABP oder B-FABP können durch andere Mittel als durch Immunassays bestimmt werden. Zum Beispiel kann die Probe einer 2D-Gelelektrophorese unterworfen werden und die FABP-Menge durch densitometrisches Scannen des Gels oder des Blots davon abgeschätzt werden. Es ist jedoch wünschenswert, dass der Assay auf eine schnelle Weise durchgeführt wird, sodass der Patient sofort behandelt werden kann.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
Beispiele
Material und Methoden
Patienten
Die Studienpopulation bestand aus 22 dem Alter und Geschlecht nach angepassten Kontrollpatienten (Kontrollgruppe), 20 bestätigten AMI-Patienten (AMI-Gruppe) und 22 bestätigten Schlaganfallpatienten (Schlaganfallgruppe). Die Kontrollgruppe schloss 14 Männer, mittleres Alter 66 in dem Bereich von 34–86 Jahren, und 8 Frauen ein, mittleres Alter 63 in dem Bereich von 51–81 Jahren. Die AMI-Gruppe schloss 16 Männer, mittleres Alter 65 in dem Bereich von 29–90 Jahren, und 4 Frauen ein, mittleres Alter 72 in dem Bereich von 66–81 Jahren. Die Schlaganfallgruppe schloss 14 Männer, mittleres Alter 65 in dem Bereich von 30–87 Jahren, und 8 Frauen ein, mittleres Alter 64 in dem Bereich von 51–85 Jahren. Es wurden 4 Blutproben von jedem Patienten der Schlaganfallgruppe nach der Einweisung abgenommen (t₀ = 0 h; t₁ = 1 Tag, t₃ = 3 Tage, t₇ = 7 Tage). Die Blutproben wurden in trockene heparinenthaltende Röhrchen abgenommen. Nach der Zentrifugation bei 1500 g für 15 min bei 4°C wurden die Plasmaproben als Aliquots bei –20°C bis zur Analyse aufbewahrt. Die Patienten aus der Schlaganfallgruppe durchliefen serielle klinische Beurteilungen durch Neurologen, um die Schlaganfalldiagnose zu bestätigen. Die Patienten aus der AMI-Gruppe wurden in des Krankenhaus mit einem bestätigten AMI eingeliefert (Troponin-I-Konzentration > 2 ng/ml). Es wurde eine klinische Beurteilung an allen Patienten von der Kontrollgruppe durchgeführt, um einen Schlaganfall oder einen AMI auszuschießen.
Messung des Hirn- und Herz-FABPs
Es wurden im Plasma mittels einem Sandwich-ELISA die H-FABP-Konzentrationen gemessen. Es wurde eine 96-Loch Polystyrol-Mikroplatte (NUNC) mit 100 μl/Loch polyklonalem Ziege anti-humanem Muskel-FABP (Spectral Diagnosis HC, Ontario, USA), 20,4 ng/ml in Carbonatpuffer 0,1 M pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platte wurde automatisch mit PBS (15 mM Na₂PO₄-120 mM NaCl-2,7 mM KCl pH 7,4, Sigma) auf einem BioRad NOVAPATH^TM-Wäscher gewaschen. Jeder Waschschritt wurde mit frischem PBS durchgeführt. Nichtspezifische Bindungsstellen wurden mit 200 μl/Loch 2% Casein in Carbonatpuffer für 2 h bei 37°C blockiert. Nach dem Waschschritt wurden die Proben in Dublikaten mit 100 μl/Loch pipettiert. Die Platte wurde 2 h bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschschritt wurden 100 μl/Loch Maus anti-humanes Herz-FABP (Klon 66E2, HyCult Biotechnology BV, Uden, Nehterlands), 0,3 mg/ml in PBS-1% BSA, für 1 h bei Raumtemperatur (R. T.) unter Schütteln inkubiert. Nach dem Waschschritt wurden 100 μl/Loch phosphatasemarkiertes anti-Maus Immunglobulin (Dako, Denmark), 15 ng/ml in PBS, 1 h 30 min bei R. T. unter Schütteln inkubiert. Nach dem Waschschritt wurden 50 μl/Loch Phosphatasesubstrat, 1,5 mg/ml wurde mit 100 μl/Loch 1 M NaOH gestoppt. Die Farbentwicklung wurde mit einem Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.
Messung von CK-MB und Troponin-I
Der AMI wurde durch eine klinische Beurteilung und Troponin-I- und CK-MB-Messungen diagnostiziert. Die Proben wurden bei 1500 g für 15 min zentrifugiert und bei –20°C aufbewahrt. Die Serum-CK-MB- und Troponin-I-Konzentrationen wurden bestimmt, wobei ein Fluoreszenz-Mikropartikel-Enzym-Immunassay (MEIA) mit einem automatisierten chemischen Analysegerät AxSYM^TM-System (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) verwendet wurde. Die Bildungsrate des Fluoreszenzprodukts war direkt proportional zu der Menge an Troponin-I in der Probe. Die Nachweisgrenze für Troponin-I war 0,3 μg/l. Die CK-MB-Messung ist proportional zu der Menge an Fluoreszenzsonden und die Nachweisegrenze war 0,7 μg/l.
Statistische Analyse
Die H-FABP-Konzentrationen wurden in den Werten für die optische Densitometrie (OD) entweder als +/– SD oder als ein medianer und inter-quartiler Bereich ausgedrückt. Die Konzentrationen für Troponin-I und CK-MB wurden in Konzentrationseinheiten (ng/ml) ausgedrückt. Der nicht-parametrische Mann-Whitney U-Test wurde verwendet, um zwischen den Gruppen die Konzentrationen im Plasma von H-FABP, Troponin-I und CK-MB zu vergleichen. Es wurde die PRISM^TM-Software verwendet, um Box/Whisker- und Streudiagramme auszuarbeiten. Die 95% Konfidenzintervalle (CI) und Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven, definiert durch die Analyse-it^TM-Software für Microsoft EXCEL^TM, wurden verwendet, um die diskriminierenden Zeitpunkte der Indikatoren zu beurteilen. Siehe J. M. Murphy et al., „Performance of screening and diagnostic tests", Arch. Gen. Psychiatry 1987; 44: 550–555.
Es wurden ein eindimensionaler Z-Test verwendet, um die Bereiche unter den ROC-Kurven von H-FABP zu vergleichen. Es wurden die Unterschiede in der Sensitivität, Spezifität und dem prädiktiven positiven Wert der H-FABP-Konzentrationen zu jedem Zeitpunkt beurteilt. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen.
Ergebnisse
Klinische Merkmale
Den Patienten aus der Schlaganfallgruppe wurde eine komplette klinische Beurteilung erteilt. Es wurden eine Ischämie und Blutung mit der Hilfe eines Computertomographie (CT)-Scans und der zerebralen IRM-Antwort diagnostiziert sowie ihre Lokalisation bestimmt (Daten nicht gezeigt). Die Schlaganfalldiagnose wurde für jeden Patienten aus der Schlaganfallgruppe bestätigt. Der Verletzungstyp und die Lokalisation korreliert nicht mit der H-FABP-Konzentration (Daten nicht gezeigt).
Die Patienten aus der Kontrollgruppe wurden ins Krankenhaus eingewiesen und ein Schlaganfall und AMI durch eine klinische Beurteilung ausgeschlossen.
Die Patienten aus der AMI-Gruppe in das Krankenhaus mit einem einem bestätigten AMI mit hohen Troponin-I-Spiegeln (> 2 ng/ml) eingewiesen.
Die Assayergebnisse sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Signifikanz:

*** p < 0,001
** p < 0,01
ns

nicht signifikant

Die H-FABP Plasmakonzentrationen (OD-Messung) in der AMI-Gruppe waren signifikant höher als die in der Kontrollgruppe (Tabelle 1). Die AMI-Gruppe hatte eine mediane H-FABP-Konzentration (Bereich 25–75%) von 2,65 (2,27–2,86), während die Kontrollgruppe eine Konzentration von 0,19 (0,14–0,35) hatte. Die H-FABP-Konzentration nahm mit zunehmender Zeit nach dem akuten Hirnereignis ab. Die mediane H-FABP-Konzentration (Bereich 25–75%) in der Schlaganfallgruppe war 0,64 für t₀ (0,28–1,01), 0,46 für t₁ (0,25–0,98) 0,37 für t₃ (0,20–0,76) und 0,33 für t₇ (0,18–0,73). Es bestand etwas Überlappung zwischen dem inter-quartilen Bereich der Schlaganfall- und Kontrollgruppe auf Grund der Anwesenheit von falsch Negativen. Die Verteilung der H-FABP-Konzentration wurde durch das Streudiagramm der Zeichnung dargestellt. Die Receiver-Operating-Curve-Diagramme wurden von der Sensitivität gegen die Spezifität zu verschiedenen Zeitpunkten gemacht, nämlich bei der Einweisung des Patienten und 1, 3 und 7 Tage nach der Einweisung. Die ROC-Kurven wurden verwendet, um die Sensitivität und Spezifität zu optimieren und die Summe der Sensitivität und Spezifität durch die Auswahl eines geeigneten Anhaltewerts in den Einheiten der optischen Dichte zu maximieren, was die H-FABP-Konzentration repräsentiet. Die Plots zeigten, dass die beste Sensitivität und Spezifität für diese Patientengruppe bei der Einweisung der Patienten mit einem Anhaltewert bei der OD 0,53 erhalten wurde. Unter diesen Bedingungen war die Sensitivität, Spezifität und der prädiktive positive Wert der H-FABP-Konzentrationen 59,1%, 90,9% beziehungsweise 86,7%. Der Vergleich der ROC-Kurven bei der Einweisung mit jenen, die zu späteren Zeitpunkten gemacht wurden, zeigte keine Steigerung in den Sensitivitäts- und Spezifitätswerten jenseits von jenen, die bei der Einweisung erhalten wurden.
Um die Unterschiede in den H-FABP-Konzentrationen zwischen der AMI- und Kontrollgruppe zu bestätigen, wurden CK-MB und Troponin-I unersucht. Zusätzlich wurden sie auch, um einen AMI und einen Schlaganfall zu unterscheiden, in den Schlaganfallproben untersucht. Die Konzentrationen für Troponin-I und CK-MB wurden in jeder Gruppe gemessen. Die Konzentrationen für Troponin-I und CK-MB in der AMI-Gruppe waren signifikant (p > 0,01) höher als in der Kontrollgruppe. Es wurden in der Konzentration dieser Indikatoren keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontroll- und der Schlaganfallgruppe gefunden. Die ABBOTT-Laboratories zeigten, dass die erwarteten Werte bei einem Anhaltewert von 2 ng/ml beziehungsweise 9,3 ng/ml bestimmt wurden, wobei der AxSYM^TM Troponin-I-Assay und der AxSYM^TM CK-MB-Assay für die AMI-Diagnose verwendet wurden. Der CK-MB-Wert, der für die Kontrollgruppe erwartet wurde, ist bei bis zu 3,8 ng/ml. Bei der Troponin-I-Konzentration von > 2 ng/ml waren die Sensitivität und Spezifität des MEIA Troponin-I-Assays 93,9% beziehungsweise 94,4% zum Zeitpunkt t₁. Die medianen Konzentrationen für Troponin-I und CK-MB (25–75%) in dem Plasma wurden berechnet und sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 2 Zusammenfassungen der Assayauswertung
In der Kontrollgruppe wurden zwei falsch Positive nachgewiesen. Das H-FABP war zum Zeitpunkt t₀ erhöht (Tabelle 2). Einer von diesen hatte Troponin-I- und CK-MB-Konzentrationen an der Grenze zwischen gesund und Myokardbeschwerden (3,8 ng/ml), was anzeigt, dass diese Person an einem Myokardmuskel ohne einen AMI leiden sollte. Tatsächlich hatte einer von diesen Epilepsie und beide litten an mehreren Frakturen. In der Schlaganfallgruppe wurden 13 wahre Positive nachgewiesen (10 hatten eine Ischämie und 3 Blutungen). Es wurden hohe H-FABP-Konzentrationen gemessen und die Schlaganfalldiagnose bestätigt. Es wurden gesunde Konzentrationen für Troponin-I und CK-MB gemessen und sie erlaubten den Ausschluß von einer AMI-Diagnose, mit Ausnahme von einem Patienten. Für diese Ausnahme wies die klinische Beurteilung keine Myokardleiden nach und korrelierte nicht mit der Troponin-I-Konzentration für den AMI. Das gemessene H-FABP erlaubte keine Unterscheidung zwischen Hirn- oder Myokardbeschwerden. In der Schlaganfallgruppe wurden 9 falsch Negative mit niedrigen H-FABP-Spiegeln nachgewiesen (6 hatten eine Ischämie und 3 Blutungen). Für diese Fälle wurde keine Erklärung gefunden. Es wurde keine Korrelation zwischen der niedrigen H-FABP-Konzentration und der klinischen Beurteilung gefunden.
Diskussion
Die oben genannten Ergebnisse zeigen an, dass H-FABP ein potentieller Marker für die Schlaganfalldiagnose ist. Da H-FABP ein paar Jahre zuvor als ein Marker für den akuten Myokardinfarkt vorgestellt wurde, musste ein Schlaganfall und der AMI durch ein einen weiteren biochemischen AMI-Marker wie Troponin-I oder CK-MB unterschieden werden. Nach der Unterscheidung der AMI bei den Schlaganfallpatienten konnte die H-FABP-Serumkonzentration als ein spezifischer Marker für den Schlaganfall verwendet werden.
Bei der Einweisung ermöglichte der H-FABP-Assay eine Sensitivität, eine Spezifität und einen prädiktiven positiven Wert (OD-Antwort > 0,531) von 59,1%, 90,9% beziehungsweise 86,7%. Diese Werte waren signifikant höher als jene für das S100B-Protein für den Nachweis von einem Schlaganfall. Die Sensitivität und Spezifität des S100B-Assays für den Schlaganfall war 44% beziehungsweise 67%. Der Vorteil der S100B- Analyse war die Entwicklung von einem schnellen Immunassay von weniger als 3 h. Die Spezifität von S100B war jedoch nicht auf den Schlaganfall beschränkt, sondern auch auf Melanommetastasen, Hirnkomplikationen von Kopfverletzungen und Herzoperationen. Die Kinetik von H-FABP im Blutstrom wurde durch die Messung des H-FABPs zu vier Zeitpunkten nach der Einweisung in die Klinik zur Überprüfung (t₀ (0 h), t₁ (1 Tag), t₃ (3 Tage) und t₇ (7 Tage)) für jeden Patienten mit einem bestätigten Schlaganfall gemessen. Die maximalen H-FABP-Konzentrationen wurde meistens bei t₀ beobachtet. Die Variationszeit zwischen dem Beginn im Hirn und der Einweisung interferierten nicht mit dem Ergebnis, weil die H-FABP-Konzentration an t₁ erhöht blieb. Der ROC-Kurvenbereich bestätigte die höheren H-FABP-Konzentrationen an t₀ und t₁ verglichen mit t₃ und t₇. Die besten Merkmale des Assays (Sensitivität, Spezifität) wurden an t₀ erhalten.
Der akute Myokarinfarkt wird mit der Hilfe einen biochemischen Markerassays diagnostiziert wie der Assays für Herz-Troponin-I, Creatinkinase MB, Myoglobin und jüngst H-FABP. Da die H-FABP-Konzentrationen einen AMI anzeigen konnten, wurde die Unterscheidung zwischen dem AMI und dem Schlaganfall durch die Verwendung eines anderen Markers gemacht.
Troponin-I ist ein früher Marker für den AMI oder einen Ischämieschaden und hat den Vorteil für mehrere Tage in Folge des AMI erhöht zu bleiben. Da die Konzentration des freigesetzten Troponin-I ein Maximum nach 12–24 h nach der Einweisung erreicht, wurde die Schlaganfallgruppe an t₀ und t₁ analysiert. Die Troponin-I-Konzentration in der AMI-Gruppe war signifikant höher als der Anhaltewert von 2 ng/ml. Die meisten der Schlaganfallpatienten zeigten eine normale Troponin-I-Konzentration unter dem Anhaltewert, welche die AMI-Patienten aus der Studie ausschloss, mit der Ausnahme von einem Patienten. Bei seiner klinischen Beurteilung wurde kein Myokardleiden diagnostiziert und dies korrelierte nicht mit seiner Troponin-I-Konzentration. In diesem einen Fall ermöglichte die H-FABP-Messung nicht die Unterscheidung zwischen Hirn- und Myokardbeschwerden.
Parallel dazu wurde für jeden Patienten die Konzentration der Creatinkinase MB im Plasma gemessen. Diese Marker ist weniger spezifisch als Troponin-I, weil er irgendwelche Musklelleidentypen nachweist. Beginnend zwischen 2 und 6 Stunden nach dem Beginn der Symptome wird die CK-MB in den Blutstrom freigesetzt und ihre Konzentration darin steigt bis 18 Stunden nach dem Beginn der Symptome an. Ihre Konzentration bleibt bis 2 Tage nach dem Beginn der Symptome erhöht und danach fällt sie auf normal ab.
In der Kontrollgruppe wurden zwei falsch Positive nachgewiesen. Einer von diesen hatte Epilepsie, die mit dem Schlaganfall interferiert. Beide fielen auf den Boden und brachen sich ihren Femur und Fuß. Die erhöhte CK-MB korrelierte mit einem erhöhten H-FABP. Die Epilepsie konnte den Anstieg des H-FABP-Spiegels erklären. Das H-FABP ermöglichte eine 98,6%ige Korrelation mit dem CK-MB-Assay. Da Troponin-I nicht den Nachweis von diesen falsch Positiven ermöglichte, ergaben die Troponin-I- und H-FABP-Messung eine 95,3%ige Korrelation.

Claims

Verfahren für einen diagnostischen Assay für Schlaganfall oder die Möglichkeit davon in einer Körperflüssigkeitsprobe, entnommen von einem Patienten, der in Verdacht steht an einem Schlaganfall zu leiden, welcher die Bestimmung der Konzentration des Herz- oder Hirn-Fettsäure-bindenden Proteins (H-FABP oder B-FABP) in der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration des H-FABP in einem ersten Assay bestimmt wird, wodurch ein positives Ergebnis entweder auf einen Schlaganfall oder einen akuten Myokardinfarkt hinweist, und das ferner die Durchführung eines zweiten diagnostischen Assays nur für den akuten Myokardinfarkt (AMI) umfasst, wodurch ein positives Ergebnis in dem H-FABP-Assay und ein negatives Ergebnis in dem Assay für den AMI darauf hinweist, dass der Patient an einem Schlaganfall leiden kann.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der Assay für den AMI die Bestimmung der Konzentration von Troponin-1 oder der Creatinkinase MB im Plasma, Blut oder Serum umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin ein Antikörper gegen H-FABP in dem Assay für H-FABP verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin ein polyklonaler anti-human H-FABP-Antikörper verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, worin der Assay für H-FABP einen Sandwich-ELISA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das B-FABP oder ein Antikörper dafür in Kombination damit verwendet werden, ohne irgendeinen Assay für den AMI.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der H-FABP- und B-FABP-Assay an einer Blut-, Serum- oder Plasmaprobe duchgeführt wird.