DE602004001533T2

DE602004001533T2 - Immunoassay von kardialem Troponin I

Info

Publication number: DE602004001533T2
Application number: DE602004001533T
Authority: DE
Inventors: Susann Eriksson; Kim Pettersson
Original assignee: University of Turku
Current assignee: University of Turku
Priority date: 2003-04-30
Filing date: 2004-04-01
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2024-04-02
Also published as: US20040219604A1; ATE333649T1; DE602004001533D1; FI20030652A0; EP1473567A1; EP1473567B1; ES2264079T3; US7638292B2; US20080153109A1; US7348157B2

Description

Diese E%findung betrifft einen neuen Immunoassay von kardialem Troponin I (cTnI) in einer Probe, die aus dem Blut eines Individuums stammt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Veröffentlichungen und andere Materialien, die hierin verwendet wurden, um den Hintergrund der Erfindung zu beleuchten, und insbesondere Fälle, um zusätzlich Details hinsichtlich der Praxis bereitzustellen, sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die kardialen Troponine I und T (cTnI und cTnT) sind empfindliche und zuverlässige Marker einer myokardialen Schädigung, und ihre Verwendung wurde durch wissenschaftliche Gremien für die Diagnose akuter Koronar-Syndrome (AKS) empfohlen (1, 2). Die komplexe Molekülbeschaffenheit von cTnI macht die Messungen mittels Immunoassays kompliziert, wobei es zu großen Diskrepanzen bei den cTnI-Konzentrationen kommt, wie sie mittels verschieden konfigurierter kommerzieller und Forschungsassays gemessen werden (3, 4). Dies ist denkbarerweise eine Verbundwirkung des Fehlens eines internationalen Standards und der divergierenden Erkennung der zahlreichen cTnI-Formen durch die in den Assays eingesetzten Antikörper (5, 6). Da cTnI eine Komponente des Troponin-Komplexes ist, verantwortlich für die Regulierung der Muskelkontraktion, wechselwirkt es mit anderen Komponenten des Komplexes, cTnT und Troponin (TnC), mit einer starken Wechselwirkung mit TnC in Gegenwart von intrazellulärem Calcium (7). Es wurde gezeigt, dass der Hauptteil (etwa 90%) des cTnI im Blut von Patienten mit akutem Myokardinfarkt (AMI) in Form des binären cTnI-TnC-Komplexes vorliegt und nur ein kleiner Teil in freier Form vorliegt (8, 9). Die in Immunoassays verwendeten Antikörper sollten idealerweise sowohl freies als auch komplexiertes cTnI in einer äquimolaren Weise (10) erkennen, aber spezieller, die uneingeschränkte Erkennung des Komplexes ist von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus wurde die Verwendung von Antikörpern gegen Epitope in dem zentralen Teil von cTnI allgemein empfohlen, da die N- und C-terminalen Enden sowohl in vivo als auch nach der Probennahme empfindlich gegenüber proteolytischem Abbau sind (10–12). Das cTnI-Molekül enthält zwei Serin-Reste in den Positionen 23 und 24, die in Gewebe phosphoryliert werden können, und es wurde berichtet, dass etwa 50% des cTnI im Blut von AMI-Patienten in phosphorylierter Form vorliegt (13). Die Struktur- und Konformationsänderungen, die auf die Phosphorylierung folgen, können das Binden einiger Antikörper an cTnI signifikant beeinflussen (10, 14). Darüber hinaus können die beiden Cysteinreste in den Positionen 80 und 97 eine Disulfidbindung bilden, welche es ermöglicht, dass cTnI in oxidierter und reduzierter Form gefunden wird (15), was wiederum die Antigen-Erkennung verschiedener kommerziell erhältlicher Assays beeinflusst (6). Da das cTnI-Molekül eine hohe positive Ladung hat (pI 9,87), wird es negativ geladene Moleküle, wie Heparin, anziehen, die wiederum störend auf die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung einwirken können (10). Heparinisierte Plasmaproben werden in klinischen Laboratorien weit verbreitet verwendet, und somit werden diskrepante Ergebnisse im Vergleich zum Serum auftreten, wenn die Antikörper durch Heparin beeinflusst werden (16). Auch als Antikoagulans verwendetes EDTA kann eine Diskrepanz verursachen, insbesondere in Assays, die Antikörper mit unterschiedlicher Erkennung von freiem und komplexiertem cTnI einsetzen (17), da EDTA den Calcium-abhängigen Troponin-Komplex teilweise auffalten wird. Alle der oben genannten Merkmale von cTnI sollten bei der Ausgestaltung und Entwicklung von cTnI-Immunoassays gründlich bedacht werden.
Eine analytische Störung aufgrund einer Anzahl mehr nicht-spezifischer Ursachen ist ein häufiges Problem, das nahezu alle Immunoassays bis zu einem gewissen Ausmaß beeinflusst, was in falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen resultiert (18). Die am häufigsten beschriebenen störend wirkenden Mechanismen sind jene, die durch heterophile Antikörper, Human-anti-Maus-Antikörper, Rheumafaktoren und Komplement verursacht werden [Überblick in (19, 20)]. Die Einführung von Blocking-Mitteln (z.B. Mausserum oder IgG) ist beim Beseitigen dieses Störungstyps oft nützlich (21, 22). Es wurde insbesondere häufig über falsch-positive Ergebnisse für cTnI berichtet, während die Anzahl falsch-negativer Ergebnisse, über die berichtet wurde, viel niedriger ist. Es wurde behauptet, dass die falsch-positiven Ergebnisse auf der Gegenwart von heterophilen Antikörpern (23), Rheumafaktoren (24, 25) oder einem unbekannten makromolekularen Komplex (26) beruhen. Nicht wiederholbare falsche Zunahmen waren auch der Gegenwart von Fibrin nach unvollständiger Abtrennung des Serums zuzuordnen (27). Eher ausnahmsweise können sie aus der Fluidtherapie resultieren, die dem Patienten gegeben wird (28). Ein Bericht über ein falsch-negatives cTnI-Ergebnis wurde zirkulierenden cTnI-Autoantikörpern zugeschrieben (29), und auch über Bilirubin und Hämoglobin wurde berichtet, dass sie eine negative Störung in bestimmten cTnI-Assays ergeben (30).
AUFGABE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Bemerkenswert wenig Aufmerksamkeit wurde trotz der gut bekannten Probleme, die mit diesen Assays verbunden sind, darauf gerichtet, die analytische Wiederfindung von cTI anzugeben, wenn neue cTnI-Immunoassays evaluiert wurden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen verbesserten Immunoassay zur Bestimmung von cTnI bereitzustellen, indem ein interferierender Faktor (IF), der falsch-niedrige oder sogar negative Ergebnisse verursacht, umgangen wird. Das Ziel ist es, einen Assay bereitzustellen, der akkurat cTnI in der frühen Phase in Blutproben von Patienten mit Myokardinfarkt detektiert.
Dieses Ziel wird durch die vorliegende Erfindung erreicht, welche ein Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung von kardialem Troponin I in einer Probe betrifft, stammend aus Blut eines Individuums, wobei dieses Verfahren auf einem Sandwich-Immunoassay basiert, wobei mindestens ein Fang-Antikörper und mindestens ein Markierungs-Antikörper eingesetzt werden. Gemäß der Erfindung

– ist ein erster Fang-Antikörper auf den N-terminalen Teil von cTnI, auf den C-terminalen Teil von cTnI oder auf den Teil des cTnI-Mittelfragments gerichtet, der geringfügig durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird, und ein zweiter Fang-Antikörper ist auf einen anderen bzw. weiteren der zuvor genannten Teile gerichtet, und
– ein Markierungs-Antikörper ist auf den N-terminalen Teil von cTnI, auf den C-terminalen Teil von cTnI oder auf TnC gerichtet, welches mit cTnI komplexiert ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das cTnI-Protein, seinen N-terminalen Teil, seinen C-terminalen Teil und sein Mittelfragment, das wiederum in zwei Teile unterteilt werden kann, einen stark IF-beeinflussten Teil und einen geringfügig IF-beeinflussten Teil (IF = interferierender Faktor).
2 zeigt die analytische Wiederfindung von Standard-cTnI unter Verwendung verschiedener Markierungs-Antikörper, zusammen mit Mab 1 als Fang-Antikörper. Die weißen oder hellgetönten Balken stellen die EDTA-Plasmaprobe 10 (geringe Wiederfindung), und die schwarzen oder dunkelgetönten Balken stellen die EDTA-Plasmaprobe 8 ("normale" Wiederfindung) dar. Die Balken ohne Schraffur stellen Proben dar, die auf 0,3 μg/l cTnI dotiert waren, die Balken mit dünnen diagonalen Linien Proben, die auf 3,0 μg/l cTnI dotiert waren, und die Balken mit dicken diagonalen Linien Proben, die auf 30,0 μg/l dotiert waren. Mab 2 und 5 haben das gleiche Epitop im zentralen Teil des cTnI-Moleküls, Mab 3 hat ein N-terminales Epitop, und Mab 4 hat ein C-terminales Epitop.
3 zeigt Proben von 16 AMI-Patienten, gemessen mit zwei Forschungs-cTnI-Assays (Mab 1/Mab 2- und Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assays) und zwei kommerziellen cTnI-Assays (A × Sym und ACS:180). Die cTnI-Konzentration wird gegen den Prozentsatz aufgetragen, den der Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assay an dem cTnI-Ergebnis mit dem entsprechenden Assay ergibt. Proben der Patienten 1 und 5 (leere Quadrate), Proben der anderen 14 AMI-Patienten (gefüllte Quadrate).
4 zeigt die individuellen cTnI-Freisetzungsprofile für die Patienten 1 (A) und 5 (B) relativ zum Ausschluss ("cut-off") des entsprechenden cTnI-Assay. Die Proben wurden mit vier Immunoassays vermessen: Mab 1/Mab 2 (Δ), Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4
, A × Sym (☐) oder ACS:180 (∎). Die Einfügung in B zeigt das Freisetzungsprofil im Originalmaßstab.
5 zeigt die individuelle cTnI-Freisetzungsprofile für vier Patienten, die Brustschmerz aufweisen, gemessen mit Assays gemäß der vorliegenden Erfindung, Assay A (Raute) und Assay B (Dreieck), die beide dazu entworfen wurden, nur minimal von IF beeinflusst zu werden, und zuvor bekannten Assays, nämlich Assay Mab 1/Mab 2 (Quadrat), der schwerwiegend durch IF beeinflusst wird, und einem kommerziellen cTnI-Assay, Immuno 1 (Kreis). Die Zeit nach dem Auftreten des Brustschmerzes ist auf der x-Achse gezeigt. Bei einem Patienten war das Auftreten nicht bekannt. Die cTnI-Konzentrationen in B und D sind in logarithmischem Maßstab gezeigt. Die analytische Wiederfindung des zugefügten Standard-cTnI in der Eintrittsprobe, wie mit dem Mab 1/Mab 2-Assay gemessen, ist in der oberen rechten Ecke angegeben.
6 zeigt cTnI-Freisetzungsprofile für zwei Patienten (a und b) in Proben, die beim Eintritt bzw. bei der Einlieferung (1) und 6 Stunden später (2) genommen wurden, gemessen mit Assays gemäß dieser Erfindung, Assay A und B, und zuvor bekannten Assays.
7 zeigt die relative cTnI-Konzentration für Assays gemäß dieser Erfindung, Assay A und B, verglichen mit einem kommerziellen Assay für eine Wiederfindung unter 40% und für eine Wiederfindung über 40%.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Hauptteil des kardialen Troponin I, das ein 209 As-Protein ist, liegt als Komplex mit Troponin C vor. Gemäß einer Alternative sind alle Antikörper auf Epitope auf dem cTnI-Teil des Komplexes gerichtet. Gemäß einer anderen vorzugsweisen Alternative könnte der Komplex, der sowohl kardiales Troponin I als auch Troponin C enthält, als das Antigen angesehen werden, das bestimmt werden soll. In diesem Fall könnten die Antikörper sowohl gegen Epitope auf Troponin C, als auch auf kardialem Troponin I gerichtet sein.
Das 209 As-Protein, kardiales Troponin I, umfasst einen "N-terminalen Teil", umfassend die As 1–29, einen stabilen Teil, "Mittelfragment", umfassend die As 30–109, und einen "C-terminalen Teil", umfassend die As 110–209.
Das Mittelfragment ist stabil, und die meisten der bekannten cTnI-Assays setzen Antikörper ein, die auf Epitope in diesem Bereich gerichtet sind. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch herausgefunden, dass das Mittelfragment durch einen interferierenden Faktor (IF) beeinflusst wird, und es wurde festgestellt, dass dieser Faktor die Aktivität des Antikörpers stört, der auf diesen Bereich gerichtet ist. Die Stärke des interferierenden Faktors nimmt von As 30 bis As 109 zu. Der Bereich As 70–109 ist hierin als der Teil des cTnI-Mittelfragments definiert, der stark durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird. Der verbleibende Teil, nämlich As 30–69, ist hierin als der Teil des cTnI-Mittelfragments definiert, der geringfügig durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird. Siehe 1.
Der N-terminale Teil ist für eine Spaltung anfällig, was zu einem Fragment der As 1–29 führt. Der C-terminale Teil ist stabiler als der N-terminale Teil, kann aber in einem Bereich zwischen den As 148 und 190 gespalten werden. Der verbleibende Teil des C-Terminus ist stabiler, aber es kann eine Spaltung in dem Bereich As 110–137 auftreten.
Wenn geeignete Antigen-Epitope ausgewählt werden, sollte der stark IF-beeinflusste Teil des cTnI-Mittelfragments vermieden werden.
Gemäß dieser Erfindung ist ein erster Fang-Antikörper auf den N-terminalen Teil von cTnI, auf den C-terminalen Teil von cTnI oder auf den Teil des cTnI-Mittelfragments gerichtet, der geringfügig durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird, und ein zweiter Fang-Antikörper ist auf einen anderen bzw. weiteren der zuvor genannten Teile gerichtet, und ein Markierungs-Antikörper ist auf den N-terminalen Teil von cTnI, auf den C-terminalen Teil von cTnI oder auf TnC gerichtet, das mit cTnI komplexiert ist.
Die Formulierung, welche aussagt, dass der Antikörper auf einen bestimmten Teil des cTnI-Proteins gerichtet ist, soll so interpretiert werden, dass mehr als 50% der Aminosäuren, vorzugsweise mehr als 60%, insbesondere 100%, die das Epitop darstellen, an welches der Antikörper bindet, innerhalb des genannten Teils des cTnI-Proteins lokalisiert sind.
Vorzugsweise ist ein erster Fang-Antikörper auf den Teil des cTnI-Mittelfragments gerichtet, der geringfügig durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird, und ein zweiter Fang-Antikörper ist auf den N-terminalen oder auf den C-terminalen Teil von cTnI gerichtet, und ein Markierungs-Antikörper ist auf den C-terminalen Teil von cTnI gerichtet. Z.B. ist der erste Fang-Antikörper auf den Epitopbereich As 30–70, vorzugsweise As 41–49, gerichtet, der zweite Fang-Antikörper ist auf den Epitopbereich As 148–209, vorzugsweise As 190–196, gerichtet, und der Markierungs-Antikörper ist auf das Epitop As 110–148, vorzugsweise 137–148, gerichtet.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden drei Fang-Antikörper verwendet.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der erste Fang-Antikörper auf den Teil des cTnI-Mittelfragments gerichtet, der geringfügig durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird, und ein zweiter Fang-Antikörper ist auf den C-terminalen Teil von cTnI gerichtet, und ein dritter Fang-Antikörper ist auf den N-terminalen Teil von cTnI gerichtet, und der Markierungs-Antikörper ist auf TnC gerichtet. Z.B. ist der erste Fang-Antikörper auf den Epitopbereich As 30–70, vorzugsweise As 41–49, gerichtet, der zweite Fang-Antikörper ist auf den Epitopbereich As 148–209, vorzugsweise As 190–196, gerichtet, und der dritte Fang-Antikörper ist auf den Epitopbereich As 1–29, vorzugsweise As 23–29, gerichtet.
Der Assay kann als heterogener Assay durchgeführt werden, wobei der Fang-Antikörper biotinyliert ist, um in der Lage zu sein, an eine Streptavidin-beschichtete Festphase zu binden. Der gebundene ("captured") Antikörper kann zusammen mit dem gebundenen cTnI aus dem Inkubationsgemisch abgetrennt werden, bevor es in einem getrennten Schritt dem Markierungs-Antikörper ausgesetzt wird. Der Markierungs-Antikörper kann mit einer beliebigen detektierbaren Markierung markiert sein, vorzugsweise einer Lumineszenz-Markierung. Alternativ kann der Markierungs-Antikörper simultan hinzugefügt werden, z.B. gemäß dem Alles-in-einem-Trocken-Chemie-Konzept ("all-in-one dry chemistry concept") (Literaturzitat 34). Nach der Inkubation folgt ein Waschschritt. Gemäß einer dritten Alternative kann der heterogene Assay in einem Immunchromatographischen Format gemäß gut bekannter Technologie durchgeführt werden.
Alternativ kann der Assay als ein homogener Assay durchgeführt werden, wobei keine Abtrennung vor der Zugabe des Markierungs-Antikörpers notwendig ist, der simultan mit dem Fang-Antikörper hinzugefügt werden kann. Bei dieser Alternative ist der Fang-Antikörper vorzugsweise an einen Farbstoff in der Form eines kleinen Partikels, insbesondere eines Nanopartikels, oder an ein lumineszentes Molekül gebunden. Ein besonders bevorzugter homogener Assay ist ein homogener Energietransfer-Assay, wobei der Fang-Antikörper an einen lumineszenten Lanthaniden-Chelat-Komplex gebunden ist, der durch Strahlung angeregt wird und in der Lage ist, Energie auf die Markierung des Markierungs-Antikörpers zu übertragen. Solche Assays werden im Fachgebiet beschrieben, z.B. in WO 98115830 und EP 965043 .
Durch Verwendung geeigneter Farbstoffe kann der homogene Assay in einem Serum, einer Plasmaprobe oder einer Vollblutprobe durchgeführt werden.
Alternativ kann der Assay unter Verwendung eines homogenen Detektionssystems ("Fluorescence Energy Transfer Dye System"), aber in Kombination mit einem eingebauten Waschsystem, basierend auf Kapillarkräften, wie in dem Triage^® Cardiac System (Biosite Diagnostics) verwendet, durchgeführt werden.
Die Erfindung wird durch den folgenden nicht-einschränkenden experimentellen Abschnitt veranschaulicht werden.
EXPERIMENTELLER ABSCHNITT
Wir haben die analytische Wiederfindung von aus Gewebe stammendem cTnI (ternärer Troponin-Komplex) in verschiedenen Probenmatrizes, die von gesunden Individuen oder Patienten mit Symptomen von Brustschmerz erhalten wurden, unter Verwendung von Antikörpern, die verschiedene cTnI-Epitope erkennen, untersucht. Die cTnI-Konzentration bei Eintritts- und Überwachungsproben von Patienten mit Myokardinfarkt (MI) wurde ebenfalls mit zwei Forschungs- und zwei kommerziellen cTnI-Assays gemessen. Die Ergebnisse zeigen das häufige Auftreten einer bis jetzt unidentifizierten Serum- und Plasma-Komponente, die schwerwiegend störend auf das Binden von Antikörpern, insbesondere an Epitope des stabilen Mittelfragments von cTnI, wirken kann.
Materialien und Verfahren
Reagentien
Humaner kardialer Troponin-Komplex (nativ, aus Gewebe stammender Komplex von cTnI-cTnT-TnC) und monoklonale Antikörper (Mabs), spezifisch für cTnI, wurden von HyTest Ltd. erhalten. Fünf Mabs wurden verwendet, von denen drei Epitope in dem stabilen Teil von cTnI (Mab 1-Epitop in dem Bereich der Aminosäurereste 35–55, Mab 2- und Mab 5-Epitope in dem Bereich der Aminosäurereste 80–95) hatten, einer ein N-terminales Epitop in dem Bereich von 20–35 (Mab 3) hatte und einer ein C-terminales Epitop in dem Bereich von 185–200 (Mab 4) hatte. Alle Antikörper erkennen sowohl freies cTnI, als auch cTnI im Komplex mit TnC oder TnT oder beiden. Standards wurden durch Verdünnen des kardialen Troponin-Komplexes in einem Puffer, der 7,5% Rinderserumalbumin, 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,75, 15 mmol/l NaCl und 0,5 g/l NaN₃ enthielt, hergestellt. Die cTnI-Konzentration der Troponin-Komplex-Stammlösung, die durch den Hersteller angegeben wurde, wurde verwendet, um die cTnI-Konzentrationen der Standardverdünnungen zuzuordnen. Die Standards wurden bei –20°C bis zur Verwendung gelagert, und für jeden Assay wurde ein neuer Satz von Standards verwendet.
Proben
Zehn Plasmaproben mit EDTA als Antikoagulans und passende Serumproben wurden von offensichtlich gesunden Freiwilligen im Fachgebiet Biotechnologie der Universität von Turku genommen. Heparin-Plasmaproben von 16 Patienten mit Brustschmerz wurden bei Einlieferung und zum Überwachen bis zu 97 h in der Abteilung für innere Medizin des Oulu Universitäts-Krankenhauses genommen. Die entsprechenden Serumproben wurden anfänglich im Labor des Oulu-Universitäts-Krankenhauses mit A × SYM Troponin I (Abbott Laboratories) und ACS:180 cTnI (Bayer Diagnostics) analysiert (31). Alle Proben wurden bei –20°C oder bei –70°C zur Langzeitlagerung gelagert.
Markierung der Antikörper mit Lanthaniden-Chelat-Komplex oder Biotin
Der intrinsisch fluoreszente Europium-Chelat-Komplex, der für die Markierung der Detektions-Antikörper verwendet wurde, wurde freundlicherweise von M. Sc. Jaana Rosenberg (Fachgebiet für bioorganische Chemie, Universität Turku, Finnland) zur Verfügung gestellt. Der Chelat-Komplex war ein Europium (III)-Chelat-Komplex von 2,2',2'',2''-[[4-[(4-Isothiocyanatophenyl)ethinyl]pyridin-2,6-diyl]bis(methylennitrilo)]tetrakis(essigsäure) (32). Die Markierung der Antikörper wurde in 50 mmol/l Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,8, mit einem 100fachen molaren Überschuss des Chelat-Komplexes bei Raumtemperatur über Nacht (16–20 h) durchgeführt. Der markierte Antikörper wurde von der überschüssigen freien Markierungssubstanz auf einer Superdex 200 HR 10/30-Gelfiltrationssäule abgetrennt, die mit 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,75, 15 mmol/l NaCl, 0,5 g/l NaN₃ und 25 ml/h äquilibriert und betrieben wurde, und es wurden 0,5 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, die das markierte Protein enthielten, wurden vereinigt, die Proteinkonzentration wurde mittels des Bio-Rad Protein Assays (Bio-Rad) bestimmt, und der Markierungsgrad wurde unter Verwendung einer Europium-Kalibrierlösung bestimmt. Rinderserumalbumin wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 g/l hinzugefügt, und die Lösung wurde durch ein Filter mit 0,22 μm Porengröße gefiltert und bei +4°C gelagert. Die Markierungsgrade der Antikörper waren 6–12 Eu-Chelat-Komplexe pro IgG-Molekül.
Biotinisothiocyanat (J. Rosenberg) wurde für die Biotinylierung von Antikörpern verwendet. Der Antikörper wurde mit einem 30fachen molaren Überschuss von Biotinisothiocyanat in 50 mmol/l Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,8, bei Raumtemperatur 4 h lang biotinyliert. Der biotinylierte Antikörper wurde von dem freien Biotinylierungsreagenz abgetrennt, indem das Reaktionsgemisch zweimal durch Einweg-NAP-5- oder NAP-10-Säulen (Amersham Biosciences AB) mit 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,75, 15 mmol/l NaCl, 0,5 g/l NaN₃ als Eluent hindurchgeleitet wurde. Rinderserumalbumin wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 g/l hinzugefügt, und die Lösung wurde durch ein Filter mit 0,22 μm Porengröße filtriert und bei +4°C gelagert.
Immunoassays
Der biotinylierte Fang-Antikörper Mab 1, 400 ng in 25 μl DELFIA^® Assay-Puffer (Perkin Elmer Life Sciences, Wallac Oy) pro Well, wurde 1 h lang bei 35°C ohne Schütteln an Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplattenwells (Innotrac Diagnostics Oy) gebunden. Nicht-gebundener Fang-Antikörper wurde durch Waschen der Wells entfernt, und 100 ng Eu-markierter Antikörper (Mab 2, 3, 4 oder 5) wurde in einem Volumen von 20 μl, gefolgt von 20 μl Standard oder Probe, hinzugefügt. Die Wells wurden 1 h lang bei 36°C unter langsamem Schütteln inkubiert, und die Wells wurden gewaschen und für 5 min unter einem Strom heißer trockener Luft getrocknet. Die zeitaufgelöste Europium-Fluoreszenz wurde direkt von der trockenen Oberfläche in einem Victor 1420 Multilabel Counter (Perkin-Elmer Life Sciences, Wallac Oy) gemessen. Der Assay mit vier Antikörpern, unter Verwendung von Mabs 1 und 3 als Fang-Antikörper und Mabs 2 und 4 als Detektions-Antikörper (Mabs 1 und 3/Mabs 2 und 4) wurde in der gleichen Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 200 ng jedes biotinylierten Fang-Antikörpers verwendet wurden. Die unteren Nachweisgrenzen (+2 Standardabweichungen des Blindwerts) waren näherungsweise 0,03 μg/l und 0,02 μg/l für den Mab 1/Mab 2-Assay bzw. den Mabs 1 und 3/Mabs 2 und 4-Assay.
Analytische Wiederfindung
Soweit nicht anders angegeben, wurde die analytische Wiederfindung des Standard-cTnI nach dem Zugeben von ternärem Troponin-Komplex, entsprechend 30 μg/l cTnI (Endkonzentration) zu den Proben gemessen. Das Signal aus der dotierten Probe wurde mit dem Signal eines Puffers (7,5% Rinderserumalbumin, 50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,75, 15 mmol/l NaCl und 0,5 g/l NaN₃), in der gleichen Weise dotiert, verglichen, und die Wiederfindung wurde basierend auf der Annahme berechnet, dass die Wiederfindung in dem Puffer 100% war. Die Wiederfindung von endogenem cTnI wurde nach Zugabe eines kleinen Volumens einer Patientenprobe mit hoher cTnI-Konzentration zu den Proben getestet. Die cTnI-Konzentration in der Patientenprobe wurde mit dem Mab 1/Mab 2-Assay gegen Standards bestimmt, die aus der ternären Troponin-Komplex-Stammlösung hergestellt wurden.
Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von Microcal^TMOrigin^®, Version 6.0, durchgeführt.
ERGEBNISSE
Analytische Wiederfindung von cTnI in Serum und in EDTA-Plasma
Die analytische Wiederfindung von Standard-cTnI, zugegeben als ternärer Troponin-Komplex, entsprechend einer cTnI-Endkonzentration von 30 μg/l oder 500 μg/l, und cTnI aus einer Serumprobe mit hoher cTnI-Konzentration, zugegeben bis zu einer Endkonzentration von 9 μg/l, wurde im Serum und in EDTA-Plasma von gesunden Freiwilligen mit dem Original-Mab 1/Mab 2-Assay gemessen. Die Wiederfindung von cTnI in individuellen Serum- und EDTA-Plasmaproben ist in Tabelle 1 gezeigt. Die mittlere Wiederfindung in Serumproben, die auf 30 μg/l dotiert waren, war 43,8% (Bereich 7,0–71,2%), und 27,1% (Bereich 5,5–38,6%) in EDTA-Plasmaproben. Wenn die Proben auf 500 μg/l dotiert waren, war die mittlere Wiederfindung 81,3% (Bereich 66,1–88,8%) und 74,0% (Bereich 61,6–80,9%) in Serum- bzw. EDTA-Plasmaproben. Wenn die Proben mit endogenem cTnI auf eine Endkonzentration von 9 μg/l dotiert waren, war die mittlere Wiederfindung 48,1% (Bereich 22,4–66,2%) in Serum und 38,5% (Bereich 23,6–51,0%) in EDTA-Plasma).
Tabelle 1. Wiederfindung (%) von cTnI als Teil des ternären Troponin-Komplexes, der bis zu einer cTnI-Endkonzentration von 30 oder 500 μg/l hinzugefügt worden war, und Wiederfindung (%) von cTnI aus einer Serumprobe eines AMI-Patienten, die bis zu einer Endkonzentration von 9 μg/l zu Serum oder EDTA-Plasma von 10 gesunden Freiwilligen hinzugefügt worden war. Die Wiederfindungen in den Proben 3 und 10 waren signifikant verschieden von der mittleren Wiederfindung in Serum, das auf 30 μg/l dotiert war (p = 0,0014 und p = 0,0003), in Plasma, das auf 30 μg/l dotiert war (p = 0,0013 und p = 0,0002), in Serum, das mit endogenem cTnI dotiert war (p = 0,0018 und p = 0,0003), und in Plasma, das mit endogenem cTnI dotiert war (p = 0,0206 und p = 0,0001). Die Wiederfindung bei Probe 10 war auch in Serum und Plasma, die auf 500 μg/l dotiert waren (p > 0,0001 und p = 0,0002), signifikant vom Mittelwert verschieden, während die Wiederfindung bei Probe 3 dies nicht war (p = 0,7626 und p = 0,2166).
Wiederfindung mit verschiedenen Antikörperkombinationen
Verschiedene Antikörper (Mabs 2, 3, 4 und 5) wurden als Detektions-Antikörper mit Mab 1 als Fang-Antikörper getestet, um zu sehen, ob die Wiederfindung von cTnI davon abhängig war, welche Antikörper verwendet wurden. Die EDTA-Plasmaproben 8 ("normale" Wiederfindung) und 10 (geringe Wiederfindung) wurden mit cTnI bis zu Endkonzentrationen von 0,3, 3 und 30 μg/l dotiert. Die Wiederfindung war näherungsweise 10% bei Probe 10 und 20 bis 40% bei Probe 8, sowohl mit Mab 2 als auch mit Mab 5, die sich das gleiche Epitop im zentralen Teil von cTnI teilen. Das Verwenden von Mab 3 zur Detektion, der ein Epitop in dem N-terminalen Bereich von cTnI hat, ergab eine signifikant verbesserte Wiederfindung, und der Unterschied bei der Wiederfindung zwischen Probe 8 und Probe 10 war merklich vermindert. Mab 4, mit einem C-terminalen Epitop, ergab ebenfalls eine verbesserte Wiederfindung, verglichen mit Mabs 2 und 5, aber bei Probe 10 blieb die Wiederfindung noch immer unter 30%. Die Wiederfindung mit den verschiedenen Antikörpern ist in 2 gezeigt.
Entwicklung eines cTnI-Assays unter Verwendung von zwei Fang- und zwei Detektions-Mabs
Die Wiederfindungsergebnisse mit verschiedenen Antikörpern lieferten die Basis für die Entwicklung eines neuen cTnI-Assayformats mit zwei Fang-Mabs und zwei Detektions-Mabs. Basierend auf dem Ergebnis, dass die Wiederfindung mit Mab 3 als dem Fang- und Mab 4 als dem Detektions-Antikörper nahe 100% war, sogar bei den Proben mit geringer Wiederfindung (Daten nicht gezeigt), wurden verschiedene Kombinationen mit Mabs 1, 2, 3 und 4 getestet. Da bekannt ist, dass die N- und C-terminalen Teile des cTnI-Moleküls, an die Mabs 3 und 4 binden, rasch abgebaut werden können, wurde entschieden, an den Mabs 1 und 2 festzuhalten, so dass die Detektion von cTnI in Proben, die abgebautes cTnI enthielten, möglich sein würde. Die vier getesteten Kombinationen waren Mabs 1 + 3 (Fang) mit Mabs 2 + 4 (Markierung), Mabs 1 + 4 (Fang) mit Mabs 2 + 3 (Markierung), Mabs 2 + 3 (Fang) mit Mabs 1 + 4 (Markierung) und Mabs 2 + 4 (Fang) mit Mabs 1 + 3 (Markierung). Die endgültige Kombination wurde basierend auf einem Kompromiss zwischen hohen spezifischen Signalen, Hintergrundsignalleveln in Proben von gesunden Individuen und erhöhter Wiederfindung von Standard-cTnI in Proben, die geringe Wiederfindung bei der Mab 1/Mab 2-Kombination zeigten, ausgewählt. Das endgültige Assayformat mit zwei Fang- und zwei Markierungs-Antikörpern war Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4.
Analyse der Proben bei Einlieferung bzw. Eintrittsproben und Folgeproben von Patienten mit Brustschmerz
Die cTnI-Ergebnisse von 16 Patienten, die Brustschmerz aufwiesen, (Proben bei Einlieferung bzw. Eintrittsproben plus 3–8 Folgeproben, insgesamt 108 Proben) mit dem zuvor bekannten Mab 1/Mab 2-Assay und dem neuen Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assay wurden miteinander und mit den Serumproben-Ergebnissen aus den kommerziell erhältlichen A × Sym- und ACS:180-cTnI-Assays verglichen. Zwei Patienten (Patienten 1 und 5) zeigten deutlich höhere relative Ergebnisse mit dem Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assay als mit irgendeinem der anderen Assays, während die Ergebnisse aus allen Assays für die anderen Patienten in guter Übereinstimmung waren (6). Wie aus 3 gesehen werden kann, waren die Unterschiede zwischen den vier Assays aufgrund von Unterschieden bei der Kalibration und bei der Antikörperspezifität beträchtlich. Unsere Forschungs-Mab 1/Mab 2- und Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assays, welche die gleichen Kalibrationsstandards verwenden, ergaben recht ähnliche Ergeb nisse mit geringfügig geringeren Konzentrationen mit dem Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assay. Der Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assay ergab deutlich geringere Ergebnisse, allgemein weniger als 10% der Konzentration mit A × Sym und etwa 20% derjenigen, die mit ACS:180 erhalten wurde. Der vom Hersteller empfohlene klinische MI-Ausschluss für A × Sym-cTnI war 2,0 μg/l und für ACS:180-cTnI war er 1,5 μg/l derzeit, als die Analysen durchgeführt wurden. Die klinischen Ausschlüsse für unsere Forschungsassays sind nicht endgültig etabliert worden, aber eine Abschätzung, basierend auf einer Korrelation mit den zwei kommerziellen Assays, würde einen Ausschluss um 0,2 μg/l für beide Assays nahe legen (z.B. A × Sym mit einem Ausschluss von 2,0 μg/l ergibt näherungsweise 10 Mal höhere cTnI-Konzentrationen als unsere Assays). Als die Daten unter Verwendung dieser Ausschlusswerte für die Patienten 1 und 5 normalisiert wurden (4A und 4B), war es offensichtlich, dass insbesondere bei Patient 1 der neue Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assay früher als irgendeiner der anderen Assays eine MI-Diagnose nahe legen würde. Auch bei Patient 5 ergibt der Mabs 1 + 3/Mabs 2 + 4-Assay Konzentrationen über dem Ausschluss, beginnend von der ersten Probe an. Der Unterschied zwischen den Assays war bei den ersten Proben mit kleineren cTnI-Konzentrationen am größten, und die relativen Unterschiede verringerten sich bei Proben, die später bei der Überwachung der Patienten genommen wurden. Basierend auf den Elektrokardiogrammen wurde bei Patient 1 instabile Angina mit ST-Streckensenkung diagnostiziert, und Patient 5 wurde als mit ST-Streckenhebungsinfarkt klassifiziert.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Diese Studie ist der erste Bericht einer häufig auftretenden Serum- und Plasmakomponente, die schwerwiegend störend auf die Bestimmung von zirkulierendem cTnI einwirkt. Während wir an diesem Punkt nicht in der Lage waren, diese Komponente zu identifizieren, wurden einige wesentliche Merkmale hinsichtlich ihres Auftretens und ihrer Störung bei den cTnI-Messungen geklärt. Wichtiger kann basierend auf diesen Beobachtungen ein alternativer Weg zum Auswählen von Antikörpern für cTnI-Assays empfohlen werden, wodurch die inhibierende Wirkung des interferierenden Faktors vermieden oder zumindest gemindert werden kann. Dieses Ergebnis wird von zentraler Wichtigkeit für die Entwicklung neuer cTnI-Assays mit verbesserter und standardisierter Leistung sein.
Basierend auf unseren Wiederfindungstests mit verschiedenen Antikörpern schließen wir, dass die Antikörper gegen Mittelfragment-Epitope am meisten durch den interferierenden Faktor beeinflusst werden, insbesondere die Mabs 1 und 5 mit Epitopen um die Aminosäuren 80–95. Mab 1 des Mittelfragments (Epitop um die Aminosäuren 35–55) ist deutlich weniger beeinflusst, aber es war schwierig, den Einfluss des interferierenden Faktors auf einzelne Antikörper vollständig einzuschätzen, da die Tests immer mit einer Kombination aus zwei Antikörpern durchgeführt wurden. Die N-terminalen und C-terminalen Epitope waren in einem wesentlich geringeren Ausmaß beeinflusst, und insbesondere das N-terminale Epitop erschien nahezu unbeeinflusst. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass cTnI-Assays, die Antikörper gegen Epitope verwenden, die in dem zentralen, stabilen Teil von cTnI gelegen sind, falsche oder zu geringe cTnI-Konzentrationen in Proben ergeben, die den interferierenden Faktor enthalten, und da die Empfehlung, solche Antikörper zu verwenden, allgemein akzeptiert ist, ist es wahrscheinlich, dass die meisten kommerziell erhältlichen cTnI-Assays durch diese unbekannte Komponente beeinflusst werden. Beide kommerziellen cTnI-Assays, die zum Messen der Patientenproben verwendet wurden, setzen Antikörper gegen den stabilen Teil des Moleküls ein (33) und, basierend auf den cTnI-Ergebnissen der Patienten 1 und 5, werden beide schwerwiegend durch die interferierende Komponente beeinflusst. Gemäß Collinson et al. sind die Epitope der in dem ACS:180-Assay verwendeten Antikörper in dem Bereich der Aminosäuren 30 bis 40 und 70 bis 88, während die Epitope für die in dem A × Sym-Assay eingesetzten Antikörper die Aminosäuren 20–39 und 87–91 umfassen (33).
Wir schlagen vor, dass der Wirkungsmechanismus des interferierenden Faktors auf dem Blockieren bestimmter Mittelfragment-Epitope auf cTnI, wahrscheinlich durch nicht-kovalentes Binden an den zentralen Teil von cTnI, beruht. Die Wirkung war bei dem aus Gewebe stammenden ternären Troponin-Komplex (Standardmaterial) etwas mehr hervortretend als bei den endogenen cTnI-Formen und in EDTA-Plasma offensichtlicher als in Serum. Basierend auf unseren Wiederfindungsexperimenten wissen wir, dass der interferierende Faktor sehr rasch an cTnI bindet, was eine geringe Wiederfindung verursacht, sogar wenn cTnI direkt vor dem Assay hinzugefügt wird, was darauf hindeutet, dass er eine hohe Affinität gegen cTnI hat. Der interferierende Faktor schien in kleinen und begrenzten Mengen vorhanden zu sein, da das Dotieren von Proben mit mehr cTnI scheinbar durch Sättigen des interferierenden Faktors in einer signifikant höheren Wiederfindung resultierte. Darüber hinaus war die zunehmende Wirkung in den Proben der Patienten 1 und 5, die durch den Assay mit vier Antikörpern bereitgestellt wurde, in den ersten Proben am größten, wenn nur wenig cTnI freigesetzt war. Als nachfolgend mehr cTnI freigesetzt wurde, wurde die inhibierende Wirkung des interferierenden Faktors graduell vermindert.
Basierend auf unseren Ergebnissen, sollten die Konsequenzen des interferierenden Faktors auf die cTnI-Messungen sorgfältig bedacht werden. Er wird eine veränderliche Inhibierung der cTnI-Immunreaktivität von schwacher bis zu sehr schwerer Inhibierung, abhängig von der Menge des interferierenden Faktors in der Probe, verursachen. Die vorläufigen Ergebnisse, die bei den Patienten 1 und 5 erhalten wurden, zeigten, dass der interferierende Faktor die größte Wirkung auf die cTnI-Messungen hatte, wenn nur wenig cTnI in der Probe vorhanden war, wie in den frühen Stunden eines MI oder eines Ereignisses bei instabiler Angina. Proben, die früh nach einem kardialen Ereignis genommen werden, könnten ein negatives Ergebnis ergeben, da das gesamte freigesetzte cTnI durch den interferierenden Faktor maskiert sein wird. Später im Verlauf, wenn mehr cTnI freigesetzt wird, wird mehr cTnI gemessen werden, da der interferierende Faktor nur in einer begrenzten Menge vorhanden ist und durch das freigesetzte cTnI gesättigt sein wird. Dies bedeutet, dass bei Patienten mit hohen Konzentrationen des interferieren den Faktors der MI oder das Ereignis bei instabiler Angina vollständig übersehen werden könnte, insbesondere, wenn ein Patient nach den ersten negativen cTnI-Messungen entlassen wird.
Unsere Lösung für das beschriebene Störungsproblem ist ein Multi-Antikörper-Assay-Ansatz, um die Detektion von cTnI in Gegenwart des interferierenden Faktors sicherzustellen. Da die meisten "störungsfreien" Antikörper gegen Epitope in den terminalen Teilen des Moleküls gerichtet sind, die in fragmentierten cTnI-Molekülen nicht vorhanden sind, stellen Kombinationen mit Mittelfragment-Antikörpern eine brauchbare Option bereit, die insgesamt vier Möglichkeiten für eine Sandwich-Bildung ermöglicht.
Um diese Theorie weiter zu beurteilen, testeten wir zwei zusätzliche Assays gemäß diesem Prinzip, nämlich Assay A und Assay B, und verglichen die Ergebnisse mit den zuvor bekannten Assays.
Assay A verwendet zwei biotinylierte monoklonale Antikörper zum Binden ("capture") von cTnI an die Festphase einzelner Streptavidin-beschichteter Mikrotiterplattenwells. Ein Fang-Antikörper ist auf die As 41–49 gerichtet und der andere auf die As 190–196. Der Detektions-Antikörper, der mit einem stabilen intrinsisch fluoreszenten Europium-Chelat-Komplex markiert ist, ist gegen die As 137–148 von cTnI gerichtet. Dieser Assay basiert auf dem Alles-in-einem-Trocken-Chemie-Konzept (Literaturzitat 34). Kurz gesagt, sind alle Komponenten in dem Well in einer trockenen stabilen Form eingerichtet. Der Innotrac Aio Immunoanalyzer wird zur Durchführung des Assays verwendet. Die Zugabe von 20 μl Probe (Serum, Plasma oder Vollblut) und 10 μl Assaylösung startet die Reaktion. Nach 15 Minuten Inkubation wird das Well sechsmal mit Assaylösung gewaschen und kurz getrocknet. Das Signal des Detektions-Antikörpers wird unter Verwendung zeitaufgelöster Fluorometrie gemessen. Der Assay wird in zwei Wells als Duplikat durchgeführt, und das angegebene Ergebnis ist die mittlere Ablesung aus zwei Wells.
Assay B verwendet drei biotinylierte monoklonale Antikörper zum Binden von cTnI; wobei einer auf die As 23–29, einer auf die As 41–49 und einer auf die As 190–196 gerichtet ist. Der Detektions-Antikörper ist auf TnC gerichtet, d.h., der Assay misst den cTnI-TnC-Komplex. Das Ergebnis wird als die Menge (ng/ml) von cTnI angegeben, um einen Vergleich zwischen den Assays zu erleichtern bzw. zu ermöglichen. Assay B basiert ebenfalls auf dem Alles-in-einem-Trocken-Chemie-Konzept und wird in der gleichen Weise wie Assay A durchgeführt.
Assay Immunol ist ein kommerzieller cTnI-Assay, hergestellt von Bayer Diagnostics.
Assay Access AccuTnI ist ein kommerzieller cTnI-Assay, hergestellt von Beckman Coulter.
In 5 wurde der Mab 1/Mab 2-Assay, welcher einen monoklonalen cTnI-Antikörper, der gegen die As 41–49 gerichtet ist, zum Binden, und einen monoklonalen cTnI-Antikörper, der gegen die As 87–91 gerichtet ist, zur Detektion verwendet, als ein Alles-in-einem-Assay (gleiches Assay-Protokoll wie für Assay A und Assay B) durchgeführt und nicht, wie in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben. Es kann gesehen werden, dass die neuen Assays, Assay A und Assay B, bei allen Patienten deutlich höhere cTnI-Ergebnisse beim Auftreten ergeben als die zuvor bekannten Assays, welche falsch-negative Ergebnisse an diesem Punkt ergeben.
6 zeigt cTnI-Freisetzungsprofile für zwei Patienten, die sich mit Brustschmerz präsentieren. cTnI wurde mittels der Assays gemäß dieser Erfindung, Assay A und B, und mittels zuvor bekannter Assays, nämlich eines kommerziellen Assays, Access AccuTnI, und Assay Mab 1/Mab 2 gemessen. Probe 1 wurde beim Einliefern in die Notaufnahme genommen, und Probe 2 wurde 6 Stunden später genommen. Die analytische Wiederfindung von 3 μg/l cTnI war 34,2% bei Probe 1 von Patient A und 13,1% in Probe 1 von Patient B, wenn sie mit dem Assay Mab 1/Mab 2 gemessen wurde.
Die analytische Wiederfindung von hinzugefügten cTnI (3 μg/l) wurde mit dem Mab 1/Mab 2-Assay (der durch die Gegenwart von IF beeinflusst wird) in Proben gemessen, die beim Eintritt von 52 Patienten genommen wurden, die sich mit Brustschmerz präsentierten. Eine weitere Probe wurde näherungsweise 6 Stunden später genommen. Die Box-Whisker-Plots (7) zeigen das Konzentrationsverhältnis der neuen Assays zu Beckman Access AccuTnI, wobei die Proben gemäß der Wiederfindung von cTnI in der Eintrittsprobe (</> 40%) gruppiert sind. Das mittlere Verhältnis von Assay A zu Access AccuTnI war 1,038 in Proben mit einer Wiederfindung <40% und 0,462 in Proben mit einer Wiederfindung >40%. Das mittlere Verhältnis von Assay B zu Access AccuTnI war 2,858 in Proben mit einer Wiederfindung <40% und 0,614 in Proben mit einer Wiederfindung >40%. Der Unterschied zwischen dem Mittelwert in Proben mit Wiederfindungen <40% oder >40% war statistisch verschieden in einem t-Test mit unabhängigen Proben (p = 0,004 für Assay A, p < 0,001 für Assay B). Der Median der Wiederfindung von cTnI war 65,0% in den 52 Eintrittsproben. Ergebnisse, die unterhalb der Nachweisgrenze der Assays A und B (0,012 μg/l) waren, wurden nicht eingeschlossen (Assay A n = 15; Assay B n = 16), wobei alle von diesen Eintrittsproben waren und eine Wiederfindung >40% hatten.
Die "Whisker" zeigen die Minimal- und Maximalwerte (Ausreißer ausgeschlossen), die Boxen stellen die 25–75. Perzentile dar, und die Horizontallinien stellen den Median dar. N = stellt die Anzahl von Proben in jeder Gruppe dar.
Die Figuren zeigen, dass die neuen Assays empfindlicher sind als der Access AccuTnI-Assay für Proben, die eine geringe analytische Wiederfindung von cTnI haben, wenn sie mit dem Mab 1/Mab 2-Assay gemessen wurden, d.h., eine relativ hohe Konzentration von IF.
Es wird anerkannt werden, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Form einer Vielzahl von Ausführungsformen eingeschlossen sein können, von denen nur wenige hierin offenbart sind. Es wird für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich werden, dass andere Ausführungsformen existieren und nicht vom Geist der Erfindung abweichen. Somit sind die beschriebenen Ausführungsformen veranschaulichend und sollten nicht als einschränkend interpretiert werden.
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Claims

Verfahren zur Detektion und/oder Quantifizierung von kardialem Troponin I (cTnI) in einer Probe, stammend aus Blut eines Individuums, wobei das Verfahren auf einem Sandwich-Immunoassay basiert, wobei mindestens zwei Fang-Antikörper und mindestens ein Markierungsantikörper eingesetzt werden, wobei – ein erster Fang-Antikörper auf den N-terminalen Teil von cTnI, auf den C-terminalen Teil von cTnI oder auf den Teil des cTnI-Mittelfragments gerichtet ist, der geringfügig durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird, und ein zweiter Fang-Antikörper auf einen anderen der zuvor genannten Teile gerichtet ist, und – ein Markierungsantikörper auf den N-terminalen Teil von cTnI, auf den C-terminalen Teil von cTnI oder auf TnC gerichtet ist, das mit cTnI komplexiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein erster Fang-Antikörper auf den Teil des cTnI-Mittelfragments gerichtet ist, der geringfügig durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird, und ein zweiter Fang-Antikörper auf den N-terminalen Teil oder den C-terminalen Teil von cTnI gerichtet ist und ein Markierungsantikörper auf den C-terminalen Teil von cTnI gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der erste Fang-Antikörper auf den Epitopbereich As 30–70, vorzugsweise As 41–49, gerichtet ist, der zweite Fang-Antikörper auf den Epitopbereich As 148–209, vorzugsweise As 190–196, gerichtet ist und der Markierungsantikörper auf das Epitop As 110–148, vorzugsweise 137–148, gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Fang-Antikörper auf den Teil des cTnI-Mittelfragments gerichtet ist, der geringfügig durch den interferierenden Faktor beeinflusst wird, und ein zweiter Fang-Antikörper auf den C-terminalen Teil von cTnI gerichtet ist und ein dritter Fang-Antikörper auf den N-terminalen Teil von cTnI gerichtet ist und der Markierungsantikörper auf TnC gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der erste Fang-Antikörper auf den Epitopbereich As 30–70, vorzugsweise As 41–49, gerichtet ist, der zweite Fang-Antikörper auf den Epitopbereich As 148–209, vorzugsweise As 190–196, gerichtet ist und der dritte Fang-Antikörper auf den Epitopbereich As 1–29, vorzugsweise As 23–29, gerichtet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei der Fang-Antikörper oder die Fang-Antikörper an einer festen Oberfläche befestigt ist/sind und das Verfahren als ein heterogener Assay, entweder in einem Schritt oder in mehreren Schritten, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei der Fang-Antikörper oder die Fang-Antikörper an einem kleinen Teilchen befestigt ist/sind oder an ein Molekül gebunden ist/sind und das Verfahren als ein homogener Assay durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Fang-Antikörper oder die Fang-Antikörper an ein Molekül, vorzugsweise einen lumineszenten Lanthanidenchelatkomplex, gebunden ist/sind, und das Verfahren als ein homogener Energietransfer-Assay durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe Serum, Plasma oder Vollblut ist.