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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Messungen der
elektrischen Leitfähigkeit
des Urins und die Konzentrationen von relevanten Urinanalyten bei
der Diagnose von Erkrankungen. Genauer betrifft die vorliegende
Erfindung die Verwendung von leitfähigkeits-normalisierten Messungen
von Thromboxankonzentrationen des Urins bei der Diagnose von akuten
Herzerkrankungen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Eines
der Haupterfordernisse für
die wirksame Behandlung von medizinischen Erkrankungen ist die Verfügbarkeit
von genauen, bequemen und schnellen Diagnosemethoden. Obwohl dies
für alle
Erkrankungszustände
gilt, ist es im Fall von möglicherweise
lebensbedrohlichen Erkankungen wie beispielsweise akuten Herzerkrankungen
vielleicht am meisten relevant.
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Die
Gruppe von Erkrankungen, welche das Herz und Blutgefäße betreffen,
ist eine der führenden
Ursachen für
Morbidität
und Sterblichkeit. Insbesondere akutes Koronarsyndrom (ACS) ist
eine führende
Todesursache in der westlichen Welt. Obwohl die Gruppe von Herzgefäßerkrankungen
insgesamt genommen aus einer Vielzahl von unterschiedlichen einzelnen
Erkrankungen besteht, von denen jede ihre eigenen spezifischen pathogenen
Faktoren besitzt, ist ein gemeinsames Element vieler der wichtigsten
Herzgefäßerkrankungen
die Bildung von atherosklerotischem Plaque mit all ihren verschiedenen
biochemischen und pathophysiologischen Konsequenzen.
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Auf
einer weltweiten Skala befinden sich jedes Jahr mehr als 70 Millionen
Menschen in Krankenhäusern
und anderen medizinischen Grundversorgungseinrichtungen, die an
Brustschmerzen leiden. Allein in den Vereinigten Staaten gibt es
jedes Jahr mehr als 6 Millionen Menschen mit Brustschmerzen, eine
Statistik, die sich in der Tatsache widerspiegelt, dass Herzgefäßerkrankungen
ein ganzes Viertel der gegenwärtigen
jährlichen
Gesundheitskosten in den Vereinigten Staaten ausmachen.
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Da
die Wirksamkeit der Behandlung ab dem Zeitpunkt eines Myokardanfalls
exponentiell abfällt,
ist die Verfügbarkeit
von schneller und genauer Diagnose von kardiovaskulärer Pathologie
und somit der Beginn einer geeigneten Behandlung zu einem viel früheren Zeitpunkt
für die
Verringerung der Anzahl von Todesfällen an einer Herzerkrankung
entscheidend.
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Ein
zusätzlicher
medizinischer Vorteil, der von verbesserter Diagnose-Screeningtechnologie
herrührt, ist
die Möglichkeit,
Patienten, bei denen ein Risiko zur Entwicklung atherosklerotischer
Läsionen
und anschließender
vaskulärer
(und zerebrovaskulärer)
Pathologie besteht, zu detektieren. Dies ist ein offensichtlicher
Vorteil für
die Entwicklung von verlässlichen
Strategien für
die Prävention
schwerwiegender Herzgefäßerkrankungen.
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Schließlich wird
die Entwicklung von frühen
und genauen diagnostischen Tests ermöglichen, dass der Gesundheitsservice
die Anzahl von nicht notwendigen Krankenhausaufenthalten und die
Anwendung von kostspieligen Tests, verringern kann, was entscheidende
Kostenersparnisse bietet. Gegenwärtig
werden die jährlichen
Gesamtkosten zum Testen von Patienten auf ACS entsprechend dem American
College of Cardiology auf ungefähr
6 Milliarden US-Dollar geschätzt.
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Thromboxane
sind Verbindungen, die von Prostaglandin-Endoperoxiden abgeleitet
sind, welche Thrombozytenaggregation, arterielle Kontraktion und
viele andere biologische Wirkungen verursachen. Eine solche Verbindung, Thromboxan
A2, eine sehr instabile, biologisch aktive
bizyklische Oxitan-Oxanverbindung, zeigt
sehr starke gefäßverengende
und Thrombozytenaggregierende Eigenschaften. Es wurde gefunden, dass
Thromboxan A2 eine entscheidende Rolle bei
atherothrombischen Erkrankungen spielt, und es wurde gefunden, dass
dessen erhöhte
Synthese sofort nach Anfällen
wie beispielsweise instabiler Angina und akutem myokardialen Infarkt
stattfindet [Fitzgerald, D.J. et al. (1986) N. Engl. J. Med. 315:983–989]. Wie
oben erwähnt, ist
Thromboxan A2 sehr instabil und wird schnell
in stabile Metaboliten wie beispielsweise 11-Dehydrothromboxan B2 und 2,3-Di-northromboxan B2 (im
Folgenden hierin gemeinsam als "Thromboxan
B2" bezeichnet)
umgewandelt, welche im Urin ausgeschieden werden.
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Die
elektrischen Eigenschaften von ionenhaltigen Lösungen können auf verschiedene unterschiedliche
Weisen ausgedrückt
werden. Eine solche definierende Eigenschaft ist der Widerstand
gegen elektrischen Strom. Der Elektrische Widerstand (R) kann definiert
werden als: R= ρ ×(VA)worin L und A die
Länge bzw.
Querschnittsfläche
des Mediums sind, dessen Widerstand bestimmt wird und ρ die als
spezifischer Widerstand der Probe bekannte Proportionalitätskonstante
ist. Eine gemeinhin verwendete Messung der elektrischen Eigenschaften
einer elektrolytischen Lösung
ist die Leitfähigkeit,
welche als Kehrwert des spezifischen Widerstands definiert ist und üblicherweise
in Einheiten von Siemens pro Zentimeter (S/cm) gemessen wird.
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Die
Leitfähigkeit
von Urin ist inter alia eine Messung der Verdünnung des Urins und wurde als
solche bei Untersuchungen der Pathogenese von verschiedenen unterschiedlichen
Erkankungszuständen
verwendet. Ein solches Beispiel ist die Beziehung zwischen dem Verdünnungsgrad
des Urins und dem Risiko der Calciumoxalat-Kristallisation. In einer
Studie [Tiselius, H. G. (1992) J. Urol. 148: 990–994] wurde die elektrische Leitfähigkeit
von Urin bestimmt, um den Verdünnungsgrad
des Urins zu ermitteln. Die Ergebnisse dieser Studie legten nahe,
dass das die Kontrolle der Urinverdünnung durch Verwendung eines
Leitfähigkeitsmessgeräts ein nützliches
Kontrollwerkzeug für
die Vorbeugung von Calciumstein-Erkrankungen bereitstellen kann.
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Es
ist ein Zweck dieser Erfindung, ein Urinanalyseverfahren für die verlässliche
Diagnose von einer Vielzahl von medizinischen und chirurgischen
Erkrankungen bereitzustellen.
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Es
ist ein weiterer Zweck der Erfindung, ein solches Verfahren bereitzustellen,
welches technisch einfach durchzuführen ist und zu schnellen Ergebnissen
führt,
wodurch lange Wartezeiten vermieden werden, bevor entsprechende
Behandlungskuren begonnen werden können.
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Es
ist ein besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein solches
Verfahren bereitzustellen, das bei der Diagnose von akuten Herzerkrankungen
verwendet werden kann.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Diagnoseassay
bereitzustellen, das sehr früh bei
der Entwicklung von Herzerkrankungen verwendet werden kann, so dass
es als Frühwarn-,
First-Window-Technik verwendet werden kann, die zu verlässlichen
vorhersagenden Daten führt.
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Es
ist ein weiterer Zweck der Erfindung, ein Assay für die Diagnose
von akuten Herzerkrankungen bereitzustellen, welches die Probleme
des Standes der Technik überwindet.
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Andere
Ziele und Vorteile der Erfindung werden im Verlauf der Beschreibung
offensichtlich werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
wurde überraschenderweise
herausgefunden, dass die Messung von sowohl der elektrischen Leitfähigkeit
als auch der Konzentration von relevanten Analyten in Urinproben
als ein verlässliches
Diagnose- und Vorhersagewerkzeug verwendet werden kann. Unerwarteter
Weise wurde herausgefunden, dass die Verwendung von Leitfähigkeitsbestimmungen
als Mittel zur Normalisierung von Analytkonzentrationen im Urin
zu einer entscheidenden Steigerung der diagnostischen Verlässlichkeit
und Genauigkeit führt.
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Die
Erfindung ist in erster Linie auf ein Verfahren zur Diagnose einer
medizinischen Erkrankung in einem Subjekt gerichtet, umfassend die
Schritte von:
- a) Erhalten einer Urinprobe von
dem Subjekt;
- b) Messen der Konzentration von einem oder mehreren, für die Diagnose
der medizinischen Erkrankung relevanten Analyten in der Urinprobe;
- c) Messen der elektrischen Leitfähigkeit der Urinprobe;
- d) Erhalten eines normalisierten Werts (NTV) für die Analytkonzentration
durch Dividieren der in Schritt b) erhaltenen Analytkonzentration
durch die in Schritt c) erhaltene elektrische Leitfähigkeit
der Urinprobe;
- e) Bestimmen, ob das Subjekt an der medizinischen Erkrankung
leidet durch Vergleich des in Schritt d) erhaltenen NTV mit einem
vorher bestimmten Referenzwert.
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Die
oben genannten Schritte b) und c) können in beliebiger Reihenfolge
durchgeführt
werden oder alternativ können
sie gleichzeitig durchgeführt
werden.
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Die
Bezeichnung Herzerkrankung, wie hierin verwendet, soll pathologische
Erkrankungen des Herz oder der Blutgefäße einschließlich atherosklerotischer
Erkrankungen und pathologischer thrombogener Erkrankungen bedeuten.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens der Erfindung ist die medizinische Erkrankung, welche
diagnostiziert werden soll, eine akute Herzerkrankung und der relevante
Urin-Analyt umfasst ein oder mehrere Thromboxane, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Thromboxan B2,
11-Dehydrothromboxan B2, 2,3-Di-northromboxan B2 und
Mischungen davon.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens der Erfindung ist das gemessene Thromboxan Thromboxan
B2.
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Viele
unterschiedliche Assay-Techniken können verwendet werden, um die
in dem Verfahren der Erfindung erforderlichen Messungen durchzuführen. In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden sowohl die Analyt-(z.B. Thromboxan-) Konzentration als
auch die elektrische Leitfähigkeit
unter Verwendung eines amperometrischen Assays gemessen. Ein geeignetes
amperometrisches Assay zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung ist in der gleichzeitig anhängigen israelischen Patentanmeldung Nr.
132410 offenbart.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden sowohl die Analyt- (z.B. Thromboxan-) Konzentration, als
auch die elektrische Leitfähigkeit
unter Verwendung einer Vorrichtung auf Halbleiterbasis gemessen.
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In
noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
die elektrische Leitfähigkeit der
Urinprobe unter Verwendung eines Leitfähigkeitsmessgeräts gemessen.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens der Erfindung wird die Analyt- (z.B. Thromboxan-)
Konzentration unter Verwendung eines Immunoassays bestimmt. In einer
mehr bevorzugten Ausführungsform
ist das Immunoassay ein Enzymimmunoassay (EIA).
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Alle
obigen und weitere Kennzeichen und Vorteile der Erfindung werden
aus den folgenden veranschaulichenden und nicht begrenzenden Beispielen
von bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung besser verstanden werden.
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Detaillierte
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
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Die
Konzentration des relevanten Analyten, z.B. von Thromboxan B2-Verbindungen,
im Urin können durch
die Verwendung von beliebigen geeigneten quantitativen oder halb
quantitativen Techniken bestimmt werden. Solche geeigneten Techniken
beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, enzymgebundene Immunoassays
(ELISA), Radioimmunoassays (RIA), Immunoturbidimetrie Assays, amperometrische
Assays, Messstab-Assays und Messungen unter Verwendung von Vorrichtungen
auf Halbleiterbasis. Alle der vorhergehend erwähnten Techniken sind im Stand
der Technik ausgiebig beschrieben und dem Fachmann gut bekannt.
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Die
elektrische Leitfähigkeit
des Urins kann mit irgendeinem der im Stand der Technik bekannten
Standardverfahren gemessen werden, einschließlich der Verwendung von amperometrischen
Techniken und dazu bestimmten Leitfähigkeitsmessgeräten. Festkörper-Halbleitervorrichtungen
können
ebenfalls verwendet werden. Am günstigsten
könnten
sowohl die Thromboxankonzentration des Urins als auch die elektrische
Leitfähigkeitsbestimmung
gleichzeitig erhalten werden durch die Verwendung von separaten
Kanälen
der Halbeitervorrichtung. Die beiden separaten elektrischen Ströme, die
so generiert werden, könnten
getrennt analysiert werden und diagnostische Ergebnisse könnten entsprechend
der in dem folgenden Beispiel beschriebenen Datenanalysetechnik
gebildet werden.
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Beispiel
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Korrelation von Thromboxan-/Leitfähigkeits-Messungen
mit klinischer Diagnose
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Methoden
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Subjekte und Proben:
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Eine
Gruppe von 89 Patienten im Alter zwischen 40 und 70, die in der
Notaufnahme eines großen
Bezirkskrankenhauses anwesend waren, wurden zufällig für diese Studie ausgewählt. Von
jedem der Patienten wurden Urinproben gesammelt, bevor sie irgendwelchen
diagnostischen oder Behandlungsprozeduren unterzogen wurden. Diese
Urinproben wurden sofort eingefroren und bei –20 °C für Zeiträume von weniger als 1 Monat
gelagert, bevor sie für
die biochemischen Analysen verwendet wurden.
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Die
Patienten wurden außerdem
gefragt, ob sie zur Zeit Cyclooxygenaseinhibitoren wie beispielsweise Aspirin
einnähmen
oder diese in letzter Zeit eingenommen hätten.
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Die
medizinische Erkrankung jedes Patienten wurde außerdem 30 Tage nach Entnehmen
der Urinprobe gemäß den folgenden
beiden Kriterien beurteilt:
1. Irgendein Herzanfall
2.
Keine Brustschmerzen
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Bei
der Durchführung
der obigen klinischen Beurteilung wurde die Gruppe von Patienten
entsprechend dem Ergebnis bei Einlieferung (d.h. an demselben Tag,
als die Urinproben erhalten wurden) in die beiden folgenden Untergruppen
geteilt:
i. Einweisung in eine Herzstationt/Kardiologieabteilung
ii.
Einweisung in die innere medizinische Station eines Krankenhauses
iii.
Entlassen
iv. Alle Patienten.
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Ein
Vergleich des klinischen Ergebnisses mit dem Ergebnis, das mit den
biochemischen/Leitfähigkeitsanalysen
(siehe unten in "Datenanalysemethoden") wurde durchgeführt, um
die Sensitivität
und Spezifität
der Analysen als diagnostische Werkzeuge zu bestimmen.
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Analytische Methoden:
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1. Thromboxan B2-Analyse
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Die
Konzentrationen an Thromboxan B2 in den
Urinproben wurden unter Verwendung einer Modifikation des BiotrakTM-Systems (Amersham International plc, Little
Chalfont, Buckinghamshire, England; Code RPN 220) gemessen. Die
gefrorenen Urinproben wurden aufgetaut und direkt, ohne irgendeine
Art der Vorbehandlung, in dem Thromboxan-Assay verwendet.
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Es
wurden kurzum 50 μl
jeder Probe oder Thromboxan B2-Standard
in zweifacher Ausfertigung in die Wells einer Mikrotiterplatte zugegeben,
die mit Esel-Anti-Hasen-IgG vorbeschichtet waren. Alle Standardlösungsverdünnungen
wurden in einem Assay-Puffer durchgeführt, der aus 0,1 M Phosphatpuffer
bestand, pH 7,5, und 0,9% Natriumchlorid und 0,1% Rinderserumalbumin
enthielt. Derselbe Puffer wurde ebenfalls bei der Herstellung des
Null-Standards (d.h.
0 pg Thromboxan B2) und nicht spezifischer
Bindungswells (d.h. nur Puffer) verwendet. Die Menge an zu den Standardwells
zugegebenem Thromboxan B2 variierte zwischen
0,5 und 64 pg pro Well. Anschließend wurden 50 μl Hasen-Anti-Thromboxan
B2-Antiserum zu jedem Well zugegeben (außer zu dem
spektrophotometrischen Blankwell). Daran anschließend wurden
50 μl Thromboxan
B2-Meerrettichperoxidase-Konjugatlösung zu
jedem Well zugegeben (außer
zu dem Blankwell), und die Platte wurde unter Schütteln bei
Raumtemperatur für
1 h inkubiert. Am Ende dieser Inkubationsperiode wurden die Inhalte jedes
Wells aspiriert, und jedes Well wurde viermal mit 400 μl Waschpuffer
(0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5, der 0,05% Tween 20 enthielt) gewaschen.
Direkt im Anschluss an den letzten Waschungsschritt wurden 150 μl Enzymsubstrat
(bestehend aus 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
und Wasserstoffperoxid) zu jedem Well zugegeben. Die Platte wurde
anschließend
unter Schütteln
bei Raumtemperatur für
exakt 15 min inkubiert, um die Entwicklung des farbigen Reaktionsprodukt
zu ermöglichen.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl an 1 M Schwefelsäure zu jedem
Well angehalten. Nach sorgfältigem
Mischen und innerhalb 30 min nach Zugabe der Schwefelsäure wurde
die optische Dichte jedes Wells bei 450 nm unter Verwendung eines
Plattenlesers bestimmt.
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Eine
Kalibrierungskurve wurde für
die Thromboxan B2-Standards durch Auftragen
der bekannten Thromboxan B-Menge (x-Achse) gegen den Prozentsatz
an gebundenem Antikörper
(%B/B0) gebildet. Der letztere Parameter
wurde gemäß der folgenden
Beziehung berechnet:
%B/B0 = [(Thromboxan-Standard
OD – nicht
spezifische Bindung OD)/(B0 OD-nicht spezifische
Bindung OD)] × 100
(worin jeder OD-Wert der Mittelwert von doppelten Wells ist).
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Die
Probenmengen an Thromboxan B2 für die Proben
wurden durch direktes Ablesen von der Kalibrierungskurve erhalten.
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2. Leitfähigkeitsanalyse
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Die
elektrische Leitfähigkeit
von jeder der Urinproben wurde unter Verwendung eines Cyber Scan CON100-Leitfähigkeitsmessgeräts (Eutech
Instruments Pte Ltd., Singapur) gemessen.
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3. Normalisierung
der Ergebnisse
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Ein
normalisierter Thromboxan B2-Konzentrationswert
für jede
getestete Probe wurde durch Dividieren der Thromboxankonzentration
(gemessen in pg/ml) durch den Leitfähigkeitswert (gemessen in mS/cm)
erhalten, entweder durch Anwenden einer einfachen Division oder
durch Anwenden eines höheren
statistischen Modells. Für
die leichtere Analyse wurden alle Werte in ihren natürlichen
Logarithmus umgewandelt. Somit wurde die Normalisierung der Thromboxankonzentrationen
durch die Subtraktion des natürlichen
Logarithmus des Leitfähigkeitswerts
von dem natürlichen
Logarithmus der Thromboxankonzentration erreicht.
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Datenanalysemethoden:
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Der
Cutt-off zeigt einen Wert an, der bestimmt, ob die Erkrankung des
Patienten pathologisch oder normal ist. Cut-off wurde ermittelt
gemäß Receiver
Operating characteristic Curves (ROC), welches ein Graph der Empfindlichkeit
(oder des wahren positiven Werts) gegen den falschen positiven Wert
ist. Durch diese Analyse wird die Korrelation zwischen den Testergebnissen
und dem klinischen Ergebnis optimiert.
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Die
Ergebnisse der verschiedenen hierin beschriebenen Analysen wurden
gesammelt und entsprechend den beiden folgenden Interpretations-"Regeln" analysiert.
- Regel
1 – auf
Basis der Messung der Thromboxan B2-Konzentration
allein, wobei ein positives Ergebnis (d.h. die Anwesenheit einer
Herzerkrankung) angedeutet wird durch einen in den natürlichen
Logarithmus umgewandelten Thromboxanwert größer als der Cut-off-Wert von
5,1 für
Patienten, die keine Cyclooxygenase-inhibierenden Arzneimittel (z.B.
Aspirin) einnehmen oder größer als
der Cut-off-Wert von 4,9, für
Patienten, die zur Zeit oder vor kurzem solche Arzneimittel eingenommen
haben.
- Regel 2 – auf
Basis der Bestimmung von (In Thromboxan B2-Konzentration – In Leitfähigkeitswert)
(d.h. die logarithmische Umwandlung des Verhältnisses der Thromboxan B2-Konzentration zu dem Leitfähigkeitswert), worin
ein positives Ergebnis (d.h. die Anwesenheit einer Herzerkrankung)
angedeutet wird durch ein Ergebnis größer als der Cut-off Wert von
3,2 für
Patienten, die keine Cyclooxygenase-inhibierenden Arzneimittel (z.B. Aspirin)
einnehmen, oder größer als
der Cut-off Wert von 2,7 für
Patienten, die zur Zeit oder vor kurzem solche Arzneimittel eingenommen
haben.
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Die
Cut-off-Werte sind die Referenzwerte, die in dem Verfahren der Erfindung
verwendet werden. Bevorzugt beruhen solche Referenzwerte auf den
Ergebnissen von diagnostischen Tests großer Patientengruppen.
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Nach
der Analyse der Daten entsprechend den obigen Regeln und der Tabellarisierung
der Daten wurde die Sensitivität
und Spezifität
jeder Regel gemäß den folgenden
Definitionen bestimmt:
Sensitivität (%) = wahr positiv/(falsch
negativ + wahr positiv) × 100
Spezifität (%) =
wahr negativ/(falsch positiv + wahr negativ) × 100
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Ergebnisse:
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Die
Ergebnisse des Vergleichs der klinischen Ergebnisse (irgendein Herzanfall/keine
Brustschmerzen) mit den Laborergebnissen gemäß Interpretation mit jeder
der beiden vorhergehend erwähnten
Regeln sind in Tabelle I (Regel 1: ohne Normalisierung) und Tabelle
II (Regel 2: normalisierte Ergebnisse) angegeben. Für einen
der Patienten konnte die Leitfähigkeit
nicht bestimmt werden.
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Die
Sensitivität
und Spezifität
jeder der beiden Regeln (d.h. nicht normalisierte und Leitfähigkeits-normalisierte
Thromboxanmessungen) für
jede der Patientengruppen sind in Tabelle III (nicht normalisierte
Daten) und Tabelle IV (Leitfähigkeits-normalisierte
Daten) gezeigt.
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Aus
den Tabellen III und IV ist erkennbar, dass, obwohl beide Interpretationsregeln
zu Ergebnissen mit ungefähr ähnlichen
Sensitivitätswerten
führen,
Regel 2 (welche Leitfähigkeits-normalisierte
Thromboxankonzentrationen verwendet) deutlich verbesserte Spezifitätsergebnisse
liefert. Die Bedeutung der höheren
Spezifitätswerte
der Leitfähigkeits-normalisierten
Methode ist, dass sie verwendet werden kann, um auf hoch verlässliche
Weise zu bestimmen, welche der Patienten nicht an einem akuten Herzanfall
gelitten haben und daher entlassen werden können. Es wird somit geschlossen,
dass die Leitfähigkeits-normalisierten
Thromboxan B2-Konzentrationsdaten ein viel verlässlicheres Werkzeug für die Verwendung
zur Vorhersage bei der Diagnose von akuten Herzerkrankungen bereitstellt.
