DE60117592T2

DE60117592T2 - Diagnose von pre-eclampsia

Info

Publication number: DE60117592T2
Application number: DE60117592T
Authority: DE
Inventors: Lucilla. Maternal and Fetal Research St. Thomas' Hospital POSTON; T. Maternal and Fetal Research Unit Paul St Thomas' Hospital SEED; Beverley St. Thomas' Hospital HUNT; Lucy. Maternal and Fetal Research Un St. Thomas' Hospital CHAPPELL
Original assignee: PerkinElmer LAS Inc
Current assignee: PerkinElmer Health Sciences Inc
Priority date: 2000-11-02
Filing date: 2001-11-02
Publication date: 2006-12-21
Also published as: GB0026823D0; EP1330653A2; US20040038305A1; DE60117592D1; WO2002037120A3; EP1330653B1; DE60117592T8; CA2427645C; ES2256310T3; CA2427645A1; US8283451B2; US7425419B2; US20090011429A1; ATE319094T1; AU2002212495B2; US20110300564A1; US8017734B2; WO2002037120A2; AU1249502A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage von Präeklampsie (PE). Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen diagnostischen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Vorhersage von PE.
PE wird gemäß den Richtlinien der „International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy" definiert (Davey et al., Am. J. Obstet. Gynaecol.; 158: 892–98, 1988). Schwangerschaftshypertonie wird als zwei Messungen des diastolischen Blutdrucks von 90 mm Hg oder höher in einem Zeitabstand von wenigstens 4 Stunden definiert, und starker Bluthochdruck als zwei Messungen von 110 mm Hg oder höher in einem Zeitabstand von wenigstens 4 Stunden oder als eine einzige Messung des diastolischen Blutdrucks von wenigstens 120 mm Hg. Proteinurie ist durch Ausscheidung von 300 mg oder mehr innerhalb von 24 Stunden definiert, oder, wenn keine 24 h-Sammlung durchgeführt werden konnte, durch zwei Messungen von 2+ oder mehr bei einer Analyse von Proben von Mittelstrahl- oder Katheterurin mit Teststreifen. Frauen werden als vormals normoton oder chronisch hyperton vor der 20. Schwangerschaftswoche klassifiziert. Bei vormals normotonen Frauen wird PE als Schwangerschaftshypertonie mit Proteinurie und schwere PE als starke Schwangerschaftshypertonie mit Proteinurie definiert. Bei Frauen mit chronischer Hypertonie wird Pfropf-PE durch die neue Entwicklung von Proteinurie definiert. PE tritt bei etwa 4 % aller Schwangerschaften auf und ist im UK eine der Hauptursachen für maternale Todesfälle. Diese Erkrankung, oder die Gefahr ihres Auftretens, ist die häufigste Ursache elektiver vorzeitiger Entbindungen und ist für etwa 15 % aller Frühgeburten verantwortlich. Die Blutdruckmessungen und die Untersuchung auf Proteinurie werden bei allen Schwangeren vorwiegend zum Nachweis von PE durchgeführt. Solche Verfahren und die Versorgung der betroffenen Frauen und Frühchen stellen erhebliche Anforderungen an die Ressourcen der Gesundheitsfürsorge. Eine genaue Identifizierung von Risikopatientinnen könnte die Kosten für die vorgeburtliche Versorgung erheblich senken.
Obwohl es keine allgemeine Behandlung für PE gibt (außer vorzeitiger Entbindung), haben wir kürzlich von einer signifikanten Abnahme von PE bei Hochrisikopatientinnen berichtet, denen Vitamin C- und Vitamin E-Supplementierungen gegeben wurden (siehe Chappell et al., The Lancet, 354: 810–816, 1999). Das Risiko wurde mit einem Test mit relativ geringer Empfindlichkeit bestimmt. Eine genauere und verlässlichere Identifizierung von Risikopatientinnen würde auf diejenigen Frauen zielen, die am wahrscheinlichsten von dieser oder einer alternativen prophylaktischen Therapie profitieren würden. Diejenigen, die mit geringerem Risiko bewertet würden, könnten vorgeburtlich weniger intensiv und billiger versorgt werden.
Es gibt kein allgemein anerkanntes oder genaues Verfahren zur Früherkennung von PE. Erhöhter Blutdruck und Nachweis von Proteinen im Urin treten wie oben ausgeführt dann auf, wenn der Krankheitsprozess bereits fest etabliert ist. Der Nachweis eines anomalen Blutflusses zur Uterusarterie mittels Doppler-Ultraschall bei Frauen, die später PE entwickeln, war zur Vorhersage von gewissem Nutzen, wobei sich diese Anomalie jedoch als relativ unspezifisch herausstellte und daher nicht in die klinische Routinepraxis übergenommen wurde.
Obwohl sich einige biochemische Marker aus Plasma/Urin während des Krankheitsprozesses anomal verhielten, war keiner dieser Marker alleine als Vorhersageindikator ausreichend empfindlich. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, Plazentawachstumsfaktor (P1GF) allein als Vorhersageindikator für PE zu verwenden, doch ließ sich die Aussagefähigkeit dieses Markers nicht mit Sicherheit feststellen. Die Internationale Patentveröffentlichung WO 98128006 schlägt beispielsweise vor, P1GF allein oder in Kombination mit vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) nachzuweisen, um die Entwicklung von PE vorherzusagen.
Ferner veröffentlichte unsere Gruppe bereits die Wirkung von Vitamin-Supplementierungen auf das PAI-1/PAI-2-Verhältnis im maternalen Blut (Chappell et al., 1999; Lancet, 354: 810–816), und andere dokumentierten erhöhtes PAI-1/PAI-2 bei etablierter PE (Reith et al; 1993, British Journal of Obstetrics and Gynaecology, 100: 370–4) sowie erhöhtes PAI-1 bei Frauen, die später PE entwickelten (Halligan et al., 1994; British Journal of Obstetrics ans Gynaecology, 101: 488–92). Es zeigte sich, dass P1GF bei Frauen mit etablierter PE erniedrigt war (Torry et al., 1998; American Journal of Obstetrics and Gynaecology, 179: 1539–44), und es liegt nahe, dass es vor Auftreten der Krankheit niedrig war. Man stellte fest, dass Leptin im Verlauf einer Schwangerschaft bei gesunden Schwangeren ansteigt (Highman et al., 1998; American Journal of Obstetrics and Gynaecology, 178: 1010–5), eine Beobachtung, die von uns bestätigt werden konnte. Man stellte auch fest, dass Leptin bei einer etablierten PE sogar noch weiter ansteigt, und der erste Bericht hierüber wurde von Mise et al., Journal of Endocrinology and Metabolism, 83: 3225–9, 1998 veröffentlicht. Ferner weisen Anim-Nyame et al., Hum. Reprod., 15: 2033–6, 2000 darauf hin, dass die Erhöhung von Leptinkonzentrationen vor einer PE klinisch evident ist. Diese Feststellung wird von Chappell et al., J. Soc. Gynaecol. Invest., 213A, 2001 gestützt, wo auch angegeben wird, dass eine Vitamin-Supplementierung das Leptin im Plasma von Risikopatientinnen für PE senkt.
Kein Dokument des Standes der Technik offenbart jedoch einen zuverlässigen, empfindlichen und spezifischen Test zur Vorhersage von PE.
Es wurde nun gefunden, dass eine Kombination von Markern die zur erwünschten frühen Diagnose von PE dringend benötigten Vorhersageparameter liefert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur spezifischen Vorhersage von Präeklampsie (PE) bereit, umfassend die Bestimmung, in einer maternalen Probe, des Spiegels von Plazentawachstumsfaktor (P1GF) und wenigstens eines weiteren Markers, der ausgewählt ist aus Plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1), Plasminogenaktivatorinhibitor 2 (PAI-2) und Leptin.
Es wurde gefunden, dass es durch Messen von wenigstens 2 der oben erwähnten Marker möglich ist, mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit zu bestimmen, ob es wahrscheinlich ist, dass eine Person PE entwickelt. Spezifität ist als der Anteil echter Negativer (keine Entwicklung von PE) unter den bei dem Verfahren als Negative identifizierten definiert. Empfindlichkeit ist als der Anteil echter Positiver (Entwicklung von PE) unter den bei dem Verfahren als Positive identifizierten definiert. Vorzugsweise umfasst das Verfahren eine Messung von Dreien der Marker, besonders bevorzugt von allen 4 Markern.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Bestimmung des Spiegels des Plazentawachstumsfaktors (P1GF) und des Spiegels bzw. der Höhe eines der Folgenden:

(i) Plasminogenaktivatorinhibitor 2 (PAI-2);
(ii) des Verhältnisses von Plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1) zu Plasminogenaktivatorinhibitor 2 (PAI-2); und
(iii) Leptin.

Es stellte sich heraus, dass diese speziellen Kombinationen besonders nützlich sind, um zu bestimmen, ob es wahrscheinlich ist, dass eine Person PE entwickelt.
Der Begriff „Präeklampsie", wie er hier verwendet wird, wird wie oben beschrieben entsprechend den Richtlinien der „International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy" definiert.
Der Begriff „spezifische Vorhersage von Präeklampsie", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, um spezifisch die Entwicklung von PE zu prognostizieren. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht insbesondere eine Bestimmung, ob es wahrscheinlich ist, dass eine Person PE entwickelt.
Die maternale Probe wird einer Schwangeren entnommen und kann jede Probe sein, bei der es möglich ist, die oben angegebenen Marker zu messen. Die Probe ist vorzugsweise Blut. Die Proben können zu jedem Zeitpunkt ab der etwa 10. Schwangerschaftswoche entnommen werden. Die Probe wird vorzugsweise zwischen der 12. und der 38. Schwangerschaftswoche und besonders bevorzugt zwischen der 20. und der 26. Schwangerschaftswoche entnommen.
Der Begriff „Plazentawachstumsfaktor" (P1GF) bezeichnet die bei einem Probanden gefundene freie Form. Die Aminosäuresequenz von humanem P1GF ist bekannt (siehe NCBI-Proteindatenbank, Zugangs-Nr. XP 040405). Es gibt zahlreiche Nachweisverfahren für P1GF, einschließlich des kommerziell erhältlichen Quantikine Human P1GF-Immunoassays von R&D Systems Inc.
Der Begriff „Plasminogenaktivatorinhibitor 1" (PAI-1) ist ein technischer Standardbegriff und ist für den Fachmann klar. Insbesondere ist die Sequenz der humanen Form von PAI-1 in der NCBI-Proteindatenbank unter der Zugangs-Nr. AAA 60003 angegeben. Es gibt zahlreiche Nachweisverfahren für PAI-1, einschließlich des kommerziell erhältlichen TintElize PAI-1-Kits von Biopool International.
Der Begriff „Plasminogenaktivatorinhibitor 2" (PAI-2) ist ein technischer Standardbegriff und ist für den Fachmann klar. Insbesondere ist die Sequenz der humanen Form von PAI-2 in der NCBI-Proteindatenbank unter der Zugangs-Nr. CAA 02099 angegeben. Es gibt zahlreiche Nachweisverfahren für PAI-2, einschließlich des kommerziell erhältlichen TintElize PAI-2-Kits von Biopool International.
Der Begriff „Leptin" ist ein dem Fachmann geläufiger Standardbegriff. Insbesondere ist die Aminosäuresequenz einer humanen Form von Leptin in der NCBI-Proteindatenbank unter der Zugangs-Nr. P41159 angegeben. Es gibt zahlreiche Nachweisverfahren für Leptin, beispielsweise den Quantikine-Immunoassay für humanes Leptin von R&D Systems Inc.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt, indem der Spiegel von zwei oder mehr Markern mit Hilfe des automatischen DELFIA^®-Systems bestimmt wird, das von Wallac, Finnland, erhältlich ist. Das automatische DELFIA^®-System ist ein automatisiertes System, das speziell für die Durchführung von Immunoassays entwickelt und optimiert wurde und daher zur Messung der Spiegel von zwei oder mehr der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Marker eingesetzt werden kann. Das automatische DELFIA^®-System misst die Konzentration der Marker mittels Fluoreszenz, wobei alle vier Marker in einer einzigen Vertiefung pro Probe nachgewiesen werden können.
Wir erhielten Blutproben von Schwangeren, die aufgrund einer Doppler-Untersuchung der Uterusarterie oder aufgrund der Erkrankung bei einer früheren Schwangerschaft als Risikopatientinnen für PE eingestuft wurden. Die Blutproben wurden ab der 20. Schwangerschaftswoche alle 4 Wochen bis zur Geburt entnommen. Wir bestimmten eine Auswahl biochemischer Marker, die an PE beteiligt sind, einschließlich Vitamin C, Homocystein, Plasmalipiden und 8-Epiprostaglandin F_2α, wobei jedoch keiner dieser Marker für eine Vorhersage effektiv war. Wir stellten fest, dass das Verhältnis von Plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1) zu PAI-2 vor Auftreten der Krankheit anstieg, während der Plazentawachstumsfaktor (P1GF) nicht den ausgeprägten Anstieg zeigte, der normalerweise bei einer gesunden Schwangerschaft beobachtet wird. Plasmaleptin steigt normalerweise bei Schwangerschaft an, wir stellten jedoch fest, dass es bei Frauen, die PE entwickeln sollten, viel stärker zunimmt. Kombinationen dieser Marker (siehe unten) erwiesen sich als hervorragend für die empfindliche und spezifische Vorhersage späterer PE.
Bei der Untersuchung der oben beschriebenen Kombinationen stellte man fest, dass bei Patientinnen, die PE entwickeln werden (d.h. bei denen die Vorhersage positiv ist), kein erhöhter P1GF-Spiegel bei der Schwangerschaft auftritt, obwohl P1GF normalerweise während einer Schwangerschaft zunimmt. Wenn die Kombination der Marker P1GF und PAI-2 verwendet wird, ist eine positive Vorhersage dadurch gegeben, dass die kombinierten Spiegel von P1GF und PAI-2 kleiner als normal sind.
Wenn die Kombination der Marker P1GF und Verhältnis von PAI-1 zu PAI-2 verwendet wird, ist eine positive Vorhersage durch eine Kombination aus einem erniedrigten P1GF-Spiegel und einem Verhältnis PAI-1 zu PAI-2, das höher als normal ist, gegeben.
Wenn die Kombination aus den Markern P1GF und Leptin verwendet wird, ist eine positive Vorhersage dadurch gegeben, dass das Verhältnis von Leptin zu P1GF höher als normal ist.
Um bestimmen zu können, ob der Spiegel oder das Verhältnis der oben angegebenen Marker größer oder kleiner als normal ist, muss der normale Spiegel oder das normale Verhältnis der entsprechenden Population bestimmt werden. Die entsprechende Population kann beispielsweise auf ethnischer Grundlage oder aufgrund irgendeines anderen Merkmals, welches die normalen Markerspiegel beeinflussen kann, definiert werden. Die jeweilige Population zur Feststellung des normalen Spiegels oder Verhältnisses der Marker wird vorzugsweise auf Basis eines geringen Risikos für PE ausgewählt (d.h. kein bekannter Risikomarker für PE, wie frühere PE, Diabetes, frühere Hypertonie usw.). Sobald die normalen Spiegel bekannt sind, können die gemessenen Spiegel damit verglichen werden und die Signifikanz der Differenz mit Hilfe statistischer Standardverfahren bestimmt werden. Wenn eine statistisch signifikante Differenz zwischen dem gemessenen Spiegel und den normalen Spiegel vorliegt, besteht ein signifikantes Risiko, dass die Person, deren Spiegel gemessen wurden, PE entwickelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Marker P1GF und PAI-2 über den Algorithmus d (loge[PAI-2]) + (loge[P1GF])kombiniert werden, wobei d eine Konstante zwischen etwa 0,03 und 48,6 ist. Bevorzugt liegt d zwischen 0,072 und 7,6 und besonders bevorzugt zwischen 0,0336 und 2,2. Ganz besonders bevorzugt ist d 0,75 oder 1. Alternativ können die Marker P1GF und PAI-2 über den Algorithmus [PAI-2]d·[P1GF]kombiniert werden, wobei d wie oben definiert ist. Das Zeichen „*" stellt das Multiplikationszeichen dar.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist d 1 und der oben angegebene Algorithmus wird zu [PAI-2]·[P1GF]. Bei Verwendung dieses Algorithmus und unter der Annahme, dass die Konzentration von PAI-2 in ng/ml und die Konzentration von P1GF in pg/ml gemessen wird, wurde gefunden, dass die Empfindlichkeit und die Spezifität der Vorhersage von PE 67 % bzw. 100 % sind, wenn der mit dem Algorithmus erhaltene Wert < 35.000 ist. Wenn der mit dem Algorithmus erhaltene Wert < 50.000 ist, sind Empfindlichkeit und Spezifität der Vorhersage von PE 80 % bzw. 94 % (siehe Tabelle 10 unten).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Marker P1GF und PAI-1/PAI-2-Verhältnis über den Algorithmus (loge[P1GF]) – (g·{Verhältnis PAI-1/PAI-2})kombiniert werden, wobei g eine Konstante zwischen etwa –19,4 und 3,6 ist. Bevorzugt liegt g zwischen 0,655 und 15,5 und besonders bevorzugt zwischen 1,37 und 7,0. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist g 3,0. Bei Verwendung des Algorithmus mit g = 3 und unter der Annahme, dass die Konzentration von P1GF in pg/ml gemessen wird, wurde gefunden, dass die Empfindlichkeit und die Spezifität der Vorhersage von PE 53 % bzw. 100 % sind, wenn der mit dem Algorithmus erhaltene Wert < 4,5 ist, Wenn der mit dem Algorithmus erhaltene Wert < 5 ist, sind Empfindlichkeit und Spezifität der Vorhersage von PE 80 % bzw. 88 % (siehe Tabelle 4 unten).
Es wurde ferner gefunden, dass ein Wert von > 0,1 bei der Messung des Verhältnisses Leptin/P1GF, wobei die Konzentration von Leptin in ng/ml und die Konzentration von P1GF in pg/ml gemessen wird, ein Verfahren zur Vorhersage von PE mit einer Empfindlichkeit von 67 % und einer Spezifität von 100 % erlaubt. Wenn der Wert > 0,05 ist, hat das Verfahren zur Vorhersage von PE eine Empfindlichkeit von 80 % und eine Spezifität von 88 %.
Man sieht, dass der Grad der Empfindlichkeit und der Spezifität durch Änderung des Schwellenwerts variiert werden kann. In manchen Fällen, z.B. wenn viele Niedrigrisikopatientinnen für PE gescreent werden, ist es wichtig, mit hoher Spezifität zu arbeiten. In anderen Fällen kann es wichtig sein, ausgewogen zwischen hoher Empfindlichkeit und Spezifität zu arbeiten, z.B. braucht man ein Gleichgewicht zwischen hoher Empfindlichkeit und Spezifität, wenn einzelne Hochrisikopatientinnen für PE untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung bietet viele Vorteile. Neben der Erleichterung genau gezielter Eingriffe, wie z.B. Vitamin-Supplementierungen, sind wegen der Stratifikation der vorgeburtlichen Versorgung und der geringeren Kosten für die besondere Pflege von Neugeborenen beachtliche Einsparungen bei den verfügbaren Resourcen für die Gesundheitsfürsorge zu erwarten. In den Bereichen Forschung und Entwicklung wird die Identifizierung von Hochrisikopatientinnen zukünftige klinische Studien enorm vorantreiben. Aufgrund ungeeigneter Vorhersageverfahren werden derzeit bei vielen Schwangeren unnötigerweise Eingriffe bei klinischen Studien vorgenommen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Verbindung mit anderen Tests für diagnostische Indikatoren, wie beispielsweise Blutdruck, Harnsäurespiegel usw. durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu verwendet werden, die Effizienz einer prophylaktischen Behandlung zur Vorbeugung der Entwicklung von PE zu verfolgen, wobei ein vermindertes Risiko für die Entwicklung von PE ein Zeichen dafür ist, dass die prophylaktische Behandlung wirkt.
Bislang wurde von mehr als zwanzig biochemischen Markern gezeigt, dass sie mit etablierter PE in Zusammenhang stehen, und somit gab es bis jetzt keinen logischen Grund dafür, PAI-1, PAI-2, P1GF und Leptin als Vorhersageindikatoren bei einer zweckdienlichen prospektiven Längsschnittstudie auszuwählen. Zudem haben sehr wenige Gruppen prospektiv einzelne Marker bei den gleichen Frauen untersucht, von denen in bestimmten Zeitabständen während der Schwangerschaft Proben genommen wurden. Bis zu dieser Anmeldung hat tatsächlich niemand die verschiedenen Marker bei den gleichen Frauen gemessen.
Wenn mit einem der oben angegebenen Algorithmen ein Wert erhalten wurde, kann das Log-Odds des Individuums, das PE entwickelt, über die Formel: y = a + bxberechnet werden, wobei y das Log-Odds des Individuums ist, das PE entwickelt, x der mit einem der Algorithmen erhaltene Wert ist, und a und b Konstanten sind (Werte weiter unten angegeben), die aus der logistischen Regressionsanalyse unserer vorher erfassten Datenmengen stammen, die auf der Annahme einer 4%igen Prävalenz von PE in der Population angepasst wurde. Dieser als logistische Regression bekannte Ansatz ist in der klinischen Forschung weit verbreitet.
Um zu zeigen, wie die Formel zur Bestimmung des Log-Odds eines Individuums, das PE entwickelt, verwendet werden kann, zeigen die folgenden Informationen, wie es möglich ist, die gewünschten Werte für a und b so zu bestimmen, dass ein Log-Odds-Wert mit beliebigem gewünschtem Vertrauensintervall (VI) erhalten werden kann.
Die folgenden Prädiktorformeln werden auf der Basis präeklamptischer Proben und von Kontrollen berechnet, die in der 24. Woche analysiert wurden. Die Formeln ergeben das Log-Odds für PE für jeden gegebenen Prädiktorwert. Die Wahrscheinlichkeit ist genau exp(Log-Odds)/(1 + exp(Log-Odds))(exp gibt die Umkehrfunktion des natürlichen Logarithmus an).
Alle Werte werden auf eine Prävalenz von 4 % korrigiert angegeben, Log-Odds von 4% = log(4/96) = –3,18. Um dies in eine andere Prävalenz umzurechnen, beispielsweise 20 %, muss zuerst der neue Log-Odds-Wert = log (20/80) = –1,39 berechnet werden. Die Differenz beträgt –3,18 – (–1,39) = –1,79.
Der Wert der Konstanten „a" muss um diesen Betrag erhöht werden. Der Wert von „b" bleibt unverändert.
Der beste Wert für „a" für den Algorithmus log_e[P1GF] – 3·(PAI-1/PAI-2), der das größte VI ergibt, ist 23,042. Die Werte für „a" bei VIs von 75 %, 95 % oder 99 % sind jedoch:
75 %-Grenzen: 9,314 bis 36,771
95 %-Grenzen: –0,348 bis 46,432
99 %-Grenzen: –7,697 bis 53,782
Der beste Wert für „b" für den Algorithmus log_e[P1GF] – 3·(PAI-1/PAI-2), der das größte VI ergibt, ist –5,223. Die Werte für „b" bei VIs von 75 %, 95 % oder 99 % sind jedoch:
75 %-Grenzen: –7,940 bis – 5,620
95 %-Grenzen: –9,852 bis –3,708
99 %-Grenzen: –11,306 bis –2,254
Der beste Wert für „a" für den Algorithmus des Verhältnisses Leptin/P1GF ist –5,081. Die Werte für „a" bei VIs von 75 %, 95 % oder 88 % sind jedoch:
75 %-Grenzen: –6,895 bis –4,707
95 %-Grenzen: –7,665 bis –3,937
99 %-Grenzen: –8,251 bis –3,351
Der beste Wert für „b" für den Algorithmus des Verhältnisses Leptin/P1GF ist 42,192. Die Werte von „b" bei VIs von 75 %, 95 % oder 99 % sind jedoch:
75 %-Grenzen: 22,393 bis 58,948
95 %-Grenzen: 8,455 bis 72,886
99 %-Grenzen: –2,147 bis 83,489
Der beste Wert für „a" für den Algorithmus [PAI-2]·[P1GF] ist –0,919. Die Werte von „a" bei VIs von 75 %, 95% oder 99% sind jedoch:
75 %-Grenzen: –1,923 bis 0,084
95 %-Grenzen: –2,630 bis 0,791
99 %-Grenzen: –3,167 bis 1,328
Der beste Wert für „b" für den Algorithmus [PAI-2]·[P1GF] ist 0,000. Die Werte von „b" bei VIs von 75 %, 95 % oder 99 % sind jedoch:
75 %-Grenzen: –0,000 bis –3,114
95 %-Grenzen: –0,000 bis –3,114
99 %-Grenzen: –0,000 bis –3,114
Der Fachmann kann somit mit den hier gegebenen Informationen und mit Hilfe statistischer Standardanalysen das Log-Odds eines Patienten, der PE entwickelt, mit jedem beliebigen gewünschten VI bestimmen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen diagnostischen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereit. Der Kit umfasst Reagenzien, die zur Bestimmung des Spiegels der gemessenen Marker nötig sind. Geeignete Mittel zum Testen der Marker umfassen Reagenzien für enzymgebundene Immunoassays, RIA-Reagenzien und Reagenzien für Western Blots.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden lediglich beispielhaft beschrieben, wobei auf die folgenden Figuren Bezug genommen wird.
1 zeigt eine ROC-Kurve (Receiver Operation Characteristic) zur Vorhersage von PE, basierend auf der Formel (log_e[P1GF]) – (3,0·{Verhältnis PAI-1/PAI-2}) mit Daten der 24. Schwangerschaftswoche.
2 zeigt die Höhe der PAI-2-Schwankungen während der Schwangerschaft, wobei (∎) Niedrigrisikopatientinnen bezeichnet,
Frauen bezeichnet, die später PE entwickelten und (•) Frauen bezeichnet, die kein PE entwickelten, aber SGA-Kinder (small for gestational age) zur Welt brachten.
3 zeigt die Höhe der Leptin-Schwankungen während der Schwangerschaft, wobei (∎) Niedrigrisikopatientinnen bezeichnet,
Frauen bezeichnet, die später PE entwickelten und (•) Frauen bezeichnet, die kein PE entwickelten, aber SGA-Kinder (small for gestational age) zur Welt brachten.
4 zeigt die Höhe der P1GF-Schwankungen während der Schwangerschaft, wobei (∎) Niedrigrisikopatientinnen bezeichnet,
Frauen bezeichnet, die später PE entwickelten und (•) Frauen bezeichnet, die kein PE entwickelten, aber SGA-Kinder (small for gestational age) zur Welt brachten.
5 zeigt die Höhe der PAI-1-Schwankungen während der Schwangerschaft, wobei (∎) Niedrigrisikopatientinnen bezeichnet,
Frauen bezeichnet, die später PE entwickelten und (•) Frauen bezeichnet, die kein PE entwickelten, aber SGA-Kinder (small for gestational age) zur Welt brachten.
6 zeigt die Höhe der Schwankungen des PAI-1/PAI-2-Verhältnisses während der Schwangerschaft, wobei (∎) Niedrigrisikopatientinnen bezeichnet,
Frauen bezeichnet, die später PE entwickelten und (•) Frauen bezeichnet, die kein PE entwickelten, aber SGA-Kinder (small for gestational age) zur Welt brachten.
7 zeigt die Höhe der Schwankungen des Leptin/P1GF-Verhältnisses während der Schwangerschaft.
8 zeigt die Höhe der Schwankungen von (log_e[P1GF]) – (3,0·{Verhältnis PAI-1/PAI-2}) während der Schwangerschaft.
9 zeigt die Höhe der Schwankungen von (log_e[PAI-2]) + (log_e[P1GF]) während der Schwangerschaft.
BEISPIELE
Beispiel 1
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise in der 20. Schwangerschaftswoche oder später, beispielsweise in der 24. Schwangerschaftswoche, durchgeführt.
Kurz gesagt wird das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt, indem man 5 ml venöses Blut einer Schwangeren in einen Vacutainer gibt, in welchem sich entweder Trinatriumcitrat oder 0,5 M EDTA als Anticoagulans befinden. Nach Zentrifugation wird das Plasma dekantiert und bis zum Test bei –20 °C aufbewahrt. Man kann kommerziell erhältliche Assays verwenden, beispielsweise: Assays für Leptin (Quantikine, Human Leptin immunoassay, Immunoassay R&D Systems Inc., Minneapolis MN 55413, USA); P1GF (Quantikine Human P1GF immunoassay, R&D Systems Inc., siehe oben); PAI-1 (TintElize PAI-1, Biopool International, Umea, Schweden oder Ventura CA 93003, USA) und PAI-2 (TintElize PAI-2, Biopool International, siehe oben). Die Assays werden nach den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Aus den mit den Assays erhaltenen Plasmakonzentrationen werden die folgenden Werte berechnet:

1. (log_e[P1GF]) – (3,0·Verhältnis PAI-1/PAI-2)
2. 0,75 (log_e[PAI-2]) + (log_e[P1GF])
3. Leptin/P1GF

Die bei 1, 2 oder 3 berechnete Zahl (unten als „x" bezeichnet) wird anschließend mit einer speziell dafür entwickelten Software (wird bereitgestellt) in die Gleichung y = a + bxeingesetzt, wobei y das berechnete Log-Odds des Patienten ist, der PE entwickelt, und a und b Konstanten sind (Werte weiter unten angegeben), die sich aus der logistischen Regressionsanalyse unserer Daten ableiten, die unter der Annahme einer 4%igen Prävalenz von PE in der Population angepasst wurden, und x der aus 1, 2 oder 3 berechnete Wert ist. Dieser als logistische Regression bekannte Ansatz ist in der klinischen Forschung weit verbreitet. In diesem Zusammenhang behaupten wir die Neuheit für das Etablieren geeigneter Werte für a und b.
Die Wahrscheinlichkeit (0–100 %) für die Entwicklung von PE bei allen drei Tests ist durch exp [y/(1 + y)]·100 % gegeben. Dieser Wert kann an die Prävalenz einer Population für PE oder anhand des Risikos eines einzelnen Patienten angepasst werden.
Das Testverfahren zur Vorhersage von PE umfasst die gleichzeitige Messung von PAI-1, PAI-2, P1GF und Leptin in „Kit"-Form. Jeder Assay basiert dabei auf einem Farbtest, beispielsweise einem enzymgebundenen Immunabsorptionsassay, ELISA, bei dem die Intensität der Farbentwicklung in einer Test-„Vertiefung" proportional zur Konzentration des vorhandenen Markers ist. Der Kit umfasst vier Vertiefungen, von denen jede für einen Marker spezifisch ist, und der Tester (Krankenhausbiochemiker) gibt zu jeder Vertiefung ein bekanntes Volumen Blutplasma einer Schwangeren. Die Farben können dann gleichzeitig auf einem Farbdichtescanner beurteilt werden. Diese Scanner stehen in allen klinischen Standardlaboratorien zur Verfügung. Das Ergebnis für jeden Marker (auf dem Scannerausdruck erhalten) wird anschließend in ein speziell entwickeltes Computerprogramm eingegeben. Für jeden der oben angegebenen Algorithmen berechnet das Programm einen einzelnen Wert. Dieser Wert kann mit den Grenzen des normalen Bereichs verglichen werden, der in Tabelle 4 unten angegeben ist.
Abhängig von diesem Wert wird das Risiko der Frauen in % (0–100 %) beurteilt und bestimmt.
Wie oben angegebenen, führt man das erfindungsgemäße Verfahren besonders bevorzugt mit dem automatischen DELFIA^®-System durch.
Entwicklung der Algorithmen
Bei der Entwicklung der Algorithmen für die Kombination der speziellen Marker erhielt man den besten Wert mit (log_e[PIGF] – (3,0·{Verhältnis PAI-1/PAI-2}). In der 24. Schwangerschaftswoche betrug die Fläche unter der ROC-Kurve 0,96 (95 % VI 0,88–1,99). Ein idealer Test würde eine Fläche von 1 ergeben, wohingegen ein rein zufälliger Test eine Fläche von 0,5 ergeben würde. Diese Formel ließ sich auch gut für Proben verwenden, die in früheren oder späteren Schwangerschaftswochen getestet wurden, obwohl der Test für einen klinischen Nutzen umso nützlicher ist, je früher das Risiko abgeschätzt werden kann. Die Flächen unter der Kurve bei den verschiedenen getesteten Schwangerschaftswochen sind in Tabelle 1 unten angegebenen und in 1 für die 24. Schwangerschaftswoche graphisch dargestellt.
Tabelle 1
Wir stellten auch fest, dass die Kombination aus PAI-2 und P1GF mit dem Algorithmus 0,75 (log_e[PAI-2]) + (log_e[P1GF]) eine fast ebenso gute Risikovorhersage liefert. Siehe Tabelle 2.
Tabelle 2
Daneben stellten wir fest, dass eine Kombination des Verhältnisses von Leptin/P1GF ein guter Vorhersageindikator für PE ist (siehe Tabelle 3).
Tabelle 3
Ein zusätzlicher Wert dieses Vorhersagetests liegt in seinem schlechten Aussagewert für die spätere Entwicklung von Wachstumsretardierung. Verschiedene Marker, insbesondere solche, die im Plazentagewebe synthetisiert werden, sind bei PE und Schwangerschaften, die mit einer fötalen Wachstumsretardierung assoziiert sind, bei denen aber keine Komplikation durch PE auftritt, in gleicher Weise erhöht. Keine der Markerkombinationen, die wir verwendet haben, sagte eine Wachstumsretardierung vorher, d.h. sie sind für PE spezifisch.
Die folgenden Tabellen zeigen typische Werte für Marker und Markerverhältnisse und die aus den jeweiligen oben angegebenen Algorithmen erhaltenen Werte.
Tabelle 4. Normale Bereiche bei gesunden Frauen mit normalem Schwangerschaftsausgang
Tabelle 5. PE-Bereiche bei Hochrisikopatientinnen, die später PE entwickeln
Tabelle 6. Werte für a und b bei den Algorithmen 1 bis 3
Die Schwankungen des Leptin/P1GF-Verhältnisses bei den Kontrollen und bei Frauen, die später PE entwickelten, sind in 7 gezeigt. Die Schwankung bei P1GF und beim PAI-1/PAI-2-Verhältnis, bestimmt mit dem Algorithmus log_e[P1GF] – 3·(PAI-1/PAI-2) für Kontrollen und Frauen, die später PE entwickelten, ist in 8 gezeigt. Die Schwankung bei den PAI-2- und P1GF-Spiegeln, bestimmt mit dem Algorithmus 0,75 (log_e[PAI-2]) + log_e[P1GF] für Kontrollen und Frauen, die später PE entwickelten, ist in 9 gezeigt.
Beispiel 2
VERFAHREN
Probanden. Die Probanden wurden mit Zustimmung des örtlichen ethischen Komitees des St. Thomas-Hospitals und des Chelsea und Westminster-Hospitals in London, UK, rekrutiert.
Hochrisikopatientinnen wurden dadurch identifiziert, dass eine Entbindung in der vorhergehenden Schwangerschaft wegen einer PE vor der 37. Schwangerschaftswoche erforderlich war, oder durch eine anomale Uterusarterie bei einer Doppler-FVW (definiert als Widerstandsindex ≥ 95. Perzentile für die Schwangerschaft oder Auftreten eines frühen diastolischen Notch). Die Versuchsgruppe wurde aus dem Plazeboarm einer randomisierten klinischen Studie über Antioxidantien-Supplementierung abgezogen. 1512 Frauen wurden in der 8.–22. und in der 24. Schwangerschaftswoche auf persistente Anomalien bei einer Doppler-FVW gescreent. Bis zur Geburt nahmen insgesamt 160 Frauen an den klinischen Studien zu Antioxidantien teil. Von den 81 in der aktuellen Studie beschriebenen Hochrisikopatientinnen aus dem Plazeboarm gelangten 60 Frauen aufgrund anomaler Doppler-FVW und 21 Frauen aufgrund von PE bei der früheren Schwangerschaft in die Studie. Den 81 Frauen wurden im Rahmen einer Längsschnittstudie alle 4 Wochen Blutproben entnommen. Die Daten für die Frauen, die entweder PE mit oder ohne SGA (PE, n = 21) entwickelten oder ohne PE SGA-Kinder (SGA, n = 17) zur Welt brachten, werden beschrieben. Von den Frauen, die PE entwickelten, litten sechs unter essentieller Hypertonie (fünf nahmen zum Aufnahmezeitpunkt Methyldopa) und eine unter Antiphospholipidsyndrom. Fünf Frauen nahmen Aspirin; dies war für die Studie kein Ausschlusskriterium. Schwangerschaftspräeklampsie ist in den Richtlinien der „International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy" (Am. J. Obstet. Gynaecol., 158: 892–98, 1988) definiert, die PE als Schwangerschaftshypertonie mit Pfropf-PE beschreiben. Schwangerschaftshypertonie wurde als zwei Messungen des diastolischen Blutdrucks von ≥ 90 mm Hg in einem Zeitabstand von ≥ 4 Stunden definiert, und schwere Schwangerschaftshypertonie als zwei Messungen des diastolischen Blutdrucks von ≥ 110 nun Hg in einem Zeitabstand von ≥ 4 Stunden oder als eine einzige Messung des diastolischen Blutdrucks von ≥ 120 mm Hg. Proteinurie wurde als Ausscheidung von ≥ 300 mg/24 Stunden definiert, oder, wenn keine 24 h-Sammlung durchgeführt werden konnte, als zwei Messungen von ≥ 2+ bei einer Analyse von Proben von Mittelstrahl- oder Katheterurin mit Teststreifen. SGA-Kinder wurden als diejenigen ≤ 10. Perzentile für Schwangerschaft und Geschlecht definiert, korrigiert hinsichtlich Größe, Gewicht, Parität und Ethnizität der Mutter mit Hilfe von Perzentilkurven (Lancet et al., 339: 283–287, 1992).
Niedrigrisikopatientinnen Allen Frauen, die zum Auswahlzeitpunkt für die Studie aufgrund vorgeburtlicher Routineversorgung im Krankenhaus waren, der Untersuchung zustimmten und bei einem Screening normale Doppler-FVW zeigten und keine anderen parallelen Erkrankungen oder Risikomarker aufwiesen, wurde angeboten, an der Studie teilzunehmen. 33 Frauen stimmten zu und 1 konnte die Studie nicht beenden; die angegebenen Daten stammen von den 27 Frauen, die Kinder mit für das Geburtsalter passender Größe (AGA, appropriate size for gestational age) zur Welt brachten. Da von Niedrigrisikopatientinnen (mit normaler Doppler-FVW der Uterusarterie) zur Welt gebrachte SGA-Kinder wahrscheinlich eher „normal" klein sind als wachstumsretardiert, wurden mit SGA assoziierte Schwangerschaften aus dieser Gruppe nicht in die SGA-Gruppe miteinbezogen.
Blutabnahmen. Venöses Blut wurde ohne Manschette aus einem Arm in Röhrchen mit für jeden der getesteten Faktoren (hier auch als Marker bezeichnet) geeigneten Zusätzen abgenommen. Die Proben wurden sofort auf Eis gestellt und innerhalb von 3 Stunden zentrifugiert. Die Überstände wurden vor dem Test bei –70 °C aufbewahrt.
Analyse von biochemischen Markern
Indices für Antioxidansstatus und oxidativen Stress
Proben, die auf Ascorbinsäure und α-Tocopherol untersucht werden sollten, wurden in 2%-iger Metaphosphorsäure gelagert. Ascorbinsäure und Harnsäure wurden mittels Reversed Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt (Pediatr. Res. et al., 36: 487–93, 1994) (Ascorbinsäure; untere Nachweisgrenze 5 nM; Intraassay-Variationskoeffizient [VK] 2,2 %; Interassay-VK 3,5 %; Harnsäure; untere Nachweisgrenze 5 nM; Intraassay-VK 2,6 %; Interassay-VK 3,8 %). α-Tocopherol wurde mittels Reversed Phase-HPLC getestet (Br. J. Nutr. et al., 63: 631–8, 1990) (untere Nachweisgrenze 10 nM; Intraassay-VK 2,1 %; Interassay-VK 3,9 %). Aufgrund methodisch bedingter Probenverluste wurde das Isoprostan 8-epi-PGF_2α (ein Marker für die Lipidperoxidation) nicht bei allen Frauen bestimmt, wurde aber in verfügbaren Proben von 21 Niedrigrisikopatientinnen, 13 Frauen, die SGA-Kinder zur Welt brachten, und 17 präeklamptischen Patientinnen wie oben beschrieben mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie untersucht (J. Chromatogr. B. Biomedical Applications, 667: 199–208, 1995). Frühere Untersuchungen unseres Labors wiesen darauf hin, dass diese Zahlen ausreichende Aussagekraft haben sollten, um signifikante Differenzen zwischen den Gruppen offenlegen.
Indices für Plazentainsuffizienz. Plasminogenaktivatorinhibitor (PAI-2) wurde mittels ELISA bestimmt (TintElize, Biopool International, Schweden; untere Nachweisgrenze 6 ng/ml; Intraassay-VK 3,7 %, Interassay-VK 3,0 %). Serumleptin wurde mittels RIA mit ¹²⁵-markiertem humanem Leptin erfasst (LINCO Research, Inc., Missouri, USA; untere Nachweisgrenze 0,5 ng/ml; Intraassay-VK 4,5 %, Interassay-VK 4,9 %). P1GF wurde mittels ELISA erfasst (R&D Systems, Abingdon, UK; untere Nachweisgrenze 7 pg/ml; Intraassay-VK 5,6 %–7,0 %, Interassay-VK 10,9 %–11,8 %).
Index für Endothelfunktion. Plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1) wurde mittels ELISA bestimmt (TintElize, Biopool International, Schweden; untere Nachweisgrenze 0,5 ng/ml; Intraassay-VK 3,3 %, Interassay-VK 2,9 %).
Lipide. Serumtriglyceride und Gesamtcholesterin wurden mit enzymatischen colorimetrischen Tests gemessen (UNIMATE 5 TRIG bzw. UNIMATE 5 CHOL, Roche/BCI, Lewes, Sussex, UK). HDL-Cholesterin wurde durch Detergentien-basierte Isolierung und enzymgebundenen colorimetrischen Nachweis bestimmt (DIRECT HDL CHOLESTEROL, Randox Laboratories, Co., Antrim, Nordirland). LDL-Cholesterin wurde durch Berechnung aus Triglyceriden und HDL-Cholesterin abgeschätzt. Apo-Al und Apo-B wurden mit Immunturbidimetrie erfasst (Dade/Behring, Milton Keynes, UK).
Statistische Analyse
Die Daten wurden in Stata 6.0 (StataCorp, College Station, Texas) analysiert. Für jeden biochemischen Marker wurden Gesamtscores (Mittelwert aus 2 oder mehr Messungen während der Wochen 20–36) berechnet (Matthews et al., Br. Med. J., 300: 230–5, 1990). Log-Transformationen und geometrische Mittelwerte wurden für 8-epi-PGF_2α, Leptin, PAI-1, PAI-2, das PAI-1/PAI-2-Verhältnis, Triglyceride, das Vitamin E/Cholesterin-Verhältnis und Harnsäure verwendet. Da sich PAI-1 während der Schwangerschaft deutlich änderte, wurde eine 2-Way-Interaction zwischen Zeit und Ergebnis mit verallgemeinerten Schätzgleichungen (Generalised Estimating Equations, GEE) angepasst (Biometrika et al., 73: 13–22, 1986). GEE wurde auch dazu verwendet, den Einfluss der Rasse (Kaukasisch/Europäisch gegenüber Afrikanisch/Karibisch) und der Parität abzuschätzen.
Die Marker, die signifikante Unterschiede zeigten (8-epi-PGF_2α, HDL-Cholesterin, Harnsäure, PAI-1/PAI-2-Verhältnis, Leptin und P1GF) wurden als mögliche Prädiktoren für PE in der 20. und 24. Woche angesehen. Die Flächen, die aus Receiver Operation Characteristic (ROC)-Kurven erhalten wurden, wurden zur Beurteilung ihrer Nützlichkeit herangezogen. Multiple logistische Regression wurde verwendet, um drei kombinierte Prädiktorindices zu entwickeln (Einzelheiten auf Anfrage erhältlich). Empfindlichkeit und Spezifität wurden für geeignete Cutpoints berechnet. Für den besten Index ist eine geglättete ROC-Kurve (Stata Technical Bulletin, 2000, 52:sg120) angegeben.
Prozentunterschiede zur Referenzgruppe sind mit 95 %-Vertrauensintervallen (VI) mit robusten Standardabweichungen angegeben (Biometrika et al., 73: 57–64, 1988). Eine Signifikanz an der 5 %-Grenze wird dann behauptet, wenn der VI keinen Effekt ausschließt (0 % oder ROC-Fläche 0,5).
ERGEBNISSE
Die Einzelheiten bei Beginn der Studie sind in Tabelle 7 und die perinatalen Merkmale in Tabelle 8 angegeben. In der PE-Gruppe waren 45 % (95 % VI, 21 bis 69 %) mehr Frauen afrikanischer oder karibischer Herkunft als in der Niedrigrisikogruppe; sonst waren keine weiteren Unterschiede signifikant.
Längsschnittprofil biochemischer Marker
Bei einigen Frauen erfolgte die Geburt vor der letzten Probennahme (36. Woche). Es gab einige weitere Lücken wegen versäumter Klinikbesuche und methodisch bedingter Probenverluste. Andere biochemische Marker als 8-epi-PGF_2α, (wie oben ausführlich erläutert) wurden bei den meisten Frauen bei wenigstens vier Gelegenheiten gemessen (66 %–84 %, Mittelwert 78 % der Frauen; abhängig vom Marker).
Indices für Antioxidansstatus und oxidativen Stress. Im Vergleich zu Niedrigrisikopatientinnen nahmen die Ascorbinsäurekonzentrationen im Plasma sowohl bei der SGA-Gruppe (–39 %; VI –61 % bis –17 %) als auch bei der PE-Gruppe (–30%; VI –50 % bis –11 %) ab. Die Unterschiede zwischen der SGA- und der PE-Gruppe waren nicht signifikant. Die Cholesterin-korrigierte Konzentration von α-Tocopherol im Plasma zeigte im Verlauf der Schwangerschaft bei den Niedrigrisikopatientinnen einen leichten Anstieg, zwischen den Gruppen wurden aber keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Im Vergleich zu Niedrigrisikopatientinnen tendierten die Gesamtscores für die 8-epi-PGF_2α-Konzentrationen im Plasma der PE-Gruppe zu höheren Werten (mittlerer Unterschied 51 %; VI –1 % bis 131 %). Ein weniger ausgeprägter Trend ließ sich auch für die SGA-Gruppe beobachten (–41 %; VI –6 % bis 114 %). Die Harnsäurekonzentrationen nahmen im Verlauf der Schwangerschaft bei allen Gruppen zu, die Zunahme in der PE-Gruppe war jedoch größer als bei den Niedrigrisikopatientinnen (21 %; VI 8 % bis 36 %) oder der SGA-Gruppe (Differenz 19 %, VI 4 % bis 37 %).
Indices für Plazentainsuffizienz. Verglichen mit Niedrigrisikopatientinnen war die PAI-2-Konzentration sowohl bei der SGA-Gruppe (–28 %; VI –41 % bis –11 %) als auch bei der PE-Gruppe (–43 %; VI –55 % bis –26 %) geringer, aber der Unterschied zwischen den beiden letzten Gruppen war nicht signifikant (siehe 2). Die Serumleptinkonzentration war bei der PE-Gruppe signifikant höher als bei der SGA-Gruppe (92 %; VI 39 % bis 165 %) oder der Niedrigrisikogruppe (74 %; VI 21 % bis 135 %), und die Werte der SGA- und der Niedrigrisikogruppe waren einander ähnlich (siehe 3). Diese Unterschiede blieben nach Korrektur um BMI bestehen. Der P1GF-Wert bei Niedrigrisikopatientinnen stieg an und fiel dann mit dem Geburtsalter ab (siehe 4). Dieses Profil war bei der SGA-Gruppe abgestumpft (–35 %; VI –57 % bis –3 %) und bei der PE-Gruppe fast aufgehoben (verglichen mit der Niedrigrisiko –63 %; VI –77 % bis –40 %; verglichen mit SGA –42 %; VI –67 % bis +1 %).
Index für Endothelfunktion und das Verhältnis PAI-1/PAI-2. Im Verlauf der Schwangerschaft nahm PAI-1 bei allen Gruppen zu. Im Vergleich zur Niedrigrisikogruppe waren die Plasmakonzentrationen bei der PE-Gruppe signifikant höher (13 %; VI 2 % bis 25 %) (siehe 5). Das PAI-1/PAI-2-Verhältnis fiel während der Schwangerschaft bei den Niedrigrisikopatientinnen um –26 % (VI –41 % bis –8 %) ab, zeigte insgesamt keine Veränderung bei der SGA-Gruppe, stieg jedoch bei der PE-Gruppe um 62 % (VI 17 % bis 122 %). Im Vergleich zu Niedrigrisikopatientinnen war das PAI-1/PAI-2-Verhältnis bei der SGA-Gruppe 45 % (VI 15 % bis 82 %) und bei der PE-Gruppe 85 % (VI 44 % bis 139 %) höher, wobei der Unterschied 28 % betrug (VI –3 % bis 70 %) (siehe 6).
Lipide. Die Serumtriglyceridkonzentrationen nahmen während der Schwangerschaft zu, wobei sie bei der PE-Gruppe am größten waren (Unterschied zu Niedrigrisikopatientinnen 29 %, VI 2 % bis 62 %). HDL-Cholesterin im Serum war bei der PE-Gruppe 13 % niedriger als bei Niedrigrisikopatientinnen (VI –24 % bis –2 %). Bei den Konzentrationen von Gesamt- und LDL-Cholesterin, Apo-A1 oder Apo-B waren keine Unterschiede festzustellen (Daten nicht gezeigt).
Biochemische Indices und Blutdruck zur Vorhersage von Präeklampsie
sTabelle 9 gibt die ROC-Flächen zur Vorhersage von PE in der 20. und 24. Schwangerschaftswoche an, wobei sechs Marker verwendet wurden, die als potentielle Vorhersageindikatoren identifiziert worden waren. In der 20. Schwangerschaftswoche konnte man anhand von HDL-Cholesterin, dem PAI-1/PAI-2-Verhältnis, Leptin und P1GF PE-Patientinnen von Niedrigrisikopatientinnen unterscheiden (ROC-Flächen signifikant > 0,5), und anhand von HDL-Cholesterin und Leptin ließ sich spätere PE von SGA unterscheiden. Im Vergleich zur Niedrigrisikogruppe ergaben PAI-1/PAI-2-Verhältnis, Leptin und P1GF bei der PE-Gruppe in der 24. Schwangerschaftswoche ROC-Werte von > 0,75 (wobei Zufall = 0,5 und idealer Wert = 1,00), und Harnsäure war marginal signifikant. Leptin, PIGF und Harnsäure unterschieden zwischen der PE- und der SGA-Gruppe. Mehrere logistische Regressionsanalysen führten zu drei Algorithmen mit ROC-Werten ≥ 0,89 für die Vorhersage von PE in der 24. Woche und zu ROC-Werten ≥ 0,80 in der 20. Woche (Tabelle 9B), verglichen mit Niedrigrisikopatientinnen. In der 24. Schwangerschaftswoche unterschieden diese Algorithmen auch signifikant die PE- von der SGA-Gruppe. Ein Beispiel einer ROC-Kurve für einen dieser Algorithmen (log_e[P1GF]) – (3,0 (Verhältnis PAI-1/PAI-2)) in der 24. Schwangerschaftswoche ist in 1 gezeigt.
Der Blutdruck (mittlerer arterieller, systolischer und diastolischer) bei der Aufnahme und in der 20. Woche war sehr vorhersagekräftig für spätere PE (z.B.: mittlerer arterieller Blutdruck bei der Aufnahme; ROC-Fläche % PE gegen Niedrigrisiko; 0,79, VI 0,66 bis 0,92; systolischer Blutdruck 0,78, VI 0,65 bis 0,91 und diastolischer Blutdruck 0,80, VI 0,68 bis 0,98), aber diese Daten werden stark von den 6 Frauen der Hochrisikogruppe beeinflusst, die bereits an Hypertonie litten, einem bekannten Risikomarker für PE.
Es gab keinen statistischen Beweis, dass irgendeiner der drei Hauptindices oder irgendeine Kombination von der Parität beeinflusst wurde, oder dass sich die Werte zur Vorhersage von PE zwischen den ethnischen Gruppen unterschieden. Für jeden Indikator wurden zwei Schwellenwerte definiert, die so gewählt waren, dass a) die Empfindlichkeit und b) die Spezifität maximiert wurden. Die Werte in der 24. Schwangerschaftswoche im Vergleich mit der Niedrigrisikogruppe sind in Tabelle 10 angegeben.
DISKUSSION
Die Daten hier stellen unseres Wissens die bislang umfassendste Längsschnittstudie biochemischer Indices der Krankheit im Blut von Frauen dar, die PE entwickeln. Frühere prospektive Längsschnittuntersuchungen haben sich auf die Auswertung einzelner biochemischer Marker, oft mit weniger Probanden, konzentriert und haben nicht die Profile von PE mit Frauen verglichen, die SGA-Kinder zur Welt brachten, aber kein PE entwickelten. Die vorliegenden Daten haben dadurch, dass sie substantielle Unterschiede zwischen den Profilen der Marker bei präeklamptischen Schwangerschaften und denen bei SGA-Geburten, bei denen keine Komplikationen durch die Krankheit auftreten, dokumentieren, interessante Einblicke in die Ätiologie dieses Zustands geliefert. Weitere Kombinationen der identifizierten Marker sind für die Vorhersage von PE nützlich. Ein Test, der spätere PE von Schwangerschaften unterscheidet, bei denen nur eine fötale Wachstumsretardierung auftritt, ist klinisch insbesondere als Ergänzung zur Doppler-FVW-Analyse nützlich. Eine solche Unterscheidung zu einem frühen Zeitpunkt der Schwangerschaft würde Obstetriker und Schwangere zur erhöhten Überwachung der Symptome von PE alarmieren und eine Intervention zur Vorbeugung von PE erlauben, sollte eine klinisch erprobte Intervention, z.B. eine Supplementierung mit Vitamin C und E oder mit Calcium, zur Verfügung stehen.
Obwohl wir erkennen, dass die Geburtsgewichtsperzentile als Ersatzmarker für fötale Wachstumsretardierung nur eingeschränkt genutzt werden kann, konnten wir zwischen der SGA-Gruppe und sowohl der Niedrigrisikogruppe als auch der PE-Gruppe wichtige Unterschiede beobachten, durch welche wertvolle mechanistische Erkenntnisse gewonnen werden konnten. Die meisten Hochrisikopatientinnen wurden aufgrund anomaler Doppler-FVW rekrutiert, die auf eine ungenügende Trophoblasteninvasion und hohen uteroplazentaren Widerstand hinweist. Die Ascorbinsäurekonzentrationen im Plasma der gesunden Kontrollen blieben während der Schwangerschaft konstant. Im Vergleich dazu waren die maternalen Ascorbinsäurekonzentrationen während der gesamten Schwangerschaft sowohl bei der SGA-Gruppe als auch bei der PE-Gruppe signifikant gering. Dies stimmt mit der Hypothese überein, dass eine schlechte uteroplazentare Perfusion eine Prädisposition für eine erhöhte Synthese freier Radikale in der Plazenta und somit oxidativen Stress für die Mutter darstellt. Ohne Kenntnis der täglich aufgenommenen Menge kann der Beitrag einer geringeren Menge an mit der Nahrung aufgenommenem Vitamin C nicht unberücksichtigt gelassen werden, obwohl die im Plasma von PE-Patientinnen belegte erhöhte Verbrauchsgeschwindigkeit von Ascorbat ein Anzeichen dafür wäre, dass die wahrscheinlichere Erklärung ein übermäßiger metabolischer Vitamin C-Verbrauch ist. Der Trend zu erhöhten Konzentrationen des Isoprostan 8-epi-PGF_2α in der PE-Gruppe (p = 0,055) ist trotz erheblicher Streuung der Daten ein Anzeichen für oxidativen Stress. 8-epi-PGF_2α, ein Marker für die Lipidperoxidation, tritt in der präeklamptischen Plazenta auf und wird entweder als im maternalen Plasma betroffener Frauen erhöht (Clin. Sci. et al., 91: 711–18, 1996) oder normal (Br. Obstet. Gynaecol. et al., 105: 1195–99, 1998) beschrieben. Ein weiterer Hinweis für oxidativen Stress ist der frühe Anstieg der Harnsäure, ein Produkt des Xanthin/Xanthinoxidase-Stoffwechselwegs, bei der PE-Gruppe, aber nicht bei der SGA-Gruppe. Eine reduzierte renale Clearance der Harnsäure könnte auch zu erhöhten Plasmakonzentrationen bei etablierter PE führen, dies erklärt aber wahrscheinlich nicht die vor der klinischen Manifestation der Krankheit beobachtete Zunahme.
Da die Ascorbinsäurekonzentrationen sowohl bei der PE-Gruppe als auch bei der SGA-Gruppe niedrig waren, könnte eine spezielle Rolle von oxidativem Stress für eine Entstehung von PE fraglich sein. Hubel et al., S. 453–486, 1999 vermuten jedoch, dass Frauen, die PE entwickeln, mit höherer Wahrscheinlichkeit schädliche Lipidperoxide synthetisieren, d.h. eine übertriebene Reaktion auf die Oxidantienbelastung, eine Theorie, die von dem sehr viel stärkeren Trend zu höheren Werten für 8-epi-PGF_2α bei der PE-Gruppe gestützt wird. Dies kann durch die bei PE gut charakterisierte maternale Dyslipidämie kommen, einschließlich Hypertriglyceridämie, (Hubel et al., S. 453–486, 1999) (die bei dieser Studie schon in der 20. Schwangerschaftswoche auftrat), durch erhöhte Konzentrationen an freien Fettsäuren und verminderter LDL-Partikelgröße, was gemeinsam zur Bildung schädlicher Lipidperoxide und anschließender Endothelzellaktivierung beitragen könnte. Andere Risikomarker, einschließlich Diabetes und essentieller Hypertonie mit damit assoziierter mikrovaskulärer Dysfunktion, können ebenfalls die Reaktion des Kreislaufs auf eine Pro-Oxidans-Belastung beeinflussen.
Das Lipidprofil bei dieser Untersuchung zeigte einen spezifischen Anstieg der Serumtriglyceridkonzentration bei Frauen, die PE entwickelten. Eine Erhöhung der Triglyceride wurde schon früher bei Frauen, die später PE entwickelten, in der 10. Schwangerschaftswoche beschrieben (Hubel et al., S. 453–486, 1999); unsere Studie bestätigt einen frühen Anstieg und könnte vermuten lassen, dass Triglyceride eine wichtige pathophysiologische Rolle spielen. Frühere Untersuchungen haben eine Abnahme des HDL- Cholesterins bei Frauen mit etablierter PE dokumentiert (Hubel et al., S. 453–486, 1999); bei der aktuellen Studie war HDL selektiv bei Frauen reduziert, die später die Krankheit entwickelten, was erneut auf eine Dyslipidämie während des Krankheitsprozesses hindeutet. Es gab keinen Unterschied bei den Konzentrationen von LDL-Cholesterin, man erkennt jedoch, dass bei PE eher die Eigenschaften als die absoluten Konzentrationen von LDL verändert sind.
Die anomale Leptinkonzentration reflektiert aller Wahrscheinlichkeit nach eine Plazentainsuffizienz. Der deutliche Anstieg der Konzentration von Leptin im maternalen Blut während einer normalen Schwangerschaft wird in der Regel auf dessen plazentare Synthese zurückgeführt, da Leptin in der Plazenta synthetisiert wird (Ashworth et al., 5: 18–24, 2000), obwohl die Leptinsynthese durch maternale Adipocyten wahrscheinlich auch hierzu beiträgt. Frühere Untersuchungen haben einen weiteren Anstieg der Serumleptinkonzentrationen bei Frauen mit PE berichtet, der wahrscheinlich eine plazentare Hypoxie widerspiegelt (Mise et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 83: 3225–29, 1998). Der selektive frühe Anstieg der Leptinkonzentrationen in dieser Studie bei Frauen, die später PE entwickelten, könnte auf eine Rolle als Prognoseindikator hindeuten. Eine frühe Erhöhung von Leptin bei Frauen, die später PE entwickeln, wurde kürzlich beschrieben (Anim-Nyame et al., Hum. Reprod., 15: 2003–6, 2000), wenn auch keine anderen Hochrisikogruppen untersucht wurden. Von weiterem Interesse bei der aktuellen Studie war, dass sich das Serumleptin bei gesunden Schwangeren und bei Schwangeren, die SGA-Kinder zur Welt brachten, nicht unterschied. Eine Korrektur hinsichtlich BMI (body mass index) änderte die beobachteten Unterschiede nicht. Wenn der Leptinanstieg bei Frauen, die PE entwickelten, durch Hypoxie entsteht, muss dies bei der SGA-Gruppe als weniger ausgeprägt angesehen werden. Alternativ wird die Leptinsynthese durch Cytokine stimuliert, die bekanntermaßen zu dem mit PE assoziierten entzündlichen Zustand beitragen. Eine Zunahme der Serumleptinkonzentration kann auch zu einer entzündlichen Reaktion und zu einer vaskulären Dysfunktion beitragen, da das Peptid selbst entzündungsfördernde Eigenschaften besitzt.
Wo Leptin selektiv erhöht war, war ein anderer Marker für Plazentainsuffizienz, P1GF, bei Frauen, die später PE entwickelten, deutlich und selektiv erniedrigt, weshalb auch dieser angiogene Marker ein potentieller Vorhersageindikator zu sein versprach. Dies stimmt mit früheren Querschnittsstudien überein, die beschreiben, dass niedrige Plasma-P1GF-Konzentrationen für PE charakteristisch sind (Torry et al., Am. J. Obstet. Gynaecol., 179: 1539, 1998), und unsere Studie bestätigt einen kürzlich erschienenen Artikel von Tidwell et al., Am. J. Obstet. Gynaecol., 184: 1267–1272, 2001, der eine frühe Abnahme des Plasma-P1GF bei Frauen zeigte, die später PE entwickelten. Ein anderer Bericht (Livingston et al., Am. J. Obstet. Gynaecol., 184: 1218–1220, 2001), in dem zweimal Proben genommen wurden, einmal in der 20. Woche und einmal bei der Diagnose von PE, zeigte keine Unterschiede für P1GF in der 20. Schwangerschaftswoche. Bei unserer Studie waren die abgestumpften P1GF-Konzentrationen, obwohl sie in der 24. Schwangerschaftswoche merklich anomaler waren, in der 20. Schwangerschaftswoche ebenfalls mäßig, aber signifikant reduziert. Im Gegensatz zu Leptin reguliert eine niedrigere Sauerstoffspannung P1GF herunter (Ahmed et al., Placenta, 21: 516–24, 2000) und kann eine Erklärung für das Ausbleiben einer normalen Zunahme sein. Die Folgen von geringem P1GF können schädlich sein und möglicherweise zu einer schlechten Trophoblastenproliferation, einem verminderten Schutz vor Apoptose und einer beeinträchtigten Gefäßentwicklung führen.
Die maternale Konzentration von PAI-2, der auch in den Trophoblasten der Plazenta synthetisiert wird, war bei der Unterscheidung präeklamptischer Schwangerschaften weniger selektiv und war sowohl bei der PE- als auch bei der SGA-Gruppe reduziert, wie bereits früher beschrieben wurde (Lindoff et al., Am. J. Obstet. Gynaecol., 171: 60–64, 1994). PAI-1, der einzige untersuchte Endothelmarker, war bei der präeklamptischen Gruppe erhöht, insbesondere gegen Schwangerschaftsende. Da PAI-2 abnimmt und PAI-1 zunimmt, wie bereits früher für etablierte PE beschrieben wurde (Halligan et al., Br. J. Obstet. Gynaecol., 101: 488–92, 1994), nimmt das Verhältnis von PAI-1/PAI-2 zu (Reith et al., Br. J. Obstet. Gynaecol., 100: 370–74, 1993). Wir beschreiben hier, dass dem Beginn einer PE auch ein anomal erhöhtes PAI-1/PAI-2-Verhältnis vorausgehen kann.
Die Untersuchung bot die einzigartige Möglichkeit, den potentiellen Wert verschiedener Markerkombinationen zur Unterscheidung und Vorhersage präeklamptischer Schwangerschaften festzustellen. Keine bisherige Studie hat gleichzeitig ein breites Spektrum relevanter biochemischer Indices ausgewertet. Für sich genommen zeigten sechs der Marker eine Signifikanz für eine Vorhersage von PE in der 20. Schwangerschaftswoche, und Serumleptin und HDL-Cholesterin unterschieden gut zwischen einer präeklamptischen Gruppe und einer SGA-Gruppe. P1GF zeigte in der 24. Schwangerschaftswoche die beste Trennschärfe. Drei spezielle Kombinationen der untersuchten Marker zeigten, dass sie zur Vorhersage von PE eingesetzt werden können; eine Kombination aus P1GF und dem PAI-1/PAI-2-Verhältnis, eine Kombination aus PAI-2 und PIGF, und die Kombination mit dem Verhältnis Leptin/P1GF. Bei Messung in der 24. Woche sagten diese Kombinationen die spätere Entwicklung von PE bei Verwendung als Screeningtest mit potentiell hoher Spezifität und bei Verwendung bei Hochrisikopatientinnen mit potentiell hoher Empfindlichkeit voraus. Die Aussagekraft in der 20. Woche war fast ebenso hoch. Diese Daten lassen sich vorteilhaft mit Werten anderer potentieller Screeningtests für PE vergleichen (Friedmann, SA et al. und Lindheimer, MD, Prediction and Differential Diagnosis in Chesley's Hypertensive Disorders in Pregnancy, Hrsg.: Lindheimer, MD, Roberts, JM, Cunningham, G, Appleton & Lang, Connecticut, USA, S. 201–227, 1999). Der Blutdruck wurde bei dieser Studie als starker Prädiktor identifiziert, seine Vorhersagefähigkeit erhöhte sich jedoch durch die Einbeziehung von Frauen mit chronischer Hypertonie, einem bekannten Risikofaktor für PE.
Alle Niedrigrisikopatientinnen, die freiwillig an der Studie teilnahmen, bildeten im Verlauf der klinischen Studie die Kontrollgruppe; dies hatte den Vorteil, dass die Proben aller drei Gruppen ähnlich behandelt und eine gleiche Zeit lang aufbewahrt wurden, führte jedoch zu einem signifikanten Unterschied bei der Enthnizität zwischen der präeklamptischen Gruppe und der Niedrigrisikogruppe. Uns sind keinerlei Anhaltspunkte aus der Literatur bekannt, die bei den untersuchten Markern für oxidativen Stress, Plazenta- oder Endothelfunktion eine ethnische Variation vermuten lassen, wenn auch die meisten Studien Ethnizität nicht einbeziehen. Aus der bei dieser Studie durchgeführten statistischen Analyse ergab sich auch kein Hinweis, der vermuten ließe, dass die Ethnizität zu irgendeinem der beobachteten Unterschiede beiträgt.
Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass die Daten für ein breites Spektrum an Markern, die mit PE assoziiert sind, Trends bei der Schwangerschaft beschreiben. Unsere Untersuchung hat frühe und selektive Veränderungen bei Markern für oxidativen Stress, Lipiden und einigen Markern für plazentare Dysfunktion gezeigt, was nahe legt, dass diese eine Rolle bei der Ätiologie der Krankheit spielen könnten. Da anomale Profile einige Wochen vor dem klinischen Einsetzen von PE evident waren, konnten wir Markerkombinationen identifizieren, die das Potential besitzen, Frauen zu identifizieren, die später PE entwickeln.
Tabelle 7. Baseline-Kennwerte bei Niedrig- und Hochrisikopatientinnen entsprechend den klinischen Ergebnissen. Niedrigrisikopatientinnen, die dem Geburtsalter entsprechende Kinder (AGA) zur Welt brachten, Hochrisikopatientinnen, die SGA-Kinder zur Welt brachten (small for gestational age) und Hochrisikopatientinnen, die Präeklampsie (PE) entwickelten.

* IQR = Interquartilsbereich

Tabelle 8. Perinatale Kennwerte bei Niedrigrisiko- und Hochrisikopatientinnen entsprechend den klinischen Ergebnissen. Niedrigrisikopatientinnen, die Kinder mit für das Geburtsalter passender Größe (AGA) zur Welt brachten, Hochrisikopatientinnen, die SGA-Kinder zur Welt brachten (small for gestational age) und Hochrisikopatientinnen, die Präeklampsie (PE) entwickelten.
Tabelle 9a. Vorhersage von PE mit biochemischen Indices im maternalen Blut in der 20. und 24. Schwangerschaftswoche. ROC-Flächen sind angegeben (mit 95 % Vertrauensintervallen). Verglichen sind Niedrigrisikopatientinnen mit normalem Ergebnis (LR) und Hochrisikopatientinnen, die SGA-Kinder zur Welt brachten. Wenn die Vertrauensintervalle 0,5 nicht einschließen, ist der Unterschied signifikant.
Tabelle 9b zeigt einen Vergleich, wenn das Risiko für PE mit Kombinationen biochemischer Indices festgestellt wird.
Tabelle 10. Empfindlichkeit und Spezifität (95 % Vertrauensintervalle) für zwei Schwellenwerte, die aus drei identifizierten Formeln für die Vorhersage von PE berechnet wurden.

Claims

Verfahren zur spezifischen Vorhersage von Präeklampsie (PE), umfassend die Bestimmung, in einer maternalen Probe, des Spiegels von Plazentawachstumsfaktor (P1GF) und des Spiegels bzw. der Höhe wenigstens eines der Folgenden: (i) Plasminogenaktivator-Inhibitor-2 (PAI-2); (ii) des Verhältnisses von Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) zu Plasminogenaktivator-Inhibitor-2 (PAI-2); und (iii) Leptin.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Bestimmung des Spiegels von Plazentawachstumsfaktor (PIGF) und des Spiegels von Plasminogenaktivatorinhibitor-2 (PAI-2), wobei eine positive Vorhersage gegeben ist, wenn die kombinierten Spiegel von P1GF und PAI-2 niedriger sind als der Normalspiegel.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Bestimmung des Spiegels von P1GF und des Verhältnisses von PAI-1/PAI-2, wobei eine positive Vorhersage durch die Kombination eines im Vergleich mit dem Normalspiegel niedrigeren P1GF-Spiegels und ein Verhältnis von PAI-1 zu PAI-2, das größer ist als das normale, gegeben ist.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Bestimmung des Verhältnisses von Leptin zu PIGF, wobei eine positive Vorhersage durch ein Verhältnis von Leptin zu PIGF gegeben ist, das größer als das normale ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Spiegel der Marker P1GF und PAI-2 über den Algorithmus: d (loge[PAI-2]) + (loge[P1GF])kombiniert werden, wobei d eine Konstante zwischen etwa 0,03 und 48,6 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Spiegel der Marker P1GF und PAI-2 über den Algorithmus: [PAI-2]d·[P1GF]kombiniert werden, wobei d eine Konstante zwischen etwa 0,03 und 48,6 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Spiegel der Marker P1GF und PAI-2 über den Algorithmus [PAI-2]·[P1GF] kombiniert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Spiegel des Markers P1GF und das Verhältnis von PAI-1/PAI-2 über den Algorithmus: (loge[P1GF]) – (g·{Verhältnis PAI-1/PAI-2})kombiniert werden, wobei g eine Konstante zwischen etwa –19,4 und 3,6 ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei g 3,0 ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die maternale Probe Blut ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die maternale Probe zwischen den Wochen 12 und 38 genommen wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die maternale Probe zwischen den Wochen 20 und 36 genommen wird.
Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kit Reagenzien umfasst, die zur Bestimmung der Spiegel der Marker, die gemessen werden, erforderlich sind.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 13, bei dem die Reagenzien Reagenzien für einen enzymgebundenen Immunoassay sind.