ES2256310T3 - Diagnostico de pre-eclampsia. - Google Patents

Abstract

Método para la predicción específica de pre-eclampsia (PE) que comprende la determinación en una muestra materna del nivel del factor de crecimiento de placenta (PlGF) y el nivel, como mínimo, de uno de los siguientes: (i) inhibidor-2 (PAI-2) del activador de plasminógeno; (ii) proporción de inhibidor-1 (PAI-1) del activador de plasminógeno con respecto al inhibidor-2 (PAI-2) del activador de plasminógeno; y (iii) leptina.

Description

Diagnóstico de pre-eclampsia.

La presente invención se refiere a un método para la predicción de pre-eclampsia (PE). La presente invención se refiere también a un equipo de diagnóstico para llevar a cabo un método de predicción de PE.

Se define PE de acuerdo con las directrices de la Sociedad Internacional para el estudio de hipertensión en el embarazo (Davey y otros, Am. J. Obstet Gynecol; 158:892-98, 1988). La hipertensión en la gestación se define como dos registros de presión sanguínea diastólica de 90 mm Hg o superior, con separación entre sí mínima de 4 horas y una presión alta de 110 mm Hg o superior, con una separación mínima de 4 horas entre sí, o un registro de presión sanguínea diastólica mínima de 120 mm Hg. La proteinuria se define como la secreción de 300 mg o más en 24 horas o dos lecturas de 2+ o superior en análisis "dipstick" de muestras de flujo medio o de orina por catéter, si no hubo secreción en 24 horas. Las mujeres se clasifican como de tensión normal previa o con hipertensión crónica antes de las 20 semanas de la gestación. Para mujeres de tensión normal previa, se define PE como hipertensión en la gestación con proteinuria y PE grave como hipertensión grave en la gestación con proteinuria. Para mujeres con hipertensión crónica, se define PE superpuesto por el nuevo desarrollo de proteinuria. La PE afecta aproximadamente al 4% de todos los embarazos y es una causa principal de muerte materna en el Reino Unido. Esta enfermedad, o la amenaza de su declaración, es la causa más habitual de parto prematuro voluntario, representando aproximadamente el 15% de todos los nacimientos prematuros. La medición de la presión sanguínea y la comprobación de la proteinuria en todas las mujeres embarazadas se lleva a cabo predominantemente para la detección de PE. Estos procedimientos y los cuidados de las mujeres afectadas y de los niños prematuros establecen una considerable demanda de recursos de cuidados de salud. La identificación exacta de las mujeres en situación de riesgo podría reducir notablemente los costes de los cuidados prenatales.

Si bien no hay ningún tratamiento utilizado de manera generalizada para PE (además del parto prematuro), los inventores han informado recientemente de una reducción significativa en PE en mujeres de alto riesgo que recibían suplementos de vitamina C y de vitamina E (ver Chappell y otros, The Lancet, 354, 810-816, 1999). El riesgo fue evaluado por una prueba de sensibilidad relativamente baja. Una identificación más exacta y fiable de las mujeres de riesgo permitiría enfocar a estas mujeres que muy probablemente se podrían beneficiar de ello, o de manera alternativa adoptar terapias profilácticas. Las mujeres identificadas como riesgo más bajo podrían ser objeto de cuidados menos intensivos y menos caros en la etapa prenatal.

No hay método aceptado, de manera general, o suficientemente exacto para la predicción anticipada de PE. La elevación de la presión sanguínea y la detección de proteína en la orina tienen lugar cuando el proceso de la enfermedad está bien establecido, tal como se ha indicado anteriormente. La detección de una anormalidad del flujo sanguíneo a la arteria uterina por efecto ultrasónico Doppler en las mujeres que desarrollan posteriormente PE ha demostrado cierta uteridad en la predicción, pero esta anormalidad se ha observado que es relativamente no específica y, por esta razón, no ha sido adoptada en la práctica clínica habitual.

Si bien ciertos marcadores bioquímicos de plasma/orina han demostrado ser anormales en el proceso de la enfermedad, ningún marcador individual ha demostrado tener una sensibilidad adecuada para su utilización como indicador de predicción. Por ejemplo, la utilización del factor de crecimiento de placenta (PlGF) solo como indicador de predicción de PE ha sido propuesta, pero la capacidad de predicción de este marcador no se ha podido determinar de manera cierta. Por ejemplo, la publicación de patente internacional WO 98/28006 sugiere la detección de PlGF solo o en combinación con el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a efectos de predicción del desarrollo de PE.

Además, el efecto de la implementación de vitamina en la proporción de sangre materna PAI-1/PAI-2 ha sido publicada con anterioridad por el grupo de los inventores (Chappell y otros, 1999; Lancet, 354, 810-816) y otros han documentado valores elevados de PAI-1/PAI-2 en el caso de PE ya determinada (Reith y otros, 1993; British Journal of Obstetrics and Gynaecology 100, 370-4) y valores elevados de PAI-1 en mujeres que a continuación, desarrollaron PE (Halligan y otros, 1994; British Journal of Obstetrics and Gynaecology 101, 488-92). Se ha demostrado que el PlGF tiene valores reducidos en mujeres con PE ya establecido (Torry y otros, 1998; American Journal of Obstetrics and Gynaecology 179, 1539-44) y se ha sugerido que es bajo antes de la declaración de la enfermedad. Se ha observado un incremento de leptina con la gestación en mujeres embarazadas normales (Highman y otros, 1998, American Journal of Obstetrics and Gynaecology 178, 1010-5), observación que ha sido repetida por los inventores. La leptina se ha mostrado también que aumenta incluso adicionalmente en el caso de PE ya establecida, habiéndose publicado el primer informe por Mise y otros, Journal of Endocrinology and Metabolism, 83, 3225-9, 1998. Además, Anim-Nyame y otros, Hum. Reprod., 15, 2033-6, 2000, han indicado que el aumento de las concentraciones de leptina antes de PE es clínicamente evidente. Este descubrimiento está apoyado por Chappell y otros, J.Soc. Gynecol. Invest., 213A, 2001, en cuyo trabajo se ha indicado también que un suplemento vitamínico reduce la leptina en plasma en mujeres con riesgo de PE.

No obstante, ninguno de los documentos de la técnica anterior dan a conocer una prueba fiable, sensible y específica para la predicción de PE.

Ahora se ha descubierto que una combinación de marcadores proporciona el parámetro de predicción requerido para el deseado diagnóstico precoz de PE.

La presente invención da a conocer un método de predicción específica de pre-eclampsia (PE) que comprende la determinación en una muestra materna del nivel de factor de crecimiento de placenta (PlGF), y como mínimo otro marcador seleccionado entre inhibidor-1 de activador de plasminógeno (PAI-1), inhibidor-2 de activador de plasminógeno (PAI-2) y leptina.

Se ha descubierto que, midiendo un mínimo de 2 marcadores de los mencionados en lo anterior, resulta posible determinar con elevada especificidad y sensibilidad si un individuo es probable que desarrolle PE. La especificidad se define como la proporción de verdaderos negativos (no desarrollará PE) identificados como negativos en el método. La sensibilidad se define como la proporción de verdaderos positivos (desarrollará PE) identificados como positivos en el método. Es preferible que el método comprenda la medición de tres de los marcadores, más preferentemente la totalidad de los cuatro marcadores.

El método de la presente invención comprende la determinación del nivel del factor de crecimiento de placenta (PlGF) con el nivel de uno de los siguientes:

(i)

inhibidor-2 del activador de plasminógeno (PAI-2);

(ii)

proporción de inhibidor-1 de activador de plasminógeno (PAI-1) con respecto a inhibidor-2 de activador de plasminógeno (PAI-2); y

(iii)

leptina.

Se ha descubierto que estas combinaciones específicas son particularmente útiles para determinar si un individuo desarrollará probablemente PE.

El término "pre-eclampsia", que se utiliza en esta descripción, se define de acuerdo con las directrices de la International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy, tal como se ha indicado anteriormente.

El término "predicción específica de pre-eclampsia", tal como se utiliza en esta descripción, significa que el método de la presente invención es utilizado para la Predicción específica del desarrollo de PE. En particular, el método de la presente invención posibilita el determinar si un individuo desarrollará probablemente PE.

La muestra maternal es tomada de una mujer embarazada y puede ser cualquier muestra de la que sea posible medir los marcadores mencionados anteriormente. Preferentemente, la muestra es sangre. Las muestras pueden ser tomadas en cualquier momento después de unas 10 semanas de gestación. Preferentemente, la muestra es tomada entre 12 y 38 semanas de gestación, más preferentemente las muestras se toman entre 20 y 36 semanas.

El término "factor de crecimiento de placenta" (PlGF) se refiere a la forma libre que se encuentra en el individuo. La secuencia de aminoácidos humana de PlGF es conocida (ver base de datos de proteínas NCBI, acceso nº XP 040405). Hay numerosos métodos para la detección de PlGF incluyendo el método comercial de inmunoensayo Quantikine Human PlGF de la firma R&D Systems Inc.

El término "inhibidor-1 de activador de plasminógeno"(PAI-1) es un término normal utilizado en esta técnica y es evidente para los técnicos en la materia. En particular, la secuencia de la forma humana de PAI-1 se facilita en la base de datos de proteínas NCBI con el acceso nº AAA 60003. Hay numerosos métodos para la detección de PAI-1, incluyendo el equipo comercialmente disponible Tint Elize PAI-1 de la firma Biopool International.

El término "inhibidor-2 de activador de plasminógeno"(PAI-2) es un término normal utilizado en esta técnica y es evidente para los expertos en la materia. En particular, la secuencia de la forma humana de PAI-2 se facilita en la base de datos de proteínas NCBI con el acceso nº CAA 02099. Hay numerosos métodos para la detección de PAI-2, incluyendo el equipo comercial Tint Elize PAI-2 de la firma Biopool International.

El término "leptina" es un término normal bien conocido por los técnicos en la materia. En particular, la secuencia de aminoácidos de una forma humana de leptina se facilita en la base de datos de proteína NCB1 con el acceso nº P41159. Hay numerosos métodos de detección de la leptina, por ejemplo, la Quantikina, inmunoensayo de leptina humana de R&D Systems Inc.

En una realización especialmente preferente de la presente invención, el método de la presente invención es llevado a cabo determinando el nivel de dos o más de los marcadores, utilizando el sistema automático DELFIA® de la firma Wallac, Finlandia. El sistema automático DELFIA® es un sistema automatizado diseñado específicamente y optimizado para llevar a cabo inmunoensayos, y puede ser utilizado por lo tanto para medir los niveles de dos o más de los marcadores utilizados en el método de la presente invención. Los sistemas automáticos DELFIA® miden la concentración de los marcadores utilizando fluorescencia, y los cuatro marcadores pueden ser detectados en un único pocillo/muestra.

Los inventores obtuvieron muestras de sangre de mujeres embarazadas que se consideraban con riesgo de PE, en base a la prueba Doppler de arteria uterina o porque habían tenido la enfermedad en un embarazo anterior. Se obtuvieron muestras sanguíneas a las 20 semanas de embarazo a intervalos de 4 semanas hasta el parto. Se midió una selección de marcadores bioquímicos implicados en PE, incluyendo vitamina C, homocisteína, lípidos del plasma y 8-epiprostaglandina F_{2}_{\alpha}, pero ninguno se demostró ser efectivo en la predicción. Se observó que la relación del inhibidor-1 de activador de plasminógeno (PAI-1) y PAI-2 incrementaban antes del inicio de la enfermedad, mientras que el factor de crecimiento de la placenta (PlGF) no mostraba la elevación pronunciada, normalmente observada en embarazos sanos. La leptina en plasma se eleva normalmente en el embarazo, pero los inventores descubrieron que se incrementaba en mucha mayor medida en mujeres que luego desarrollaban PE. Las combinaciones de estos marcadores (ver más adelante) demostraron ser excelentes en la predicción sensitiva y específica de subsiguiente PE.

En la prueba de las combinaciones que se han descrito, se ha descubierto que para pacientes que desarrollarán PE (es decir, que la predicción es positiva) no hay incremento en el nivel de PlGF con la gestación, mientras que PlGF aumenta normalmente con la gestación. Si la combinación de marcadores PlGF y PAI-2 es utilizada, se consigue una predicción positiva por los niveles combinados de PlGF y PAI-2 menores de lo normal.

En el caso de utilizar la combinación de marcadores PlGF y la proporción de PAI-l a PAI-2, se consigue una predicción positiva para una combinación del nivel reducido de PlGF y la proporción de PAI-1 a PAI-2 con un valor superior al normal.

Si se utiliza la combinación de marcadores PlGF y leptina, se consigue una predicción positiva por la proporción de leptina a PlGF con un valor superior al normal.

A efectos de determinar si el nivel o proporción de los marcadores, a los que se ha hecho referencia, es superior al normal o inferior al normal, el nivel o proporción normal de la población relevante debe ser determinado. La población relevante puede ser definida basándose, por ejemplo, en los antecedentes étnicos o en cualquier otra característica que pueda afectar a los niveles normales de los marcadores. La población relevante para establecer el nivel normal o proporción normal de los marcadores se selecciona preferentemente en base a riesgo bajo para PE (es decir, ningún marcador de riesgo conocido para PE, tal como PE anterior, diabetes, hipertensión arterial, etc.). Una vez son conocidos los niveles normales, los niveles de medición se pueden comparar y la significación de la diferencia determinada utilizando métodos estadísticos normales. Si hay una diferencia estadísticamente significativa entre el nivel medido y el nivel normal, entonces existe un riesgo significativo de que el individuo del que se han medido los niveles desarrollará PE.

En una realización preferente de la presente invención, se pueden combinar los marcadores PlGF y PAI-2 utilizando el algoritmo:

d(log_{e}[PAI-2]) + (log_{e}[PlGF])

en el que d es una constante en una gama de valores de 0,03 a 48,6. Preferentemente, se encuentra en una gama de valores de 0,072 a 7,6, más preferentemente en una gama de valores de 0,0336 a 2,2. Más preferentemente, d es 0,75 ó 1. Se pueden combinar, alternativamente, los marcadores PlGF y PAI-2 utilizando el algoritmo:

[PAI-2]^{2 \ \text{*}}[PlGF]

en el que d es el definido anteriormente. El signo "^{\text{*}}" es utilizado como signo de multiplicación.

En una realización especialmente preferente, d tiene el valor 1 y el algoritmo indicado puede ser expresado
[PAI-2]^{\text{*}}[PlGF]. Utilizando este algoritmo, y suponiendo que la concentración de PAI-2 es medida en forma de ng/ml y la concentración de PlGF es medida como pg/ml, se ha descubierto que si el valor obtenido utilizando el algoritmo es < 35.000, la sensibilidad y especificidad de predicción de PE es 67% y 100%, respectivamente. Si el valor obtenido utilizando el algoritmo es < 50.000, la sensibilidad y especificidad de predicción de PE es de 80% y 94%, respectivamente (ver más adelante tabla 10).

En otra realización preferente de la presente invención, los marcadores PlGF y la proporción PAI-1/PAI-2 se pueden combinar utilizando el algoritmo:

(log_{e}[PlGF])-(g^{\text{*}}\{proporción \ PAI-1/PAI-2\})

en el que g es una constante con valores comprendidos entre -19,4 y 3,6. Preferentemente, g se encuentra en una gama de valores de 0,655 a 15,5, más preferentemente de 1,37 a 7,0. En una realización especialmente preferente, g tiene el valor 3,0. Utilizando el algoritmo cuando g es 3,0, y suponiendo que la concentración de PlGF se mide en forma de pg/ml, se ha descubierto que, si el valor obtenido utilizando el algoritmo es < 4,5, la sensibilidad y especificidad de predicción de PE es de 53% y 100%, respectivamente. Si el valor obtenido utilizando el algoritmo es < 5, la sensibilidad y especificidad de predicción de PE es de 80% y 88%, respectivamente (ver siguiente tabla 4).

También se ha descubierto que, midiendo la proporción leptina/PlGF, cuando la concentración de leptina es de ng/ml y la concentración de PlGF es de pg/ml, un valor > 0,1 proporciona un método de predicción de PE con sensibilidad de 67% y especificidad de 100%. Cuando el valor es > 0,05, el método de predicción de PE tiene una sensibilidad de 80% y una especificidad de 88%.

Se puede apreciar que el nivel de sensibilidad y de especificidad pueden ser alterados al cambiar el nivel de umbral. En algunas situaciones, por ejemplo, cuando se efectúa el rastreo de grandes números de mujeres de bajo riesgo de PE, es importante tener una elevada especificidad. En otras situaciones, puede ser importante tener un equilibrio entre alta sensibilidad y especificidad, por ejemplo, cuando se consideran mujeres individuales con elevado riesgo de PE, se necesita un equilibrio entre alta sensibilidad y especificidad.

La presente invención ofrece ambas ventajas. Además de facilitar un direccionado exacto de intervenciones, por ejemplo, suplementos vitamínicos, se puede esperar un gran ahorro en recursos sanitarios, debido a la estratificación de cuidados prenatales y reducidos costes de cuidados especiales neonatales. En el área de investigación y desarrollo, la identificación de pacientes de alto riesgo facilitará notablemente futuras pruebas clínicas. En la actualidad, debido a inadecuados métodos de predicción, grandes números de mujeres embarazadas reciben intervenciones innecesariamente en pruebas clínicas.

El método de la presente invención puede ser llevado a cabo conjuntamente con otras pruebas para indicadores diagnósticos, tales como presión sanguínea, nivel de ácido úrico, etc.

El método de la presente invención puede también ser utilizado a efectos de controlar la eficacia de un tratamiento profiláctico para la prevención del desarrollo de PE, en el que una reducción en el riesgo de desarrollar PE será indicativa del funcionamiento del tratamiento profiláctico.

Se ha demostrado que más de veinte marcadores bioquímicos han sido asociados anteriormente con PE declarada y no existe razón lógica alguna a priori para escoger PAI-1, PAI-2, PlGF y leptina en ningún estudio longitudinal prospectivo, para la evaluación de utilización de indicadores predictivos. Además, muy pocos grupos han evaluado algún marcador individual prospectivamente en las mismas mujeres de las que se han tomado muestras a intervalos a lo largo de su embarazo. De manera importante, ninguna ha medido los diferentes marcadores en las mismas mujeres, a diferencia de la presente solicitud.

Una vez que un valor ha sido obtenido utilizando uno de los algoritmos mencionados anteriormente, las probabilidades logarítmicas de que el individuo desarrolle PE se pueden calcular utilizando la fórmula:

y = a + bx

en la que y es la probabilidad logarítmica de que el individuo desarrolle PE, x es el valor obtenido utilizando uno de los algoritmos, y a y b son constantes (valores que se darán más adelante) derivados del análisis de regresión logística de los datos previamente calculados, ajustados en la suposición de 4% de prevalencia de PE en la población. Este enfoque, conocido como regresión logística, se utiliza ampliamente en la investigación clínica.

A efectos de demostrar cómo se puede utilizar la fórmula para determinar probabilidades logarítmicas ("log-odds") de que un individuo desarrolle PE, la siguiente información demuestra que es posible determinar los valores deseados de a y b, de manera que se puede obtener un valor de probabilidad logarítmica teniendo cualquier intervalo de confianza deseado (CI).

Las siguientes fórmulas de predicción están calculadas basándose en la muestra de los pre-eclámpticos y controles analizados a las 24 semanas. Las fórmulas proporcionan las probabilidades logarítmicas de PE de cualquier valor determinado del predictor. La probabilidad es exp(log-odds)/(1 + exp(log-odds)) (exp significa la función inversa del logaritmo natural).

Todos los valores son indicados corregidos para una prevalencia de 4%, probabilidad logarítmica ("log-odds") de 4% = log(4/96) = -3,18. Para convertir a una prevalencia diferente, por ejemplo, 20%, primero elaborar la nueva probabilidad logarítmica = log(20/80) = -1,39. La diferencia es -3,18 - (-1,39) = 1,79.

El valor de la constante "a" se debe incrementar en esta magnitud.

El valor de "b" no cambia.

Los mejores valores de "a" para utilización con el algoritmo log_{e}[PlGF] – 3^{\text{*}}(PAI-1/PAI-2), que proporciona el CI más elevado es 23,042. No obstante, el valor de "a" para CI de 75%, 95% o 99% es:

límites 75%: 9,314 a 36,771

límites 95%: - 0,348 a 46,432

límites 99%: -7,697 a 53,782

El mejor valor de "b" para utilización con el algoritmo log_{e}[PlGF] – 3^{\text{*}}(PAI-1/PAI-2), que proporciona los CI más elevados es -5,223. No obstante, el valor para "b" con CI de 75%, 95% o 99% es:

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límites 75%: -7,940 a -5,620

límites 95%: -9,852 a -3,708

límites 99%: -11,306 a -2,254

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El mejor valor para "a" a utilizar con el algoritmo proporción de leptina/PlGF es -5,801. No obstante, el valor de "a" con CI de 75%, 95% o 99% es:

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límites 75%: -6,895 a -4,707

límites 95%: -7,665 a -3,937

límites 99%: -8,251 a -3,351

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El mejor valor de "b" a utilizar con el algoritmo proporción leptina/PlGF es 42,197. No obstante, el valor de "b" con CI de 75%, 95% o 99% es:

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límites 75%: 22,393 a 58,948

límites 95%: 8,455 a 72,886

límites 99%: -2,147 a 83,489

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El mejor valor de "a" a utilizar con el algoritmo [PAI-2]^{\text{*}}[PlGF] es -0,919. No obstante, el valor de "a" con CI de 75%, 95% o 99% es:

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límites 75%: -1,923 a 0,084

límites 95%: -2,630 a 0,791

límites 99%: -3,167 a 1,328

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El mejor valor de "b" a utilizar con el algoritmo [PAI-2]^{\text{*}}[PlGF] es 0,000. No obstante, el valor de "b" con CI de 75%, 95% o 99% es:

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límites 75%: -0,000 a -3,114

límites 95%: -0,000 a -3,114

límites 99%: -0,000 a -3,114

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Por lo tanto, es posible para los técnicos en la materia determinar las probabilidades logarítmicas de que un paciente desarrolle PE con cualquier CI deseado, basándose en la información proporcionada y utilizando análisis estadísticos estándar.

La presente invención proporciona también un equipo diagnóstico para llevar a cabo el método de la presente invención. El equipo comprende reactivos requeridos para determinar el nivel de marcadores objeto de medición. Entre los agentes adecuados para el ensayo de los marcadores se incluyen reactivos de inmunoensayo enlazados con enzimas, reactivos RIA y reactivos para análisis Western.

La presente invención se describe a continuación solamente a título de ejemplo, con referencia a las siguientes figuras.

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La figura 1 muestra una curva -ROC- (Receiver Operation Characteristic) (característica de operación de receptor) para la predicción de PE, basándose en la fórmula (log_{e}[PlGF])-(3,0 ^{\text{*}} {proporción PAI-1/PAI-2}) a partir de datos en la semana 24 de gestación.

La figura 2 muestra el nivel de variación de PAI-2 durante el período de gestación, siendo -\blacksquare- mujeres de bajo riesgo, -\ding{115}- mujeres que desarrollaron posteriormente PE, y -\medbullet- mujeres que no desarrollaron PE pero que tuvieron en el parto niños pequeños, teniendo en cuenta la edad de gestación (SGA).

La figura 3 muestra el nivel de variación de leptina durante el período de gestación, siendo -\blacksquare- mujeres de bajo riesgo, -\ding{115}- mujeres que a continuación desarrollaron PE, y -\medbullet- mujeres que no desarrollaron PE pero que tuvieron en el parto niños pequeños para la edad de gestación (SGA).

La figura 4 muestra el nivel de variación de PlGF durante el período de gestación, siendo -\blacksquare- mujeres de bajo riesgo, -\ding{115}- mujeres que a continuación desarrollaron PE, y -\medbullet- mujeres que no desarrollaron PE pero que tuvieron en el parto niños pequeños para la edad de gestación (SGA).

La figura 5 muestra el nivel de variación de PAI-1 durante el período de gestación, siendo -\blacksquare- mujeres de bajo riesgo, -\ding{115}- mujeres que a continuación desarrollaron PE, y -\medbullet- mujeres que no desarrollaron PE pero que tuvieron en el parto niños pequeños para la edad de gestación (SGA).

La figura 6 muestra el nivel de variación de la proporción PAI-1/PAI-2 durante el período de gestación, siendo -\blacksquare- mujeres de bajo riesgo, -\ding{115}- mujeres que a continuación desarrollaron PE, y -\medbullet- mujeres que no desarrollaron PE pero que tuvieron en el parto niños pequeños para la edad de gestación (SGA).

La figura 7 muestra el nivel de variación de la proporción leptina/PlGF durante el período de gestación.

La figura 8 muestra el nivel de variación de (log_{e}[PlGF])-(3,0 ^{\text{*}} {proporción PAI-1/PAI-2}) durante el período de gestación.

La figura 9 muestra el nivel de la variación de (log_{e}[PAI-2]) + (log_{e}[PlGF]) durante el período de gestación.

Ejemplos

Ejemplo 1

El método de la presente invención es llevado a cabo preferentemente en la semana 20 del embarazo o más adelante, por ejemplo, a las 24 semanas.

De modo breve, el método de la presente invención es llevado a cabo tomando 5 mls de sangre venosa de una mujer embarazada en un contenedor de vacío ("vacutainer") con citrato trisódico o EDTA 0,5 M como anticoagulante. El plasma es decantado después de centrifugación y almacenado a -20ºC hasta el ensayo. Se pueden utilizar ensayos de tipo comercial, tales como los siguientes: ensayos para leptina (Quantikine, inmunoensayo para leptina humana, inmunoensayo R&D Systems Inc, Minneapolis MN 55413, USA);

PlGF (Inmunoensayo PlGF humano, Quantikine, R&D Systems Inc, igual que lo anterior);

PAI-1 (TintElize PAI-1, Biopool International, Umea, Suecia o Ventura CA 93003, USA) y PAI-2 (TintElize PAI-2, Biopool International, tal como lo anterior). Los ensayos son llevados a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lo siguiente se calcula a partir de las concentraciones de plasma obtenidas en los ensayos:

1.

(log_{e}[PlGF]) - (3,0 ^{*} proporción PAI-1/PAI-2)

2.

0,75 (log_{e}[PAI-2]) + (log_{e}[PlGF])

3.

leptina/PlGF

El número calculado en 1, 2 ó 3 (al cual se hace referencia más adelante como "x") es introducido a continuación en un software diseñado de forma especial (aprovisionado) en la ecuación

y = a + bx

en la que y es la probabilidad logarítmica calculada de que el paciente desarrolle PE, y a y b son constantes (valores indicados más adelante) derivados de análisis de regresión logística del conjunto de datos de los inventores ajustado, bajo la suposición de prevalencia de 4% de PE en la población y x es el valor calculado de 1, 2 ó 3. Este enfoque, conocido como regresión logística, es ampliamente utilizado en la investigación clínica. Los inventores reivindican novedad en el establecimiento de los valores apropiados para a y b en este contexto.

La probabilidad (0-100%) de desarrollar PE para cada una de las tres pruebas queda facilitada por
exp [y/(1 + y)] ^{\text{*}} 100%. Este valor puede ser ajustado por la prevalencia de población de PE o por el riesgo de un paciente individual.

El método de comprobación para la predicción de PE comporta la medición simultánea de PAI-1, PAI-2, PIGF y leptina en forma de "equipo". Cada uno de los ensayos se basa corrientemente en una prueba colorimétrica, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente relacionado con una enzima, ELISA, en el que la intensidad de desarrollo de color en un "pocillo" de prueba es proporcional a la concentración de marcador existente. El equipo comporta cuatro pocillos, uno específico para cada marcador y el comprobador (bioquímico del hospital) añade un volumen conocido del plasma de la sangre de la mujer embarazada a cada pocillo. Los colores son evaluados a continuación simultáneamente en un escáner de densidad de color. Estos escáneres se encuentran a disposición, de manera rutinaria, en todos los laboratorios de hospitales. El resultado de cada marcador (obtenido en la impresión del escáner) es registrado en un programa de ordenador especialmente diseñado. Para cada uno de los algoritmos descritos anteriormente, el programa calcula un solo valor. Este valor puede ser comparado a los límites de la gama normal indicada por la siguiente
tabla 4.

Dependiendo de este valor, se evalúa y se determina el tanto por ciento de riesgo (0-100%) para cada mujer.

Tal como se ha indicado anteriormente, es particularmente preferente que el método de la presente invención sea llevado a cabo utilizando un sistema automático de DELFIA®.

Desarrollo del algoritmo

En el diseño de algoritmos para la combinación de los marcadores específicos, el mejor valor fue obtenido utilizando (log_{e}[PlGF])-(3,0 ^{\text{*}} {proporción PAI-1/PAI-2}). A las 24 semanas de gestación, el área debajo de la curva -ROC- era de 0,96(95% CI 0,88 - 1,99). Una prueba perfecta daría un área de 1, mientras que una prueba no mejor que la probabilidad daría un área de 0,5. Esta fórmula funciona bien, asimismo, para muestras comprobadas en semanas anteriores y posteriores de gestación, si bien, para ser de utilidad clínica, cuanto antes se pueda evaluar el riesgo, más útil será la prueba. Las áreas por debajo de la curva para diferentes gestaciones comprobadas se indican a continuación en la tabla 1 y se muestran gráficamente durante 24 semanas de gestación en la figura 1.

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TABLA 1

Gestación	área -ROC-	95% CI
20 semanas	0,81	0,63-0,98
24 semanas	0,96	0,88-1,00
28 semanas	0,91	0,78-1,00
32 semanas	0,96	0,90-1,00
36 semanas	0,99	0,97-1,00

Los inventores han descubierto también que la combinación de PAI-2 y PlGF proporciona una predicción casi igualmente buena de riesgo, utilizando el algoritmo 0,75(log_{e}[PAI-2]) + (log_{e}[PlGF]). Ver tabla 2.

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TABLA 2

Gestación	área debajo curva -ROC-	intervalo confianza 95%
20 semanas	0,80	0,60-1,00
24 semanas	0,88	0,74-1,00
28 semanas	0,91	0,77-1,00
32 semanas	0,94	0,86-1,00
36 semanas	0,97	0,91-1,00

Adicionalmente, los inventores han descubierto que una combinación de la proporción de leptina/PlGF es un buen indicador de predicción de PE (ver tabla 3).

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TABLA 3

Gestación	área debajo curva -ROC-	intervalo confianza 95%
20 semanas	0,78	0,59-0,98
24 semanas	0,87	0,74-1,00
28 semanas	0,80	0,60-1,00
32 semanas	0,96	0,90-1,00
36 semanas	0,90	0,75-1,00

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Un valor adicional de estas pruebas de predicción se encuentra en su insatisfactorio valor de predicción para el desarrollo posterior de retraso de crecimiento. Varios marcadores, particularmente los sintetizados en tejidos de la placenta, son elevados de manera similar en PE y en embarazos asociados con retraso de crecimiento del feto, pero sin complicaciones por PE. Ninguna de las combinaciones de marcadores utilizadas por los inventores era predictiva del retardo de crecimiento, es decir, eran específicas para PE.

Las siguientes tablas muestran valores típicos de los marcadores y proporciones de marcadores iguales a los obtenidos para los algoritmos correspondientes anteriormente indicados.

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TABLA 4 Gamas normales en mujeres sanas con resultados normales del embarazo

Marcador	Media	Gama normal (90% de la gama
		de referencia)
PlGF pg/ml	586	292 a 1177
PAI-1 ng/ml	40,0	25,4 a 63,0
PAI-2 ng/ml	169	78 a 363
PAI-1/PAI-2	0,24	0,10 a 0,55
leptina ng/ml	18,7	8,4 a 42,0
log_{e}PlGF - (3,0x	5,57	4,71 a 6,43
{proporción PAI-1/PAI-2}
leptina/PlGF	0,030	0,013 a 0,069
0,75(logPAI-2) + (logPlGF)	10,20	9,30 a 11,0

TABLA 5 Gamas de PE en mujeres de alto riesgo que desarrollaron PE posteriormente

Marcador	Media	Gama normal (90% de la gama
		de referencia)
PlGF pg/ml	221	54 a 910
PAI-1 ng/ml	39,8	23,5 a 67,5
PAI-2 ng/ml	103,0	49,4 a 214,6
PAI-1/PAI-2	0,387	0,180 a 0,830
leptina ng/ml	30,7	14,9 a 63,2
log_{e}PlGF - (3,0x	4,01	2,36 a 5,67
{proporción PAI-1/PAI-2}
leptina/PlGF	0,124	0,020 a 0,764
0,75(log_{e}PAI-2) +	8,80	7,20 a 10,40
(log_{e}PlGF)

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TABLA 6 Valores para a y b en los algoritmos 1 a 3

Ecuación	a	b
log_{e}PlGF - 3,0x	28,1	-5,65
{proporción PAI-1/PAI-2}
leptina/PlGF	6,56	2,31
0,75(log_{e}PAI-2) +	24,9	2,62
(log_{e}PlGF)

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La variación en la proporción de leptina con respecto a PlGF para controles y para mujeres que posteriormente desarrollaron PE se muestra en la figura 7. La variación en la proporción de PlGF y PAI-1/PAI-2, determinada utilizando el algoritmo log_{e} [PlGF]-3 *(PAI-1/PAI-2) para controles y mujeres que más adelante han desarrollado PE, se muestra en la figura 8. La variación en los niveles de PAI-2 y PlGF determinada utilizando el algoritmo 0,75 (log_{e}[PAI-2])+ log_{e} [PlGF] para controles y mujeres que desarrollaron PE más adelante se muestra en la figura 9.

Ejemplo 2

Métodos

Sujetos. Se reclutaron sujetos con aprobación de un comité ético local del Hospital St.Thomas y Hospital Chelsea y Westminster, Londres, Reino Unido.

Las mujeres de alto riesgo fueron identificadas por PE con exigencia de parto antes de 37 semanas de gestación en el embarazo anterior o por FVW Doppler de arteria uterina anormal(definido como índice de resistencia \geq 95º percentil para gestación o la presencia de una bajada diastólica precoz ("diastolic notch")). El grupo de estudio fue confeccionado a partir de la parte placebo de una prueba clínica al azar de suplementación antioxidante. Se rastrearon 1512 mujeres a las 18-22 semanas y a las 24 semanas de gestación en cuanto a anormalidades del FVW Doppler. Un total de 160 mujeres participaron en la prueba clínica de antioxidantes hasta el parto. De las 81 mujeres de alto riesgo indicadas en el presente estudio procedentes del sector placebo, 60 mujeres entraron en el estudio en base a FVW Doppler anormal y 21 en base a PE en el embarazo anterior. Las 81 mujeres fueron seguidas de forma longitudinal con muestreo de sangre a intervalos de 4 semanas. Se han indicado datos de las mujeres que desarrollaron PE con o sin SGA (PE, n=21) o que tuvieron en el parto niños pequeños para la edad de gestación (SGA, n=17) sin PE. De las mujeres que desarrollaron PE, 6 tenían hipertensión esencial (cinco tomaban metidopa en el momento de reclutarlas) y una tenía síndrome antifosfolípidos. Cinco mujeres tomaban aspirina, no siendo éste criterio de expulsión para la prueba. Se define la pre-eclampsia de gestación por las directrices de la International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy ("Sociedad Internacional para el estudio de la hipertensión en el embarazo")(Am. J. Obstet Gynecol., 158:892-98, 1988), que describe PE como hipertensión de la gestación con PE superpuesta. La hipertensión en la gestación fue definida como dos lecturas de presión de sangre diastólica \geq90 mmHG con separación de \geq4 horas y fuerte hipertensión de gestación en forma de dos lecturas de presión sanguínea diastólica \geq110 mmHg con separación de \geq 4 horas o un registro de presión de sangre diastólica \geq120 mmHg. La proteinuria se definió como \geq300 mg/24 horas o dos lecturas de \geq2+ en el análisis de muestras de orina de flujo medio o de catéter si no había recogida disponible de 24 horas. Los niños SGA fueron definidos como aquellos \leq10 percentil para gestación y género corregido en cuento a altura materna, peso, paridad y etnicidad utilizando gráficos de percentiles (Lancet y otros, 339:283-287, 1992).

Mujeres con bajo riesgo. Todas las mujeres atendidas en la clínica prenatal hospitalaria para cuidados rutinarios durante el periodo de reclutamiento para pruebas que consintieron en el estudio y que después del rastreo mostraron FVW Doppler normal y que no existían otras enfermedades o marcadores de riesgo, fueron invitadas a participar. 33 consintieron y 1 no terminó la realización de estudio, presentándose datos de 27 mujeres que tuvieron en el parto niños de tamaño apropiado para la edad de gestación (AGA). Dado que los niños SGA nacidos de mujeres de bajo riesgo (con FVW Doppler de arteria uterina normal) tienen mayores probabilidades de ser "normalmente" pequeños que de presentar limitaciones en el crecimiento, los embarazos asociados con SGA en este grupo no se incluyeron en el grupo SGA.

Muestras de sangre. Se extrajo sangre venosa de un brazo haciéndolo pasar a tubos con adiciones apropiadas para cada uno de los factores (a los que también se hace referencia como marcadores) ensayados. Las muestras fueron colocadas inmediatamente sobre hielo y sometidas a centrifugación dentro de 3 horas. Los sobrenadantes se almacenaron a -70ºC antes del ensayo.

Análisis de Marcadores Bioquímicos

Índices de situación de antioxidante y tensión oxidante. Se almacenaron muestras para el ensayo de ácido ascórbico y \alpha tocoferol en ácido metafosfórico al 2%. Se determinaron el ácido ascórbico y el ácido úrico por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (HPLC) (Pediatr Res y otros, 36: 487-93, 1994) (ácido ascórbico; límite inferior de detección 5 nM; coeficiente de variación intraensayo (CV)2,2%; CV interensayo 3,5%; ácido úrico; límite inferior de detección 5 nM; CV intraensayo 2,6% CV interensayo 3,8%). Se ensayó el \alpha tocoferol por HPLC de fase inversa (Br.J.Nutr y otros, 63:631-8, 1990) (límite inferior de detección 10 nM; CV intraensayo 2,1%; interensayo 3,9%). Debido a pérdidas de muestras de origen metodológico no se determinó en todas las mujeres el isoprostano 8-epi-PGF_{2} (marcador de peroxidación de lípidos), pero fue evaluado en muestras disponibles procedentes de 21 mujeres de bajo riesgo, 13 SGA y 17 pre-eclámpticas, tal como se ha descrito anteriormente (J. Chromatorgr B. Biomedical Applications., 667: 199-208, 1995), por cromatografía gaseosa-espectrometría de masa. Los estudios anteriores llevados a cabo por el laboratorio del inventor indicaron que estos números proporcionarían un control adecuado para revelar diferencias significativas entre grupos.

Índices de insuficiencia de placenta. Se determinó el inhibidor de activador de plasminógeno (PAI-2) por ensayo ELISA (Tintelize, Biopool International, Suecia; límite inferior de detección 6 ng/ml; CV intraensayo 3,7%; CV
interensayo 3,0%. La leptina del suero fue evaluada por RIA utilizando leptina humana ^{125} etiquetada (LINCO Research, Inc, Missouri, USA; límite inferior de detección 0,5 ng/ml; CV intraensayo 4,5%; CV intrerensayo 4,9%). Se evaluó el PlGF por ensayo ELISA (R&D systems, Abingdon, UK; con límite inferior de detección de 7 pg/ml; CV intraensayo 5,6%-7,0%; CV intrerensayo 10,9%-11,8%).

Índice de función endotelial. El inhibidor-1 de actividor de plasminógeno (PAI-1) fue determinado por ensayo ELISA (Tintelize, Biopool International, Suecia; límite inferior de detección 0,5ng/ml; CV intraensayo 3,3%; CV interensayo 2,9%).

Lípidos. Se midieron los triglicéridos del suero y el colesterol total por pruebas colorimétricas enzimáticas
(UNIMATE 5 TRIG y UNIMATE 5 SCHOL respectivamente, Roche/BCl, Lewes, Sussex, UK). Se determinó el colesterol HDL por aislamiento basado en detergente y detección colorimétrica relacionada con enzima (DIRECT HDL CHOLESTEROL, Randox laboratories, Co Antrim, Irlanda del Norte). Se estimó el colesterol LDL por cálculo a partir de triglicéridos y colesterol HDL. Se evaluaron Apo A-1 y Apo B por inmunoturbidimetria (Dade/Behring, Milton Keynes, UK).

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados en Stata 6,0 (StataCorp, College Station, Texas). Las calificaciones de resumen (media de 2 o más mediciones hechas en las semanas 20-36) fueron conjugadas para cada marcador bioquímico (Matthews y otros, Br Med. J., 300: 230-5, 1990). Se utilizaron transformaciones logarítmicas y medias geométricas para 8-epi-PGF_{20}_{\alpha}, leptina, PAI-1, PAI-2, proporción PAI-1/PAI-2, trigliceridos, proporción vitamina E/colesterol y ácido úrico. Dado que el PAI-1 cambió considerablemente con la gestación, se hizo el equilibrado de la interacción de dos vías entre tiempo y resultados con ecuaciones de estimación generalizada ("GEE").(Biometrika y otros, 73:13-22, 1986) también se utilizó GEE para estimar el impacto de raza (caucásica/europea con respecto a africana/caribeña) y paridad.

Se consideraron marcadores mostrando diferencias significativas (8-epi PGF2\alpha, HDL Colesterol, ácido úrico, proporción PAI-1/PAI-2, leptina y PlGF) como posibles predictores de PE a las 20 y 24 semanas. Se utilizaron áreas derivadas de las curvas de la característica de la operación de receptor (ROC) para evaluar su utilidad. Se utilizó regresión logística múltiple para desarrollar tres índices de predicción combinados(se dispone de detalles bajo demanda). Se calcularon sensibilidad y especificidad para los puntos apropiados de corte. Una curva ROC suavizada (Stata Technical Bulletin, 2000; 52:sg 120) se facilita para el mejor índice.

Se indican diferencias porcentuales de los grupos de referencia con intervalos con 95% de confianza (CI) utilizando errores estándar consistentes (Biometrika y otros, 73: 57-64, 1988). Se reivindica carácter significativo al nivel de 5% cuando el CI no excluye efecto alguno (0% o área ROC 0,5).

Resultados

Se indican en la tabla 7 detalles de entrada del estudio y características perinatales en la tabla 8. Hubo 45% (95% CI 2l a 69%) más mujeres de origen africano o caribeño en el grupo PE que en el grupo de bajo riesgo; no habían otras diferencias significativas.

Perfil longitudinal de los marcadores bioquímicos

Algunas mujeres tuvieron el parto antes de la última muestra (semana 36). Hubieron unas pocas omisiones adicionales debido a fallos en acudir a la clínica y pérdida de muestras por razones metodológicas. Se midieron marcadores bioquímicos distintos a 8-epi-PGF_{2}_{\alpha} (tal como se ha indicado anteriormente) por lo menos en cuatro ocasiones para la mayor parte de las mujeres (66%-84%, media 78% de mujeres, dependiendo del marcador).

Índices de situación de antioxidante y esfuerzo oxidante. Se disminuyeron las concentraciones de ácido ascórbico en el plasma tanto en grupos SGA (-39%; CI-61% a -17%) como en grupos PE (-30%; CI-50% a -11%) en comparación con mujeres de bajo riesgo. Las diferencias entre grupos SGA y PE no eran significativas. Las concentraciones de
\alpha-tocoferol en plasma corregidas en cuanto a colesterol mostraron un pequeño aumento con respecto a la gestación en las mujeres de bajo riesgo, pero no se observaron diferencias significativas entre los grupos. Las calificaciones de resumen para concentraciones de 8-epi-PGF_{2}_{\alpha} en plasma mostraron una tendencia a valores más elevados en el grupo PE (diferencia media 51%; CI-1% a 131%) en comparación con las mujeres de bajo riesgo. También se observó una tendencia menos pronunciada en el grupo SGA (-41%; CI-6% a 114%). Las concentraciones de ácido úrico aumentaron con la gestación en todos los grupos, pero el aumento en el grupo PE fue superior que en las mujeres de bajo riesgo (21%; CI 8% a 36%) o en el grupo SGA (diferencia 19%, CI4% a 37%).

Índices de suficiencia placentaria. En comparación con mujeres de bajo riesgo, la concentración de PAI-2 fue inferior en ambos grupos SGA (-28%; CI-41% a -11%) y PE (-43%; CI-55% a -26%) pero la diferencia entre los últimos grupos no fue significativa (ver figura 2). La concentración de leptina en el suero fue significativamente más elevada en el grupo PE en comparación con SGA (92%; CI 39% a 165%)o grupos de bajo riesgo (74%, CI 21% a 135%) y valores en los grupos de SGA y grupos de bajo riesgo fueron similares (ver figura 3). Estas diferencias siguieron siendo significativas después de corrección por BMl. El PlGF en el grupo de mujeres de bajo riesgo subió y luego disminuyó con la edad de gestación (ver figura 4). Este perfil era menos marcado en el grupo SGA (-35%; CI-57% a -3%) y casi desaparecía en el grupo PE (en comparación con el grupo de bajo riesgo -63%: CI -77% a -40%; en comparación con SGA -42%; CI-67% a +1%).

Índice de función endotelial y proporción de PAI-1/PAI-2. El PAI-1 incrementó con la gestión en todos los grupos. Las concentraciones de plasma eran significativamente más elevadas en PE (13%; CI2% a 25%)en comparación con el grupo de bajo riesgo (ver figura 5). La proporción PAI-1/PAI-2 disminuyó en las mujeres de bajo riesgo en -26% (CI-41% a -8%) a lo largo de la gestación, no mostrando ningún cambio general en el grupo SGA pero con incremento en el grupo PE en 62%(CI 17% a 122%). En comparación con las mujeres del grupo de bajo riesgo la proporción PAI-1/PAI-2 era 45% superior en el grupo SGA (CI 15% a 82%) y 85% superior en los grupos PE (CI 44% a 139%), siendo la diferencia 28% (CI-3% a 70%) (ver figura 6).

Lípidos. Las concentraciones de triglicéridos del suero incrementaron con la gestación siendo más elevadas en el grupo PE (diferencia con respecto a las mujeres de bajo riesgo 29%, CI 2% a 62%). El colesterol HDL en el suero fue 13% inferior en el grupo PE que en las mujeres de bajo riesgo (CI -24% a -2%). No se observaron diferencias entre grupos en colesterol total y LDL, concentraciones apo-A1 o apo-B (datos no mostrados).

Índices bioquímicos y presión sanguínea para predicción de pre-eclampsia

La Tabla 9 muestra áreas ROC para la predicción de la Pe a las 20 y 24 semanas de gestación, utilizando seis marcadores identificados como indicadores de predicción potenciales. A las 20 semanas de gestación, el colesterol HDL, proporción PAI-1/PAI-2, leptina y PlGF eran capaces de distinguir PE de mujeres de bajo riesgo (áreas ROC significativamente > 0,5), y el colesterol HDL y leptina distinguieron PE subsiguiente con respecto a SGA. A las 24 semanas de gestación, la proporción PAI-1/PAI-2, leptina y PlGF dieron valores de ROC > 0,75 (con probabilidad = 0,5 y valor perfecto = 1,00) para el grupo PE en comparación con el grupo de bajo riesgo, y el ácido úrico era marginalmente significativo. La leptina, PlGF y el ácido úrico distinguían entre los grupos PE y SGA. Una serie de análisis de regresión logística condujeron a tres algoritmos con valores de ROC \geq 0,89 para la predicción de PE a las 24 semanas y \geq 0,80 a las 20 semanas (Tabla 9B) en comparación con mujeres de bajo riesgo. Estos algoritmos distinguen también, de manera significativa, la PE del grupo SGA a las 24 semanas de gestación. Un ejemplo de una curva de ROC para uno de estos algoritmos (log_{e}[PlGF])-(3,0*(proporción PAI-1/PAI-2) a las 24 semanas de gestación es la indicada en la figura 1.

La presión sanguínea (arterial media, sistólica y diastólica) en la inscripción y a las 20 semanas era altamente predictiva de subsiguiente PE (por ejemplo, presión arterial media sanguínea de inscripción; área ROC% PE con respecto a LR; 0,79, CI 0,66 a 0,92; BP sistólica 0,78, CI 0,65 a 0,91 y BP diastólica 0,80, CI 0,68 a 0,98), pero estos datos están fuertemente influenciados por seis mujeres con hipertensión previa en el grupo de alto riesgo, un conocido marcador de riesgo para PE.

No había prueba estadística de que alguno de los tres índices principales o cualquier combinación de los mismos estuviera afectado por la paridad, o que los valores para predicción de PE eran distintos entre grupos étnicos. Se definieron para cada indicador dos valores de umbral escogidos para hacer máxima a) sensibilidad y b) especificidad. Se indican en la Tabla 10 valores para las 24 semanas de gestación, en comparación con el grupo de bajo
riesgo.

Comentario

Los datos proporcionados, de acuerdo con los conocimientos de los inventores, proporcionan el estudio longitudinal más completo hasta la fecha, de índices bioquímicos de la enfermedad en la sangre de mujeres destinadas a desarrollar PE. Otras investigaciones longitudinales prospectivas previas se han enfocado en la evaluación de marcadores bioquímicos únicos, frecuentemente en un número menor de sujetos, y no han comparado los perfiles en PE con mujeres que en el parto tuvieron niños pequeños para la edad de gestación, pero que no desarrollaron PE. Los datos presentes, en la documentación de diferencias sustantivas entre perfiles de los marcadores en embarazos pre-eclámpticos y los de partos SGA no complicados por la enfermedad, han proporcionado datos interesantes en la etiología del estado clínico. Además, las combinaciones de marcadores identificados, utilizan la predicción de PE. Una prueba que distingue la PE subsiguiente de embarazos, caracterizados por limitación del crecimiento fetal, sólo es útil clínicamente, especialmente como coadyuvante a análisis FVW Doppler. Esta discriminación precoz en el embarazo pondría en aviso al especialista de obstetricia y a la mujer embarazada para aumentar el control de los síntomas de PE y permitir la intervención para la prevención de PE, en caso de que se dispusiera de una intervención clínicamente comprobada disponible, por ejemplo, suplemento de vitamina C y de vitamina E o
calcio.

Si bien los inventores reconocen que existen limitaciones en la utilización del percentil del peso en el nacimiento como marcador subrogado de limitación de crecimiento fetal, se observaron importantes diferencias tanto del grupo de bajo riesgo como del grupo PE en el grupo SGA, y estos han proporcionado una valiosa interpretación mecanicista. La mayor parte de mujeres de alto riesgo fueron reclutadas en base al FVW Doppler anormal, indicativo de invasión fracasada de trofoblastos y elevada resistencia úteroplacental. La concentraciones en plasma de ácido ascórbico en controles sanos fueron estables a lo largo de la gestación. Como comparación, las concentraciones maternas de ácido ascórbico eran significativamente bajas en ambos grupos SGA y PE en todo el embarazo. Esto coincidiría con la hipótesis de que una reducida perfusión úteroplacental predispone a un incremento en la síntesis de radicales libres en la placenta y, por lo tanto, a tensiones oxidantes maternas. Sin conocimiento de la dieta diaria, no se puede eliminar una contribución de un contenido bajo de vitamina C en la dieta, si bien la tasa incrementada de consumo de ascorbato, documentado en el plasma de mujeres con PE, indicaría que la explicación más probable es el consumo metabólico excesivo de vitamina C. La tendencia a concentraciones elevadas del isoprostano 8-epi-PGF_{2}_{\alpha} en el grupo PE (p=0,055), a pesar de una considerable dispersión de los datos, indica tensión oxidante. El 8-epi-PGF_{2}_{\alpha}, un marcador de peroxidación de lípido, se encuentra presente en la placenta pre-eclámptica y se ha indicado de forma variable con incrementos (Clin. Sci y otros, 91: 711-18, 1996) o en valores normales (Br. J. Obstet. Gynaecol y otros, 105: 1195-99, 1998) en el plasma materno en mujeres afectadas. Otras evidencias de las tensiones oxidantes se encuentran en el incremento precoz en el grupo PE, pero no el grupo SGA del ácido úrico, un producto de la ruta xantina/xantina oxidasa. La secreción renal reducida de ácido úrico puede conducir también a una elevada concentración en plasma en casos de PE ya establecido, pero es improbable que explique el aumento observado antes de la manifestación clínica de la
enfermedad.

Dado que las concentraciones de ácido ascórbico eran bajas en ambos grupos PE y SGA, se podría cuestionar un papel específico para la tensión oxidante en el origen de PE. No obstante, Hubel y otros, páginas 453-486, 1999, han sugerido que las mujeres que desarrollan PE pueden tener mayores probabilidades de sintetizar peróxidos de lípidos perjudiciales, es decir, desarrollar una respuesta exagerada a la carga oxidante, en teoría soportada por la tendencia mucho más elevada hacia valores más elevados de 8-epi-PGF_{2}_{\alpha} en el grupo PE. Esto puede proceder de la dislipidemia maternal bien caracterizada en PE, incluyendo hipertrigliceridaemia (Hubel y otros, páginas 453-486, 1999) (que tuvo lugar de manera precoz a las 20 semanas de gestación en este estudio), concentraciones de ácidos grasos libres incrementadas y dimensiones de partículas LDL disminuidas que conjuntamente pueden contribuir a la formación de peróxidos de lípidos perjudiciales y a la subsiguiente activación de las células endoteliales. Otros marcadores de riesgo, incluyendo diabetes e hipertensión esencial, con disfunción microvascular asociada, pueden tener también influencia en la respuesta circulatoria a una carga pro-oxidante.

El perfil de lípidos de este estudio mostró un aumento específico en la concentración de triglicéridos en el suero en las mujeres que desarrollaron PE. El aumento de triglicéridos ha sido descrito anteriormente a las 10 semanas de gestación en mujeres que posteriormente han desarrollado PE del estudio de los inventores (Hubel y otros, páginas 453-486, 1999); confirma una elevación precoz y puede sugerir que los triglicéridos juegan un importante papel patofisiológico. Otros estudios anteriores han documentado una disminución en colesterol HDL en mujeres con PE ya establecido (Hubel y otros, páginas 453-486, 1999); en el presente estudio el HDL ha sido reducido selectivamente en mujeres que han desarrollado más tarde la enfermedad, implicando nuevamente dislipidemia en el proceso de la enfermedad. No ha habido diferencia en las concentraciones de colesterol LDL, pero se ha reconocido que en PE se alteran más bien las características en vez de las concentraciones absolutas de los
LDL.

Las concentraciones anormales de leptina es probable que reflejen insuficiencia placentaria. El incremento sustancial de concentraciones de leptina en la sangre materna en un embarazo normal se atribuye, de manera general, a síntesis de la placenta, dado que la leptina es sintetizada en la placenta (Ashworth y otros, 5: 18-24, 2000), si bien la síntesis de la leptina por adipocitos maternos es probable que contribuya. Otros estudios previos han indicado un incremento adicional de las concentraciones de leptina en el suero en mujeres con PE, reflejando posiblemente la hipoxia de placenta (Mise y otros, J. Clin. Endocrinol. Metab., 83: 3225-29, 1998). La elevación selectiva precoz de concentraciones de leptina en este estudio, en las mujeres que más tarde desarrollaron PE, puede indicar un papel como indicador de pronóstico. El aumento precoz de la leptina en mujeres destinadas de desarrollar PE ha sido descrito recientemente (Anim-Nyame y otros, Hum. Reprod., 15: 2003-6, 2000), si bien no se investigaron otros grupos de alto riesgo. De interés adicional en el presente estudio fue el descubrimiento que la leptina de suero no era distinta en las mujeres embarazadas sanas a la de las que tuvieron niños SGA. La corrección por BMI (índice de masa corporal) no alteró las diferencias observadas. Si la elevación de la leptina en mujeres que desarrollaron PE resulta de la hipoxia, entonces esto se debe suponer que es menos pronunciado en el grupo SGA. De manera alternativa, la síntesis de la leptina es estimulada por citoquinas, lo que se reconoce que contribuye al estado inflamatorio asociado con PE. Un incremento en la concentración de leptina en el suero puede contribuir también a una respuesta inflamatoria y disfunción vascular, dado que el propio péptido tiene características pro-inflamatorias.

Mientras la leptina fue incrementada de manera selectiva, otro marcador de insuficiencia placentaria, el PlGF fue reducido sustancialmente y selectivamente en mujeres que más tarde desarrollaron PE, haciendo prometedor este marcador angiogénico como indicador de predicción potencial. Esto está de acuerdo con otros estudios cruzados anteriores, que indican que las concentraciones bajas de PlGF en plasma son características de PE (Torry y otros, Am. J. Obstet. Gynecol., 179: 1539, 1998) y el estudio de los inventores confirma un informe reciente de Tidwell y otros, Am. J. Obstet. Gynecol., 184: 1267-1272, 2001, que ha demostrado una disminución precoz del PlGF en el plasma de mujeres que desarrollaron posteriormente PE. Otro informe (Livingston y otros, Am. J. Obstet. Gynecol., 184: 1218-1220, 2001) en el que se tomaron las muestras dos veces, una vez a las 20 semanas y después del diagnóstico de PE ha demostrado que no existía diferencia en PlGF a las 20 semanas de gestación. En el estudio de los inventores, las concentraciones de PlGF estabilizadas ("blunted"), si bien eran notablemente más anormales a las 24 semanas de gestación, se redujeron de manera modesta, pero significativa a las 20 semanas de gestación. En contraste con la leptina, una tensión de oxígeno reducida regula en descenso el PlGF (Ahmed y otros, Placenta., 21: S16-24, 2000) y puede proporcionar una explicación del fallo del incremento normal. Las consecuencias de un PlGF reducido pueden ser varias, conduciendo potencialmente a una reducida proliferación de trofoblastos, reducida protección contra apoptosis y evolución vascular
comprometida.

La concentración materna de PAI-2, sintetizada también en los trofoblastos de la placenta, era menos selectiva en la discriminación de embarazos pre-eclámpticos, siendo reducida en ambos grupos PE y SGA, tal como se ha indicado con anterioridad (Lindoff y otros, Am. J. Obstet. Gynecol., 171: 60-64, 1994). El PAI-1, único marcador endotelial estudiado, era elevado, particularmente hacia el final del embarazo en el grupo pre-eclámptico. Al disminuir PAI-2 y aumentar PAI-1, tal como se ha indicado anteriormente para PE ya establecida (Halligan y otros, Br. J. Obstet. Gynaecol., 101: 488-92, 1994), la proporción PAI-1/PAI-2 aumenta (Reith y otros, Br. J. Obstet. Gynaecol., 100: 370-74, 1993). Los inventores informan a este respecto que una proporción anormalmente elevada de PAI-1/PAI-2 es previa también al inicio de PE.

El estudio ofreció la oportunidad única de evaluar el valor potencial de diferentes combinaciones de marcadores en la discriminación y predicción de embarazos pre-eclámpticos. Ningún estudio previo ha evaluado simultáneamente una amplia gama de índices bioquímicos relevantes. Individualmente, seis de los marcadores mostraran significación para la predicción de PE a las 20 semanas de gestación y la leptina en el suero y el colesterol HDL mostraron buena discriminación entre grupos pre-eclámpticos y SGA. El PlGF mostró la mayor discriminación a las 24 semanas. Tres combinaciones específicas de los marcadores estudiados mostraron que pueden ser utilizados para la predicción de PE; una combinación de PlGF y la proporción PAI-1: PAI-2, una combinación de PAI-2 y PlGF y la combinación de la proporción combinación leptina: PlGF. Medidas a las 24 semanas, estas combinaciones predijeron el desarrollo posterior de PE con potencial para alta especificidad si se utilizaba como prueba de rastreo y alta sensibilidad si se utilizaba en mujeres de alto riesgo. La predicción a las 20 semanas fue casi igual de elevada. Estos datos se comparan favorablemente con valores para otras pruebas de rastreo potencial para PE
(Friedman SA y otros, y Lindheimer MD. Prediction and Differential Diagnosis in Chesley’s Hypertensive Disorders in Pregnancy. Ed: Lindheimer MD, Roberts JM. Cunningham G. Appleton & Lang, Connecticut, USA. pp 201-227, 1999). Se identificó la presión sanguínea como elemento importante de predicción en este estudio, pero la capacidad de predicción fue incrementada por la inclusión de mujeres con hipertensión crónica, factor de riesgo conocido
para PE.

Todas las mujeres de bajo riesgo que se brindaron como voluntarias para el estudio durante el curso de la prueba clínica formaron el grupo de control; esto tenía la ventaja de que las muestras de los otros tres grupos fueron tratadas de manera similar y almacenadas durante un período idéntico, pero condujo a una diferencia significativa en la etnicidad entre grupos pre-eclámpticos y grupos de bajo riesgo. Los inventores no son conscientes de pruebas en la literatura científica que sugieran ninguna variación étnica en los marcadores de esfuerzo oxidante, función placentaria o endotelial estudiada, si bien la mayor parte de estudios no consideran la etnicidad. Tampoco han habido pruebas desde el punto de vista de análisis estadístico realizado en este estudio que sugieran que la etnicidad contribuyera acualquiera de las diferencias observadas.

Como conclusión, los datos muestran tendencias gestacionales en una amplia gama de marcadores asociados con PE. Las investigaciones de los inventores han demostrado cambios precoces y selectivos en marcadores de esfuerzo oxidante, lípidos y algunos marcadores de disfunción placentaria sugiriendo que éstos pueden jugar un papel en la etiología de la enfermedad. Dado que los perfiles anormales eran evidentes varias semanas antes del inicio clínico de PE, los inventores fueron capaces de identificar combinaciones de marcadores que tienen el potencial de identificar mujeres que más tarde desarrollarán PE.

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TABLA 7 Características de la línea base en mujeres de riesgo bajo y alto, según los resultados clínicos. Las mujeres de bajo riesgo con partos apropiados para la edad de gestación (AGA), mujeres del grupo de alto riesgo con partos SGA (niños pequeños para la edad de gestación) y mujeres de alto riesgo que desarrollaron pre-eclampsia (PE)

	Bajo riesgo	Alto riesgo	Alto riesgo
	AGA	SGA	PE
N	27	17	21
Edad Media (años)	31,9	30,8	29,9
(IQR)	(30,6-34,1)	(23,8-33,4)	(27,5-34,9)
Fumadores	0	3(17%)	1(5%)
Índice de masa corporal media	23,0	22,9	27,0
(kg/m^{2}) (IQR)	(21,9-24,9)	(21,5-25,8)	(23,5-32,5)
Paridad \geq1	6 (22%)	6 (33%)	15 (71%)
Análisis de la forma de onda
Doppler a las 24 semanas
Índice de resistencia	0,47	0,63	0,72
medio (IQR)	(0,44-0,55)	(0,61-0,69)	(0,62-0,79)
En talla unilateral	0	5(28%)	3(14%)
En talla bilateral	0	13(72%)	18(86%)

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TABLA 8

Características perinatales en mujeres de bajo y alto riesgo de acuerdo con los resultados clínicos. Las mujeres de bajo riesgo con partos con niños apropiados para la edad de gestación (AGA), mujeres de alto riesgo que tuvieron partos de niños SGA (pequeño para edad de gestación) y mujeres de alto riesgo que desarrollaron pre-eclampsia (PE)

	Bajo riesgo AGA	Alto riesgo SGA	Alto riesgo PE
N	27	17	21
Presión sanguínea sistólica media;	121	125	150
máxima antes del parto (mmHg) (IQR)	(120-130)	(120-133)	(150-184)
Presión sanguínea diastólica media;	80	77	106
máxima antes del parto (mmHg) (IQR)	(70-82)	(70-86)	(100-118)
Excreción de proteína en la orina	0	0	855
máxima media (mg/24 hr) (IQR)			(580-3010)
Edad de gestación media en el parto	40,3	39,7	37,1
(semanas) (IQR)	(39,1-41,2)	(38,3-40,6)	(34,4-38,6)
Peso medio en el nacimiento (gramos)	3480	2700	2500
(IQR)	(3340-3770)	(2353-3015)	(2070-2940)
Peso medio en el nacimiento (percentil)	57	5	8
(IQR)	(30-82)	(1-7)	(2-24)
Niños pequeños para la edad de gestación	0	17 (100%)	11 (52%)

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TABLA 9a

Predicción de PE utilizando índices bioquímicos en sangre materna a las 20 y 24 semanas de gestación. Se indican áreas ROC (con intervalos de confianza de 95%). La comparación se realiza con mujeres de bajo riesgo con resultado normal (LR) y mujeres de alto riesgo que tuvieron en el parto niños pequeños para la edad de gestación (SGA). Si los intervalos de confianza no incluyen 0,5, la diferencia es significativa

	gestación 20 semanas	gestación 24 semanas
Índice bioquímico	PE vs. LR	PE vs SGA	PE vs. LR	PE vs SGA
8-epi-PGF_{2}_{\alpha}	0,62	0,53	0,55	0,37
	(0,44,0,81)	(0,29,0,76)	(0,35,0,75)	(0,13,0,61)
Colesterol-HDL	0,73	0,75	0,61	0,64
	(0,57,0,89)	(0,57,0,93)	(0,41,0,82)	(0,40,0,87)
Ácido úrico	0,57	0,68	0,67	0,70
	(0,38,0,76)	(0,48,0,87)	(0,50,0,85)	(0,52,0,89)
Proporción PAI-1/ PAI-2	0,70	0,57	0,76	0,62
	(0,52,0,87)	(0,36,0,78)	(0,59,0,92)	(0,42,0,83)
Leptina	0,71	0,82	0,77	0,88
	(0,55,0,88)	(0,67,0,97)	(0,62,0,92)	(0,76,1,00)
Factor de crecimiento	0,72	0,60	0,85	0,73
de la placenta	(0,54,0,91)	(0,39,0,80)	(0,71,0,99)	(0,54,0,92)

TABLA 9b Muestra la comparación cuando se evalúa el riesgo de PE utilizando combinaciones de índices bioquímicos

	gestación 20 semanas	gestación 24 semanas
Combinación de índices	PE vs. LR	PE vs SGA	PE vs. LR	PE vs SGA
Log_{e}PlGF-3,0	0,81	0,61	0,95	0,76
{proporción PAI-1/PAI-2}	(0,65,0,97)	(0,39,0,83)	(0,87,1,00)	(0,57,0,96)
PAI-2 * PlGF	0,80	0,76	0,89	0,83
	(0,63,0,97)	(0,58,0,94)	(0,78,1,00)	(0,68,0,99)
Leptina/PlGF	0,80	0,76	0,89	0,83
	(0,63,0,97)	(0,58,0,94)	(0,78,1,00)	(0,68,0,99)

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TABLA 10 Sensibilidad y especificidad (Intervalos de confianza 95%) para dos valores de umbral calculadas a partir de tres fórmulas identificadas para predicción de PE

Fórmula	Valores de umbral	Sensibilidad	Especificidad
loge[PlGF]-3,0	<4,5	53%	100%
{proporción PAI-1/PAI-2}		(27%,79%)	(79%,100%)
	<5	80%	88%
		(52%,96%)	(62%,98%)
PAI-2 *PlGF	<35*10^{3}	67%	100%
		(38%,88%)	(79%,100%)
	<50*10^{3}	80%	94%
		(52%,96%)	(70%,100%)
proporción leptina/PlGF	>0,1	67%	100%
		(38%,88%)	(80%,100%)
	>0,05	80%	88%
		(52%,96%)	(64%,99%)

Claims (14)

1. Método para la predicción específica de pre-eclampsia (PE) que comprende la determinación en una muestra materna del nivel del factor de crecimiento de placenta (PlGF) y el nivel, como mínimo, de uno de los siguientes:

(i)

inhibidor-2 (PAI-2) del activador de plasminógeno;

(ii)

proporción de inhibidor-1 (PAI-1) del activador de plasminógeno con respecto al inhibidor-2 (PAI-2) del activador de plasminógeno; y

(iii)

leptina.

2. Método, según la reivindicación 1, que comprende la determinación del nivel del factor de crecimiento de placenta (PlGF) y del nivel de inhibidor-2 (PAI-2) de activador de plasminógeno, en el que se realiza la predicción positiva por los niveles combinados de PlGF y PAI-2 con valores menores que el nivel normal.

3. Método, según la reivindicación 1, que comprende la determinación del nivel de PlGF y de la proporción de PAI-1/PAI-2, en el que se consigue una predicción positiva por la combinación de un nivel reducido de PlGF en comparación con el nivel normal, y siendo la proporción de PAI-1 con respecto a PAI-2 superior a la normal.

4. Método, según la reivindicación 1, que comprende la determinación de la proporción de leptina respecto a PlGF, en la que se consigue una predicción positiva con una proporción de leptina respecto a PlGF superior a la normal.

5. Método, según la reivindicación 2, en el que el nivel de los marcadores PlGF y PAI-2 se combina utilizando el algoritmo:

d(log_{e}[PAI-2])+(log_{e}[PlGF])

en el que d es una constante dentro de una gama de valores aproximada de 0,03 a 48,6.

6. Método, según la reivindicación 2, en el que el nivel de los marcadores PlGF y PAI-2 es combinado utilizando el algoritmo:

[PAI-2]^{d \text{*}}[PlGF]

en el que d es una constante en una gama de valores aproximada de 0,03 a 48,6.

7. Método, según la reivindicación 2, en el que el nivel de los marcadores PlGF y PAI-2 es combinado utilizando el algoritmo [PAI-2]^{\text{*}}[PlGF].

8. Método, según la reivindicación 3, en el que el nivel del marcador PlGF y la proporción de PAI-1/PAI-2 se combinan utilizando el algoritmo:

(Log_{e}[PlGF]) - (g\text{*}\{proporción \ PAI-1/PAI-2\})

en el que g es una constante en una gama aproximada de -19,4 a 3,6.

9. Método, según la reivindicación 8, en el que g es 3,0.

10. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra maternal está constituida por sangre.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra maternal es extraída entre 12 y 38 semanas.

12. Método, según la reivindicación 11, en el que la muestra maternal es extraída entre 20 y 36 semanas.

13. Equipo de diagnóstico para llevar a cabo el método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el equipo comprende reactivos requeridos para determinar el nivel de los marcadores objeto de medición.

14. Equipo de diagnóstico, según la reivindicación 13, en el que los reactivos son reactivos de inmunoensayo relacionados con enzimas.