KR20180029046A - 조산 예측용 바이오마커 쌍 - Google Patents

조산 예측용 바이오마커 쌍 Download PDF

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트레이시 플레이셔
앤드류 개스만
제프 플릭
채드 브래드포드
아쇼카 폴피티야
듀린 에드워드 히콕
폴 커니
그레고리 찰스 크리치필드
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세라 프로그노스틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 제시하며, 상기 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전값에서의 변화를 나타낸다. 또한, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 적어도 1 쌍에 대한 반전값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다.

Description

조산 예측용 바이오마커 쌍
본 발명은 2016년 2월 3일에 출원된 미국 가특허출원 제62/290,796호, 2015년 12월 24일에 출원된 미국 가특허출원 제62/387,420호, 및 2015년 6월 19일에 출원된 미국 가특허출원 제62/182,349호의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 발명은 일반적으로 정밀 의학 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는 임산부의 조산(preterm birth) 가능성을 결정하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
세계 보건 기구에 따르면, 1500만명으로 추산되는 아기가 매년 조산(임신 37주 완료 전)으로 출생한다. 믿을 만한 데이터가 있는 거의 모든 국가에서, 조산율(preterm birth rate)은 증가하고 있다. 세계 보건 기구; March of Dimes; The Partnership for Maternal, Newborn & Child Health; Save the Children, Born too soon: the global action report on preterm birth, ISBN 9789241503433(2012)을 참조하라. 100만명으로 추산되는 아기가 매년 조산 합병증으로 사망한다. 세계적으로, 조산은 신생아(생후 첫 4주 이내의 아기) 사망의 주요 원인이고, 5세 미만 아동에서 폐렴 다음의 두 번째 주요 사망 원인이다. 많은 생존자가 학습 장애 및 시각 및 청각 문제를 포함하여, 평생 장애에 맞닥뜨린다.
믿을 만한 데이터가 있는 184개 국가에 걸쳐서, 조산의 비율은 태어난 아기의 5% 내지 18% 범위이다. Blencowe et al., "National, regional and worldwide estimates of preterm birth." The Lancet, 9; 379(9832):2162-72 (2012). 조산의 60% 이상이 아프리카 및 남아시아에서 발생하고 있기는 하지만, 그럼에도 불구하고 조산은 세계적인 문제이다. 높은 수치를 나타내는 국가에는 브라질, 인도, 나이지리아 및 미국이 포함된다. 15% 이상의 조산율을 나타내는 11개 국가 중, 2개국을 제외한 모두가 사하라 사막 이남의 아프리카(sub-Saharan Africa)에 있다. 고소득 국가에서는 9%인 데에 비해, 최빈국에서는 평균적으로 12%의 아기가 너무 조산된다. 특정 국가 내에서도, 가난한 가정은 더 높은 위험에 있다. 조산아(premature baby)의 4분의 3 이상이, 실현 가능하고 비용-효율적인 관리(care), 예를 들어 조기 진통(preterm labor)의 위험이 있는 임산부에게 주어져 아기의 폐를 강화시키는 산전 스테로이드 주사를 이용하여 구제될 수 있다.
조산으로 출생한 영아는 만기에 출생한 영아에 비해 사망률(mortality) 및 다양한 건강 및 발달 문제에 대하여 더 큰 위험에 처해 있다. 합병증은 급성 호흡기, 위장, 면역, 중추신경계, 청각, 및 시각 문제뿐 아니라 장기 운동신경, 인지, 시각, 청각, 행동, 사회정서적, 건강, 및 성장 문제를 포함한다. 조산아의 출산은 또한 가정에 상당한 감정적 및 경제적 비용을 초래할 수 있으며, 공공 부문 서비스, 예컨대 건강 보험, 교육, 및 다른 사회적 지지 시스템에 대한 영향을 끼칠 수 있다. 가장 이른 재태 기간(gestational age)에 출생한 영아에게 사망률 및 질병률(morbidity)의 가장 큰 위험이 있다. 그러나, 만기에 근접하여 출생한 영아가 조산으로 출생한 영아의 최다수를 나타내며, 만기에 출생한 영아에 비해 더 많은 합병증을 겪는다.
초음파에서 자궁경부 개방을 보이는 임신 24주 미만인 여성에서의 조산을 예방하기 위해, 자궁경부를 강한 봉합사로 꿰메는 자궁경부 원형결찰(cervical cerclage)로 알려진 수술 절차가 이용될 수 있다. 임신 34주 미만이고 활성 조기 진통 중인 여성에 대해, 조기 진통을 일시적으로 중단시키고/시키거나 태아 폐 발달을 촉진시키기 위해 약제의 투여뿐만 아니라 입원이 필요할 수 있다. 임산부가 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 경우, 의료인(health care provider)은 예방적 약물, 예를 들어 17-α 하이드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate)(Makena) 주사 및/또는 질 프로게스테론 겔, 자궁경부 페서리(pessary), 성활동 및/또는 다른 신체적 활동에 대한 제한, 및 조기 진통의 위험을 증가시키는 만성 병태, 예컨대 당뇨병 및 고혈압에 대한 치료의 변경을 포함하는 다양한 임상 전략을 시행할 수 있다.
조산의 위험이 있는 여성을 식별하고 적절한 산전 관리를 제공할 큰 필요성이 있다. 고위험으로 식별된 여성에게는 더 강한 산전 감시 및 예방적 개입을 대비해야 한다. 위험 평가를 위한 현재 전략은 조산 이력 및 병력 및 임상 시험을 기본으로 하나, 이들 방법은 낮은 퍼센트(percentage)의 조기 분만(preterm delivery) 위험이 있는 여성을 식별할 수 있을 뿐이다. 자연 조산(spontaneous PTB)(sPTB)의 이전 이력은 현재 후속 PTB의 가장 강력한 예측변수이다. 1회 사전 sPTB 이후에, 2차 PTB의 가능성은 30-50%이다. 다른 산모 위험 인자에는 흑인종, 낮은 산모 체질량 지수(body-mass index), 및 짧은 자궁경부 길이가 있다. sPTB를 예측하기 위한 양수, 자궁경질 체액(cervicovaginal fluid), 및 혈청 바이오마커(biomarker) 연구는 궁극적으로 조기에 분만하는 여성에서 다중 분자 경로가 비정상적이라는 것을 제시한다. 조산 위험을 조기에 식별할 수 있다면 조기 분만을 예방하기 위한 적절한 모니터링 및 임상 관리를 계획할 수 있게 할 것이다. 상기 모니터링 및 관리는 더욱 빈번한 산전 관리 방문, 연속적 자궁경부 길이 측정, 이른 조기 진통의 징후 및 증상에 관한 교육 강화, 금연과 같은 변경 가능한 위험 행동에 대한 생활방식 개입, 자궁경부 페서리 및 프로게스테론 치료를 포함할 수 있다. 최종적으로, 조산 위험의 믿을 만한 산전 식별이 또한 모니터링 자원을 효율적으로 할당하기 위해 중요하다.
위험이 있는 여성을 식별하기 위한 집중적인 연구에도 불구하고, 임상 및 인구통계적 인자에만 기초하거나 또는 측정된 혈청 또는 질 바이오마커를 사용하는 PTB 예측 알고리즘은 임상적으로 유용한 검사가 되지 못하였다. 첫번째 임신 동안 및 임신중 충분히 조기에 위험이 있는 여성을 식별하기 위한 보다 정확한 방법이 임상 개입을 하기 위해 필요하다. 본 발명은 임산부가 조산의 위험이 있는지 여부를 결정하는 조성물 및 방법을 제시함으로써 이러한 필요성을 해결한다. 관련 이점이 또한 제시된다.
본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 예측하는 조성물 및 방법을 제시한다.
본 발명은 표 26에 개시된 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커를 제시한다. 본 발명의 바이오마커는 임산부에서의 조산 위험을 예측할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 바이오마커는 IBP4, SHBG, PSG3, LYAMI, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CDI4, 및 APOC3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 표 26에 개시된 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커의 대용 펩티드(surrogate peptide)를 제시한다. 일부 실시양태에서, 단리된 바이오마커의 대용 펩티드는 표 26에 개시된 대용 펩티드의 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 바이오마커 및 이의 대용 펩티드는 임산부에서의 조산 위험을 예측하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대용 펩티드는 IBP4, SHBG, PSG3, LYAMI, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CDI4, 및 APOC3로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커에 대응한다.
본 발명은 표 26에 개시된 그룹으로부터 선택되는 대용 펩티드에 대응하는 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(stable isotope labeled standard peptide)(SIS 펩티드)를 제시한다. 본 발명의 바이오마커, 이의 대용 펩티드 및 SIS 펩티드는 임산부에서의 조산 위험을 예측하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, SIS 펩티드는 IBP4, SHBG, PSG3, LYAMI, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CDI4, 및 APOC3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커의 대용 펩티드에 대응한다.
본 발명은 표 26에 열거된 단리된 바이오마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 제시하며, 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군(term control) 사이의 비(ratio) 값에서의 변화를 나타낸다.
본 발명은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 제시하며, 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 비 값에서의 변화를 나타낸다.
본 발명은 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 제시하며, 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 비 값에서의 변화를 나타낸다.
일 실시양태에서, 본 발명은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 제시하며, 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값(reversal value)에서의 변화를 나타낸다.
일 실시양태에서, 본 발명은 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 제시하며, 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다.
일 실시양태에서, 본 발명은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하는 대용 펩티드 쌍을 포함하는 조성물을 제시하며, 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 조성물은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하는 대용 펩티드 쌍을 포함하는 조성물을 제시하며, 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 조성물은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 바이오마커 쌍 IBP4/SHBG를 제시하며, 바이오마커 쌍은 만기 대조군에 비해 조산 위험이 있는 임산부 사이에서 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 단리된 바이오마커 쌍 IBP4/SHBG를 제시하며, 바이오마커 쌍은 만기 대조군에 비해 조산 위험이 있는 임산부에서 더 높은 비를 나타낸다.
일 실시양태에서, 본 발명은 바이오마커 쌍 IBP4/SHBG에 대응하는 대용 펩티드 쌍을 포함하는 조성물을 제시하며, 바이오마커 쌍은 만기 대조군에 비해 조산 위험이 있는 임산부에서 더 높은 비를 나타낸다. 일 실시양태에서, 조성물은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널(panel)을 제시하며, 각각의 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 패널은 상기 바이오마커 각각으로부터 유래된 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널을 제시하며, 각각의 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 패널은 상기 바이오마커 각각으로부터 유래된 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2 쌍의 대용 펩티드의 패널을 제시하며, 각각의 대용 펩티드 쌍은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하고, 각각의 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 패널은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2 쌍의 대용 펩티드의 패널을 제시하며, 각각의 대용 펩티드 쌍은 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하고, 각각의 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 패널은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2 쌍의 대용 펩티드의 패널을 제시하며, 각각의 대용 펩티드 쌍은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하고, 적어도 1 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 조성물은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2 쌍의 대용 펩티드의 패널을 제시하며, 각각의 대용 펩티드 쌍은 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하고, 적어도 1 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 조성물은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2 쌍의 대용 펩티드의 패널을 제시하며, 각각의 대용 펩티드 쌍은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하고, 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널로부터 유래된, 계산된 스코어(score)는 임산부와 만기 대조군 사이의 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 조성물은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2 쌍의 대용 펩티드의 패널을 제시하며, 각각의 대용 펩티드 쌍은 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하고, 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널로부터 유래된, 계산된 스코어는 임산부와 만기 대조군 사이의 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 조성물은 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 적어도 1 쌍에 대한 비를 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임산부는 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 적어도 1 쌍에 대한 비를 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임산부는 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 수득하는 초기 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 각각의 바이오마커의 SIS 대용 펩티드를 검출, 측정 또는 정량화하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계는 출산시 재태 기간(gestational age at birth)이 알려진 조산 임신 및 만기 임신의 코호트(cohort)에서의 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커의 비를 측정함으로써 가능성/위험 지수의 형성을 포함하는 초기 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 조산 위험 지수는 출산시 재태 기간이 기록된 조산 및 만기 임신의 코호트에서 IBP4/SHBG의 비를 측정함으로써 형성된다. 일부 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계는 IBP4/SHBG의 비를 측정하는 단계 및 지수 그룹에서와 같은 IBP4/SHBG를 유도하기 위한 동일한 단리 및 측정 기술을 사용하여 조산 위험을 유도하기 위해 상기 값을 지수와 비교하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 적어도 1 쌍에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임산부는 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 수득하는 초기 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 각각의 바이오마커의 SIS 대용 펩티드를 검출, 측정 또는 정량화하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 적어도 1 쌍에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임산부는 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 수득하는 초기 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 각각의 바이오마커의 SIS 대용 펩티드를 검출, 측정 또는 정량화하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널에 대한 반전 값에서의 변화를 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널에 대한 반전 값에서의 변화를 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반전 값은 임산부와 만기 대조군 사이의 개별 바이오마커의 상대적 강도에서의 변화의 존재를 나타내며, 임산부에서의 조산 가능성을 나타낸다. 추가 실시양태에서, 측정 단계는 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 대용 펩티드를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임산부는 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 수득하는 초기 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 각각의 바이오마커의 SIS 대용 펩티드를 검출, 측정 또는 정량화하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4 및 SHBG로 이루어진 바이오마커 쌍에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임산부는 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 수득하는 초기 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 각각의 바이오마커의 SIS 대용 펩티드를 검출, 측정 또는 정량화하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 SHBG에 대한 IBP4의 비(IBP4/SHBG)로 이루어진 바이오마커 쌍에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함하고, 만기 대조군에 비해 임산부에서의 더 높은 비가 조산에 대한 증가된 위험을 나타낸다. 추가 실시양태에서, 임산부는 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 수득하는 초기 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 각각의 바이오마커의 SIS 대용 펩티드를 검출, 측정 또는 정량화하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커 쌍 IBP4 및 SHBG에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임산부는 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 수득하는 초기 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 각각의 바이오마커의 SIS 대용 펩티드를 검출, 측정 또는 정량화하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 임산부에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b. 생물학적 샘플을 상기 쌍의 제1 멤버와 특이적으로 결합하는 제1 포획제 및 상기 쌍의 제2 멤버와 특이적으로 결합하는 제2 포획제와 접촉시킴으로써, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및 상기 쌍의 제1 바이오마커와 제1 포획제 사이 및 상기 쌍의 제2 멤버와 제2 포획제 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서 IBP4 및 SHBG를 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b. 생물학적 샘플을 IBP4에 특이적으로 결합하는 포획제 및 SHBG에 특이적으로 결합하는 포획제와 접촉시킴으로써, IBP4 및 SHBG가 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및 c. IBP4와 포획제 사이 및 SHBG와 포획제 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 바이오마커 쌍에 대한 반전 값을 측정하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화의 존재는 임산부에서의 조산 가능성을 나타낸다. 일 실시양태에서, 샘플은 재태 기간의 19 내지 21주 사이에 얻는다. 추가 실시양태에서, 포획제는 항체, 항체 단편, 핵산-계 단백질 결합 시약, 이의 소분자(small molecular) 또는 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 상기 방법은 효소 면역분석법(enzyme immunoassay)(EIA), 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA), 및 방사면역측정법(radioimmunoassay)(RIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에세이(assay)에 의해 수행된다.
본 발명은 또한 임산부에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 b. 상기 샘플을 질량 분석법 정량화로 구성된 프로테오믹스 워크-플로우(proteomics work-flow)에 처리시키는 것을 포함하는, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서 IBP4 및 SHBG를 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 b. 상기 샘플을 질량 분석법 정량화로 구성된 프로테오믹스 워크-플로우에 처리시키는 것을 포함하는, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 반전 값은 임산부와 만기 대조군 사이의 개별 바이오마커의 상대적 강도에서의 변화의 존재를 나타내며, 임산부에서의 조산 가능성을 나타낸다. 추가 실시양태에서, 측정 단계는 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 대용 펩티드를 측정하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 조산 위험 지수는 출산시 재태 기간이 기록된 조산 및 만기 임신의 코호트에서 IBP4/SHBG의 비를 측정함으로써 형성된다. 이어서, 임상 실습에서 개별 임신에서의 IBP4/SHBG의 측정 비를 지수 그룹에서와 같은 IBP4/SHBG를 유도하기 위해 동일한 단리 및 측정 기술을 사용하여 조산 위험을 유도하기 위한 지수에서 비교한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명 및 청구항으로부터 명확해질 것이다.
도 1. 채혈 윈도우(Blood draw window). 개별 반전 성능이 채혈 윈도우에 걸쳐 도시되어 있다. 반전은 IBP4/SHBG; VTNC/VTDB; IBP4/SHBG; VTNC/SHBG; IBP4/SHBG; CATD/SHBG; PSG2/ITIH4; CHL1/ITIH4; PSG2/C1QB; PSG2/FBLN3; HEMO/IBP6; HEMO/PTGDS를 나타낸다.
도 2. GABD에 대한 발견 사례, 검증(verification) 및 타당성 확인(validation) 사례.
도 3. 임신 동안의 단백질 발현. 알려진 단백질 거동을 기초로 다양한 단백질이 분석되어, 조산에 의해 영향을 받지 않는 단백질/경로를 알 수 있다. 도 3은 임신 동안 임신 관련 단백질의 발현을 도시한 것이다. 이들 단백질 및 이의 네트워크는 나타낸 재태 기간에서 조산 병리학에 의해 영향을 받지 않는다.
도 4. 임신 동안의 단백질 발현. 도 4는 태반 특이적 성장 호르몬과 관련하여 도 3에서 나타낸 그래프의 확대 버전을 도시한 것이다.
도 5. 임신 동안의 단백질 병리학. 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 4(insulin-like growth factor binding protein 4)(IBP4)는 19-21주 채혈 윈도우에서 적어도 10%만큼 과잉-발현되었다. 성 호르몬 결합 글로불린(sex hormone binding globulin)(SHBG)은 19-21주 채혈 윈도우에서 적어도 10%만큼 과소-발현되었다.
도 6. 검증 선택 기준. 도 6은 임상적이고 분석적으로 강력한 고성능의 조산 검사를 수행하기 위한 기준을 나타낸 것이다.
도 7. 몬테 카를로 교차 타당성 확인(Monte Carlo Cross Validation)(MCVV). MCVV는 동일한 집단으로부터 추출된 샘플의 독립적 세트 상에서 분류인자(classifier)가 얼마나 잘 작동하는지를 추정하는 보수적 방법이다(예를 들어, PAPR).
도 8. [IBP4]/[SHBG CHL1 CLUS]의 분석. CHL1 및 CLUS는 IBP4/SHBG 단독에 비해 0.03만큼 성능을 향상시켰다.
도 9. 능력(power) 및 샘플 크기 분석. 능력 및 샘플 크기 분석은 연구가 샘플 수 및 성능 추정치의 임계치에서 귀무가설을 거부할 만큼 충분히 강력할 것(AUC = 0.5)임을 예측한다.
도 10. 임신 시계(clock) 및 출산 시기. 임신시 증가하나, PTB 사례 및 대조군에서 상이하지 않은 다중 피분석물(analyte)은 생화학적으로 임신 날짜를 결정(dating)하는데 사용될 수 있다. 생화학적 날짜 결정은 마지막 생리 기간 일자에 의한 날짜 결정 또는 초음파 날짜 결정에 의한 날짜 결정, 또는 sPTB 위험, TTB 또는 GAB 예측의 후속 결정 이전의 날짜 결정의 확인에 유용할 수 있다.
도 11. 분류인자 개발. 도 11은 분류인자를 개발하는 기준을 도시한 것이다.
도 12. 발견 에세이에서 경로 커버리지(coverage). 도 12는 경로에 따른 단백질의 분포를 도시한 것이다.
도 13. 발견 데이터의 PCA는 채혈 윈도우에 걸친 변화를 검출하므로, 매우 복합화된 에세이가 재태 기간에 민감하다는 것을 나타낸다.
도 14. 발견 샘플에서 측정된 단백질의 계층적 클러스터링(hierarchical clustering).
도 15. 큰 클러스터 내의 태반 특이적 단백질 가지(branch). 우측 패널은 Thompson에 의해 식별된 임신 동안 발현된 유전자의 모듈(module)을 열거한 것이며, 좌측 패널은 발견 혈청-프로테오믹스 에세이가 이 모듈의 관련 발현을 재생한다는 것을 나타낸다. (Thompson et al., Genome Res. 12(10):1517-1522 (2002).
도 16. 조절장애 단백질 PreTRMTM 샘플.
도 17. 강조된 성 호르몬 결합 글로불린(SHGB) 생물작용. SHGB는 태반 세포(우측)에서 발현된다. SHGB는 태반 태아 구획(좌측)에서 유리 테스토스테론의 수준 및 에스트로겐 수준의 제어를 맡을 수 있다.
도 18. IBP4, IGF2, PAPP-A 및 PRG2의 상호작용. IBP4는 IGF2의 음성 조절인자이다. IBP4는 PAPPA 중개 단백질 가수분해(proteolysis)에 의해 IGF2로부터 유리된다. 낮은 수준의 PAPPA가 IUGR 및 PE와 관련되어 있다. 증가된 수준의 IBP4는 IGF2의 억제된 활성을 나타낸다. PTB 사례는 PAPPA, PRG2의 억제된 수준 및 IBP4의 증가된 수준을 갖는다.
도 19. 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 4(IBP4). IBP4는 PTB 사례에서 상향 조절된다. IGF2는 임신 초기에서 EVT의 증식, 분화 및 침윤을 자극한다. IGF 활성은 정상적인 태반형성 및 태아 성장을 위해 필수적이다. IBP4는 산모-태아 경계면(interface)에서 IGF2 활성의 자가분비 및 근거리분비 제어를 중개한다. 세포영양아층(cytotrophoblast)에 의해 발현되는 IGF2의 활성은 탈락막 세포(decidual cell)에 의해 생성되는 IBP에 의해 균형을 이룬다. 1차 3개월에 증가된 IBP4 및 감소된 IGF2는 태반 기능부전과 관련이 있었다(예를 들어, IUGR/SGA).
도 20. IBP4, SHBG 및 CHL1에 대한 MS 대 ELISA 상관관계. 질량 분석법 및 ELISA는 핵심 피분석물에 대해 양호하게 일치한다. 2개의 직교 플랫폼(orthogonal platform)에서의 일치는 피분석물 측정 신뢰성을 확고히 한다.
도 21. 19-21주 GABD로부터의 발견 샘플에서 IBP4/SHBG에 의한 PTB 분류. 임신 19-21주에 대한 발견 샘플을 고 BMI 및 저 BMI로 나누었다. IBP4/SHBG 반전 값은 낮은 SHBG 값으로 인해 고 BMI 범주에서 더 높다. 사례 및 대조군의 분리는 저 BMI에서 더 크다.
도 22. 저 BMI의 PTB 사례에서 억제된 SHBG 수준. GABD에 걸친 PAPR 대상체에서의 SHBG 혈청 수준의 선형 조화(fit). SHBG 수준은 고 BMI에 의해 억제된다. SHBG 수준은 임신 기간 동안 증가한다. 저 BMI의 PTB 사례는 가속화된 비율로 임신 기간 동안 증가하는 SHBG 수준을 감소시켰다.
도 23은 PAPR에서 연구 대상체의 분포를 요약한 것이다.
도 24는 BMI 계층화된 타당성 확인 샘플 세트를 분류하기 위하여 IBP4/SHBG 예측변수를 사용한 ROC 곡선 및 대응 AUC 값을 도시한 것이다.
도 25는 예측변수 스코어의 함수로서 임상 위험의 측정인 출현율 조정 양성 예측도(positive predictive value)(PPV)를 도시한 것이다. 예측변수 스코어와 PPV의 계산된 연관성은 임의의 알려지지 않은 대상체에 대한 sPTB 위험의 가능성을 결정하게 한다. 위험 곡선 그래프 하부의 상부(보라색) 선은 GAB <35 0/7주에 대응하고; 상부로부터의 제2 선(적색)은 35 0/7 및 37 0/7/ 주 사이의 GAB에 대응하며; 상부로부터의 제3 선(녹색)은 37 0/7 및 39 0/7/ 주 사이의 GAB에 대응하고; 상부로부터의 제4 선(청색)은 GAB 39 0/7 주 < GAB에 대응한다.
도 26은 카플란 마이어 분석(Kaplan Meier analysis)에서의 사례로서 고위험 및 저위험 그룹에 대한 출산율을 나타낸 것이다. 고위험 및 저위험은 2X 도 25의 데이터로부터의 sPTB의 평균 집단 위험(=14.6%)의 상대적 위험의 상부 또는 하부로서 정의되었다.
도 27은 최적의 BMI 및 GA 구간 내에서 맹검(blinded) 검증 및 타당성 확인 분석으로부터의 대상체의 조합을 사용하는 예측변수 성능에 대응하는 ROC 곡선을 도시한 것이다. 조합 샘플에 대한 ROC 곡선은 0.72의 AUROC에 대응한다(p = 0.013).
도 28은 44개 단백질이 중첩된 3주 GA 구간으로 상향 또는 하향 조절되고 분석 필터를 통과한 것을 도시한 것이다.
도 29는 전체에서의 최고 수행 반전인 IBP4/SHBG가 19 0/7 내지 21 6/7의 구간에서 AUROC=0.74를 가졌음을 도시한 것이다.
도 30은 2,000개의 부트스트랩(bootstrap) 상호작용으로부터 수득된 0.76의 평균 AUROC를 도시한 것이다. 검증 샘플 상의 맹검 IBP4/SHBG AUROC 성능은 모든 대상체 및 BMI 계층화 대상체에 대해 각각, 발견에서 수득된 성능과 양호하게 일치하는 0.77 및 0.79였다. 맹검 검증에 이어서, 부트스트랩 성능 결정을 위해 발견 및 검증 샘플을 조합하였다.
도 31은 MS 대 ELISA 스코어 값에 의해 유래된 sPTB 사례 대 대조군 분리를 도시한 것이다.
도 32는 BMI 제한이 없는 면역분석 대 MS ROC 분석을 도시한 것이다.
도 33은 22 초과 내지 37 이하의 BMI에 대한 면역분석 대 MS ROC 분석을 도시한 것이다.
도 34는 BMI 계층화 대상체(좌측 패널) 및 모든 대상체(우측 패널)에 대해, GABD 133-146 내의 MS 및 ELISA 유래 IBP4/SHBG 스코어 값 사이의 상관관계를 도시한 것이다.
도 35는 대조군과 사례(BMI 계층화)의 ELISA 및 MS 분리를 도시한 것이다.
도 36은 대조군과 사례(모든 BMI)의 Elisa 및 MS 분리를 도시한 것이다.
도 37은 Abbott Architect CMIA, 반자동 면역분석 도구 및 샘플의 면역 제거, 효소 분해 및 Agilent 6490 질량 분석계 상의 분석을 포함하는 Sera Prognostics의 프로테오믹(proteomic) 분석에 의한 SHBG 측정치 비교를 도시한 것이다.
도 38은 Roche cobas e602 분석기, 반자동 면역분석 도구 및 샘플의 면역 제거, 효소 분해 및 Agilent 6490 질량 분석계 상의 분석을 포함하는 Sera Prognostics의 프로테오믹 분석에 의한 SHBG 측정치 비교를 도시한 것이다.
도 39는 Abbott Architect CMIA 및 Roche cobas e602 분석기, 양측 반자동 면역분석 도구에 의한 SHBG 측정치 비교를 도시한 것이다.
도 40은 IBP4 단백질(유니프롯(Uniprot): P22692)의 최장 이소형(isoform)의 도메인 및 구조적 특징을 도시한 것이다. IBP4 QCHPALDGQR (aa, 214-223) 펩티드는 티로글로불린 1형 도메인 내에 위치한다. IBP4는 잔기 125에서 단일 N-연결 글리코실화 부위를 갖는다.
도 41은 2개의 IBP4 이소형에서 QCHPALDGQR 펩티드의 위치를 강조한 것이다.
도 42는 SHBG 단백질(유니프롯: P04278)의 최장 이소형의 도메인 및 구조적 특징을 도시한 것이다. SHBG IALGGLLFPASNLR (aa, 170-183) 펩티드는 제1 라민 G-유사 도메인에 위치한다. SHBG는 3개의 글리코실화 부위(잔기 380 및 396에서 2개의 N-연결 부위; 잔기 36에서 1개의 O-연결 부위)를 갖는다.
도 43은 SHBG의 7개의 이소형 내의 엑손(exon) 4에서 IALGGLLFPASNLR 펩티드의 위치를 강조한 것이다.
도 44는 채혈시 재태 기간(gestational age at blood draw)(GABD)에 걸친 sPTB 사례 및 만기 대조군에 대하여 별도로 IBP4 수준에 대한 평균 반응률을 도시한 것이다. 이동하는(sliding) 10일 윈도우를 사용하여 평활화함으로써 단면 발견 데이터를 분석하였다. 사례 대 대조군 신호는 대략 최대 10% 차이에 대응한다.
도 45는 채혈시 재태 기간(GABD)에 걸친 sPTB 사례 및 만기 대조군에 대하여 별도로 SHBG 수준에 대한 평균 반응률을 도시한 것이다. 이동하는 10일 윈도우를 사용하여 평활화함으로써 단면 발견 데이터를 분석하였다. 사례 대 대조군 신호는 대략 최대 10% 차이에 대응한다.
도 46은 채혈시 재태 기간(GABD)에 걸친 sPTB 사례 및 만기 대조군에 대하여 별도로 IBP4/SHBG 예측변수 스코어를 도시한 것이다. 이동하는 10일 윈도우를 사용하여 평활화함으로써 단면 발견 데이터를 분석하였다. 2개의 곡선 사이의 최대 차이는, 개별 피분석물에 대한 신호에서 대략 10% 차이인 것에 비해, 대략 20% 차이에 대응한다(도 45 및 46). 이들 데이터는 IBP4/SHBG 반전 전략을 사용함으로써 수득된 진단 신호의 증폭을 나타낸다.
도 47은 많은 상이한 반전 형성의 결과로서 진단 신호의 증폭을 도시한 것이다. 반전의 형성이 일반적으로 진단 신호를 증폭시키는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 많은 상이한 단백질에 의해 형성된 반전의 진단 성능을 ROC 분석에 의해 시험하였다. 상부 패널에 나타낸 것은 임신 19/0 주 및 21/6 주 사이에 수집된 샘플로부터의 데이터세트를 사용한 AUC 값(sPTB 사례 대 만기 대조군)의 범위이다. 인접한 박스 도식(plot)은 관련 반전을 형성하기 위해 사용되는 개별 상향 조절 및 하향 조절 단백질에 대한 ROC 성능의 범위를 도시한 것이다. 유사하게, 하부 패널은 반전에 대한 윌콕손 검정(Wilcoxon test)(sPTB 사례 대 만기 대조군)으로부터 유래된 p-값이 대응 개별 단백질에 대한 것들에 비해 더욱 유의미하다는 것을 도시한 것이다.
도 48은 개별 IBP4 및 SHBG 반응률의 측정 및 계산된 대응 반전 스코어에 대한 분석적 변동 계수(coefficient of variation)(CV)를 도시한 것이다. 생물학적 변이가 없는 임신 공여자(donor)로부터의 풀링된 대조 혈청 샘플(pHGS)을 다중 뱃치(batch)에서 수일에 걸쳐 분석하였다. 반전 변이는 개별 단백질과 연관된 변이에 비해 적다. 이들 데이터는 반전의 형성이 샘플의 실험실 처리 동안 발생하는 분석적 변이에 대해 제어된다는 것을 나타낸다. 분석적 변이는 생물학적 현상이 아니다.
도 49는 많은 반전 및 이의 개별 상향 및 하향 조절 단백질에 대한 분석적 CV를 도시한 것이다. 반전의 형성이 일반적으로 진단 신호를 증폭시키는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 많은 단백질의 비에 의해 형성된 고성능 반전(AUC >0.6)의 ROC 성능(AUC)을 시험하였다. 상부 패널에 나타낸 것은 임신 19/0 주 및 21/6 주 사이에 수집된 샘플로부터의 데이터세트를 사용한 AUC 값(sPTB 사례 대 만기 대조군)의 범위이다. 인접한 박스 도식은 관련 반전을 형성하기 위해 사용되는 개별 상향 조절 및 하향 조절 단백질에 대한 ROC 성능의 범위를 도시한 것이다. 유사하게, 반전에 대한 윌콕손 검정(sPTB 사례 대 만기 대조군)으로부터 유래된 p-값은 대응 개별 단백질에 대한 것들에 비해 더욱 유의미하다.
도 50은 자간전증 대 다른 증상(indication)에 대해 의학적으로 나타낸 바와 같이 주석이 달린 대상체에 대한 PreTRMTM 스코어 비교를 도시한 것이다.
도 51은 타당성 확인 샘플 세트(BMI>22<=37)에서 IBP4/SHBG 예측변수 성능 메트릭(metric)의 표를 도시한 것이다. 대조군(컷-오프 상부)으로부터 사례(컷-오프 하부)를 정의하기 위해 상이한 경계를 사용함으로써, 예측변수 예민도, 특이성, ROC 곡선 하의 면적(AUC) 및 오즈비(odds ratio)를 결정하였다.
도 52는 당뇨병 주석을 갖는 반전 강도 히트맵(heatmap)을 도시한 것이다. 적색 화살표는 당뇨병 사례를 도시한 것이다. 스크린의 우측 상의 PTB 사례 및 좌측 상의 만기 출산과 함께 샘플이 하부에 열거되어 있다. 당뇨병 환자는 우측 상에 클러스터링되어 있으며, 임신성 당뇨병을 예측하는 바이오마커로부터 진단 검사를 구축할 수 있음을 나타낸다.
도 53은 피분석물 반응률의 계층적 클러스터링을 도시한 것이다.
도 54는 세포외 매트릭스 상호작용에서 작용하는 차별적으로 발현된 단백질을 도시한 것이다.
도 55는 18주에 최대 분리를 나타내는 IGF-2 경로에서의 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학적 도식(kinetic plot)을 도시한 것이다.
도 56A는 sPTB에서 IGF-2, IBP4, PAPP1 및 PRG2 단백질 사이에서 이들 단백질의 생체이용률에 영향을 미치는 상호작용의 도식을 나타낸 것이다; 56B는 IR-B에 대한 인슐린 결합 및 IR-A 또는 IGF1R에 대한 인슐린 및 IGF 결합에 의해 우선적으로 활성화되는 세포내 신호의 도식을 나타낸 것이다.
도 57은 대사 호르몬 균형에서의 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 58은 신생 혈관 형성에서의 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 59는 선천성 면역성에서의 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 60은 응고에서의 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 61은 차별적으로 발현된 혈청/분비된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 62는 차별적으로 발현된 PSG/IBP의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 63은 차별적으로 발현된 ECM/세포 표면 단백질의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 64는 차별적으로 발현된 보체/급성기 단백질-1의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 65는 차별적으로 발현된 보체/급성기 단백질-2의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 66은 차별적으로 발현된 보체/급성기 단백질-3의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 67은 차별적으로 발현된 보체/급성기 단백질-4의 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 68은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 채혈시 재태 기간(GABD)으로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 69는 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 70은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 71은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 72는 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 73은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 74는 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 75는 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 76은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 77은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 78은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 79는 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 80은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 81은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 82는 17주 0일차 내지 28주 6일차의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 83은 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 84는 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 I에 명시된 피분석물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 85는 17주 0일차 내지 28주 6일차의 GABD로부터의 데이터를 이용하여 패널 A 내지 G에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 86은 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 87은 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 88은 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 89는 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 90은 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 91은 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 92는 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 93은 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 94는 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 95는 <37 0/7 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 C에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 96은 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 97은 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 98은 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 99는 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 100은 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 101은 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 102는 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 103은 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 104는 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 I에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 105는 <35 0/7 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 패널 A 내지 C에 명시된 펩티드 전이물에 대한 동역학적 도식을 나타낸 것이다.
도 106은 sPTB 사례 및 대조군에서의 IBP4 및 SHBG 수준 및 IBP4/SHBG 반전 값을 별도로 도시한 것이다.
도 107은 MSD 결과와 상업용 ELISA 키트 및 MS-MRM의 상관관계를 도시한 것이다.
도 108은 PPROM(PTL)의 부재시 조기 진통 중 19-20주에서 양호한 성능을 갖는 반전의 예를 나타낸 박스 도식을 제시한다.
도 109는 만삭전 조기 양막 파열(preterm premature rupture of membrane)(PPROM) 중 19-20주에서 양호한 성능을 갖는 반전의 예를 나타낸 박스 도식을 제시한다.
도 110은 임신 <37 0/7주 대 >= 37 0/7주의 컷-오프를 사용하여 예측변수 스코어(ln IBP4/SHBG)와 sPTB의 출현율 조정 상대 위험(양성 예측값) 사이의 관계를 나타낸 위험 곡선이다. 위험 곡선 그래프 하부의 상부(보라색) 선은 sPTB(GAB <35주)에 대응하고; 상부로부터의 제2 선(적색)은 sPTB(35 < GAB < 37주)에 대응하며; 상부로부터의 제3 선(녹색)은 TERM(37 < GAB < 39주)에 대응하고; 상부로부터의 제4 선(청색)은 TERM(39주 < GAB)에 대응한다.
도 111은 임신 <35 0/7주 대 >= 35 0/7주의 컷-오프를 사용하여 예측변수 스코어(ln IBP4/SHBG)와 sPTB의 출현율 조정 상대 위험(양성 예측값) 사이의 관계를 나타낸 위험 곡선이다. 위험 곡선 그래프 하부의 상부(보라색) 선은 sPTB(GAB <35주)에 대응하고; 상부로부터의 제2 선(적색)은 sPTB(35 < GAB < 37주)에 대응하며; 상부로부터의 제3 선(녹색)은 TERM(37 < GAB < 39주)에 대응하고; 상부로부터의 제4 선(청색)은 TERM(39주 < GAB)에 대응한다.
본 발명은 일반적으로 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 특정 단백질 및 펩티드가, 대조군에 비해 조산 위험이 증가된 임산부에서 차별적으로 발현된다는 발견에 기초한다. 본 발명은 또한 본원에 개시된 바이오마커 쌍의 반전 값이 높은 예민도 및 특이성으로 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법에 사용될 수 있다는 예기치 않은 발견이 부분적으로 특히 기초이다. 비 및/또는 반전 쌍의 성분으로서 본원에 개시된 단백질 및 펩티드는 개별적으로 비, 반전 쌍에서 또는 바이오마커/반전 쌍의 패널에서 검사 샘플을 분류하고, 조산의 가능성을 예측하며, 만기 출산의 가능성을 예측하고, 출산시 재태 기간(gestational age at birth)(GAB)을 예측하며, 출산까지의 기간(time to birth)(TTB)을 예측하고/하거나 PTB 위험이 있는 임산부에서 예방적 치료의 진전을 모니터링하는 바이오마커로서 작용한다. 반전 값은 하향 조절된 바이오마커의 상대 피크 면적에 대한 상향 조절된 바이오마커의 상대 피크 면적의 비이며, 변이(variability)를 정규화하고 진단 신호를 증폭하는 작용을 한다. 본 발명은 함께 쌍이 되었을 때, 반전 값을 기초로 조산의 가능성을 예측할 수 있는 특정 바이오마커의 선택에 부분적으로 존재한다. 따라서, 본 발명의 기초인 새로운 반전에서 쌍을 이룰 때 유익한 특정 바오이마커를 선택하는 것이 인간의 독창성이다.
용어 "반전 값"은 하향 조절된 피분석물의 상대 피크 면적에 대한 상향 조절된 피분석물의 상대 피크 면적의 비를 지칭하며, 변이를 정규화하고 진단 신호를 증폭시키는 작용을 한다. 좁은 윈도우 내의 가능한 모든 반전 중에서, 개별 일변량(univariate) 성능에 기초하여 하위 세트(subset)가 선택된다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에서 반전 값으로서 지칭되는, 하향 조절된 바이오마커의 상대 피크 면적에 대한 상향 조절된 바이오마커의 상대 피크 면적의 비는 강력하고 정확한 분류인자를 식별하고, 조산의 가능성을 예측하며, 만기 출산의 가능성을 예측하고, 출산시 재태 기간(GAB)을 예측하며, 출산까지의 기간을 예측하고/하거나 임산부에서 예방적 치료의 진전을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 바이오마커 쌍의 상대적 발현이 반전되어 PTB와 비-PTB 사이의 반전 값에서의 변화를 나타내는 바이오마커 쌍의 식별에 부분적으로 기초한다. 본원에 개시된 방법에서 바이오마커의 비의 사용은 임산부로부터의 생물학적 샘플의 제거 이후 인간 조작의 결과인 변이를 정정한다. 상기 변이는, 예를 들어 샘플 수집, 처리, 제거, 분해 또는 샘플에 존재하는 바이오마커를 측정하는데 사용되는 방법의 다른 단계 동안 도입될 수 있으며, 바이오마커가 자연에서 어떻게 거동하는지와는 독립적이다. 따라서, 본 발명은 변이를 감소시키고/시키거나 진단 신호를 증폭, 정규화 또는 명확히하기 위한 진단 또는 예측하는 방법에서 반전 쌍의 사용을 일반적으로 포함한다.
만기 반전 값은 하향 조절된 피분석물의 상대 피크 면적에 대한 상향 조절된 피분석물의 상대 피크 면적의 비를 지칭하며, 변이를 정규화하고 진단 신호를 증폭하는 작용을 하며, 본 발명의 바이오마커 쌍은 임의의 다른 수단에 의해, 예를 들어 상대 피크 면적의 빼기, 더하기 또는 곱하기에 의해 측정될 수 있는 것으로도 고려된다. 본원에 개시된 방법은 상기 다른 수단에 의한 바이오마커 쌍의 측정을 포함한다.
이 방법은 데이터 정규화와 독립적인 가장 간단한 가능 분류인자를 제공하고, 과적합(overfitting)을 회피하게 하며, 임상에서 시행하기에 용이한 매우 간단한 실험적 검사를 야기하기 때문에 유리하다. 데이터 정규화와 독립적인 반전 값에서의 변화에 기초하는 마커 쌍의 사용은 본원에 개시된 임상적으로 관련된 바이오마커의 개발을 가능하게 하였다. 임의의 단일 단백질의 정량화는 측정 변이, 정상 변동, 및 기준선 발현에서의 개체 관련 변이에 의해 야기된 불확실성이 있기 때문에, 조직화된 체계적 조절 하에 있을 수 있는 마커 쌍의 식별은 개별화된 진단 및 예후를 위한 강력한 방법을 가능하게 한다.
본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하기 위한 바이오마커 반전 쌍 및 반전 쌍의 관련 패널, 방법 및 키트를 제시한다. 본 발명의 하나의 주요 이점은 발달하고 있는 조산의 위험이 임신 과정 초기에 평가될 수 있어 조기 분만을 예방하기 위한 적절한 모니터링 및 임상 관리가 시기적절한 방식으로 개시될 수 있다는 것이다. 본 발명은 조산에 대한 임의의 위험 인자가 결여되어 있고, 달리 식별 및 치료되지 않는 여성에게 특히 유익하다.
예로서, 본 발명은 조산의 예측적 반전 값에서의 변화를 나타내는 것으로 식별되었던 바이오마커 쌍의 상대적 발현에 관한 정량적 데이터를 적어도 포함하는, 샘플과 연관된 데이터세트를 수득하고, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는데 유용한 결과를 생성하기 위해 데이터세트를 사용하는 분석 과정에 상기 데이터세트를 입력함으로써, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는데 유용한 결과를 생성하는 방법을 포함한다. 하기에서 추가로 개시되는 바에 있어서, 정량적 데이터는 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 뉴클레오티드, 핵산, 뉴클레오시드, 당, 지방산, 스테로이드, 대사산물, 탄수화물, 지질, 호르몬, 항체, 생물학적 거대분자(macromolecule)에 대한 대용으로 제공되는 관심 영역 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 공개된 데이터베이스의 등록번호, 서열, 또는 참고문헌에 의해 본 발명에서 식별된 특정 바이오마커 이외에, 본 발명은 또한 예시된 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 97% 동일하고, 현재 알려져 있거나, 이후 발견되며 본 발명의 방법을 위한 유용성을 갖는 바이오마커 변이체의 사용을 고려한다. 이들 변이체는 다형성(polymorphism), 스플라이스(splice) 변이체, 돌연변이 등을 나타낼 수 있다. 이에 대하여, 본 명세서는 본 발명의 맥락에서 다수의 업계 공지된 단백질을 개시하며, 1종 이상의 공개된 데이터베이스와 연관된 예시적 등록 번호뿐 아니라 이들 업계 공지된 단백질과 관련하여 발표된 저널 기사에 대한 예시적 참고문헌을 제시한다. 그러나, 상기 당업자는 개시된 바이오마커의 추가적인 특징을 제시할 수 있는 추가 등록 번호 및 저널 기사가 용이하게 식별될 수 있고, 예시적 참고문헌은 개시된 바이오마커에 관해 제한하지 않는다는 것을 인식한다. 본원에 개시된 바에 있어서, 다양한 기법 및 시약이 본 발명의 방법에서 사용된다. 본 발명의 맥락에서 적합한 샘플은, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 양수, 질 분비물, 침, 및 소변을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특별한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청이다. 본원에 개시된 바에 있어서, 바이오마커는 당업계에 알려진 다양한 에세이 및 기법을 통해 검출될 수 있다. 본원에 더 개시된 바에 있어서, 상기 에세이는, 비제한적으로 질량 분석법(mass spectrometry)(MS) 이용 에세이, 항체 이용 에세이뿐 아니라 상기 둘의 양태(aspect)를 조합한 에세이를 포함한다.
본원에 개시된 반전 쌍의 성분인 단백질 바이오마커는, 예를 들어 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 4(IBP4), 성 호르몬 결합 글로불린(SHBG), 비트로넥틴(Vitronectin)(VTNC), 그룹-특이적 성분(비타민 D 결합 단백질(Vitamin D Binding Protein))(VTDB), 카텝신(cathepsin) D(리포솜 아스파르틸 프로테아제)(CATD), 임신 특이적 베타-1-당단백질(pregnancy specific beta-1-glycoprotein) 2(PSG2), 인터-알파-트립신 억제제 중쇄 패밀리, 멤버(Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor Heavy Chain Family, Member) 4(ITIH4), 세포 부착 분자(cell adhesion molecule) L1-유사(CHL1), 보체 성분 1, Q 부문, B쇄(Complement Component 1, Q Subcomponent, B Chain)(C1QB), 피불린(Fibulin) 3(FBLN3), 헤모펙신(Hemopexin)(HEMO 또는 HPX), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 6(IBP6), 프로스타글란딘 D2 신타아제(prostaglandin D2 synthase) 21kDa(PTGDS)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 도 1을 포함한, 임의의 첨부된 도면 및 표에 열거된 쌍을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 적어도 1 쌍에 대한 반전 값을 측정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 적어도 1 쌍에 대한 반전 값을 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 표 26에 개시된 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커를 제시한다. 본 발명의 바이오마커는 임산부에서의 조산 위험을 예측할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 바이오마커는 IBP4, SHBG, VTNC, VTDB, CATD, PSG2, ITIH4, CHL1, C1QB, FBLN3, HPX, 및 PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단리된 바이오마커는 IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CD14, 및 APOC3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 표 26에 개시된 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커의 대용 펩티드를 제시한다. 일부 실시양태에서, 단리된 바이오마커의 대용 펩티드는 표 26에 개시된 대용 펩티드의 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 바이오마커 및 이의 대용 펩티드는 임산부에서의 조산 위험을 예측하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대용 펩티드는 IBP4, SHBG, VTNC, VTDB, , CATD, PSG2, ITIH4, CHL1, C1QB, FBLN3, HPX, 및 PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커에 대응한다. 일부 실시양태에서, 대용 펩티드는 IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CD14, 및 APOC3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커에 대응한다.
본 발명은 표 26에 개시된 그룹으로부터 선택되는 대용 펩티드에 대응하는 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 제시한다. 본 발명의 바이오마커, 이의 대용 펩티드 및 SIS 펩티드는 임산부에서의 조산 위험을 예측하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, SIS 펩티드는 IBP4, SHBG, VTNC, VTDB, , CATD, PSG2, ITIH4, CHL1, C1QB, FBLN3, HPX, 및 PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커의 대용 펩티드에 대응한다. 일부 실시양태에서, SIS 펩티드는 IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CD14, 및 APOC3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커의 대용 펩티드에 대응한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 단리된 바이오마커 쌍 IBP4/SHBG를 제시하며, 상기 바이오마커 쌍은 만기 대조군에 비해 조산 위험이 있는 임산부 사이에서 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 단리된 바이오마커 쌍 IBP4/SHBG를 제시하며, 상기 바이오마커 쌍은 대조군에 비해 조산 위험이 있는 임산부에서 더 높은 비를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, 및 CATD/SHBG로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1 쌍의 바이오마커에 대한 반전 값을 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 샘플은 GABD의 19주 및 21주 사이에 수득된다. 추가 실시양태에서, 상기 샘플은 GABD의 19주 및 22주 사이에 수득된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG에 대한 반전 값을 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 샘플은 GABD의 19주 및 21주 사이에 수득된다. 추가 실시양태에서, 상기 샘플은 GABD의 19주 및 22주 사이에 수득된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1 쌍의 바이오마커에 대한 반전 값을 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함하고, 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화의 존재는 임산부에서의 조산 가능성을 결정한다. 추가 실시양태에서, 상기 샘플은 GABD의 19주 및 21주 사이에 수득된다. 추가 실시양태에서, 상기 샘플은 GABD의 19주 및 22주 사이에 수득된다.
임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 반복 방법은 본 발명의 실시양태에 포함되며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1 쌍의 바이오마커 및 본원에 개시되고/되거나 예시된 단백질로부터 선택되는 임의의 다른 바이오마커 쌍에 대한 반전 값을 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함하고, 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화의 존재는 임산부에서의 조산 가능성을 결정한다. 본원에 개시된 방법의 반복 수행은 단일 샘플로부터 수득된 후속 측정뿐 아니라 측정용 후속 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 위험 스코어로서 표현될 수 있는 임산부에서의 조산 가능성이 명시된 값을 초과하는 것으로 결정된 경우, 상기 방법은 동일한 샘플로부터의 별개의 반전 쌍 또는 후속 샘플로부터의 동일하거나 별개의 반전 쌍을 사용하여 반복되어, sPTB에 대한 위험을 더 계층화할 수 있다.
특정 바이오마커 이외에, 본 발명은 예시된 서열과 약 90%, 약 95%, 또는 약 97% 동일한 바이오마커 변이체를 더 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 변이체는 다형성, 스플라이스 변이체, 돌연변이 등을 포함한다. 단백질 바이오마커에 대한 참고로 개시되어 있으나, 반전 값에서의 변화는 바이오마커 쌍에 대한 단백질 또는 유전자 발현 수준에서 식별될 수 있다.
추가 마커는 산모 특징, 병력, 지난 임신 이력, 및 산과 이력을 포함하나 이에 제한되지 않는 1종 이상의 위험 징후로부터 선택될 수 있다. 상기 추가 마커는, 예를 들어 이전의 저체중아 분만 또는 조기 분만, 복수의 제2기 3개월의 자연 유산, 이전의 제1기 3개월의 인공 유산, 가족 및 세대간 인자, 불임의 이력, 미분만, 태반 이상, 자궁경부 및 자궁 이상, 짧은 자궁경부 길이 측정치, 임신성 출혈, 자궁내부 성장 제약, 자궁내 디에틸스틸베스트롤 노출, 다태 임신(multiple gestation), 영아 성별, 저신장, 낮은 임신전 체중, 낮거나 높은 체질량 지수, 당뇨병, 고혈압, 비뇨생식기 감염(즉, 요로 감염), 천식, 불안 및 우울, 천식, 고혈압, 갑상선 기능저하증을 포함할 수 있다. 조산에 대한 인구통계적 위험 징후는, 예를 들어 산모 연령, 인종/민족성, 단일 혼인 상태, 낮은 사회경제적 상태, 산모 연령, 직장 관련 신체 활동, 직업적 방사선 피폭(occupational exposure) 및 환경 노출 및 스트레스를 포함할 수 있다. 추가 위험 징후는 불충분한 산전 관리, 흡연, 마리화나 및 다른 불법 약물의 사용, 코카인 사용, 알코올 섭취, 카페인 섭취, 산모 체중 증가, 식이 섭취, 임신 후기 동안의 성 활동 및 여가 시간 신체 활동을 포함할 수 있다. (Preterm Birth: Causes, Consequences, and Prevention, Institute of Medicine (US) Committee on Understanding Premature Birth and Assuring Healthy Outcomes; Behrman RE, Butler AS, editors. Washington (DC): National Academies Press (US); 2007). 마커로서 유용한 추가 위험 징후는 당업계에 알려진 학습 알고리즘, 예컨대 선형 판별 분석, 지지도 벡터 머신 분류, 회귀적 특징 제거(recursive feature elimination), 마이크로어레이(microarray)의 예측 분석, 로지스틱 회귀분석(logistic regression), CART, 플렉스트리(FlexTree), LART, 랜덤 포레스트(random forest), MART, 및/또는 생존 회귀분석(survival analysis regression)을 사용하여 식별될 수 있으며, 이는 당업자에게 알려져 있고 본원에 더 개시된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바에 있어서, 단수형 "하나", "한", 및 "상기"("a", "an", 및 "the")는 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 경우 복수 언급을 포함한다는 것을 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "바이오마커"에 대한 언급은 2종 이상의 바이오마커 등의 혼합물을 포함한다.
용어 "약"은, 상세하게는 주어진 양에 대한 언급에서 플러스 또는 마이너스 5퍼센트의 편차를 포함한다는 것을 의미한다.
첨부된 청구항을 포함하여, 본원에서 사용된 바에 있어서, 단일 형태 "하나", "한", 및 "상기"는 내용이 달리 명확하게 기술하지 않는 경우 복수 언급을 포함하고, "적어도 1종" 및 "1종 이상"과 교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "포함하다", "포함하는", "포함하다", "포함하는", "함유하다", "함유하는"("comprises," "comprising," "includes," "including," "contains," "containing,") 및 이의 임의의 변형은 비-배타적 포함을 포함시키는 것으로 의도되어, 요소 또는 요소의 목록을 포함, 포함, 또는 함유하는 물질의 과정, 방법, 제법 한정 물건(product-by-process), 또는 조성물이 상기 요소만을 포함하는 것은 아니며, 물질의 상기 과정, 방법, 제법 한정 물건, 또는 조성물에 분명하게 열거되지 않았거나 내재하지 않는 다른 요소를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "패널"은 조성물, 예컨대 1종 이상의 바이오마커를 포함하는 어레이(array) 또는 집합체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 본원에 개시된 1종 이상의 바이오마커의 발현 패턴의 프로파일 또는 지수를 지칭할 수 있다. 바이오마커 패널에 유용한 바이오마커의 수는 바이오마커 값들의 특정 조합에 대한 예민도 및 특이성 값에 기초한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 달리 명시되지 않는 경우, 용어 "단리된" 및 "정제된"은 일반적으로 그것의 천연 환경(예를 들어, 그것이 천연 산출인 경우 천연 환경)으로부터 제거되었던 물질의 조성물을 설명하며, 따라서 인간의 손에 의해 그것의 천연 상태로부터 변경되어 구조, 기능 및 특성 중 적어도 1종에 관하여 현저하게 상이한 특징을 포함한다. 단리된 단백질 또는 핵산은 그것이 천연에서 존재하는 방식과 구별되며, 합성 펩티드 및 단백질을 포함한다.
용어 "바이오마커"는 생물학적 분자, 또는 생물학적 분자의 단편을 지칭하며, 이의 변화 및/또는 검출은 특정 신체 조건 또는 상태와 연관될 수 있다. 용어 "마커" 및 "바이오마커"는 본 발명에 걸쳐 상호 교환적으로 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 바이오마커는 조산의 증가된 가능성과 연관되어 있다. 상기 바이오마커는 임의의 적합한 피분석물을 포함하나, 뉴클레오티드, 핵산, 뉴클레오시드, 아미노산, 당, 지방산, 스테로이드, 대사산물, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 호르몬, 항체, 생물학적 거대분자에 대한 대용으로 제공되는 관심 영역 및 이들의 조합(예를 들어, 당단백질, 리보핵단백질, 지단백질)을 포함하는 생물학적 분자로 제한되는 것은 아니다. 상기 용어는 또한 생물학적 분자의 일부분 또는 단편, 예를 들어 적어도 5개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 6개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 7개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 8개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 9개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 10개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 11개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 12개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 13개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 14개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 15개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 5개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 16개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 17 개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 18개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 19개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 20개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 21개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 22개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 23개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 24개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 25개의 연속 아미노산 잔기, 또는 그 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드의 펩티드 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바에 있어서, "대용 펩티드"는 MRM 에세이 구성에서 관심 바이오마커의 정량화를 위한 대용으로서 제공하기 위해 선택되는 펩티드를 지칭한다. 대용 펩티드의 정량화는 MRM 검출 기법과 함께 안정 동위원소 표지 표준 대용 펩티드("SIS 대용 펩티드" 또는 "SIS 펩티드")를 사용하여 최고로 달성된다. 대용 펩티드는 합성물일 수 있다. SIS 대용 펩티드는, 펩티드의 C-말단에서, 예를 들어 아르기닌 또는 리신, 또는 임의의 다른 아미노산을 이용한 중(heavy) 표지로 합성되어, MRM 에세이에서 내부 표준으로서 제공될 수 있다. SIS 대용 펩티드는 천연 산출 펩티드가 아니며, 그것의 천연 산출 상대물에 비해 현저하게 상이한 구조 및 특성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1 쌍의 바이오마커에 대한 비를 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함하고, 임산부와 만기 대조군 사이의 비에서의 변화의 존재는 임산부에서의 조산 가능성을 결정한다. 일부 실시양태에서, 상기 비는 분자(numerator)에서 상향 조절된 단백질, 분모(denominator)에서 하향 조절된 단백질 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 예시된 바에 있어서, IBP4/SHBG는 분자에서 상향 조절된 단백질 및 분모에서 하향 조절된 단백질의 비가고, 이는 본원에서 "반전"으로서 정의된다. 비가 분자에서 상향 조절된 단백질, 또는 분모에서 하향 조절된 단백질을 포함하는 사례에서, 비-조절된 단백질은 정규화(예를 들어, 예비 분석적 또는 분석적 변이를 감소)를 위해 제공될 것이다. "반전"인 비의 특별한 경우에, 증폭 및 정규화 둘 다가 가능하다. 본 발명의 방법은 반전의 하위 세트에 한정되지 않으며, 바이오마커의 비를 또한 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "반전"은 하향 조절된 피분석물의 측정 값에 대한 상향 조절된 피분석물의 측정 값의 비를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 피분석물 값은 그 자체로 대응 안정 동위원소 표준 피분석물의 피크 면적의 비에 대한 내인성 피분석물의 피크 면적의 비가며, 본원에서 반응률 또는 상대 비로서 지칭된다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "반전 쌍"은 비교되는 클래스(class)들 사이에서의 변화를 나타내는, 쌍으로 있는 바이오마커를 지칭한다. 단백질 농도 또는 유전자 발현 수준에서 반전의 검출은 데이터 정규화 또는 집단-전체 임계치(population-wide threshold)의 수립에 대한 필요성을 제거한다. 일부 실시양태에서, 반전 쌍은 단리된 바이오마커 쌍, IBP4/SHBG이며, 반전 쌍은 만기 대조군에 비해 조산 위험이 있는 임산부 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 추가 실시양태에서, 반전 쌍 IBP4/SHBG는 만기 대조군에 비해 조산 위험이 있는 임산부에서 높은 비를 나타낸다. 개별 바이오마커가 분자와 분모 사이에 전환되는 대응 반전 쌍은 임의의 반전 쌍의 정의 내에 포함된다. 당업자는 상기 대응 반전 쌍이 그것의 예측력에 관하여 동일하게 유익하다는 것을 인식할 것이다.
용어 "반전 값"은 하향 조절된 피분석물의 상대 피크 면적에 대한 상향 조절된 피분석물의 상대 피크 면적의 비를 지칭하며, 변이를 정규화시키고 진단 신호를 증폭시키기 위해 제공된다. 좁은 윈도우 내의 가능한 모든 반전 중에서, 하위 세트는 개별 일변량 성능에 기초하여 선택된다. 본원에 개시된 바에 있어서, 본원에서 반전 값으로서 지칭되는, 하향 조절된 바이오마커의 상대 피크 면적에 대한 상향 조절된 바이오마커의 상대 피크 면적의 비는 강력하고 정확한 분류인자를 식별하고, 조산의 가능성을 예측하며, 만기 출산의 가능성을 예측하고, 출산시 재태 기간(GAB)을 예측하며, 출산까지의 기간을 예측하고/하거나 임산부에서 예방적 치료의 진전을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
이 반전 방법은 데이터 정규화와 독립적인 가장 간단한 가능 분류인자를 제공하고, 과적합을 회피하게 하며, 임상에서 시행하기에 용이한 매우 간단한 실험적 검사를 야기하기 때문에 유리하다. 본원에 개시된 바와 같은 데이터 정규화와 독립적인 반전에 기초하는 마커 쌍의 사용은 임상적으로 관련된 PTB 바이오마커의 식별을 위한 방법으로서 굉장한 힘을 갖는다. 임의의 단일 단백질의 정량화는 측정 변이, 정상 변동, 및 기준선 발현에서의 개체 관련 변이에 의해 야기된 불확실성이 있기 때문에, 조직화된 체계적 조절 하에 있을 수 있는 마커 쌍의 식별은 개별화된 진단 및 예후를 위해 보다 강력할 것임을 입증해야 한다.
본 발명은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 포함하는 조성물을 제시하며, 상기 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다. 일 실시양태에서, 조성물은 상기 바이오마커 각각으로부터 유래된 대용 펩티드를 위한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명은 IBP4 및 SHBG로 이루어진 단리된 바이오마커 쌍을 제시하며, 상기 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다.
IBP4는 인슐린-유사 성장 인자 IGF1 및 IGF2를 음성적으로 조절하는 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IBP) 패밀리의 멤버이다. (Forbes et al.. Insulin-like growth factor I and II regulate the life cycle of trophoblast in the developing human placenta. Am J Physiol, Cell Physiol. 2008;294(6):C1313-22). IBP4는 합포체영양막(syncytiotrophoblast)에 의해 발현되며(Crosley et al., IGFBP-4 and -5 are expressed in first-trimester villi and differentially regulate the migration of HTR-8/SVneo cells. Reprod Biol Endocrinol. 2014;12(1):123), 융모막외 영양세포(extravillous trophoblast)에 의해 발현되는 우세한 IBP이다(Qiu et al. Significance of IGFBP-4 in the development of fetal growth restriction. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(8):E1429-39). 만기 임신과 비교하면, 임신 초기의 산모 IBP4 수준은 태아 성장 제한 및 자간전증에 의해 복잡한 임신에서 더 높다. (Qiu et al., supra, 2012)
SHBG는 생물학적으로 활성인 미결합 스테로이드 호르몬의 가용성을 조절한다. Hammond GL. Diverse roles for sex hormone-binding globulin in reproduction. Biol Reprod. 2011;85(3):431-41. 혈장 SHBG 수준은 임신 동안 5-10배 증가하며(Anderson DC. Sex-hormone-binding globulin. Clin Endocrinol (Oxf). 1974;3(1):69-96), 태반 영양막 세포를 포함하여, 간외 발현에 대한 증거가 존재한다. (Larrea et al. Evidence that human placenta is a site of sex hormone-binding globulin gene expression. J Steroid Biochem Mol Biol. 1993;46(4):497-505) 생리적으로, SHBG 수준은 트리글리세리드, 인슐린 수준 및 BMI와 음성적으로 연관되어 있다. (
Figure pct00001
et al. Novel insights in SHBG regulation and clinical implications. Trends Endocrinol Metab. 2015;26(7):376-83) SHBG 수준에 대한 BMI의 효과는 부분적으로 BMI 계층화를 이용하여 개선된 예측 성능을 설명할 수 있다.
양막내 감염 및 염증은 TNF-α 및 IL1-β를 포함한 염증전 사이토카인의 증가된 수준을 갖기 때문에 PTB와 연관되어 왔다. (Mendelson CR. Minireview: fetal-maternal hormonal signaling in pregnancy and labor. Mol Endocrinol. 2009;23(7):947-54; Gomez-Lopez et al. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 2014;11(6):571-81). 간에서 SHBG 전사는 IL1-β 및 NF-kB 중개 TNF-α 신호전달(
Figure pct00002
et al. Novel insights in SHBG regulation and clinical implications. Trends Endocrinol Metab. 2015;26(7):376-83), 정상 및 비정상 진통의 개시에 관련된 경로(
Figure pct00003
TM, Bennett PR. The role of nuclear factor kappa B in human labour. Reproduction. 2005;130(5):569-81)에 의해 억제된다. sPTB로 예정된 여성에서 SHBG의 낮은 수준은 감염 및/또는 염증의 결과일 수 있다. 따라서, SHBG는 업스트림(upstream) 염증 신호에 반응하는 태반-태아 단위에서의 안드로겐 및 에스트로겐 작용의 제어를 위해 중요할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하는 대용 펩티드 쌍을 포함하는 조성물을 제시하며, 상기 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널을 제시하며, 각각의 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2 쌍의 대용 펩티드의 패널을 제시하며, 대용 펩티드의 각각의 쌍은 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하고, 각각의 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화를 나타낸다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1 쌍의 바이오마커에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널에 대한 반전 값에서의 변화를 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반전 값은 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화의 존재를 나타내며, 임산부에서의 조산 가능성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 측정 단계는 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 대용 펩티드를 측정하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 임산부의 표 1 내지 77 및 도 1 내지 111 중 임의의 것에 열거된 바이오마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1 쌍의 바이오마커에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 임산부의 표 27 내지 59, 61 내지 72, 76 및 77에 명시된 바이오마커 쌍으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1 쌍의 바이오마커에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 임산부의 표 26에 열거된 바이오마커로 쌍으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 1 쌍의 바이오마커에 대한 반전 값을 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 임산부의 표 1 내지 77 및 도 1 내지 111 중 임의의 것에 명시된 바이오마커 쌍으로 이루어진 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널에 대한 반전 값에서의 변화를 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반전 값은 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화의 존재를 나타내며 임산부에서의 조산 가능성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 측정 단계는 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 대용 펩티드를 측정하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 임산부의 표 27 내지 59, 61 내지 72, 76 및 77에 명시된 바이오마커 쌍으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널에 대한 반전 값에서의 변화를 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반전 값은 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화의 존재를 나타내며 임산부에서의 조산 가능성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 측정 단계는 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 대용 펩티드를 측정하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 임산부의 표 26에 명시된 바이오마커로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널에 대한 반전 값에서의 변화를 측정하여, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 반전 값은 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화의 존재를 나타내며 임산부에서의 조산 가능성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 측정 단계는 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 대용 펩티드를 측정하는 단계를 포함한다.
출산까지의 기간을 예측하도록 지시된 방법에 대해, "출산"은 막의 파열이 있거나 없는, 진통의 자연 개시에 이은 출산을 의미한다.
임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법에 관하여 개시 및 예시되었지만, 본 발명은 출산시 재태 기간(GAB)을 예측하는 방법, 만기 출산을 예측하는 방법, 임산부에서의 만기 출산의 가능성을 결정하는 방법뿐 아니라 임산부에서 출산까지의 기간을 예측하는 방법(TTB)에 유사하게 적용 가능하다. 상술한 방법 각각이 산모-태아 건강 고려와 관련하여 특이적이고 상당한 유용성 및 이득을 갖는다는 것이 당업자에게 분명해질 것이다.
또한, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법에 관하여 개시 및 예시되었지만, 본 발명은 이상 글루콜라 검사(abnormal glucola test), 임신성 당뇨병, 고혈압, 자간전증, 자궁내부 성장 제약, 사산, 태아 성장 제한, HELLP 증후군, 양수과소증(oligohyramnios), 융모양막염, 융모양막염, 태반 전치(previa), 태반 유착(acreta), 박리,박리 태반, 태반 출혈, 만삭전 조기 양막 파열, 조기 진통, 부정적 자궁경부, 과숙 임신(postterm pregnancy), 담석증, 자궁 과다 팽창(uterine over distention), 스트레스를 예측하는 방법에 유사하게 적용 가능하다. 하기에 더욱 상세하게 개시되는 바에 있어서, 본원에 개시된 분류인자는, 예를 들어 자간전증 또는 임신성 당뇨병과 같은 병태에 기초하여 의학적으로 지시된 PTB의 성분에 대해 예민하다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 출산까지의 기간(TTB)의 강한 예측변수인 ITIH4/CSH를 사용함으로써 본원에 예시된 바이오마커, 바이오마커 쌍 및/또는 반전을 제시한다(도 10). TTB는 GABD와 출산시 재태 기간 사이의 차이로서 정의된다. 이 발견은 개별적으로 또는 TTB 또는 GABD의 상기 피분석물의 수학적 조합으로 예측을 가능하게 한다. 사례 대 대조군 차이가 결여되어 있으나 임신에 걸친 피분석물 강도에서의 변화를 나타내는 피분석물은 본 발명의 방법에 따른 임신 시계에서 유용하다. 다른 장애의 조산을 진단할 수 없는 다중 피분석물의 교정은 임신 날짜를 결정하는데 사용될 수 있다. 상기 임신 시계는 다른 척도(예를 들어, 마지막 생리 기간 일자 및/또는 초음파 날짜 결정)에 의해 날짜 결정을 확인하는데 가치가 있거나, 예를 들어 sPTB, GAB 또는 TTB를 후속적으로 보다 정확하게 예측하기 위해 단독으로 유용하다. 본원에서 "시계 단백질"로도 지칭되는 이들 피분석물은 다른 날짜 결정 방법의 부재시 또는 다른 날짜 결정 방법과 함께 임신 날짜를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 표 60은 TTB 및 GAB를 예측하기 위한 본 발명의 임신 시계에 유용한 시계 단백질의 목록을 제시한다.
추가 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법은 조산과 연관된 1종 이상의 위험 징후에 대한 측정 가능한 특징을 검출하는 단계를 더 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 위험 징후는 이전의 저체중아 분만 또는 조기 분만, 복수의 제2기 3개월의 자연 유산, 이전의 제1기 3개월의 인공 유산, 가족 및 세대간 인자, 불임의 이력, 미분만, 임신력(gravidity), 초임부, 경임부, 태반 이상, 자궁경부 및 자궁 이상, 임신성 출혈, 자궁내부 성장 제약, 자궁내 디에틸스틸베스트롤 노출, 다태 임신, 영아 성별, 저신장, 낮은 임신전 체중, 낮거나 높은 체질량 지수, 당뇨병, 고혈압, 및 비뇨생식기 감염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
"측정 가능한 특징"은 대상체에서의 조산 가능성과 결정 및 연관될 수 있는 임의의 특성, 특징 또는 양태이다. 상기 용어는 GAB의 예측, 조산의 예측, 또는 임산부에서 출산까지의 기간의 예측과 결정 및 연관될 수 있는 임의의 특성, 특징 또는 양태를 더 포함한다. 바이오마커에 대해, 상기 측정 가능한 특징은, 예를 들어 생물학적 샘플에서 바이오마커, 또는 이의 단편의 존재, 부재, 또는 농도, 변경된 구조, 예컨대 번역후 변형, 예컨대 바이오마커의 아미노산 서열 상의 한군데 이상의 자리에서의 산화의 존재 또는 양 또는, 예를 들어 만기 대조군 대상체에서의 바이오마커의 형태와 비교하여 변경된 형태의 존재, 및/또는 1종 이상의 바이오마커의 프로파일의 일부로서 바이오마커의 존재, 양, 또는 변경된 구조를 포함할 수 있다.
바이오마커 이외에, 측정 가능한 특징은, 예를 들어 산모 특징, 연령, 인종, 민족성, 병력, 지난 임신 이력, 산과 이력을 포함한 위험 징후를 더 포함할 수 있다. 위험 징후에 대해, 측정 가능한 특징은, 예를 들어 이전의 저체중아 분만 또는 조기 분만, 복수의 제2기 3개월의 자연 유산, 이전의 제1기 3개월의 인공 유산, 가족 및 세대간 인자, 불임의 이력, 미분만, 태반 이상, 자궁경부 및 자궁 이상, 짧은 자궁경부 길이 측정치, 임신성 출혈, 자궁내부 성장 제약, 자궁내 디에틸스틸베스트롤 노출, 다태 임신, 영아 성별, 저신장, 낮은 임신전 체중/낮은 체질량 지수, 당뇨병, 고혈압, 비뇨생식기 감염, 갑상선 기능저하증, 천식, 낮은 교육 정도, 흡연, 약물 사용 및 알코올 섭취를 더 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 체질량 지수(BMI)의 계산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조산의 가능성을 결정하는 개시 방법은 질량 분석법, 포획제 또는 이의 조합을 사용하여 1종 이상의 바이오마커를 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함한다.
추가 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 개시 방법은 임산부로부터 생물학적 샘플을 제공하는 초기 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 개시 방법은 상기 가능성을 의료인에 전달하는 단계를 포함한다. GAB를 예측하는 개시 방법, 만기 출산을 예측하는 방법, 임산부에서의 조산의 가능성을 결정하는 방법뿐 아니라 임산부에서 출산까지의 기간을 예측하는 방법은 유사하게 상기 가능성을 의료인에 전달하는 단계를 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계에 관하여 개시 및 예시되었으나, 본 발명에 걸쳐 개시된 모든 실시양태는 GAB를 예측하는 방법, 만기 출산을 예측하는 방법, 임산부에서의 조산의 가능성을 결정하는 방법뿐 아니라 임산부에서 출산까지의 기간을 예측하는 방법에 유사하게 적용 가능하다. 구체적으로, 조산에 대한 방법에 관한 명시적 언급과 함께 본 출원에 걸쳐 언급된 바이오마커 및 패널은 또한 GAB를 예측하는 방법, 만기 출산을 예측하는 방법, 임산부에서의 조산의 가능성을 결정하는 방법뿐 아니라 임산부에서 출산까지의 기간을 예측하는 방법에서 사용될 수 있다. 상술한 방법 각각이 산모-태아 건강 고려에 관하여 특이적이고 상당한 유용성 및 이득을 갖는다는 것이 당업자에게 분명해질 것이다.
추가 실시양태에서, 전달은 임산부에 대한 후속 치료 결정을 알려준다. 일부 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법은 위험 스코어로서 상기 가능성을 표현하는 추가적인 특징을 포함한다.
본원에 개시된 방법에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계는 알려진 출산시 재태 기간으로 조산 임신 및 만기 임신의 코호트에서의 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커의 비를 측정함으로써 가능성/위험 지수의 형성을 포함하는 초기 단계를 포함한다. 개별 임신에 대해, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계는 가능성/위험 지수를 형성하고, 측정된 비를 위험 지수와 비교하여 개별 임신에 대한 개인화된 위험을 유도하는 초기 단계에서 사용되는 바와 동일한 측정 방법을 사용하여 단리된 바이오마커의 비를 측정하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 조산 위험 지수는 출산시 재태 기간이 기록된 조산 및 만기 임신의 코호트에서 IBP4/SHBG의 비를 측정함으로써 형성된다. 이어서, 임상 실습에서 지수 그룹에서와 동일한 단리 및 IBP4/SHBG를 유도하기 위한 측정 기술을 사용하여 조산 위험을 유도하기 위해 개별 임신에서의 IBP4/SHBG의 측정된 비가 상기 지수에서 비교된다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "위험 스코어"는 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서의 1종 이상의 바이오마커의 양 또는 반전 값을 임산부의 무작위 풀(pool)로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 계산된 1종 이상의 바이오마커의 평균 양을 나타내는 표준 또는 기준 스코어와 비교한 것에 기초하여 부여될 수 있는 스코어를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 위험 스코어는 반전 값의 로그, 즉 개별 바이오마커의 상대 강도의 비로서 표현된다. 당업자는 위험 스코어가 다양한 데이터 변형에 기초하여 표현될 수 있을 뿐 아니라 비 그 자체로서 표현될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 특히 반전 쌍에 관하여, 당업자는 분자 및 분모에서의 바이오마커가 전환되는 경우, 임의의 비가 동일하게 유익하거나, 관련 데이터 변형(예를 들어, 빼기)이 적용된다는 것을 이해할 것이다. 바이오마커의 수준은 임신에 걸쳐 고정될 수 없기 때문에, 표준 또는 기준 스코어는 샘플을 얻은 시기의 임산부의 것과 대응되는 임신 시점에 대해 수득되었어야 한다. 표준 또는 기준 스코어는 상기 가능성이 대상체에 대해 결정되는 시기마다 비교가 실제로 수행되기 보다는 간접적이 되도록, 미리 결정되고 예측변수 모델로 짜여질 수 있다. 위험 스코어는 표준치(예를 들어, 숫자) 또는 임계치(예를 들어, 그래프 상의 선)일 수 있다. 위험 스코어의 값은 임산부의 무작위 풀로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 계산된 1종 이상의 바이오마커의 평균 양으로부터의 상향 또는 하향 편차와 연관된다. 특정 실시양태에서, 위험 스코어가 표준 또는 기준 위험 스코어에 비해 클 경우, 임산부는 조산의 증가된 가능성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 기준 위험 스코어를 초과하는 만큼의 임산부의 위험 스코어의 규모, 또는 양은 임산부의 위험한 수준을 표시하거나, 이와 연관될 수 있다.
본원에 예시된 바에 있어서, PreTRMTM 분류인자는 IBP4 펩티드 전이물(QCHPALDGQR_394.5_475.2) 및 SHBG 펩티드 전이물(IALGGLLFPASNLR_481.3_657.4)의 SIS 정규화 강도의 자연 로그로서 정의된다. Score = ln(P1 n/P2 n)이고, 여기서 P1 n 및 P2 n는 각각 IBP4 및 SHBG 전이물에 대한 SIS 정규화 피크 면적 값을 나타낸다. SIS 정규화는 대응 SIS 피크 면적으로 나눈 내인성 피크 면적의 상대 비로서 정의된다: 예를 들어, P1 n = P1 e/P1 SIS, 여기서 P1 e = IBP4 내인성 전이물에 대한 피크 면적이고, P1 SIS = IBP4 SIS 전이물에 대한 피크 면적이다. PreTRMTM 스코어의 분포와 대응 출현율 조정 양성 예측도 사이의 식별된 연관성으로부터, sPTB의 가능성이 스코어의 결정에 기초하여 알려지지 않은 대상체에 부여될 수 있다. 이 관계 또는 연관성은 도 25에 도시되어 있으며, 실험실 측정과 임상 예측을 연결한다.
PreTRMTM 분류인자는 IBP4 펩티드 전이물(QCHPALDGQR_394.5_475.2) 및 SHBG 펩티드 전이물(IALGGLLFPASNLR_481.3_657.4)의 SIS 정규화 강도의 자연 로그로서 정의되는 한편, 본 발명은 또한 다중 반전을 포함하는 분류인자를 포함한다. 개선된 성능은 1종 이상의 반전으로부터 형성되는 예측변수를 구성함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 예를 들어 별도 GABD 윈도우, 만삭전 조기 양막 파열(PPROM) 대 PPROM의 부재시 조기 통증(PTL), 태아 성별, 초임부 대 경임부에 대해 강한 예측 성능을 갖는 다중 반전을 포함한다. 이 실시양태는 재태 기간 범위의 초기(예를 들어, 17-19주) 또는 후기(예를 들어, 19-21주)에 강한 예측 성능을 형성한 반전에 대하여 실시예 10, 및 표 61에 예시된다. 예시된 바에 있어서, 다중 반전의 조합(SumLog)으로부터 형성된 예측변수의 성능을 전체 채혈 범위에 대해 평가하였으며, 개별 반전의 로그 값을 더한 것(SumLog)으로부터 예측변수 스코어를 유도하였다. 당업자는 1종 이상의 반전으로부터 형성되는 예측변수를 구성하기 위해 다른 모델(예를 들어, 로지스틱 회귀분석)을 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은 알려진 임상 인자, 예를 들어 채혈 기간, 태아 성별, 임신력뿐 아니라 임의의 다른 알 수 있는 환자 특징 및/또는 본 출원에 걸쳐 개시된 위험 인자에 기초하여 반전 중 1종 또는 하위 세트를 선택하는 지시 변수(indicator variable)를 함유하는 분류인자를 더 포함한다. 이 실시양태는 실시예 10, 표 61 내지 64에 예시되어 있으며, 이는 sPTB, PPROM 및 PTL 중 2종의 상이한 표현형에 대해 독립적으로 반전 성능(17-21주)을 예시한다. 이 실시양태는 실시예 10, 표 76 및 77 및 도 108 및 109에 유사하게 예시되어 있으며, 이는 sPTB, 만삭전 조기 양막 파열(PPROM) 및 PPROM의 부재시 조기 통증(PTL) 중 2종의 상이한 표현형에 대해 독립적으로 반전 성능(19-21주)을 예시한다. 따라서, 본 발명의 방법은 PPROM 및 PTL의 독립적 예측변수를 수립하거나, 상기 개시된 바와 같은 단일 예측변수에서 1종 이상의 반전의 조합을 이용하여 전체적인 성능을 최대화하기 위한 반전의 선택을 포함한다. 이 실시양태는 실시예 10, 표 65-68에 더 예시되어 있으며, 이는 sPTB, 초임부 및 경임부 중 2종의 상이한 표현형에 대해 독립적으로 반전 성능(17-21주)을 예시한다. 이 실시양태는 실시예 10, 표 69-72 및 도 106에 더 예시되어 있으며, 이는 태아 성별에 기초하는 sPTB 중 2종의 상이한 표현형에 대해 독립적으로 반전 성능(17-21주)을 예시한다. PPROM 및 PTL, 임신력 및 태아 성별에 관하여 예시되는 한편, 본 발명의 방법은 GABD 또는 본원에 개시되거나 이와 달리 당업자에게 알려진 임의의 알려진 임상 인자/위험 인자에 기초하여 반전 중 1종 또는 하위 세트를 선택하는 지시 변수를 함유하는 분류인자를 더 포함한다. 지시 변수를 포함하는 분류인자를 갖기 위한 대안으로서, 본 발명은 GABD 또는 본원에 개시되거나 이와 달리 당업자에게 알려진 임의의 알려진 임상 인자/위험 인자에 기초하여 임산부의 하위 세트에 맞춤화된 별도 분류인자를 더 제시한다. 예를 들어, 이 실시양태는 각각의 시간 윈도우에 대해 최고 성능 반전에 기초하는 GABD에 대해 연속적이고/이거나 중첩하는 시간 윈도우에 대해 별도 분류인자를 포함한다.
본원에 예시된 바에 있어서, 청구된 방법의 예측 성능은 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 BMI 계층화를 이용하여 개선될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 명시된 BMI를 갖는 임산부로부터 수득된 샘플을 이용하여 실행될 수 있다. 간략하게는, BMI는 개체의 미터 신장의 제곱으로 나눈 킬로그램 체중이다. BMI는 체지방을 직접 측정하지 않지만, 연구는 BMI가 피하지방 두께 측정, 생체전기 저항, 덴시토메트리(densitometry)(수중 체중법(underwater weighing)), 이중 에너지 방사선 흡수 계측법(dual energy x-ray absorptiometry)(DXA) 및 다른 방법으로부터 수득된 체지방의 더욱 직접적인 측정치와 연관되어 있다는 것을 나타내었다. 또한, BMI는 이들 신체 비만의 더욱 직접적인 측정치로서 다양한 신진대사 및 질환 결과와 강하게 연관되어 있는 것으로 나타난다. 일반적으로, 18.5 미만의 BMI를 갖는 개체는 저체중으로 간주되고, 18.5 이상 내지 24.9의 BMI를 갖는 개체는 정상 체중으로 간주되는 한편, 25.0 이상 내지 29.9의 BMI를 갖는 개체는 과체중인 것으로 간주되며, 30.0 이상의 BMI를 갖는 개체는 비만인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 청구된 방법의 예측 성능은 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이상, 27 이상, 28 이상, 29 이상 또는 30 이상의 BMI 계층화를 이용하여 개선될 수 있다. 다른 실시양태에서, 청구된 방법의 예측 성능은 18 이하, 19 이하, 20 이하, 21 이하, 22 이하, 23 이하, 24 이하, 25 이하, 26 이하, 27 이하, 28 이하, 29 이하 또는 30 이하의 BMI 계층화를 이용하여 개선될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "생물학적 샘플"은 임산부로부터 얻어지며, 본원에 개시된 1종 이상의 바이오마커를 함유하는 임의의 샘플을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 적합한 샘플은, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 양수, 질 분비물, 침, 및 소변을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특별한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청이다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 생물학적 샘플은 혈액의 임의의 파편(fraction) 또는 성분, 비제한적으로, T 세포, 단핵구, 호중구, 적혈구, 혈소판 및 미세소포(microvesicle), 예컨대 엑소좀(exosome) 및 엑소좀-유사 비히클을 포함할 수 있다. 특별한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈청이다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "조산"은 37주 완료 미만의 재태 기간의 분만 또는 출산을 지칭한다. 조산의 다른 일반적으로 사용되는 하위범주는 중앙 조산(임신의 33주 내지 36주의 출산), 매우 조산(임신의 <33주의 출산), 및 극심한 조산(임신의 ≤28주의 출산)으로 수립 및 설명되었다. 본원에 개시된 방법에 대하여, 당업자는 조산 및 만기 출산을 기술하는 컷-오프뿐 아니라 조산의 하위범주를 설명하는 컷-오프가 본원에 개시된 방법을 실행하는 단계에서, 예를 들어 특정 건강 이득을 최대화하기 위해 조정될 수 있다는 것을 이해한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 조산을 설명하는 컷-오프는, 예를 들어 임신의 ≤37주, 임신의 ≤36주, 임신의 ≤35주, 임신의 ≤34주, 임신의 ≤33주, 임신의 ≤32주, 임신의 ≤30주, 임신의 ≤29주, 임신의 ≤28주, 임신의 ≤27주, 임신의 ≤26주, 임신의 ≤25주, 임신의 ≤24주, 임신의 ≤23주 또는 임신의 ≤22주의 출산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조산을 설명하는 컷-오프는 임신의 ≤35주이다. 상기 조정은 당업자로 간주되는 개인의 기술 세트 내에 있으며, 본원에 개시된 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것이 더 이해된다. 재태 기간은 출산을 위한 태아 발달 정도 및 태아의 준비도를 대표한다. 재태 기간은 전형적으로 마지막 정상 생리 일자로부터 출산일까지의 기간의 길이로서 정의되어 왔다. 그러나, 산과 측정 및 초음파 추산이 또한 재태 기간을 추산하는데 도움을 줄 수 있다. 조산은 일반적으로 2개의 별도 하위그룹으로 분류되어 왔다. 첫째, 자연 조산은 후속 진통 증가 또는 제왕절개 분만에 관계없이 조기 진통 또는 만삭전 조기 양막 파열의 자연 개시에 이어 발생하는 것이다. 둘째, 의학적으로 지시된 조산은 여성의 간호인(caregiver)이 산모 및/또는 태아의 건강 또는 생명을 위협하는 것으로 결정한 1종 이상의 조건에 대한 유도 또는 제왕절개에 따라 발생하는 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 자연 조산 또는 의학적으로 지시된 조산에 대한 가능성을 결정하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 자연 조산에 대한 가능성을 결정하는 것에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 의학적으로 지시된 조산에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 출산시 재태 기간을 예측하는 것에 관한 것이다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "추산된 재태 기간" 또는 "추산된 GA"는 마지막 정상 생리 일자 및 추가 산과 측정, 초음파 추산 또는, 비제한적으로 앞선 단락에서 개시된 것들을 포함한 다른 임상 파라미터에 기초하여 결정된 GA를 지칭한다. 이와 반대로, 용어 "예측된 출산시 재태 기간" 또는 "예측된 GAB"는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법에 기초하여 결정된 GAB를 지칭한다. 본원에 사용된 바에 있어서, "만기 출산"은 37주 완료 이상의 재태 기간의 출산을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 임산부는 생물학적 샘플이 수집된 시기에 임신 17주 내지 28주이며, GABD(채혈시 재태 기간)로도 지칭된다. 다른 실시양태에서, 임산부는 생물학적 샘플이 수집된 시기에 임신 16주 내지 29주, 17주 내지 28주, 18주 내지 27주, 19주 내지 26주, 20주 내지 25주, 21주 내지 24주, 또는 22주 내지 23주이다. 추가 실시양태에서, 임산부는 생물학적 샘플이 수집된 시기에 임신 약 17주 내지 22주, 약 16주 내지 22주, 약 22주 내지 25주, 약 13주 내지 25주, 약 26주 내지 28주, 또는 약 26주 내지 29주이다. 따라서, 생물학적 샘플이 수집된 시기에 임산부의 재태 기간은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30주일 수 있다. 특별한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 임신 19주 내지 21주에 수집된다. 특별한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 19주 내지 22주의 재태 기간에 수집된다. 특별한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 19주 내지 21주의 재태 기간에 수집된다. 특별한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 19주 내지 22주의 재태 기간에 수집된다. 특별한 실시양태에서, 생물학적 샘플은 18주의 재태 기간에 수집된다. 추가 실시양태에서, 연속적이거나 중첩하는 시간 윈도우에 대한 최고 수행 반전은 단일 분류인자와 조합되어, 채혈시 재태 기간의 더 넓은 윈도우에 걸친 sPTB의 가능성을 예측할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "양" 또는 "수준"은 생물학적 샘플 및/또는 대조군에서 검출 가능하거나 측정 가능한 바이오마커의 양을 지칭한다. 바이오마커의 양은, 예를 들어, 폴리펩티드의 양, 핵산의 양, 또는 단편 또는 대용의 양일 수 있다. 상기 용어는 대안적으로 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바이오마커의 용어 "양" 또는 "수준"은 상기 바이오마커의 측정 가능한 특징이다.
본 발명은 또한 임산부의 표 1 내지 77 및 도 1 내지 111 중 임의의 것에 명시된 바이오마커 쌍으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b. 생물학적 샘플을 상기 쌍의 제1 멤버와 특이적으로 결합하는 제1 포획제 및 상기 쌍의 제2 멤버와 특이적으로 결합하는 제2 포획제와 접촉시킴으로써, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및 상기 쌍의 제1 바이오마커와 제1 포획제 사이 및 상기 쌍의 제2 멤버와 제2 포획제 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 임산부의 표 27 내지 59, 61 내지 72, 76 및 77에 명시된 바이오마커 쌍으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b. 생물학적 샘플을 상기 쌍의 제1 멤버와 특이적으로 결합하는 제1 포획제 및 상기 쌍의 제2 멤버와 특이적으로 결합하는 제2 포획제와 접촉시킴으로써, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및 상기 쌍의 제1 바이오마커와 제1 포획제 사이 및 상기 쌍의 제2 멤버와 제2 포획제 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 임산부에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b. 생물학적 샘플을 상기 쌍의 제1 멤버와 특이적으로 결합하는 제1 포획제 및 상기 쌍의 제2 멤버와 특이적으로 결합하는 제2 포획제와 접촉시킴으로써, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및 상기 쌍의 제1 바이오마커와 제1 포획제 사이 및 상기 쌍의 제2 멤버와 제2 포획제 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서 IBP4 및 SHBG를 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; b. 생물학적 샘플을 IBP4에 특이적으로 결합하는 포획제 및 SHBG에 특이적으로 결합하는 포획제와 접촉시킴으로써, IBP4 및 SHBG가 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및 c. IBP4와 포획제 사이 및 SHBG와 포획제 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 바이오마커 쌍에 대한 반전 값을 측정하는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 임산부와 만기 대조군 사이의 반전 값에서의 변화의 존재는 임산부에서의 조산 가능성을 나타낸다. 일 실시양태에서, 샘플은 19주 내지 21주의 재태 기간에 수득된다. 추가 실시양태에서, 포획제는 항체, 항체 단편, 핵산-계 단백질 결합 시약, 이의 소분자 또는 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 상기 방법은 효소 면역분석법(EIA), 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 및 방사면역측정법(RIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에세이에 의해 수행된다.
본 발명은 또한 임산부에서 IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, 및 HPX/PTGDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 b. 샘플을 질량 분석법 정량화로 구성된 프로테오믹스 워크-플로우에 처리시키는 단계를 포함하는, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 임산부에서 IBP4 및 SHBG를 검출하는 방법을 제시하며, 상기 방법은 a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 b. 샘플을 질량 분석법 정량화로 구성된 프로테오믹스 워크-플로우에 처리시키는 단계를 포함하는, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
"프로테오믹스 워크-플로우"는 일반적으로 다음 단계 중 1종 이상을 포함한다: 혈청 샘플을 해동하고, 면역-친화 크로마토그래피에 의해 14개의 최고 풍부(high abundance) 단백질을 제거시킨다. 프로테아제, 예를 들어 트립신을 사용하여 제거처리된 혈청을 분해시켜, 펩티드를 얻는다. 상기 분해는 후속적으로 SIS 펩티드의 혼합물을 이용하여 강화되고, 이어서 탈염되며, MRM 모드로 조작된 3중 사중극 기구(triple quadrapole instrument)를 이용해 LC-MS/MS 처리된다. 내인성 펩티드 피크 및 대응 SIS 펩티드 상대물 피크의 면적 비로부터 반응률을 형성한다. 당업자는, 예를 들어 MALDI-TOF, 또는 ESI-TOF와 같은 다른 유형의 MS가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다는 것을 인식한다. 또한, 당업자는, 예를 들어 특정 시약(예컨대, 프로테아제)을 선택하거나, 특정 단계를 생략 또는 변경함으로써(예를 들어, 면역제거가 필요하지 않을 수 있고, SIS 펩티드는 더 일찍 또는 더 늦게 첨가될 수 있으며, 펩티드를 대신하여 안정 동위원소 표지 단백질이 표준으로서 사용될 수 있다) 프로테오믹스 업무-흐름을 수정할 수 있다.
샘플에서 바이오마커, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및/또는 이의 단편 및 임의로 1종 이상의 다른 바이오마커 또는 이의 단편의 존재 또는 부재(예를 들어, 존재 대 부재; 또는 검출 가능한 양 대 검출 불가능한 양 판독) 및/또는 양(예를 들어, 절대 또는 상대 농도와 같은 절대 또는 상대 양 판독)을 측정하기 위해, 임의의 기존의, 이용 가능하거나 종래의 분리, 검출 및 정량화 방법이 본원에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커의 검출 및/또는 정량화는 포획제를 사용하는 에세이를 포함한다. 추가 실시양태에서, 포획제는 항체, 항체 단편, 핵산-계 단백질 결합 시약, 이의 소분자 또는 변이체이다. 추가 실시양태에서, 에세이는 효소 면역분석법(EIA), 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 및 방사면역측정법(RIA)이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 바이오마커의 검출 및/또는 정량화는 질량 분석법(MS)을 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 질량 분석법은 공동-면역침강-질량 분석법(co-immunoprecitipation-mass spectrometry)(co-IP MS)이며, 전체 단백질 복합물의 단리에 적합한 기법인 공동면역침강에 이어 질량 분석이 수행된다.
본원에 사용된 바에 있어서, "질량 분석계"는 피분석물을 휘발/이온화시켜 기체상 이온을 형성하고, 이의 절대 또는 상대 분자 질량을 결정할 수 있는 장치를 지칭한다. 휘발/이온화의 적합한 방법은 기질-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption ionization)(MALDI), 전자분무, 레이저/광, 열, 전기, 원자화/분무화 등, 또는 이들의 조합이다. 질량 분석법의 적합한 형태는 이온 트랩 기구(ion trap instrument), 사중극 기구, 정전식 및 자성 섹터 기구(electrostatic and magnetic sector instrument), 비행 시간 기구(time of flight instrument), 비행 시간 이중 질량 분석계(time of flight tandem mass spectrometer)(TOF MS/MS), 푸리에 변환(Fourier-transform) 질량 분석계, 이들 유형의 질량 분석계의 다양한 조합으로 구성된 오비트랩(Orbitrap) 및 하이브리드 기구를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 기구는 기질-보조 레이저 탈착(MALDI), 전자분무, 또는 나노스프레이 이온화(ESI) 또는 이들의 조합을 포함한 질량 분석계 내로의 도입을 위해 샘플을 분별하고(예를 들어, 화학적, 또는 생물학적 특성을 기본으로 하는 액체 크로마토그래피 또는 고상 흡착 기법) 샘플을 이온화하는 다양한 다른 기구와 차례로 접속될 수 있다.
일반적으로, 펩티드의 질량, 및 바람직하게는 또한 선택된 펩티드의 단편화 및/또는 (부분적) 아미노산 서열에 대한 정밀한 정보를 제공할 수 있는 임의의 질량 분석(MS) 기법(예를 들어, 이중 질량 분석법, MS/MS; 또는 포스트 소스 디케이(post source decay), TOF MS)이 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 적합한 펩티드 MS 및 MS/MS 기법 및 시스템은 그 자체로(per se) 잘 알려져 있으며(예를 들어, Methods in Molecular Biology, vol. 146: "Mass Spectrometry of Proteins and Peptides", by Chapman, ed., Humana Press 2000; Biemann 1990. Methods Enzymol 193: 455-79; 또는 Methods in Enzymology, vol. 402: "Biological Mass Spectrometry", by Burlingame, ed., Academic Press 2005 참조), 본원에 개시된 방법을 실행하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 개시 방법은 정량적 MS를 수행하여 1종 이상의 바이오마커를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 정량적 방법은 자동화(Villanueva, et al., Nature Protocols (2006) 1(2):880-891) 또는 반자동화 형식으로 수행될 수 있다. 특별한 실시양태에서, MS는 액체 크로마토그래피 장치(LC-MS/MS 또는 LC-MS) 또는 기체 크로마토그래피 장치(GC-MS 또는 GC-MS/MS)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이 맥락에서 유용한 다른 방법은 동위원소-코딩 친화성 태그(isotope-coded affinity tag)(ICAT), 이중 질량 태그(tandem mass tag)(TMT), 또는 세포 배양에서 아미노산에 의한 안정 동위원소 표지(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)(SILAC)에 이은 크로마토그래피 및 MS/MS를 포함한다.
본원에 사용된 바에 있어서, 용어 "다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring)(MRM)" 또는 "선택 반응 모니터링(selected reaction monitoring)(SRM)"은 낮은 존재비의 피분석물을 정량화하는데 특히 유용한 MS 이용 정량화 방법을 지칭한다. SRM 실험에서, 사전 정의된 전구체 이온 및 1종 이상의 이의 단편은 3중 사중극 기구의 2개의 질량 필터에 의해 선택되고, 정밀한 정량화를 위해 시간에 걸쳐 모니터링된다. 다중 SRM 전구체 및 단편 이온 쌍은 상이한 전구체/단편 쌍 사이를 신속하게 토글링(toggling) 함으로써 동일한 실험에서 크로마토그래피 시간 척도로 측정되어, MRM 실험을 수행할 수 있다. 표적화된 피분석물(예를 들어, 펩티드 또는 소분자, 예컨대 화학적 개체, 스테로이드, 호르몬)의 보유 시간(retention time)과 조합된 일련의 전이물(전구체/단편 이온 쌍)은 최종 에세이를 구성할 수 있다. 많은 수의 피분석물이 단일 LC-MS 실험 동안 정량화될 수 있다. MRM 또는 SRM과 관련하여 용어 "예정된", 또는 "동적"은 특정 피분석물에 대한 전이물이 예상된 보유 시간 주변의 시간 윈도우에서만 수득되어, 단일 LC-MS 실험에서 검출 및 정량화될 수 있는 피분석물의 수를 유의미하게 증가시키고, 검사의 선택에 기여하는 에세이의 변형을 지칭하며, 이는 보유 시간이 피분석물의 물리적 성질에 의존하는 특성이기 때문이다. 단일 피분석물은 또한 1종 이상의 전이물을 이용하여 모니터링된다. 최종적으로, 에세이에 포함된 것은 관심 피분석물에 대응하는 표준일 수 있으나(예를 들어, 동일한 아미노산 서열), 안정 동위원소의 포함에 의해 상이할 수 있다. 안정 동위원소 표준(Stable isotopic standard)(SIS)은 정밀한 수준으로 에세이에 결합되고 대응하는 알려지지 않은 피분석물을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 추가 수준의 특이성은 알려지지 않은 피분석물 및 이의 대응 SIS의 공동-용출(co-elution) 및 이들의 전이물 특성(예를 들어, 알려지지 않은 2개의 전이물의 수준의 비 및 이의 대응 SIS의 2개의 전이물의 비에서의 유사성)에 의해 기여될 수 있다.
바이오마커 펩티드 분석에 적합한 질량 분석 에세이, 기구 및 시스템은, 비제한적으로 기질-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간(MALDI-TOF) MS; MALDI-TOF 포스트-소스-디케이(PSD); MALDI-TOF/TOF; 표면-강화 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)(SELDI-TOF) MS; 전자분무 이온화 질량 분석법(electrospray ionization mass spectrometry)(ESI-MS); ESI-MS/MS; ESI-MS/(MS)n (n은 0을 초과하는 정수이다); ESI 3D 또는 선형 (2D) 이온 트랩 MS; ESI 3중 사중극 MS; ESI 사중극 직교 TOF(Q-TOF); ESI 푸리에 변환 MS 시스템; 실리콘 상의 탈착/이온화(desorption/ionization on silicon)(DIOS); 2차 이온 질량 분석법(secondary ion mass spectrometry)(SIMS); 기압 화학 이온화 질량 분석법(atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry)(APCI-MS); APCI-MS/MS; APCI- (MS)n; 이온 이동도 분석법(ion mobility spectrometry)(IMS); 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(inductively coupled plasma mass spectrometry)(ICP-MS) 기압 광이온화 질량 분석법(atmospheric pressure photoionization mass spectrometry)(APPI-MS); APPI-MS/MS; 및 APPI- (MS)n을 포함할 수 있다. 이중 MS (MS/MS) 배열에서의 펩티드 이온 단편화는, 예를 들어 충돌 유도 해리(collision induced dissociation)(CID)와 같은 당업계에 정립된 방식을 사용하여 달성될 수 있다. 본원에 개시된 바에 있어서, 질량 분석법에 의한 바이오마커의 검출 및 정량화는 특히 Kuhn et al. Proteomics 4: 1175-86 (2004)에 개시된 바와 같은 다중 반응 모니터링(MRM)을 포함할 수 있다. LC-MS/MS 분석 동안의 예정된 다중-반응-모니터링(예정된 MRM) 모드 수집은 펩티드 정량화의 예민도 및 정확도를 향상시킨다. Anderson and Hunter, Molecular and Cellular Proteomics 5(4):573 (2006). 본원에 개시된 바에 있어서, 질량 분석법-이용 에세이는, 예를 들어 크로마토그래피 및 하기 본원에 개시된 다른 방법과 같은 업스트림 펩티드 또는 단백질 분리 또는 분별 방법과 유리하게 조합될 수 있다. 본원에 더 개시된 바에 있어서, 샷건(shotgun) 정량적 프로테오믹스는 조산의 예후 바오이마커의 고-처리량 식별 및 검증을 위해 SRM/MRM-이용 에세이와 조합될 수 있다.
당업자는 질량 측정 방법, 예컨대 MS/MS, LC-MS/MS, 다중 반응 모니터링(MRM) 또는 SRM 및 생성물 이온 모니터링(product-ion monitoring)(PIM)을 포함하고, 또한 웨스턴 블롯, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 면역침강, 면역조직화학, 면역형광법, 방사면역측정법, 도트 블롯팅(dot blotting), 및 FACS를 포함한 수많은 방법이 바이오마커의 수를 결정하는데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 바이오마커의 수준을 결정하는 단계는 면역분석법 및/또는 질량 분석 방법 사용을 포함한다. 추가 실시양태에서, 질량 분석 방법은 MS, MS/MS, LC-MS/MS, SRM, PIM, 및 당업계에 알려진 다른 상기 방법으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, LC-MS/MS는 1D LC-MS/MS, 2D LC-MS/MS 또는 3D LC-MS/MS를 더 포함한다. 면역분석 기법 및 프로토콜은 일반적으로 당업자에게 알려져 있다(Price and Newman, Principles and Practice of Immunoassay, 2nd Edition, Grove's Dictionaries, 1997; 및 Gosling, Immunoassays: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000.). 경쟁 및 비-경쟁 면역분석법을 포함한 다양한 면역분석 기법이 사용될 수 있다(Self et al., Curr . Opin . Biotechnol., 7:60-65 (1996)).
추가 실시양태에서, 면역분석법은 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침강, 면역조직화학, 면역형광법, 방사면역측정법(RIA), 도트 블롯팅, FACS로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 면역측정법은 ELISA이다. 또 다른 실시양태에서, ELISA는 직접 ELISA(효소-결합 면역흡착 분석법), 간접 ELISA, 샌드위치(sandwich) ELISA, 경쟁 ELISA, 복합 ELISA, ELISPOT 기술, 및 당업계에 알려진 다른 유사한 기법이다. 이들 면역분석 방법의 원리는 당업계, 예를 들어 John R. Crowther, The ELISA Guidebook, 1st ed., Humana Press 2000, ISBN 0896037282에 알려져 있다. 전형적으로 ELISA는 항체를 이용하여 수행되나, 본 발명의 1종 이상의 바이오마커에 특이적으로 결합하고 검출될 수 있는 임의의 포획제를 이용하여 수행될 수 있다. 복합 ELISA는 일반적으로 다수의 배열 주소로 단일 구획(예를 들어, 마이크로플레이트 웰(microplate well)) 내의 2종 이상의 피분석물을 동시에 검출하게 한다(Nielsen and Geierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 107-20 (2004) and Ling et al. 2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87-98 (2007)).
일부 실시양태에서, 방사면역측정법(RIA)은 본 발명의 방법에서 1종 이상의 바이오마커를 검출하는데 사용될 수 있다. RIA는 당업계에 잘 알려진 경쟁-이용 에세이이며, 알려진 양의 방사성-표지(예를 들어, 125I 또는 131I-표지) 표적 피분석물과 상기 피분석물에 대해 특이적인 항체를 혼합하는 단계, 이어서 샘플로부터의 비-표지 피분석물을 첨가하는 단계 및 대체된 표지 피분석물의 양을 측정하는 단계를 포함한다(예를 들어, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, by Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198 for guidance 참조).
검출 가능한 표지가 본 발명의 방법에서의 바이오마커의 직접 또는 간접 검출을 위해 본원에 개시된 에세이에서 사용될 수 있다. 요구되는 예민도, 항체와의 결합 용이성, 안정성 요구, 및 이용 가능한 계측 및 처리 공급에 따른 표지의 선택과 함께 광범위한 검출 가능 표지가 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에서 바이오마커의 에세이 검출에 기초하는 적합한 검출 가능 표지의 선택에 익숙하다. 적합한 검출 가능 표지는 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)(FITC), 오레곤 그린(Oregon Green)TM, 로다민, 텍사스 레드, 테트라호디민 이소티오시아네이트(tetrarhodimine isothiocynate)(TRITC), Cy3, Cy5 등), 형광 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)(GFP), 피코에리트린 등), 효소(예를 들어, 루시페라아제, 서양고추냉이 산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제 등), 나노입자, 비오틴, 디곡시게닌(digoxigenin), 금속 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
질량 분석법계 분석에 대해, 동위원소 시약을 이용한 차등 태그, 예를 들어 동위원소-코딩 친화성 태그(ICAT) 또는 동중핵(isobaric) 태그 시약을 사용하는 보다 최근의 변형, iTRAQ(Applied Biosystems, Foster City, Calif.), 또는 이중 질량 태그, TMT(Thermo Scientific, Rockford, IL)에 이은 다차원 액체 크로마토그래피(LC) 및 이중 질량 분석법(MS/MS) 분석은 본 발명의 방법을 실행하는데 추가 방법론을 제시할 수 있다.
화학발광 항체를 사용한 화학발광 에세이가 단백질 수준의 예민도, 비-방사성 검출을 위해 사용될 수 있다. 형광색소로 표지된 항체가 또한 적합할 수 있다. 형광색소의 예는, 비제한적으로 DAPI, 플루오레세인, Hoechst 33258, R-피코시아닌, B-피코에리트린, R-피코에리트린, 로다민, 텍사스 레드, 및 리사민(lissamine)을 포함한다. 간접 표지는 당업계에 잘 알려진 다양한 효소, 예컨대 서양고추냉이 산화효소(HRP), 알칼리 포스파타아제(AP), 베타-갈락토시다아제, 우레아제 등을 포함한다. 서양고추냉이-산화효소, 알칼리 포스파타아제, 및 베타-갈락토시다아제에 대해 적합한 기질을 사용하는 검출 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다.
직접 또는 간접 표지로부터의 신호는, 예를 들어 발색 기질로부터의 색을 검출하기 위한 분광광도계; 방사선을 검출하기 위한 방사선 카운터(counter), 예컨대 125I 검출용 감마 카운터; 또는 특정 파장의 빛의 존재시 형광을 검출하기 위한 형광계를 사용하여 분석될 수 있다. 효소-결합 항체의 검출을 위해, 정량적 분석이 분광광도계, 예컨대 제조사의 지시에 따른 EMAX 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)(Molecular Devices; Menlo Park, Calif.)를 사용하여 이루어질 수 있다. 소망하는 경우, 본 발명을 실행하기 위해 사용되는 에세이는 자동화되거나, 로봇으로 수행될 수 있으며, 다중 샘플로부터의 신호가 동시에 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 질량 분석법(MS)을 사용한 바이오마커의 정량화를 포함한다. 추가 실시양태에서, 질량 분석법은 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS), 다중 반응 모니터링(MRM) 또는 선택 반응 모니터링(SRM)일 수 있다. 추가 실시양태에서, MRM 또는 SRM은 예정된 MRM 또는 예정된 SRM을 더 포함할 수 있다.
상기 개시된 바에 있어서, 크로마토그래피는 또한 본 발명의 방법을 실행하는데 사용될 수 있다. 크로마토그래피는 화학 물질을 분리하는 방법을 포함하고, 일반적으로 피분석물의 혼합물이 액체 또는 기체("이동상")의 유동하는 흐름에 의해 운송되고 그것들이 고정 액체 또는 고체상("고정상") 주변 또는 그 위로 유동함에 따라, 유동상과 상기 고정상 사이에서 피분석물의 차등 분포의 결과로서 성분으로 분리되는 과정을 포함한다. 고정상은 일반적으로 미세하게 분할된 고체, 필터 재료의 시트, 또는 고체 표면 상의 액체의 박막 등일 수 있다. 크로마토그래피는 생물학적 기원의 화합물, 예컨대 아미노산, 단백질, 단백질 또는 펩티드의 단편 등의 분리에 적용 가능한 기법으로서 당업자에 의해 잘 이해될 것이다.
크로마토그래피는 칼럼형(columnar)(즉, 고정상이 칼럼 내에 놓여 있거나 패킹되어 있다), 바람직하게는 액체 크로마토그래피, 및 더욱 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography)(HPLC), 또는 초고성능/압력 액체 크로마토그래피(ultra high performance/pressure liquid chromatography)(UHPLC)일 수 있다. 크로마토그래피의 상세내용은 당업계에 잘 알려져 있다(Bidlingmeyer, Practical HPLC Methodology and Applications, John Wiley & Sons Inc., 1993). 크로마토그래피의 예시적 유형은, 비제한적으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), UHPLC, 정상(normal phase) HPLC(NP-HPLC), 역상(reversed phase) HPLC(RP-HPLC), 이온 교환(ion exchange) 크로마토 그래피(IEC), 예컨대 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 친수성 상호작용(hydrophilic interaction) 크로마토그래피(HILIC), 소수성(hydrophobic) 상호작용 크로마토그래피(HIC), 겔 여과 크로마토그래피 또는 겔 침투 크로마토그래피를 포함한 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피(SEC), 크로마토포커싱(chromatofocusing), 친화 크로마토그래피, 예컨대 면역-친화, 고정화 금속 친화 크로마토그래피 등을 포함한다. 단일 또는 2차원 이상의 크로마토그래피를 포함한 크로마토그래피는, 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같은 다운스트림(downstream) 질량 분석법과 같은 추가 펩티드 분석 방법과 함께 펩티드 분별 방법으로서 사용될 수 있다.
추가 펩티드 또는 폴리펩티드 분리, 식별 또는 정량화 방법은 본 발명의 바이오마커를 측정하기 위해 상기 개시된 분석 방법 중 임의의 것과 함께 사용될 수 있다. 상기 방법은, 비제한적으로 화학 추출 분할, 모세관 등전점 전기영동(capillary isoelectric focusing)(CIEF), 모세관 등속전기영동(isotachophoresis)(CITP), 모세관 전기크로마토그래피(electrochromatography)(CEC) 등을 포함한 등전점 전기영동(IEF), 1차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)(PAGE), 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(2D-PAGE), 모세관 겔 전기영동(CGE), 모세관 띠 전기영동(zone electrophoresis)(CZE), 미셀 계면동전위(micellar electrokinetic) 크로마토그래피(MEKC), 자유 유동(free flow) 전기영동(FFE) 등을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "포획제"는 표적, 특히 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 항체, 항체 단편, 핵산-계 단백질 결합 시약(예를 들어, 압타머(aptamer), 슬로우 오프-레이트 변형 압타머(Slow Off-rate Modified Aptamer)(SOMAmerTM)), 단백질-포획제, 천연 리간드(즉, 그것의 수용체 또는 그 반대에 대한 호르몬), 이의 소분자 또는 변이체를 포함한다.
포획제는 표적, 특히 바이오마커에 특이적으로 결합하도록 구성될 수 있다. 포획제는 유기 분자, 예컨대 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 당업자에게 식별 가능한 다른 비 중합 분자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에 개시된 실시양태에서, 포획제는 표적, 특히 바이오마커를 검출, 정제, 단리, 또는 풍부하게 하기 위해 사용될 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 임의의 업계 알려진 친화성 포획 기술은 개시 방법에서의 사용을 위한 생물학적 배지의 복합 혼합물의 성분인 바이오마커를 선택적으로 단리 및 풍부화/농축시키기 위해 사용될 수 있다.
바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체 포획제는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986)를 참조한다. 항체 포획제는 임의의 면역글로불린 또는 천연이거나 전체적으로 또는 부분적으로 합성되어 생성되는 이의 유도체일 수 있다. 특이적 결합력을 유지하는 이의 모든 유도체가 또한 상기 용어에 포함된다. 항체 포획제는 면역글로불린 결합 도메인에 상동성이거나 대개 상동성인 결합 도메인을 가지며, 천연 공급원으로부터 유래되거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성되어 생성될 수 있다. 항체 포획제는 단일클론성 또는 다클론성 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일쇄 항체이다. 당업자는 항체가, 예를 들어 인간화, 부분적 인간화, 키메라, 키메라 인간화 등을 포함한 임의의 다양한 형태로 제공될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 항체 포획제는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv 디아바디(diabody), 및 Fd 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 항체 단편일 수 있다. 항체 포획제는 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 포획제는 무손상 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있고/있거나 그것은 부분 항체 서열을 코딩하는 유전자로부터 재조합적으로 생성될 수 있다. 항체 포획제는 단일쇄 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 포획제는, 예를 들어 다이설피드 결합(disulfide linkage)에 의해 함께 연결된 다중쇄; 및 상기 분자로부터 수득된 임의의 기능성 단편을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 단편은 모 항체 분자의 특이적-결합 특성을 함유한다. 전체 분자의 기능성 성분으로서 작은 크기 때문에, 항체 단편은 특정 면역화학 기법 및 실험 적용에서의 사용을 위하여 무손상 항체에 비해 이점을 제공할 수 있다.
본 발명을 실행하기에 유용한 적합한 포획제는 또한 압타머를 포함한다. 압타머는 고유한 3차원(3-D) 구조를 통해 그것의 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열이다. 압타머는 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상이한 압타머는 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 압타머는 DNA 또는 RNA 또는 화학적으로 변형된 핵산일 수 있으며, 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 영역을 함유할 수 있고, 고차원 구조를 포함할 수 있다. 압타머는 또한 광자반응성(photoreactive) 또는 화학적으로 반응성인 작용기가 압타머에 포함되어 그것의 대응 표적에 그것이 공유적으로 결합되게 하는 포토압타머(photoaptamer)일 수 있다. 압타머 포획제의 사용은 동일한 바이오마커에 특이적으로 결합하는 2종 이상의 압타머의 사용을 포함할 수 있다. 압타머는 태그를 포함할 수 있다. 압타머는 SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 전신적 진화(systematic evolution of ligands by exponential enrichment))를 포함한, 임의의 알려진 방법, 과정을 사용하여 식별될 수 있다. 일단 식별되면, 압타머는 화학적 합성 방법 및 효소적 합성 방법을 포함한 임의의 알려진 방법에 따라 제조 또는 합성되고, 바이오마커 검출을 위한 다양한 적용에서 사용될 수 있다. Liu et al., Curr Med Chem. 18(27):4117-25 (2011). 본 발명의 방법을 실행하는데 유용한 포획제는 또한 개선된 오프-레이트 특징을 갖는 것으로 당업계에 알려진 SOMAmer(슬로우 오프-레이트 변형 압타머)를 포함할 수 있다. Brody et al., J Mol Biol. 422(5):595-606 (2012). SOMAmer는 SELEX 방법을 포함한 임의의 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
바이오마커는 그것들의 분해능을 개선하거나, 그것들의 신원을 결정하기 위해 분석 이전에 변형될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 예를 들어, 바이오마커는 분석 전에 단백질 가수분해를 겪을 수 있다. 임의의 프로테아제가 사용될 수 있다. 프로테아제, 예컨대 바이오마커를 분리된 수의 단편으로 분해할 수 있는 트립신이 특히 유용하다. 분해로부터 야기된 단편은 바이오마커에 대한 지문으로서 작용하므로 검출을 간접적으로 가능하게 한다. 이것은 문제의 바이오마커에 대해 교란될 수 있는 유사한 분자 질량을 갖는 바이오마커가 존재하는 경우에 특히 유용하다. 또한, 단백질 가수분해 단편화는 고분자량 바이오마커에 대해 유용하며, 이는 작은 바이오마커가 질량 분석법에 의해 더욱 용이하게 용해되기 때문이다. 다른 예에서, 바이오마커는 검출 분해능을 개선하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴라미니다아제는 당단백질로부터 말단 시알산 잔기를 제거하여 음이온성 흡착제에 대한 결합을 개선하고 검출 분해능을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 바이오마커는 분자 바이오마커에 특이적으로 결합하여 그것들을 더 구별하는 특정 분자량의 태그의 부착에 의해 변형될 수 있다. 임의로는, 상기 변형된 바이오마커를 검출하는 단계 이후에, 바이오마커의 신원은 단백질 데이터베이스(예를 들어, SwissProt)에서 변형된 바이오마커의 물리적 및 화학적 특징을 매칭시킴으로써 더 결정될 수 있다.
샘플에서의 바이오마커가 검출을 위해 기재 상에서 포획될 수 있다는 것이 당업계에서 더 인식된다. 전통적 기재는 항체-코팅된 96개의 웰 플레이트 또는 단백질의 존재에 대해 후속적으로 조사되는 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)을 포함한다. 대안적으로, 마이크로스피어(microsphere), 마이크로입자, 마이크로비드, 비드, 또는 다른 입자에 부착되는 단백질-결합 분자가 바이오마커의 포획 및 검출을 위해 사용될 수 있다. 단백질-결합 분자는 항체, 펩티드, 펩토이드(peptoid), 압타머, 소분자 리간드 또는 입자의 표면에 부착되는 다른 단백질-결합 포획제일 수 있다. 각각의 단백질-결합 분자는 다른 단백질-결합 분자에 부착되어 복합 에세이에서 바이오마커의 검출을 허용하는 다른 검출 가능 표지로부터 구별될 수 있도록 코딩되는 고유한 검출 가능 표지를 포함할 수 있다. 예는 알려진 형광 강도를 이용한 컬러-코딩 마이크로스피어(예를 들어, Luminex (Austin, Tex.)에 의해 생산된 xMAP 기술을 이용한 마이크로스피어 참조); 퀀텀 닷 나노결정을 함유하는, 예를 들어 퀀텀 닷 색의 다른 비 및 조합을 갖는 마이크로스피어(예를 들어, Life Technologies (Carlsbad, Calif.)에 의해 생산된 Qdot 나노결정); 유리 코팅 금속 나노입자(예를 들어, Nanoplex Technologies, Inc. (Mountain View, Calif.)에 의해 생산된 SERS 나노태그 참조); 바코드 재료(예를 들어, Nanoplex Technologies, Inc.에 의해 생산된 나노바코드와 같은 서브-마이크론 크기의 줄무늬 금속 막대 참조), 컬러 바 코드를 갖는 코딩 마이크로입자(예를 들어, Vitra Bioscience, vitrabio.com에 의해 생산된 CellCard), 디지털 홀로그램 코드 이미지를 갖는 유리 마이크로입자(예를 들어, Illumina (San Diego, Calif.)에 의해 생산된 CyVera 마이크로비드); 화학 발광 염료, 염료 화합물의 조합; 및 검출 가능하게 상이한 크기의 비드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양태에서, 바이오칩이 본 발명의 바이오마커의 포획 및 검출을 위해 사용될 수 있다. 많은 바이오칩이 당업계에 알려져 있다. 이들은, 예를 들어 Packard BioScience 사(Meriden Conn.), Zyomyx (Hayward, Calif.) 및 Phylos (Lexington, Mass.)에 의해 생산된 단백질 바이오칩을 포함한다. 일반적으로, 단백질 바이오칩은 표면을 갖는 기질을 포함한다. 포획 시약 또는 흡착제는 기질의 표면에 부착된다. 흔히, 표면은 다수의 주소 지정 가능한 위치를 포함하며, 이들 각각의 위치는 그것에 결합된 포획제를 갖는다. 포획제는 생물학적 분자, 예컨대 폴리펩티드 또는 핵산일 수 있으며, 이는 특이적 방식으로 다른 바이오마커를 포획한다. 대안적으로, 포획제는 크로마토그래피 재료, 예컨대 음이온 교환 재료 또는 친수성 재료일수 있다. 단백질 바이오칩의 예는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 바이오마커 쌍의 반전 값에서의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 조산의 가능성을 예측하는 방법을 제시한다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 결합제를 포함하는 패널과 접촉될 수 있다. 이어서, 검출된 1종 이상의 바이오마커의 발현은 하기 개시된 방법에 따라, 예를 들어 핵산 증폭 방법의 사용과 함께 또는 이의 사용 없이 평가될 수 있다. 숙달된 의사는 본원에 개시된 방법에서 유전자 발현의 측정이 자동화될 수 있다는 것을 인식한다. 예를 들어, 유전자 발현의 복합화된 측정을 수행할 수 있는 시스템이 사용되어, 예를 들어 수백개의 mRNA 종의 상대 존재비의 디지털 판독을 동시에 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 증폭 방법이 폴리뉴클레오티드 바이오마커를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브(probe)는 다양한 잘 알려지고 정립된 방법론(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, pp. 7.37-7.57 (2nd ed., 1989); Lin et al., in Diagnostic Molecular Microbiology, Principles and Applications, pp. 605-16 (Persing et al., eds. (1993); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (2001 및 후속 업데이트)) 중 임의의 것에 의해 단리된 핵산 기재를 사용하는 증폭 및 검출 방법에서 사용될 수 있다. 핵산을 증폭시키는 방법은, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)(PCR) 및 역전사 PCR(RT-PCR)(예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호; 제4,683,202호; 제4,800,159호; 제4,965,188호 참조), 리가아제(ligase) 연쇄 반응(LCR)(예를 들어, Weiss, Science 254:1292-93 (1991) 참조), 가닥 변위 증폭(strand displacement amplification)(SDA)(예를 들어, Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 (1992); 미국 특허 제5,270,184호 및 제5,455,166호 참조), 호열성(Thermophilic) SDA(tSDA)(예를 들어, 유럽 특허 제0 684 315호) 및 미국 특허 제5,130,238호; Lizardi et al., BioTechnol. 6:1197-1202 (1988); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-77 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-78 (1990); 미국 특허 제5,480,784호; 제5,399,491호; 미국특허 공개 제2006/46265호에 개시된 방법을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서의 mRNA를 측정하는 단계는 생물학적 샘플에서의 대응 단백질 바이오마커의 수준을 검출하기 위한 대용으로서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 바이오마커, 바이오마커 쌍 또는 바이오마커 역전 패널 중 임의의 것은 또한 적절한 RNA를 검출함으로써 검출될 수 있다. mRNA의 수준은 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR 이후 RT-PCR)에 의해 측정될 수 있다. RT-PCR은 mRNA로부터 cDNA를 생성하는데 사용될 수 있다. cDNA는 qPCR 에세이에서 사용되어 DNA 증폭 과정 진전으로서 형광성을 형성할 수 있다. 표준 곡선에 대한 비교에 의해, qPCR은 세포 당 mRNA의 복제 수와 같은 절대 측정치를 생성할 수 있다. 노던 블롯(Northern blot), 마이크로어레이, 인베이더 분석(Invader assay), 및 모세관 전기영동과 조합된 RT-PCR은 모두 샘플에서 mRNA의 발현 수준을 측정하는데 사용되어 왔다. Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004를 참조한다.
본원에 개시된 일부 실시양태는 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 진단 및 예후 방법에 관한 것이다. 1종 이상의 바이오마커의 발현 수준의 검출 및/또는 바이오마커의 비 결정은 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는데 사용될 수 있다. 상기 검출 방법은, 예를 들어 병태의 조기 진단을 위해, 대상체가 조산 경향을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 조산의 진전 또는 치료 프로토콜의 진전을 모니터링하기 위해, 조산의 중증도를 평가하기 위해, 조산의 결과 및/또는 회복 또는 만기 출산의 전망을 예측하기 위해, 또는 조산에 대한 적합한 치료의 결정을 돕기 위해 사용될 수 있다.
생물학적 샘플에서 바이오마커의 정량화는, 비제한적으로 상기 개시된 방법뿐 아니라 당업계에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 수득된 정량화 데이터는 이어서 분석 분류 과정을 거친다. 상기 과정에서, 원데이터(raw data)는 알고리즘에 따라 조종되며, 여기서 상기 알고리즘은, 예를 들어 본원에 제시된 실시예에 개시된 바와 같이 데이터의 훈련 세트(training set)에 의해 미리 정의되었다. 알고리즘은 본원에 제시된 데이터의 훈련 세트를 사용하거나, 본원에 제시된 가이드라인을 사용하여 상이한 데이터 세트를 갖는 알고리즘을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하기 위해 측정 가능한 특징을 분석하는 단계는 예측 모델의 사용을 포함한다. 추가 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하기 위해 측정 가능한 특징을 분석하는 단계는 상기 측정 가능한 특징과 기준 특징을 비교하는 단계를 포함한다. 당업자가 인식할 수 있는 바에 있어서, 상기 비교는 기준 특징에 대한 직접 비교이거나, 기준 특징이 예측 모델에 결합된 간접 비교일 수 있다. 추가 실시양태에서, 임산부에서의 조산 가능성을 결정하기 위해 측정 가능한 특징을 분석하는 단계는 선형 판별 분석 모델, 지지도 벡터 머신 분류 알고리즘, 회귀적 특징 제거 모델, 마이크로어레이의 예측 분석 모델, 로지스틱 회귀분석 모델, CART 알고리즘, 플렉스 트리(Flex tree) 알고리즘, LART 알고리즘, 랜덤 포레스트 알고리즘, MART 알고리즘, 기계 학습 알고리즘, 페널라이즈드(penalized) 회귀분석 방법, 또는 이들의 조합 중 1종 이상을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 분석은 로지스틱 회귀분석을 포함한다.
분석 분류 과정은 정량적 데이터를 조종하고 샘플의 분류에 제공하기 위한 다양한 통계 분석 방법 중 임의의 1종을 사용할 수 있다. 유용한 방법의 예는 선형 판별 분석, 회귀적 특징 제거, 마이크로어레이의 예측 분석, 로지스틱 회귀분석, CART 알고리즘, 플렉스트리 알고리즘, LART 알고리즘, 랜덤 포레스트 알고리즘, MART 알고리즘, 기계 학습 알고리즘 등을 포함한다.
GAB의 예측용 랜덤 포레스트의 생성을 위해, 당업자는 출산시 재태 기간(GAB)이 알려져 있고, 출산 수주 전에 얻은 혈액 시료에서 N개의 피분석물(전이물)이 측정되었던 k 대상체(임산부)의 세트를 고려할 수 있다. 회귀분석 트리는 모든 대상체를 함유하는 근 노드(root node)로 시작한다. 모든 대상체에 대한 평균 GAB는 근 노드에서 계산될 수 있다. 근 노드 내에서 GAB의 분산은 높을 것이며, 이는 상이한 GAB를 가진 여성의 혼합이 있기 때문이다. 근 노드는 이어서 2개의 가지로 나뉘어(분할되어), 각각의 가지가 유사한 GAB를 갖는 여성을 함유한다. 각각의 가지에서 대상체에 대한 평균 GAB는 다시 계산된다. 각각의 가지 내에서 GAB의 분산은 근 노드에 비해 낮아질 것이며, 이는 각각의 가지 내에서 여성의 하위 세트가 근 노드에서에 비해 상대적으로 더 유사한 GAB를 갖기 때문이다. 피분석물 및 유사한 GAB를 갖는 가지를 생성하는 피분석물에 대한 임계값을 선택함으로써 2개의 가지가 생성된다. 피분석물 및 임계값은 일반적으로 각각의 노드에서 피분석물의 무작위 하위 세트를 갖는 모든 피분석물 및 임계값의 세트 중에서 선택된다. 상기 절차는 대상체가 매우 유사한 GAB를 갖는 잎(말단 노드)을 생성하기 위해 회귀적 가지 생성을 계속한다. 각각의 말단 노드에서 예측된 GAB는 말단 노드에서 대상체에 대한 평균 GAB이다. 이 절차는 단일 회귀분석 트리를 생성한다. 랜덤 포레스트는 수백 또는 수천개의 상기 트리들로 구성될 수 있다.
분류는 샘플이 주어진 클래스에 속하는 가능성을 결정하기 위한 임계치를 설정하는 예측적 모델링 방법에 따라 이루어질 수 있다. 상기 가능성은 바람직하게는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80% 또는 그 이상이다. 분류는 또한 수득된 데이터세트와 기준 데이터세트 사이의 비교가 통계적으로 유의미한 차이를 제공하는지 여부를 결정함으로써 이루어질 수 있다. 그러한 경우, 데이터세트가 수득된 샘플은 기준 데이터세트 클래스에 속하지 않는 것으로 분류된다. 이와 반대로, 상기 비교가 기준 데이터세트와 통계적으로 유의미하게 상이하지 않은 경우, 데이터세트가 수득된 샘플은 기준 데이터세트 클래스에 속하는 것으로 분류된다.
모델의 예측력은 특정 값 또는 값의 범위의 품질 메트릭(quality metric), 예를 들어 AUROC(ROC 곡선 하부 면적) 또는 정확도를 제공하는 그것의 능력에 따라 평가될 수 있다. 곡선 하부 면적 측정치는 완전한 데이터 범위에 걸친 분류인자의 정확도를 비교하는데 유용하다. 큰 AUC를 갖는 분류인자일수록 2개의 관심 그룹 사이의 알려지지 않은 것들을 올바르게 분류하는 능력이 더 크다. 일부 실시양태에서, 소망하는 품질 임계는 적어도 약 0.5, 적어도 약 0.55, 적어도 약 0.6, 적어도 약 0.7, 적어도 약 0.75, 적어도 약 0.8, 적어도 약 0.85, 적어도 약 0.9, 적어도 약 0.95, 또는 그 이상의 정확도로 샘플을 분류할 예측 모델이다. 대안적 측정치로서, 소망하는 품질 임계는 적어도 약 0.7, 적어도 약 0.75, 적어도 약 0.8, 적어도 약 0.85, 적어도 약 0.9, 또는 그 이상의 AUC로 샘플을 분류할 예측 모델을 지칭할 수 있다.
당업계에 알려진 바와 같이, 예측 모델의 상대적 예민도 및 특이성은 2개의 메트릭이 역전 관계를 갖는 선택도 메트릭 또는 예민도 메트릭을 선호하도록 조정될 수 있다. 상기 개시된 바와 같은 모델에서의 제한은 수행되는 검사의 특정 요구에 따라 선택된 예민도 또는 특이성 수준을 제공하도록 조정될 수 있다. 예민도 및 특이성 중 하나 또는 둘 다는 적어도 약 0.7, 적어도 약 0.75, 적어도 약 0.8, 적어도 약 0.85, 적어도 약 0.9, 또는 그 이상일 수 있다.
원데이터(raw data)는 최초에 각각의 바이오마커에 대해 일반적으로 3중으로 또는 다중 3중으로 값을 측정함으로써 분석될 수 있다. 데이터는 조종될 수 있으며, 예를 들어 원데이터는 표준 곡선, 및 각각의 환자에 대한 평균 및 표준 편차를 계산하는데 사용되는 3중 측정치의 평균을 사용하여 변형될 수 있다. 이들 값은 모델에서 사용되기 전에 변형, 예를 들어 로그-변형, 박스-콕스(Box-Cox) 변형(Box and Cox, Royal Stat. Soc., Series B, 26:211-246(1964))될 수 있다. 이어서, 데이터는 상태에 따라 샘플을 분류할 예측 모델에 입력된다. 결과적 정보는 환자 또는 의료인에게 전달될 수 있다.
조산에 대한 예측 모델을 생성하기 위해, 알려진 대조군 샘플 및 관심있는 조산 분류에 대응하는 샘플을 포함하는 강력한 데이터 세트가 훈련 세트에서 사용된다. 샘플 크기는 일반적으로 용인되는 기준을 사용하여 선택될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 상이한 통계적 방법이 매우 정확한 예측 모델을 얻기 위해 사용될 수 있다. 상기 분석의 예는 실시예 2에 제시된다.
일 실시양태에서, 계층적 클러스터링은 피어슨 상관관계(Pearson correlation)가 클러스터링 메트릭으로서 사용되는 예측 모델의 도출에서 수행된다. 하나의 방법은 "지도 학습(supervised learning)"의 문제에서 "학습 샘플"로서 조산 데이터세트를 고려하는 것이다. CART는 기계에 대한 적용에서 표준이며(Singer, Recursive Partitioning in the Health Sciences, Springer(1999)), 임의의 질적 특징을 양적 특징으로 변형하는 단계; 호텔링 T2 통계(Hotelling's T2 statistic)용 샘플 재사용 방법에 의해 평가된, 달성된 유의미한 수준에 의해 이들을 분리하는 단계; 및 랏쏘(lasso) 방법의 적합한 적용에 의해 변형될 수 있다. 예측에서의 문제는 예측력(sight of prediction)을 잃지 않으면서, 실제로 회귀분석의 품질 평가에서의 분류를 위한 지니 기준(Gini criterion)을 적합하게 사용하도록 함으로써 회귀분석에서의 문제로 전환된다.
이 방법은 플렉스트리라고 지칭되는 것을 야기하였다(Huang, Proc . Nat. Acad. Sci . U.S.A 101:10529-10534(2004)). 플렉스트리는 시뮬레이션에서 및 다중 형태의 데이터에 적용되었을 때에 매우 잘 수행되며, 청구된 방법을 실행하는데 유용하다. 플렉스트리를 자동화하는 소프트웨어가 개발되었다. 대안적으로 LARTree 또는 LART가 사용될 수 있다(Turnbull (2005) Classification Trees with Subset Analysis Selection by the Lasso, Stanford University). 상기 명칭은 CART 및 플렉스트리; 언급되었던 랏쏘; 및 Efron et al. (2004) Annals of Statistics 32:407-451 (2004)에 의해 LARS로 지칭된 것을 통한 랏쏘의 구현에서와 같은 이진 트리(binary tree)를 반영한다. 또한, Huang et al.., Proc . Natl . Acad. Sci . USA. 101(29):10529-34 (2004)를 참조한다. 사용될 수 있는 다른 분석 방법은 로직 회귀분석(logic regression)을 포함한다. 로직 회귀분석의 하나의 방법은 Ruczinski, Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512 (2003)이다. 로직 회귀분석은 그것의 분류인자가 이진 트리로서 나타내어질 수 있다는 점에서 CART와 유사하다. 그것은 각각의 노드가 CART에 의해 생성된 단순한 "및" 표현에 비해 보다 일반적인 특징에 대한 불 표현(Boolean statement)을 갖는다는 점에서 상이하다.
다른 방법은 최근접 수축 중심(nearest shrunken centroid) 방법이다(Tibshirani, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A 99:6567-72(2002)). 상기 기술은 k-수단-유사이지만, 클러스터 중심을 수축시킴으로써 당업자가 특징을 자동적으로 선택하여, 랏쏘에서의 경우와 같이 유익한 소수의 것에 관심을 집중시킨다는 이점을 갖는다. 상기 방법은 PAM 소프트웨어로서 이용 가능하며 광범위하게 사용된다. 사용될 수 있는 2개의 추가 세트의 알고리즘은 랜덤 포레스트(Breiman, Machine Learning 45:5-32 (2001)) 및 MART(Hastie, The Elements of Statistical Learning, Springer (2001))이다. 이들 2개의 방법은 결과에 "투표"하는 예측변수를 포함하는 "위원회 방법(committee method)"으로서 당업계에 알려져 있다.
유의성(significance) 순서를 제공하기 위해, 위발견율(false discovery rate)(FDR)이 결정될 수 있다. 첫째, 부동성(dissimilarity) 값의 귀무 분포(null distribution) 세트가 생성된다. 일 실시양태에서, 관찰된 프로파일의 값은 우연히 수득된 상관관계 계수의 분포의 서열을 생성하기 위해 변경되어, 상관관계 계수의 귀무 분포(null distribution)의 적절한 세트를 형성한다(Tusher et al., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A 98, 5116-21 (2001)). 귀무 분포의 세트는 모든 이용 가능한 프로파일에 대해 각각의 프로파일의 값을 변경하는 단계; 모든 프로파일에 대해 쌍으로 상관관계 계수를 계산하는 단계; 이 변경에 대해 상관관계 계수의 확률 밀도 함수를 계산하는 단계; 및 N회 동안 상기 절차를 반복하는 단계에 의해 수득되며, 여기서 N은 일반적으로 300인 큰 수이다. N 분포를 사용하여, 당업자는 그것들의 값이 주어진 유의성 수준에서 실험적으로 관찰된 유사성 값의 분포로부터 수득된 (유사성의) 값을 초과하는 상관관계 계수 값의 수치의 적절한 측정치(평균, 중앙 등)를 계산한다.
FDR은 경험적 데이터에서 선택된 피어슨 상관관계에 비해 큰 상관관계의 수(유의미한 상관관계)에 대한 잘못 예측된 유의미한 상관관계의 수(무작위화된 데이터의 세트에서 선택된 피어슨 상관관계에 비해 큰 상관관계로부터 추산됨)의 비가다. 이 컷-오프 상관관계 값은 실험 프로파일 사이의 상관관계에 적용될 수 있다. 상술한 분포를 사용하여, 신뢰성의 수준이 유의성에 대해 선택될 수 있다. 이는 우연히 수득되었을 결과를 초과하는 상관관계 계수의 최저값을 결정하기 위해 사용된다. 이 방법을 사용하여, 당업자는 양성 상관관계, 음성 상관관계 또는 둘 다에 대한 임계치를 얻는다. 이 임계치(들)를 사용하여, 사용자는 쌍으로 상관관계 계수의 관찰된 값을 필터링하여 임계치(들)를 초과하지 않는 것들을 제거할 수 있다. 또한, 주어진 임계치에 대해 위양성율(false positive rate)의 추산이 얻어질 수 있다. 개별 "무작위 상관관계" 분포 각각에 대해, 당업자는 얼마나 많은 관찰이 임계 범위를 벗어나는지 알 수 있다. 이 절차는 수치 시퀀스를 제공한다. 시퀀스의 평균 및 표준 편차는 잠재적 위양성의 평균 수 및 그것의 표준 편차를 제공한다.
대안적인 분석 방법에서, 횡단면 분석에서 선택된 변수는 시간-대-사례 분석(time-to-event analysis)(생존 분석)에서의 예측 변수로서 별도로 사용되고, 여기서 사례는 조산의 발생이며, 사례가 없는 대상체는 주어진 출산 당시에 검열된 것으로 간주된다. 특정 임신 결과(조산 사례 또는 사례 없음), 각각의 환자가 관찰될 무작위화된 길이의 시간, 프로테오믹 및 다른 특징의 선택을 고려하면, 생존을 분석하기 위한 파라메트릭(parametric) 방법이 광범위하게 적용된 반-파라메트릭 콕스 모델에 비해 더 우수할 것이다. 생존의 와이블 파라메트릭 피트(Weibull parametric fit)는 위험률이 단조롭게 증가, 감소, 또는 유지되게 하고, 비례 위험 표현(콕스 모델에서와 같음) 및 가속화된 고장-시간 표현을 또한 갖는다. 회귀 계수의 근사 최대 가능성 추정량을 얻는데 이용 가능한 모든 표준 도구 및 대응 함수가 이 모델과 함께 이용 가능하다.
또한, 콕스 모델이 사용될 수 있으며, 특히 랏쏘를 이용한 관리 가능한 크기로의 공변량의 수의 감소가 분석을 유의미하게 간분해시킬 것이기 때문에, 출산까지의 기간의 예측에 대한 비파라메트릭 또는 반-파라메트릭 방법의 가능성을 허용 할 수 있다. 이들 통계적 도구는 당업계에 알려져 있으며, 프로테오믹 데이터의 모든 방식에 적용 가능하다. 상기 임산부에서의 조산 가능성 및 조산 사례까지의 예측된 시간에 관하여, 용이하게 결정될 수 있고 매우 유익한 임상적이고 유전적인 데이터인 바이오마커의 세트가 제공된다. 또한, 알고리즘은 임산부에서의 조산 가능성에 관한 정보를 제공한다.
따라서, 당업자는 본 발명에 따른 조산 가능성이 정량적이거나 단정적인 변수를 사용하여 결정될 수 있다는 것을 이해한다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 실행하는데 있어서, N개의 바이오마커 각각의 측정 가능한 특징은 단정적인 데이터 분석을 받아, 이진의 단정적 결과로서 조산 가능성을 결정할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 정량적 변수, 특히 예측된 출산시 재태 기간을 초기에 계산함으로써 N개의 바이오마커 각각의 측정 가능한 특징을 분석할 수 있다. 예측된 출산시 재태 기간은 조산의 위험을 예측하기 위한 기초로서 후속적으로 사용될 수 있다. 정량적 변수를 초기에 사용하고, 후속적으로 상기 정량적 변수를 단정적 변수로 전환함으로써, 본 발명의 방법은 측정 가능한 특징에 대해 검출된 측정의 연속체를 고려한다. 예를 들어, 조산 대 만기 출산의 이진 예측을 만들기 보다 출산시 재태 기간을 예측함으로써, 임산부를 위해 치료를 맞춤화하는 것이 가능하다. 예를 들어, 조기에 예측된 출산시 재태 기간은 만기에 근접한 예측된 재태 기간에 비해 보다 강력한 태아기 개입, 즉 모니터링 및 치료를 야기할 것이다.
j일 플러스 또는 마이너스 k일의 예측된 GAB를 갖는 여성 중에서, p(PTB)는 37주 재태 기간 이전에 실제로 분만하는 j일 플러스 또는 마이너스 k일의 예측된 GAB를 갖는 PAPR 임상 시험(실시예 1 참조)에서의 여성의 비로서 추산된다. 보다 일반적으로, j일 플러스 또는 마이너스 k일의 예측된 GAB를 갖는 여성에 대해, 출산시 실제 재태 기간이, 명시된 재태 기간에 비해 적을 가능성, p(실제 GAB < 명시된 GAB)는, 명시된 재태 기간 이전에 실제로 분만하는 j일 플러스 또는 마이너스 k일의 예측된 GAB를 갖는 PAPR 임상 시험에서의 여성의 비로서 추산되었다.
예측 모델의 개발에서, 마커의 하위 세트, 즉 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 최대 완전한 세트의 마커를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로 매우 정확한 예측 모델을 유지하는 한편, 정량적 샘플 분석의 요구, 예를 들어 시약의 이용 가능성, 정량의 편리성 등을 제공하는 마커의 하위 세트가 선택될 것이다. 분류 모델을 수립하기에 유익한 마커의 수의 선택은 성능 메트릭의 정의 및 이 메트릭을 기본으로 하는 유용한 예측력을 갖는 모델을 생성하기 위한 사용자-정의 임계치가 필요하다. 예를 들어, 성능 메트릭은 예측의 AUC, 예민도 및/또는 특이성뿐 아니라 예측 모델의 전체적 정확도일 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바에 있어서, 분석 분류 과정은 정량적 데이터를 조종하고 샘플의 분류를 제공하기 위한 다양한 통계 분석 방법 중 임의의 하나를 사용할 수 있다. 유용한 방법의 예는, 비제한적으로 선형 판별 분석, 회귀적 특징 제거, 마이크로어레이의 예측 분석, 로지스틱 회귀분석, CART 알고리즘, 플렉스트리 알고리즘, LART 알고리즘, 랜덤 포레스트 알고리즘, MART 알고리즘, 및 기계 학습 알고리즘을 포함한다. 다양한 방법이 훈련 모델에서 사용된다. 마커의 하위 세트의 선택은 마커 하위 세트의 전진(forward) 선택 또는 후진(backward) 선택을 위한 것일 수 있다. 모든 마커의 사용 없이 모델의 성능을 최적화할 마커의 수가 선택될 수 있다. 최적 용어의 수를 정의하는 한가지 방식은 주어진 알고리즘에 대해 사용된 용어의 임의의 조합 및 수를 사용하는 이 메트릭에 대해 수득된 최대 값으로부터의 1종 이하의 표준 오차에 놓여 있는 소망하는 예측력(예를 들어, AUC>0.75, 또는 예민도/특이성의 동등한 측정치)을 갖는 모델을 생성하는 용어의 수를 선택하는 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 조산의 가능성을 결정하는 키트를 제시한다. 상기 키트는 바이오마커의 검출을 위한 1종 이상의 약제, 임산부로부터 단리된 생물학적 샘플을 수용하기 위한 용기; 및 약제와 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플의 일부가 반응하여 생물학적 샘플에서 단리된 바이오마커의 존재 또는 양을 검출하기 위한 인쇄된 설명서를 포함할 수 있다. 약제는 별도 용기에 포장될 수 있다. 키트는 1종 이상의 대조군 기준 샘플 및 면역분석법을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
키트는 키트 내에 함유된 조성물을 위한 1종 이상의 용기를 포함할 수 있다. 조성물은 액체 형태로 있거나 동결건조될 수 있다. 조성물용으로 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이엘(vial), 시린지(syringe), 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱을 포함한 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 키트는 또한 조산의 가능성을 결정하는 방법에 대해 기록된 설명서를 함유한 포장 삽입물을 포함할 수 있다.
상기 설명으로부터, 변화 및 변형이 본원에 개시된 발명에 대해 이루어져 다양한 용도 및 조건에 채택할 수 있다는 것이 명확해질 것이다. 상기 실시양태는 또한 다음 청구항의 범위 내에 있다.
본원에서 변수의 임의의 정의에서 요소 목록의 설명은 임의의 단일 요소 또는 열거된 요소의 조합(또는 하위조합)으로서의 상기 변수의 정의를 포함한다. 본원의 실시양태의 설명은 임의의 단일 실시양태로서의 실시양태 또는 임의의 다른 실시양태 또는 이의 일부와 조합된 실시양태를 포함한다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 간행물은 각각의 독립적 특허 및 간행물이 참고로 포함되는 것으로 명시적으로 및 개별적으로 지시된 경우와 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
다음 실시예는 제한이 아닌, 예시적 방식에 의해 제시된다.
실시예
실시예 1. 조산 위험 측정용 바이오마커의 발견 및 타당성 확인을 위한 샘플 세트의 개발
조산 위험의 프로테오믹 평가(Proteomic Assessment of Preterm Risk)(PAPR) 임상 연구의 수행을 관리하는 표준 프로토콜을 개발하였다. 미국 전역의 11군데 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)(IRB) 승인 현장의 여성으로부터 시료를 수득하였다. 사전 동의서 제공 이후, 혈청 및 혈장 샘플뿐 아니라 환자의 인구통계적 특징, 과거 병력 및 임신 이력, 현재 임신 이력 및 병행 약제에 관한 적절한 정보를 얻었다. 분만 이후, 산모 및 영아 병태 및 합병증과 관련하여 데이터를 수집하였다. 표준화된 냉장 원심분리, 2-D 바코드 저온유리병(cryovial) 내로의 샘플의 분취 및 이어서 -80℃에서의 동결이 필요한 프로토콜에 따라 혈청 및 혈장 샘플을 처리하였다.
분만 이후에, 조산 사례를 개별적으로 재검토하여 이들의 상황을 자연 조산 또는 의학적으로 지시된 조산으로 결정하였다. 자연 조산 사례만을 본 분석을 위해 사용하였다. 조산의 바이오마커 발견을 위해, 17주 0일차(17.0) 내지 28주 6일차(28.6)의 채혈시 재태 기간(GABD)에 걸친 86개의 조산 사례 및 172개의 대조군으로부터의 혈청 샘플을 분석하였다. 별도 샘플 세트가 또한 검증의 목적을 위해 분석되었으며, 이는 동일한 재태 기간 범위에 걸친 50개의 조산 사례 및 100개의 대조군으로부터의 혈청으로 구성되었다. 각각의 사례에 대해 2개의 대조군을 GABD에 의해 매칭시켰으며, 이는 2012년 국가 인구 통계 보고서(National Vital Statistics Report)에서 보고된 출산 분포를 매칭시킨 대조군의 일부 무작위로 생성된 패널로부터 선택되었다. 실험실 직원은 출산시 재태 기간 및 양측 샘플 세트에 대해 사용된 대상체의 사례 대 대조군 상태에 대해 맹검처리되었다는 것을 보장하기 위해 프로토콜을 실시하였다. 정보학 직원 또한 샘플의 해석적 분석이 완료될 때까지 검증 샘플 세트에 대해 맹검처리되었다.
혈청 프로테옴(proteome)에서의 질환 관련 변화에 대한 식별에 관하여 유익하지 않은 것으로 처리되는 가장 풍부한 단백질 중 14종을 제거하는 인간 14 다중 친화도 제거 시스템(Multiple Affinity Removal System)(MARS 14)을 사용하여 혈청 샘플에서 고 풍부 단백질을 제거하였다. 이를 위하여, 임상, 풀링된 인간 혈청 샘플(human serum sample)(HGS), 또는 인간 풀링된 임산부 혈청 샘플(pHGS) 각각의 동일 부피(50 ㎕)를 150 ㎕ Agilent 칼럼 버퍼 A로 희석하고, Captiva 필터 플레이트 상에서 여과하여 침전물을 제거하였다. 여과된 샘플을 MARS-14 칼럼(4.6 x 100 mm, Cat. #5188-6558, Agilent Technologies)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 제거하였다. 샘플을 오토샘플러(autosampler)에서 4℃까지 냉각하고, 제거 칼럼을 실온에서 작동시켰으며, 수집된 분획은 추가 분석까지 4℃로 유지하였다. 추가 분석을 위해 미결합 분획을 수집하였다.
제거처리된 혈청 샘플을 디티오트레이톨로 환원시키고, 요오도아세트아미드를 사용하여 알킬화한 다음, 5.0 ㎍ 트립신 골드(Trypsin Gold) - 질량 스펙 등급(Mass Spec Grade)(Promega)를 이용하여 37℃에서 17시간(± 1시간) 동안 분해시켰다. 트립신 분해 이후, 187개 안정 동위원소 표준(SIS) 펩티드의 혼합물을 샘플에 첨가하고, 각각의 샘플의 절반을 Empore C18 96-웰 고상 추출 플레이트(Solid Phase Extraction Plate)(3M Bioanalytical Technologies) 상에서 탈염하였다. 상기 플레이트를 제조사의 프로토콜에 따라 조절하였다. 펩티드를 300 ㎕ 1.5% 트리플루오로아세트산, 2% 아세토니트릴로 세척하고, 250 ㎕ 1.5% 트리플루오로아세트산, 95% 아세토니트릴로 용출시켰으며, -80℃에서 30분 동안 동결시키고, 이어서 건조상태까지 동결건조시켰다. 동결건조된 펩티드는 3개의 비-인간 내부 표준(internal standard)(IS) 펩티드를 함유하는 2% 아세토니트릴/0.1% 포름산을 사용하여 재구성시켰다. 펩티드를 40℃의 Agilent Poroshell 120 EC-C18 칼럼(2.1x100mm, 2.7 ㎛)에서 400 ㎕/min의 30분 아세토니트릴 구배로 분리하고, Agilent 6490 3중 사중극 질량 분석계로 주입하였다.
제거처리되고 트립신 분해된 샘플을 예정된 다중 반응 모니터링 방법(scheduled Multiple Reaction Monitoring method)(sMRM)을 사용하여 분석하였다. sMRM 에세이는 259개의 생물학적 펩티드 및 190개의 IS 펩티드(187 SIS + 3 IS)를 측정한 898개의 전이물을 모니터링하였고, 148개의 단백질을 나타내었다. 질량 헌터 정량 분석 소프트웨어(Mass Hunter Quantitative Analysis software)(Agilent Technologies)를 사용하여 크로마토그래피 피크를 통합시켰다.
데이터 분석
발견 및 검증 샘플 데이터의 분석을 2상으로 수행하였다. 제1 상에서, 발견 샘플을 사용한 선택 및 독립 검증 샘플 세트를 사용한 확인에 의해 강력한 바이오마커를 식별하였다. 제2 상에서, 발견 및 검증 데이터를 조합하여, 분류인자 개발용 최고 피분석물 및 피분석물의 패널을 식별하기 위해 사용하였다.
상 I: 맹검 분석
초기 분류인자 개발은 17.0 내지 25.6의 재태 기간에 집중되었다. 발견 샘플을 사용하여, 62개 단백질에 대응하는 펩티드의 세트를 예비분석 및 분석 기준에 기초하여 선택하였다. 인접한 윈도우들 사이에 2주의 중첩을 갖는 3주에 걸친 일련의 좁은 GABD 윈도우에서 피분석물 진단 성능을 평가하였다. 진단 성능에서의 일관성(GABD에 걸친 사례 대 대조군에서의 상향 및 하향 조절)에 기초하여, 43개 피분석물의 하위 세트를 추가 분석을 위해 선택하였다.
각각의 좁은 GABD 윈도우에 대해, 좁은 윈도우 내에서 상향 및 하향 조절된 피분석물의 모든 조합을 사용하여 반전 세트를 형성하였다. 반전 값은 하향 조절된 피분석물의 상대 피크 면적에 대한 상향 조절된 피분석물의 상대 피크 면적의 비가며, 변이를 정규화하고 진단 신호를 증폭하는 역할을 한다. 좁은 윈도우 내의 모든 가능한 반전 중에서, 개별 일변량 성능(AUC >= 0.6)에 기초하여 하위 세트를 선택하였다.
각각의 윈도우에 대해, 다양한 크기의 반전 패널을 형성하였다(2, 3, 4, 6, 8의 크기). 윈도우 내에서 각각의 패널 크기에 대해, 70% 및 30%의 샘플에 대해 각각 로지스틱 분류인자를 반복적으로 1,000회 훈련 및 검사함으로써 몬테 카를로 교차 타당성 확인(MCCV)을 수행하였다. 평균 MCCV AUC에 의해 최적인 것으로 결정된 패널 크기 4를, 패널 상에서 잘 수행되는 반전 후보의 식별을 위해 후속적으로 사용하였다. MCCV 분석에서 패널 크기 4의 상위 수행 로지스틱 분류인자 상의 발생 빈도에 의해 반전 후보를 식별하였다. 각각의 윈도우에 대해, 0.7 내지 1 범위의 예민도에 대한 AUC, 또는 부분(partial) AUC (pAUC) 성능 측정치, 또는 출산까지의 기간(TTB) 값에 대한 분류인자 결과 스코어의 상관관계(GABD와 출산시 재태 기간 사이의 날짜 차이)를 사용하여 3개 세트의 반전 빈도 테이블을 형성하였다. 이들 반전 목록 각각으로부터, 상위 15개의 반전을 추가 분석을 위해 선택하였다.
각각의 GABD 좁은 윈도우에 대해, 3개의 목록(AUC, pAUC, 및 TTB) 각각으로부터 크기 2, 3, 4의 반전 패널을 형성하였으며, MCCV의 성능 분석에 기초하여 각각의 윈도우에서 각각의 패널 크기에 대해 상위 15개 패널을 선택하였다. 각각의 윈도우에 대한 3개의 목록(AUC, pAUC, 및 TTB) 각각으로부터의 상위 15개 반전과 함께, 크기 2, 3, 4의 이들 상위 15개 패널을 사용하여 발견 샘플에 대해 로지스틱 분류인자를 훈련하였으며, 검증 샘플을 위해 맹검 방식으로 분류 스코어를 생성하였다.
제3자 통계학자가 모든 반전 및 분류인자 패널의 성능을 평가하였으며, ROC 곡선에 대한 AUC, pAUC 및 분류인자 스코어의 TTB 상관관계를 보고하였다.
상 II: 비맹검 분석
비맹검 이후에, 발견 및 검증 데이터 세트를 조합하고 재분석하였다. 진단 단백질의 발현이 임신에 걸쳐 변화할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 GABD의 함수로서 단백질의 수준을 검사하였다. +/- 10일의 중앙 평활화 윈도우를 적용하여 동역학적 도식을 생성하였다. 단백질의 상대 수준은 대응 SIS 표준에 대한 내인성 펩티드 피크 면적의 비(상대적 비)로서 표현하였다. 임신중 증가하나 PTB 사례 및 대조군에서 상이하지 않은 수준을 갖는 단백질의 예를 도 3, 4 및 10에 도시하였다. 상기 단백질의 수준 측정은 임신의 정확한 날짜 결정(예를 들어, 임신 "시계")에 유용할 수 있다. 임신 시계는 1종 이상의 단백질(전이물)의 상대 존재비로부터 재태 기간을 예측한다. 대안적으로, 이 동일한 분석에서, 본 발명자들은 수준이 GABD에 걸쳐 변화하나, PTB 사례와 대조군 사이에 차이를 나타내는 단백질을 식별하였다. 도 5. 이들 단백질은 PTB 분류인자 개발을 위한 분명한 진단 후보이다. 과소발현된 단백질의 것에 비해 과잉발현된 단백질의 비를 사용하여 반전을 형성하는 것의 영향을 또한 예시하였다(도 8 및 21). 이것이 PTB 사례와 대조군의 분리에서의 증가를 야기한다는 것이 분명하다. 이전 분석은 일부 피분석물의 수준이 임신전 체질량 지수(BMI)에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 제시하였다. CLIN. CHEM. 37/5, 667-672 (1991); European Journal of Endocrinology (2004) 150 161-171. 이러한 이유로, BMI가 35 미만인 환자에서만 임신에 걸친 반전값을 표현함으로써, 분리에 대한 BMI의 영향을 조사하였다(도 21). 이는 분리에서의 추가 개선을 야기한다.
조합된 발견 및 검증 데이터 세트에서의 반전 선택 및 분류인자 개발은 초기 연구를 반영하였다. 본 발명자들은 분석을 증폭하기 위해 3차 중첩 GABD 윈도우(133-153일차)에 집중하였다. MCCV 분석을 수행하여 후보 반전을 식별하였다. 패널의 성능을 평가하기 위해, 반전값을 단순 로그섬(LogSum) 분류인자에 조합하였다. 로그섬 분류인자는 상기 샘플에 대한 각각의 반전의 상대적 비 값의 로그의 합에 기초하여 각각의 샘플에 대해 스코어를 할당한다. 이 유형의 분류인자에서 계수의 결여는 과적합의 문제를 회피하게 한다. 당업자는 동일한 피분석물을 사용하여 잘 정립된 기법을 이용해 동일한 로지스틱 분류인자를 유도할 수 있다. 4개의 단백질로부터 형성된 3개의 상위 반전의 패널의 다변수 성능을 교차 타당성 확인에 의해 수득된 AUC 값의 히스토그램으로서 도 8의 ROC 곡선에 도시하였다. 이전 분석은 일부 피분석물의 수준이 임신전 체질량 지수(BMI)에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 제시하였다.
본 발명자들은 단백질 및/또는 반전을 결정하고, 출산까지의 기간(TTB)의 강한 예측변수인 ITIH4/CSH를 사용함으로써 본원에 예시하였다(도 10). TTB는 GABD와 출산시 재태 기간(GAB) 사이의 차이로서 정의된다. 이것은 TTB(또는 GAB)를 임상적으로 추정하기 위해 독립적으로 또는 상기 피분석물의 수학적 조합으로 예측할 수 있는 가능성을 갖는다.
실시예 2. IBP4 / SHBG sPTB 예측변수의 타당성 확인
본 실시예는 임신 초기에 증상이 없는 여성에서 큰 산모 혈청 프로테오믹스 활동으로 식별된 IBP4/SHBG sPTB 예측변수의 타당성 확인을 나타낸다.
대상체
미국 전역의 11군데 임상시험심사위원회(IRB) 승인 현장에서 표준화된 프로토콜 하에서 조산 위험의 프로테오믹 평가 연구를 수행하였다(임상시험. 정부 식별자: NCT01371019). 17 0/7 및 28 6/7 주 GA 사이의 대상체를 등록하였다. 최고의 임상적으로 추산된 재태 기간을 제공하기 위해, 조기 초음파 바이오메트리(biometry), 또는 초음파 단독에 의해 확인된 월경 일자의 미리 정의된 프로토콜을 사용하여 날짜 결정을 수립하였다. 키 및 임신전 자가-보고된 체중으로부터 체질량 지수(BMI)를 유도하였다. 다태 임신 및 알려지거나 의심되는 주요 태아 이상을 갖는 임신은 배제되었다. 대상체 인구통계적 특징, 과거 병력 및 임신 이력, 현재 임신 이력 및 병행 약제에 관한 적절한 정보를 수집하였으며, 전자 사례 보고 양식에 입력하였다. 분만 이후, 산모 및 영아 결과 및 합병증에 대해 데이터를 수집하였다. 모든 분만은 만기(≥37 0/7 주 GA), 자연 조산(만삭전 조기 양막 파열을 포함함) 또는 의학적으로 지시된 조산으로 판정하였다. 명시된 바와 같이, 연구 지역의 주요 검사자와 차이가 명확해졌다. 판정을 완료하고 데이터를 타당성 확인 연구 이전에 고정하였다.
샘플 수집
산모 혈액을 수집하고 다음과 같이 처리하였다: 10분 실온 응고 기간, 이어서 즉시 냉장 원심분리 또는 원심분리까지 4-8℃의 얼음물 욕조에 배치. 혈액을 수집한지 2.5시간 이내에 원심분리하였으며, 0.5 ml 혈청 분취량을 분석까지 -80℃에서 저장하였다.
예측변수 개발 원리
IBP4/SHBG 예측변수의 개발은 '오믹스(omics)' 연구에서의 최고 실행을 위한 의학 협회(Institute of Medicine)(IOM) 가이드라인과 일치하는 독립적이고 순차적인 발견, 검증 및 타당성 확인 단계를 포함하였다. IOM(의학 협회). Evolution of Translation Omics: Lessons Learned and the Path Forward. (Micheel CM, Nass SJ, Omenn GS, eds.). Washington, DC: The National Academies Press.; 2012:1-355. 분석적 타당성 확인은 임상적 타당성 확인 샘플 분석에 선행하였으며, 뱃치 사이 및 뱃치내 정밀도, 캐리오버(carryover) 및 검출 한계의 평가를 포함하였다.
발견 및 검증과 독립적으로 미리 특정된 sPTB 사례 및 대조 시료에 대해 타당성 확인 집합(nested) 사례/대조군 분석을 수행하였다. sPTB 사례는 타당성 확인에 고유한 2개 지역과 함께, 총 9개 지역으로부터의 샘플을 포함하였다. 타당성 확인 사례 및 대조군은 질량 분석법(MS) 혈청 분석 이전에 각각의 대상체의 의료 기록과 함께 100% 온-사이트(on-site) 원천 문서 검증을 하였다. 이 과정은 모든 대상체가 포함 및 배제 기준을 충족하였음을 보장하였을뿐 아니라, 샘플 수집 및 분만 시에 모든 대상체에 대한 출산 과제의 의학적/임신 합병증 및 GA를 입증하였다. 타당성 확인 연구 설계, 분석 계획 및 맹검 프로토콜을 포함한 상세한 분석 프로토콜을 미리 수립하였다. 임상 책임자(Director of Clinical Operation)(DCO) 및 임상 데이터 관리자를 제외하고, 인원은 출산 데이터 과제의 대상체 사례, 대조군 및 GA에 대해 맹검처리되었다. 데이터 분석 계획은 미리 특정된 타당성 확인 청구 및 이중 독립적 외부 피분석물에 대한 프로토콜을 포함하였다. 하기 개시된 바와 같이 계산된 예측변수 스코어를 모든 대상체 샘플에 대해 맹검 통계에 의해 결정하였다. DCO에 의해 예측변수 스코어에 연결된 사례, 대조군 및 GA 데이터는 독립적 외부 통계 분석을 거쳤다. 수신자 조작 특징 곡선 하부의 면적(Area under the receiver operating characteristic curve)(AUROC) 및 유의성 검사 결과를 DCO에게 다시 전달하였다. 데이터의 전달을 SUMPRODUCT 함수(Microsoft. Microsoft Excel. 2013)의 사용과 결합하여 데이터 완전성의 유지를 보장하였다. 타당성 확인 결과를 통해 각각의 대상체로부터의 데이터의 감사 추적(audit trail)을 제공하기 위해, 실시간 디지털 타임-스탬프(digital time-stamping)를 분석 데이터, 계획 및 보고서에 적용하였다.
타당성 확인 연구 설계
최초 분석에서, sPTB 사례를 만삭전 조기 양막 파열(PPROM) 또는 <37 0/7 주 GA의 진통의 자연 개시로 인한 분만이 있는 대상체로서 정의하였다. 대조군은 ≥37 0/7 주 GA에 분만한 대상체였다. 이전 발견 및 검증 분석은 넓은 재태 기간(17 0/7 내지 25 6/7 주 GA)에 걸쳐 수집된 혈청 샘플을 사용하여 44개의 후보 바이오마커를 조사하였다(보충 자료). 발견 및 검증은 채혈 구간(19 0/7 내지 21 6/7 주)에서 최적의 좁은 GA를 식별하였으며, sPTB에 대하여 AUROC에 의한 최고 예측변수로서 2개의 단백질 IBP4 및 SHBG를 비(IBP4/SHBG)로 사용하였다(보충 자료). 발견 및 검증에서, 극단적 BMI가 없는 대상체는 IBP4/SHBG에 의한 개선된 분류 성능을 가졌다(보충 결과). 발견 및 검증 분석 이후에, 본 발명자들은 분석적이고 임상적인 타당성 확인을 진행하였다.
17 0/7 내지 28 6/7 주 GA에 걸친 총 이용 가능한 81명의 대상체로부터 19 0/7 내지 21 6/7 주 채혈시 GA(GABD)에 총 18명 대상체의 타당성 확인 sPTB 사례를 수집하였다. GABD에 의해 매칭된 sPTB 사례 당 2개의 대조군을 포함하는 대조군 세트를 R 통계 프로그램(R 3.0.2)(Team RC. R: a Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria; 2014. 2015; Matei A,
Figure pct00004
Y. The R "sampling" package. European Conference on Quality in Survey Statistics. 2006)을 사용하여 무작위적으로 선택하였으며, 카이-제곱 검정(Chi-Square test)을 사용하여 2012년 국가 인구 통계 보고서(Martin JA, Hamilton BE, Osterman MJ, Curtin SC, Mathews TJ. Births: Final Data for 2012. National Vital Statistics Reports. 2014;63(09):1-86)에 개요를 서술한 바와 같이 만기 분만 분포와 비교하였다. 무작위적으로 (10개의 그룹으로) 생성된 대조군 세트를 1.0에 근접한 p-값을 제공하는 세트에 대해 시험하였다.
주요 목적은 AUROC를 사용하여 sPTB에 대한 예측변수로서 IBP4/SHBG 비의 성능을 입증하는 것이었다(Team RC. R: a Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria; 2014. 2015; Sing T, Sander O, Beerenwinkel N, Lengauer T. ROCR: visualizing classifier performance in R. Bioinformatics. 2005;21(20):7881). 전체 다중 검사 오차율(α = 0.05)을 제어하기 위해, 고정 서열 방법(Dmitrienko A, Tamhane AC, Bretz F, eds. Multiple Testing Problems in Pharmaceutical Statistics. Boca Raton, Florida: CRC Press; 2009:1-320; Dmitrienko A, D'Agostino RB, Huque MF. Key multiplicity issues in clinical drug development. Stat Med. 2012;32(7):1079-111. doi:10.1002/sim.5642.)을 BMI 계층화의 적용이 있거나 없는 발견 및 검증에서 식별된 최적 구간(19 0/7 내지 21 6/7 주 GA) 내의 GABD 증가에 적용하였다(보충 자료 참조). AUROC = 0.5에 대한 동등성을 검사하는 윌콕손-만-위트니 통계에 의해 유의성을 평가하였다(무작위 기회). (Bamber D. The area above the ordinal dominance graph and the area below the receiver operating characteristic graph. Journal of mathematical psychology. 1975;12(4):387-415. doi:10.1016/0022-2496(75)90001-2; Mason SJ, Graham NE. Areas beneath the relative operating characteristics (ROC) and relative operating levels (ROL) curves: Statistical significance and interpretation. QJR Meteorol Soc. 2002;128(584):2145-2166. doi:10.1256/003590002320603584.) <37 0/7 대 ≥37 0/7 주 GA 외의 GA 경계(예를 들어, <36 0/7 대 ≥36 0/7, <35 0/7 대 ≥35 0/7)에서 분류 성능의 결정을 위해, 사례 및 대조군을 각각 특정 경계 미만 및 동일/초과의 모든 대상체로서 재정의하였다.
실험실 방법
시스템 생물학 방법을 사용하여 매우 복합한 다중 반응 모니터링(MRM) MS 에세이를 생성하였다(보충 방법 및 결과). 타당성 확인 에세이는 예측변수 단백질 IBP4 및 SHBG 및 다른 대조군에 특이적인 단백질형 펩티드(proteotypic peptide)를 정량화하였다. 샘플을 32개의 뱃치에서 처리하였으며, 이는 임상 대상체(24), 건강한 비-임신 공여자로부터의 풀링된 혈청 표준(HGS)(3), 건강한 임신 공여자로부터의 풀링된 혈청 표준(pHGS)(3) 및 과정 대조군으로서 제공된 인산 완충 식염수(2)로 구성되었다. 모든 분석에 대해, 혈청 샘플은 우선 MARS-14 면역-제거 칼럼(Agilent Technologies)을 사용하여 높은 존재비 및 비-진단 단백질을 제거하고, 디티오트레이톨로 환원시켰으며, 요오도아세트아미드를 사용하여 알킬화하고, 트립신으로 분해시켰다. 중 표지 안정 동위원소 표준(SIS) 펩티드를 샘플에 첨가하였으며, 이를 후속적으로 탈염화하고 역전상 액체 크로마토그래피(LC)/MRM-MS에 의해 분석하였다. 혈청에서 측정된 펩티드 단편 이온(즉, 전이물)의 피크 면적을 동일한 혈청 샘플 내로 섞인 대응 SIS 전이물의 피크 면적으로 나눈 반응률(RR)을 생성함으로써 정규화를 위해 SIS 펩티드를 사용하였다.
IBP4 / SHBG 예측변수
예측변수 스코어를 IBP4와 SHBG 펩티드 전이물 반응률의 자연 로그로서 정의하였다:
Figure pct00005
여기서, RR은 각각의 펩티드의 측정된 반응률이다.
결과
도 23은 PAPR에서 연구 대상체의 분포를 요약한다. 2011년 3월과 2013년 8월 사이에, 5,501명의 대상체를 등록하였다. 프로토콜에서 미리 정의된 바와 같이, 임신의 제1기 3개월 이후에 프로게스토젠(progestogen) 치료를 받은 것으로 인해 410명(6.7%)의 대상체를 분석에서 배제하였다. 조기 중단으로 인해 추가 120명(2.2%)의 대상체를 배제하였으며, 146명(2.7%)이 추적연구를 놓쳤다. 총 4,825명의 대상체가 분석을 위해 이용 가능하였다. 533명의 PTB; 248명(4.7%)의 자발성 및 285명(5.9%)의 의학적 지시가 있었다. 만기에 분만한 이들에 비해, sPTB가 있는 대상체는 1종 이상의 사전 PTB를 가졌었으며, 연구 임신에서의 임신 12주 이후 출혈을 겪었던 경향이 더 컸다(표 1). 타당성 확인을 위해 선택된 sPTB 사례 및 만기 대조군의 특징은 히스패닉 대조군이 유의미하게 더 많이 있었다(47.5% 대 33.3% p=0.035)는 것을 제외하고, 서로 유의미하게 상이하지 않았다. 유사하게는, 타당성 확인을 위해 선택된 대상체는 만기 대조군의 민족성을 제외하고, 전체적으로 연구 코호트를 주로 대표하였다(표 1).
타당성 확인 분석
발견 및 검증 분석에서, IBP4/SHBG의 비 및 19 0/7주 내지 21 6/7 주 GA의 구간은 각각 AUROC 및 GA 구간에 의해 최고 성능을 발휘하는 sPTB 예측변수로 식별되었다(하기 보충 결과). 타당성 확인을 위해, 미리 정의된 고정 시퀀스 방법은 19 1/7 내지 20 6/7 주의 GA 구간에 대하여 식별된 최적 성능을 이용하여, BMI 계층화가 있거나 없는 IBP4/SHBG 예측변수를 확인하였다. BMI를 고려하지 않고, 확인된 성능은 AUROC = 0.67(p = 0.02)이었다(보충 결과). 그러나, 예상된 바와 같이, 성능은 0.75의 AUROC(p = 0.016, 95% CI 0.56 - 0.91)에 대응하는 >22 kg/m2 및 ≤37 kg/m2의 BMI 계층화를 이용하여 개선되었다(도 24). BMI 계층화의 보다 상세한 특징은 보충 결과에서 찾아볼 수 있다. 예민도, 특이성, AUROC 및 오즈비(odds ratio)(OR)의 성능 측정치를 다양한 사례 대 대조군 경계에서 결정하였다(표 2). sPTB 대 만기 출산에 대해(<37 0/7 대 ≥37 0/7 주), 예민도 및 특이성은 5.04의 오즈비(OR)(95% CI 1.4 - 18)와 함께, 각각 0.75 및 0.74였다. 다른 경계에서의 결과를 표 2에 요약하였다. 검사의 정확도는 낮은 GA 경계에서 개선되었다.
임상 위험의 측정치인 출현율 조정(prevalence adjusted) 양성 예측도(PPV)를 예측변수 스코어의 함수로서 도 25에 도시하였다. 예측변수 스코어 증가를 갖는 대상체의 계층화는 2X(14.6%) 및 3X(21.9%)(파선) 및 그 이상의 상대 위험에 대해 배경값(미국에서의 외동 출산에 대해 7.3%의 집단 sPTB 비율)(Martin et al., Births: final data for 2013. Natl Vital Stat Rep. 2015;64(1):1-65 Martin JA, Hamilton BE, Osterman MJ, Curtin SC, Matthews TJ. Births: final data for 2013. Natl Vital Stat Rep. 2015;64(1):1-65)으로부터의 PPV 증가로서 발생한다(도 25). 출산 범주에서 GA에 의해 색상 코딩된 대상체에 대한 IBP4/SHBG 예측변수 스코어 값의 분포를 도 25에 박스 도식으로 도시하였다. 가장 초기의 sPTB 사례(<35 0/7 주 GA)는 후기의 만기 대조군(≥39 0/7 주 GA)에 비해 더 높은 예측변수 스코어를 갖는 반면에, 후기 sPTB 사례(≥35 0/7 내지 <37 0/7 주 GA)에 대한 스코어는 초기의 만기 대조군(≥37 0/7 내지 <39 0/7 주 GA)과 중첩된다(도 25). 타당성 확인 대상체는 2X 상대 위험(14.6%의 PPV)에 대응하는 예측변수 스코어 컷-오프에 따라 고위험 또는 저위험으로 식별되었다. 고위험 및 저위험 그룹에 대한 출산율을 카플란 마이어 분석에서의 사례로서 나타내었다(도 26). 이 분석으로부터, 고위험으로 분류된 이들은 일반적으로 저위험으로 분류된 이들에 비해 일찍 분만하였다(p = 0.0004).
사후 타당성 확인 분석
최적의 BMI 및 GA 구간 내의 맹검 검증(하기 보충 데이터) 및 타당성 확인 분석으로부터의 대상체들의 조합을 사용하여 예측변수 성능을 측정하였다. 조합된 샘플 세트에 대한 ROC 곡선을 도시하였으며, 0.72의 AUROC(p = 0.013)에 대응한다(도 27).
'오믹스' 방법을 사용하여, 본 발명자들은 75%의 여성이 sPTB 되어질 것임을 식별하는 >22 kg/m2 및 ≤37 kg/m2의 BMI 구간을 갖는 19-20주의 IBP4/SHBG 수준의 비로 구성된 산모 혈청 예측변수를 개발하였다. sPTB의 이전 이력(Goldenberg et al., Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 2008;371(9606):75-84. doi:10.1016/S0140-6736(08)60074-4, Petrini et al. Estimated effect of 17 alpha-hydroxyprogesterone caproate on preterm birth in the United States. Obstet Gynecol. 2005;105(2):267-272) 및 자궁경부 길이 측정치(Iams et al. The length of the cervix and the risk of spontaneous premature delivery. National Institute of Child Health and Human Development Maternal Fetal Medicine Unit Network. N Engl J Med. 1996;334(9):567-72; Hassan et al. Vaginal progesterone reduces the rate of preterm birth in women with a sonographic short cervix: a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Ultrasound Obstet Gynecol. 2011;38(1):18-31)는 지금까지 임상 위험의 최고 측도로 간주된다; 그러나, 개별적으로 또는 조합적으로 이들은 다수의 sPTB를 예측할 수 없다.
이상적인 sPTB 예측 도구는 최소로 침윤적이고, 일상적인 산과 방문의 시기와 일치하는 임신 초기에 수행될 것이며, 최고 위험이 있는 이들을 정확하게 식별할 것이다. 현재 '오믹스 연구는 임신의 생리학적 상태에서의 동요가 sPTB 대상체에서 측정된 산모 혈청 피분석물에서 검출될 수 있다는 것을 제시한다. PTB에서의 '오믹스 발견 연구는 프로테오믹(Gravett et al. Proteomic analysis of cervical-vaginal fluid: identification of novel biomarkers for detection of intra-amniotic infection. J Proteome Res. 2007;6(1):89-96; Goldenberg et al. The preterm prediction study: the value of new vs standard risk factors in predicting early and all spontaneous preterm births. NICHD MFMU Network. Am J Public Health. 1998;88(2):233-8; Gravett et al. Diagnosis of intra-amniotic infection by proteomic profiling and identification of novel biomarkers. JAMA. 2004;292(4):462-469; Pereira et al. Insights into the multifactorial nature of preterm birth: proteomic profiling of the maternal serum glycoproteome and maternal serum peptidome among women in preterm labor. Am J Obstet Gynecol. 2010;202(6):555.e1-10; 32. Pereira et al. Identification of novel protein biomarkers of preterm birth in human cervical-vaginal fluid. J Proteome Res. 2007;6(4):1269-76; Dasari et al. Comprehensive proteomic analysis of human cervical-vaginal fluid. J Proteome Res. 2007;6(4):1258-1268; Esplin et al. Proteomic identification of serum peptides predicting subsequent spontaneous preterm birth. Am J Obstet Gynecol. 2010;204(5):391.e1-8.), 전장전사체(transcriptomic)(Weiner et al. Human effector/initiator gene sets that regulate myometrial contractility during term and preterm labor. Am J Obstet Gynecol. 2010;202(5):474.e1-20; Chim et al. Systematic identification of spontaneous preterm birth-associated RNA transcripts in maternal plasma. PLoS ONE. 2012;7(4):e34328. Enquobahrie et al. Early pregnancy peripheral blood gene expression and risk of preterm delivery: a nested case control study. BMC Pregnancy Childbirth. 2009;9(1):56), 게놈(Bezold et al. The genomics of preterm birth: from animal models to human studies. Genome Med. 2013;5(4):34; Romero et al. Identification of fetal and maternal single nucleotide polymorphisms in candidate genes that predispose to spontaneous preterm labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol. 2010;202(5):431.e1-34; Swaggart et al. Genomics of preterm birth. Cold Spring Harb Perspect Med. 2015;5(2):a023127; Haataja et al. Mapping a new spontaneous preterm birth susceptibility gene, IGF1R, using linkage, haplotype sharing, and association analysis. PLoS Genet. 2011;7(2):e1001293; McElroy et al. Maternal coding variants in complement receptor 1 and spontaneous idiopathic preterm birth. Hum Genet. 2013;132(8):935-42.), 및 대사체(metabolomic)(Menon et al. Amniotic fluid metabolomic analysis in spontaneous preterm birth. Reprod Sci. 2014;21(6):791-803) 방법을 포함해 왔다. 그러나, 지금까지 이들 방법 중 아무것도 무증상 여성에서 sPTB의 위험을 신뢰할 수 있게 예측하기 위한 확인된 검사 방법을 생성하지 못하였다.
본 발명은 독립적인 발견, 검증 및 타당성 확인 분석을 허용하는 대체로 전향적이고 동시적인 임상 연구의 결과인 한편, 오믹스' 검사 개발에 관한 IOM 가이드라인을 준수한다. 그것은 임신과 관련된 생물학적 경로를 조사하기 위한 크고 표준화된 복합 프로테오믹 에세이의 구축을 포함하였다. 연구 크기 및 상대적으로 넓은 혈액 수집 윈도우(17 0/7 내지 28 6/7 주 GA)는 또한 sPTB 사례와 만기 대조군 사이의 단백질 농도에서 뚜렷한 변경이 있는 GA 구간의 식별이 가능하였다. 저복잡성 예측변수 모델(즉, 2개 단백질의 비)의 사용은 과적합의 위험을 제한하였다.
프로테오믹 에세이 및 모델 수립의 적용은 sPTB에 대해 지속적으로 양호한 예측 성능을 갖는 중요 단백질 쌍(IBP4 및 SHBG)의 식별을 야기하였다. 다중 병인의 결과로 보이는 병태에 대한 분류인자를 수립하는 시도에도 불구하고, 예측변수는 0.75의 AUROC을 갖는 <37 0/7 대 ≥37 0/7 주 GA의 컷오프에서 양호한 성능을 입증하였다. 중요하게는, 예측변수의 정확도는 초기 sPTB(예를 들어, <35 0/7 주 GA)에 대해 개선되어, 질병률에 대해 가장 큰 잠재력을 갖는 상기 sPTB의 검출을 가능하게 한다. IBP4/SHBG 예측변수를 사용하여 sPTB에 대한 고위험이 있는 것으로 결정된 대상체는 저위험으로 식별된 대상체에 비해 상당히 일찍 분만하였다. 본 발명자들의 조사결과는 IBP4와 SHBG가 sPTB의 병인과 관련하여 중요한 기능을 수행할 수 있고/있거나 관련 생물학적 경로에서 수렴점(convergence point)으로 작용할 수 있다는 것을 제시한다.
자궁경부 길이(CL)의 범용 경질 초음파(transvaginal ultrasound)(TVU) 측정은 대다수의 우리 연구 센터에서 일상적으로 수행되지 않았으며, 1/3 미만의 연구 대상체에 대해 이용 가능하였다. 미래 연구에서 CL 측정이 프로테오믹 예측변수에 대해 개선시키는지 여부를 평가하거나, 대안적으로 IBP4/SHBG 분류인자에 의한 위험 계층화가 순차적 CL 측정으로부터 가장 이익을 얻는 여성을 식별하는지 평가하는 것은 흥미로울 것이다. 최종적으로, BMI 변수와 함께, 또는 다른 병력/임신 이력 및 사회인구통계적 특징과 조합하여 분자 예측변수의 성능을 조사하는 것이 흥미로울 것이다.
결론적으로, 무증상 경산부 및 무산부에서 IBP4 및 SHBG의 혈청 측정치에 기초하여 sPTB에 대해 미리 정의된 예측 검사는 대상체의 완전히 독립적인 세트에서 입증되었다. 또한, 이들 단백질, 이의 유전자 조절 및 관련 경로에 대한 기능적 연구는 sPTB의 분자 및 생리학적 기초를 설명하는 것을 도울 수 있다. 이 예측변수의 적용은 sPTB의 위험이 있는 여성의 초기 검출 및 예민한 검출이 가능해야 한다. 이것은 증가된 임상 감시를 통해 임신 결과를 개선시킬 수 있을 뿐 아니라, PTB 예방에 대한 임상 간섭의 개발을 가속화할 수 있다.
보충 재료 및 방법
발견 및 검증 대상체
발견 및 검증 대상체는 본 실시예에서 상기 개시된 PAPR 연구로부터 유래되었다.
발견 및 검증 원리
sPTB 사례는 본 실시예에서 상기 개시된 바와 같이 정의되었다. 예측변수의 발견 및 검증은 'omics' 리서치에서 모범 실습을 위한 지침에 따라 수행되었다 (IOM (Institute of Medicine). Evolution of Translation Omics: Lessons Learned and the Path Forward. (Micheel CM, Nass SJ, Omenn GS, eds.). Washington, DC: The National Academies Press.; 2012: 1-355). 집합 사례/대조군 분석은 서로 완전히 독립적인 샘플 세트를 사용하였다. 발견 및 검증을 위해 선택된 사례 및 대조군은 대상체내 데이터 불일치에 대해 중앙 검토(central review)를 받았다; 의료 기록과 함께 어떠한 근거문서검토 (source document verification (SDV))도 수행되지 않았다. 발견 및 검증을 위한 모든 sPTB 사례 및 대조군은 개별적으로 최고 의료 책임자(Chief Medical Officer)에 의해 판정되었고, 불일치는 임상 현장에서 PI로 확인되었다. 연구 설계, 분석 계획 및 검증 맹검 프로토콜을 비롯한 상세한 분석 프로토콜이 미리 설정되었다. 실험실 및 데이터 분석 구성원들은 검증 대상체의 사례, 대조군 및 GA 데이터 할당에 대해 맹검처리되었다. 이하 개시된 바와 같이 계산된 예측변수 스코어를 내부의 맹검처리된 통계전문가에 의해 모든 대상체에 할당하였다. DCO에 의해 예측변수 스코어에 연결된 사례, 대조군 및 GA 데이터를 분석을 위해 독립적인 외부 통계전문가에게 제공하였다. 이어서 AUROC 결과를 DCO에게 다시 전달하였다. 데이터 전달은 엑셀에서 SUMPRODUCT 함수 (Microsoft. Microsoft Excel. 2013)를 이용하여 데이터 완전성이 유지될 수 있게 하였다. 대상체로부터 검증 결과까지의 데이터의 감사 추적을 제공하기 위해, 분석 데이터, 계획 및 보고서에 디지털 타임스탬프가 적용되었다.
발견 및 검증 연구 설계
발견 및 검증 sPTB 사례는 채혈시 재태 기간 (GABD) 17 0/7 내지 28 6/7주에 걸쳐 각각 수집된 총 86개 및 50개의 대상체에 대한 것이었다. 발견 및 검증에 사용된 대상체는 서로 완전히 독립되었고 타당성 확인에 사용된 대상체와도 독립적이었다. 매칭된(matched) 대조군이 본 실시예에서 상기 개시된 바와 같이 발견 및 검증에서 sPTB 사례에 대해 식별되었다.
출현율 분석
발견, 검증 및 타당성 확인 분석 후, 이전 연구에서 사용하지 않은 추가의 만기 대조군을 PAPR 데이터베이스로부터 선택하였고, 본 실시예에서 상기 개시되고 타당성 확인에 적용된 MRM-MS 에세이를 사용하여 실험실에서 처리하였다. R 통계 소프트웨어(R Statistical software) (버젼 3.0.3)에서 샘플링 패키지를 사용하여 (Team RC. R: a Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria; 2014. 2015; Matei A, Tille Y. The R "sampling" package. European Conference on Quality in Survey Statistics. 2006), 187개의 대상체 세트를 확인된 재태 기간 채혈 구간으로부터 무작위로 선택하여 일변량의 통계 분석 (카이 제곱 검정, Chi-Square Test)을 통해, 2012년 국가 인구 통계 보고서 (National Vital Statistics Reports)(NVSR)로부터 출산시 재태 기간 (GAB) 데이터에 대해 비교하였다 (Martin et al.: Final Data for 2012. National Vital Statistics Reports. 2014;63(09): 1-86). 2012 NVST에서 최적의 p 값 (0.950의 최소 허용치로 1.0에 근접하는)을 기준으로 출산 분포에 가장 근접하는 대조군 세트가, PAPR 연구에서 BMI 분포에 대해 전체적으로 비교하기 위해 선택되었다. PAPR 연구 데이터베이스로부터 BMI 데이터에 대해 일변량의 통계 분석 (카이 제곱 검정)을 사용하면서, BMI의 분포 (0.950의 최소 허용치로 1.0에 근접하는) 및 NVSR에서 분만 시간의 분포에 가장 가깝게 접근하는 대조군 세트를 선택하고, 확인된 채혈 샘플의 GABD와 비교하였다. 모든 3개의 분포에 가장 근접한 세트를 출현율 연구를 위한 대상체 세트로서 선택하였다. 타당성 확인 GABD 구간 및 BMI 제한 안에서 검증, 타당성 확인 및 출현율에 대한 예측변수 스코어 값은 총 150개의 대상체에 대한 것이었다. 이러한 복합 데이터세트를 사용하여 도 25에서 PPV 곡선에 대해 신뢰 구간의 최적 추정치를 수득하였다. PPV에 대한 신뢰 구간은 이항 비에 대한 오차의 정규 근사 (normal approximation)를 이용하여 계산하였다 (Brown et al. Interval estimation for a binomial proportion. Statistical science. 2001 ; 16(2): 101-133).
실험실 방법
시스템 생물학 방법을 사용하여 다음과 같은 반복적용에 의해 고도로 복합적인 다중 반응 모니터링 (MRM; multiple reaction monitoring) 질량 분석법(MS) 에세이를 하였다: 문헌 큐레이션(literature curation), 표적화 및 비-표적화된 프로테오믹 발견 및 대상체 샘플의 소규모 MRM-MS 에세이. 147개의 단백질을 측정하는, 성숙(mature) MRM-MS 평가를, 발견 및 검증 연구에 적용하였다. 모든 분석에 대해, 혈청 샘플을 본 실시예에서 상기 개시한 바와 같이 실험실에서 처리하였다. 풀링된 혈청 대조군(pHGS)의 분취액을 사용하여 IBP4 및 SHBG에 대한 뱃치내 분석적 변이 계수 (CV)를 계산하였다.
일반적 예측변수 개발 전략
임신 중 단백질 발현의 역동적인 특성으로 인해 광범위한 재태 기간 범위에 걸쳐 예상되는 바이오마커 성능의 과적합을 피하고 그의 희박화를 극복하기 위한 전략이 개발되었다. 하향-조절된 피분석물의 강도에 대한 상향-조절된 피분석물의 강도의 비가 예측변수 개발에 사용되었다. 이러한 "반전"은 최고 스코어 쌍(top-scoring pair) 및 2-유전자 분류인자 전략(2-gene classifier strategies)과 유사하다 (Geman et al. Classifying gene expression profiles from pair wise mRNA comparisons. Stat Appl Genet Mol Biol. 2004;3(l):Article 19; Price et al. Highly accurate two-gene classifier for differentiating gastrointestinal stromal tumors and leiomyosarcomas. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104(9):3414-9). 이 방법은 "반전"에서 두 단백질이 동일한 사전 분석 및 분석 처리 단계를 거침에 따라 진단 신호의 증폭과 자기-정규화를 가능하게 하였다. 복잡한 프로테오믹스 워크플로우(workflow)에서 펩티드 강도 측정치를 정규화하기 위한 전략으로, 반전은 "내인성 단백질 정규화 (endogenous protein normalisation, EPN)"라는 최근 도입된 방법과 유사하다 (Li et al. An integrated quantification method to increase the precision, robustness, and resolution of protein measurement in human plasma samples. Clin Proteomics. 2015; 12(1):3; Li et al. A blood-based proteomic classifier for the molecular characterization of pulmonary nodules. Sci Transl Med. 2013;5(207):207ral42). 모델 구축에 사용된 후보 피분석물의 수는 분석 기준에 따라 감소되었다. 분석 필터에는 분석 정확도를 위한 컷-오프, 강도, 간섭 증거, 샘플 처리 순서 의존성 및 사전 분석 안정성이 포함된다. 하나의 예측변수에 있는 피분석물의 총 개수는 단일 반전에 제한되었고, 따라서 복잡한 수학 모델을 피할 수 있다. 예측변수 스코어는 단일 반전 값의 자연 로그로 정의되었고, 여기서 반전 자체가 반응률 (본 실시예에서 상기에서 정의됨)이었다. 마지막으로, 예측 성능은 임신 3주 구간으로 좁게 중첩되면서 조사되었다.
수신자 조작 특성 곡선 (Receiver Operating Characteristic Curve)
AUROC 값과 관련된 p-값을 본 실시예에서 상기 개시된 바와 같이 반전에 대해 계산하였다. 조합된 발견 및 검증 세트에서 예측변수 AUROC에 대한 분포 및 평균 값(the distribution and mean value)을 반복적으로 수행된 부트스트랩 샘플링을 사용하여 임의의 복원 추출 샘플 세트를 선택하여 계산하였다 (Efron B, Tibshirani RJ. An Introduction to the Bootstrap. Boca Raton, Florida: Chapman and Hall/CRC Press; 1994). 각각의 반복 시 선택된 샘플의 총 개수는 출발 풀에 사용가능한 총 개수에 해당하였다.
보충 결과
발견, 검증 및 타당성 확인 대상체 특징은 표 3에 요약된다. 발견 sPTB 사례에서 1회 이상의 종전의 sPTB 경험을 갖는 대상체의 백분율은 검증 또는 타당성 확인에서보다 높았고, 다른 특징은 연구 전반에 걸쳐 상당히 일관되었다.
발견 및 검증 분석
44개의 단백질은 중첩된 3주 GA 구간으로 상향-조절 또는 하향-조절되었고 분석 필터를 통과시켰다 (도 28). 하향-조절된 단백질 분의 상향-조절된 단백질의 비 및 중첩된 3-주 GA 구간 각각에서 샘플에서 시험된 예측 성능으로부터 반전이 형성되었다. 대표적 패턴을 나타내는 하위 세트의 반전에 대한 성능을 도 29에 나타낸다. 성능 웨이브는 분명하였다: IBP4/SHBG 및 APOH/SHBG 반전은 초기 윈도우에서 더 양호한 AUROC 값을 갖는 한편, ITIH4/BGH3 및 PSG2/BGH3은 재태 기간 중 더 나중에 피크를 형성하였다 (도 24). 몇몇 반전은 전체 재태 기간 범위에 걸쳐 일관되지만 보통인 성능을 보였다 (PSG2/PRG2)(도 29). 전반적으로 상부의 성능 반전, IBP4/SHBG은 19 0/7로부터 21 6/7까지 구간에서 AUROC = 0.74를 가졌다 (도 29). IBP4/SHBG 예측변수의 AUROC 성능은 대상체가 임신 전 BMI < 35(kg/m2)로 계층화될 때 0.79까지 증가하였다 (표 4). 임신 초기 (즉, 17 0/7 내지 22 6/7주 GA)에 그의 일관적으로 강한 성능 (도 29) 및 잠재적으로 바람직한 임상적 유용성 때문에, IBP4/SHBG 예측변수가 검증 분석을 위해 선택되었다.
검증 샘플 상에서 맹검처리된 IBP4/SHBG AUROC 성능은, 발견에서 수득된 성능과 잘 일치하는 것으로, 모든 대상체 및 BMI로 계층화된 대상체에 대해 각각 0.77 및 0.79였다 (표 5). 맹검 검증 후, 발견 및 검증 샘플을 부트스트랩 성능 결정을 위해 조합하였다. 2,000개의 부트스트랩 반복으로부터 0.76이라는 평균 AUROC를 수득하였다 (도 30).
BMI 타당성 확인 분석
IBP4/SHBG 예측변수의 성능은 타당성 확인 샘플에서 몇몇 BMI의 컷-오프에서 평가되었다 (표 5). AUROC은 매우 높은 (예: > 37 kg/m2) 또는 낮은 BMI(예: ≤22 kg/m2)의 제거에 의해 적당히 향상된 성능을 측정하였다. 이들 2개의 컷-오프의 조합에 의한 계층화로 AUROC가 0.75이었다 (표 5).
실시예 3. 질량 분석법 및 면역분석 데이터의 상관 관계
이 실시예는 조기, 중기 및 후기 재태 기간 수집 윈도우에서 sPTB에 대한 IBP4 및 다른 바이오마커들, 개별적인 바이오마커를 식별하는 Myriad RBM 스크린의 결과, (2) SHBG/IBP4에 대한 MS와 면역분석 결과의 상관관계, 및 (3) sPTB에 대한 바이오 마커로서의 SHBG에 관한 임상 데이터를 입증한다.
RBM 데이터
간략하게, RBM은 PAPR로부터 40개의 사례 및 40개의 대조군을 평가하였다(초기 윈도우로부터 20/20, 중앙 윈도우로부터 10/10, 후기 윈도우로부터 10/10). RBM은 Human Discovery MAP 250+ v2.0 (텍사스주 오스틴 소재의 Myriad RBM)을 사용했다. 이러한 분석의 목적은 복수의 피분석물을 사용하여 PTB를 예측하는 다변수 모델을 개발하는 것이다. 랜덤 포레스트 (random forest, rf), 부스팅, 랏쏘 및 로지스틱(logit)의 네 가지 모델링 방법을 사용했다. 우리는 각 방법이 독립적으로 그 방법을 위한 15개의 최적의 변수를 선택하는 변수 선택을 한 번 수행한다. 15개로부터, 아웃-오브-백(out-of-bag) 부트스트랩 샘플을 사용하여 ROC 곡선 아래의 면적(AUC)을 역 단계 선택 및 추정(backward stepwise selection and estimation)을 사용하여 4가지 모델링 방법 각각에 의해 최적의 피분석물을 독립적으로 선택했다. 표 6은 여러 다변수 모델의 상위 결과들을 나타낸다. 표 7은 다른 다변수 모델(Different Multivariate Model)에 의한 초기 윈도우 (GABD 17-22주) 피분석물 랭킹을 나타낸다. 표 8은 다른 다변수 모델에 의한 중앙 윈도우 (GABD 23-25주) 피분석물 랭킹을 나타낸다. 표 9는 다른 다변수 모델에 의한 후기 윈도우 (GABD 26-28주) 피분석물 랭킹을 나타낸다.
질량 분석 데이터와 상관관계가 있는 시판 ELISA 키트 식별
간략하게, ELISA 대 MS 비교는 PAPR 샘플을 사용하고 크기가 30-40개의 대상체의 범위인 다수의 연구를 포함하였다. 각 ELISA는 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 이어서 ELISA에 의한 각각의 피분석물의 예상되는 농도를 동일한 샘플로부터의 MS 유도된 상대 비과 비교하였다. 비교를 위해 Person의 r 상관관계 값을 작성하였다. ELISA 대 MS 비교는 PAPR 샘플을 사용하고 크기가 30-40개의 대상체의 범위인 다수의 연구를 포함하였다. 각 ELISA는 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 이어서 ELISA에 의한 각각의 피분석물의 예상 농도를 동일한 샘플로부터의 MS 유도된 상대 비과 비교하였다. 비교를 위해 Person의 r 상관관계 값을 작성하였다. 표 10은 피분석물 IBP4_HUMAN 및 SHBG_HUMAN에 대해 시험된 키트에 대한 에피토프 및 클론형성능 정보를 제공한다. 표 11은 상관관계가 존재하는 단백질의 경우에도, 모든 ELISA 키트가 MS와 상관있지는 않다는 것을 보여준다. 예를 들어, IBP4, CHL1, ANGT, PAPP1을 참조한다.
ELISA 및 MS 에세이 사이의 비교를 위해 PAPR 연구로부터 기지의 결과를 갖는 이전에 냉동된 120개의 혈청 샘플을 선택하였다. 이 샘플들은 119일 내지 180일의 채혈시 재태 기간 (GABD)을 갖는다. 임산부 BMI로 인해 샘플이 제외되지 않았다. ELISA는 IBP4(텍사스 웹스터 소재의 ANSCH Labs, AL-126) 및 SHBG (미네소타, 미네아폴리스 소재의 R&D Systems, DSHBG0B)의 시판용 키트에서 수행되었다. 에세이는 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 내부 표준은 플레이트-플레이트 정규화(plate-to-plate normalization)에 사용되었다. 스코어는 LN([IBP4]/[SHBG])에 따라 ELISA 농도 값으로부터 계산되었고, LN(IBP4RR/SHBGRR)에 따라 MS에 의해 계산되었으며, 여기서 RR은 SIS 펩티드 피크 면적에 대한 내인성 펩티드의 상대적 비를 말한다. 두 방법에서 얻은 스코어는 사례 대 대조군 분리 (동일한 표준 편차를 추정하면서, 대응이 없는(unpaired) t-검정에서 유래된 p값)에서 비교되었다 (도 31).
ELISA 및 MS 에세이 간의 비교를 위해 PAPR 연구로부터 기지의 결과를 갖는 57 개의 미리 냉동된 혈청 샘플 (19개의 sPTB 사례, 38개의 만기 대조군)을 선택하였다. 이 샘플들은 133일 내지 148일의 채혈시 재태 기간(GABD)을 갖는다. ELISA는 IBP4 (텍사스 웹스터 소재의 ANSCH Labs, AL-126) 및 SHBG (미네소타, 미네아폴리스 소재의 R&D Systems, DSHBG0B)를 위한 시판되는 키트에서 수행되었다. 에세이는 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 상이한 플레이트 상에서 수행된 샘플은 내부 표준을 사용하여 정규화되었다. 스코어는 LN([IBP4]/[SHBG])에 따라 ELISA 농도 값으로부터 계산되었고, LN(IBP4RR/SHBGRR)에 따라 MS에 의해 계산되었으며, 여기서 RR은 SIS 펩티드 피크 면적에 대한 내인성 펩티드의 상대적 비를 말한다. 이어서 수신기 조작 특성 곡선 아래의 면적 (AUC)에 의한 면역분석의 성능을 결정하고 동일한 샘플 세트상의 MS 유래된 AUC와 비교하였다(도 32). AUC 값은 또한 BMI 계층화를 샘플에 적용한 후에 결정되었으며 (BMI>22≤37) 총 34개의 샘플 (sPTB 사례 13개, 만기 대조군 21개)을 얻었다 (도 33).
PAPR 연구로부터 기지의 결과를 갖는 60개의 미리 냉동된 혈청 샘플을 ELISA 및 MS 에세이에 의해 분석하였다. 이 샘플은 133일 내지 146일의 예측된 채혈시 재태 기간 (GABD)을 갖는다. 상관 관계 분석은 모든 BMI에서 샘플에 대해 (도 34, 우측 패널) 또는 BMI> 22 또는 ≤37인 샘플의 하위 세트에 대해 수행되었다 (도 34, 좌측 패널). ELISA는 IBP4 (텍사스 웹스터 소재의 ANSCH Labs, AL-126) 및 SHBG (미네소타, 미네아폴리스 소재의 R&D Systems, DSHBG0B)를 위한 시판되는 키트에서 수행되었다. 에세이는 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 내부 표준은 플레이트-플레이트 정규화(plate-to-plate normalization)에 사용되었다. 스코어는 LN([IBP4]/[SHBG])에 따라 ELISA 농도 값으로부터 계산되었고, LN(IP4RR/SHBGRR)에 따라 MS에 의해 계산되었으며, 여기서 RR은 SIS 펩티드 피크 면적에 대한 내인성 펩티드의 상대적 비를 말한다. 두 방법에서 얻은 스코어는 상관관계에 의해 그리고 사례 대 대조군 분리 (동일한 표준 편차를 추정하면서 쌍을 이루지 않은 t-검정에서 유래된 p값)에서 비교되었다. 표 12는 sPTB 대 대조군 분리 (일변량)를 입증하는 IBP4 및 SHBG ELISA 키트를 보여준다.
질량 분석법 및 임상 분석기에 의한 SHBG 측정치의 비교
Sera Prognostics, 및 2개의 독립적인 기준 연구실인 ARUP Laboratories 및 Intermountain Laboratory Services에서 개별 대상체 및 임신 및 비-임신 여성의 혈청 풀로부터의 35개의 샘플을 동시에 분석하였다. 분취액을 각 연구실에 보내어 냉장 보관하고 출하를 조정하여 세 곳의 연구실 모두에서 동일한 날짜에 시험을 시작하도록 하였다. ARUP은 Roche cobas e602 분석기를 사용하고 Intermountain은 Abbott Architect CMIA (모두 반자동 면역 분석 장비임)를 사용한다. Sera Prognostics는 샘플의 면역 소모, 효소 분해 및 Agilent 6490 질량 분석계상의 분석을 수반하는 독특한 프로테오믹 분석 방법을 사용한다. ARUP와 IHC 모두의 결과는 nmol/L로 보고된 한편, Sera는 중쇄 및 경쇄 펩티드 대용의 상대적 비 (RR)을 사용한다. ARUP 및 Intermountain으로부터의 데이터를 서로 비교하여 정확도를 결정했다 (도 39). 직선성 및 정확성은 광범위한 결과에 걸쳐 1.032의 직선 기울기 및 0.990의 r2 값과 잘 맞았다. 이어서 각각의 기준 연구실의 데이터를 Sera의 RR과 선형 회귀선과 비교하였다 (도 37 및 38). 데이터는 0.937의 r2 값을 갖는 ARUP 및 0.934의 r2 값을 갖는 Intermountain과 Sera 결과에 잘 비교되었다.
실시예 4. PreTRM IBP4 및 SHBG 펩티드 내의 SNP, 삽입-결실 및 구조 변이체
이 실시예는 PreTRM IBP4 및 SHBG 펩티드 내의 기지의 SNP, 삽입-결실 (indel) 및 구조 변이체를 나타낸다.
표 13 및 표 14는 PreTRM IBP4 및 SHBG 펩티드 내의 기지의 SNP, 삽입-결실 (indel) 및 구조 변이체를 상세히 나타낸다. 정보는 단일 뉴클레오타이드 다형성 데이터베이스 (dbSNP) 빌드 146(Single Nucleotide Polymorphism database (dbSNP) Build 146)로부터 유래된 것이다. SHBG에서 단일 미스센스 변이 (G>C), A179P (dbSNP id: rsl15336700)는 0.0048의 최고 총 대립 유전자 빈도를 갖는다. 이 대립 유전자 빈도는 낮지만, 1000개의 게놈 프로젝트에서 연구된 몇몇 아집단은 상당히 높은 빈도를 보였다. 이러한 모집단 (대립 유전자 빈도)은 다음과 같다: 미국 남서부에 있는 아프리카 출신 미국인 (0.0492); 바바도스에 있는 아프리칸 캐리비안 (0.0313); 나이지리아 이바단에 있는 요루바족 (0.0278); 케냐 웨부예에 있는 루히아족(0.0101); 나이지리아의 에산족(Esan)(0.0101); 콜롬비아 메델린 출신 콜롬비아인 (0.0053); 감비아의 서부 지역에 있는 감비아인 (0.0044). 연구된 그 밖의 모든 아집단은 이 뉴클레오티드 위치에 변화가 없었다. 표 상단에는 클러스터 id - (dbSNP rs 숫자), 이형 접합성 - 평균 이형 접합성, 타당성 확인-타당성 확인 방법 (또는 타당성 확인 없이 빈칸), MAF - 대립유전자 빈도(Minor Allele Frequency), 함수 - 다형성의 함수적 특성, dbSNP 대립유전자 - 대립유전자 뉴클레오티드의 식별, 단백질 잔기 - 대립유전자로부터 잔기, 코돈 pos - 코돈에서 위치, NP_001031.2 아미노산 pos - 참조 서열 NP_001031.2에서 아미노산 위치, 및 NM_001040.2 mRNA pos - 참조 서열 NM_001040.2에서 뉴클레오티드 위치가 포함된다.
실시예 5. IBP4 / SHBG 반전은 sPTB에 대한 진단 신호를 증폭시키고 분석적 변이를 감소시킴.
이 실시예는 IBP4/SHBG 반전 전략을 사용하여 수득된 진단 신호의 증폭 및 변이의 감소를 입증한다.
sPTB 사례 및 만기 대조군 각각에 대해 지시된 재태 기간 범위에 걸쳐 MS에 의해 결정된 IBP4 및 SHBG의 수준이 도시되어 있다 (도 44 및 도 45). 곡선은 펩티드 상대적 비 (대응하는 SIS 피크 면적에 대한 내인성 펩티드 피크 면적)의 평균 평활화에 의해 작성되었다. 사례 대 대조군 신호는 IBP4 및 SHBG에 대해 대략 최대 10 % 차이에 해당한다. 스코어가 ln(IBP4RR/SHBGRR)가 도시됨에 따라 계산될 때, 신호의 증폭이 뚜렷하다 (최대 차이는 약 20 %임) (도 46). 이 데이터는 IBP4 /SHBG 반전 전략을 사용하여 얻은 진단 신호의 증폭을 입증한다.
2개의 단백질 수준의 비를 형성하면 변이를 감소시킬 수 있는데, 왜냐하면 각 단백질이 동일한 분석 및 예비 분석 처리 단계를 경험하기 때문이다. 변이에 미치는 영향을 조사하기 위해 임신한 공여자로부터 풀링된 대조군 혈청 샘플 (pHGS)로부터 개별 단백질 (IBP4 및 SHBG의 RR) 및 IBP4 RR/SHBG RR 비에 대해 CV를 결정하였다. 생물학적 변이가 없는 풀링된 대조군 샘플을 여러 뱃치로 며칠 동안 분석하였다. 반전 변이는 개별 단백질과 관련된 변이보다 작다 (도 48).
일반적으로 반전의 형성이 진단 신호를 증폭시키는지를 조사하기 위해 많은 단백질의 비에 의해 형성된 고성능 반전 (AUC> 0.6)의 ROC 성능 (AUC) 성능을 검사하였다. 도 47의 상단 패널에는 19/0주 내지 21/6주 재태 기간에 수집된 샘플의 데이터 세트를 사용하여 AUC 값 (sPTB 사례 대 만기 대조군)의 범위가 표시된다. 인접한 박스 도식은 관련 반전을 형성하는 데 사용되는 개별 상향-조절 및 하향-조절된 단백질의 ROC 성능에서 범위를 보여준다. 마찬가지로, 반전에 대한 윌콕슨(Wilcoxon) 시험 (sPTB 사례 대 만기 대조군)으로부터 유래된 p값은 상응하는 개별 단백질에 대한 p값보다 더 크다 (도 47, 하단).
반전의 형성이 변이를 더욱 일반적으로 감소시키는지를 조사하기 위해, 임신한 공여자로부터의 풀링된 대조군 혈청 샘플(pHGS)에서의 반전을 포함하는 72개의 상이한 반전 값에 대한 분석적 변이를 검사하였다 (즉, 개별 단백질의 분석적 변이에 대한 상대적인 피크 면적의 비). 생물학적 변이가 없는 풀링된 대조군 샘플을 여러 뱃치로 며칠 동안 분석하였다. 반전 변이는 개별 단백질과 관련된 변이보다 작다 (도 49).
분석적 변이를 감소시키기 위한 반전 전략의 일반화 가능성
도 48은 실험실에서 여러 개의 뱃치로 수일 동안 여러 기구로 분석된 pHGS 시료 (풀링된 임산부 샘플)에 대해 계산된 CV를 보고한다. CV는 생물학적 변이가 없는 pHGS 표본을 사용하여 계산되었기 때문에, 샘플의 실험실 처리 과정에서 도입된 분석적 변이의 척도에 해당한다. 72개의 반전에 대한 비 값과 관련된 분석적 변이는 반전들을 형성하는 데 사용되는 개별적인 상향-조절 및 하향-조절된 단백질의 상대적 피크 면적의 분석적 변이보다 낮다. 도 49.
실시예 6. 의학적으로 표시된 PTB 분석
본 실시예에서는 분류인자가 자간전증 또는 임신성 당뇨병과 같은 증상에 근거하여 의학적으로 표현된 PTB의 구성요소에 민감하다는 것을 확인한다.
PreTRM™은 자연 PTB에 대한 예측변수로서 개발되고 확인되었다. 미국 내 모든 PTB의 약 75%는 자연적이며, 나머지는 일부 산모 또는 태아 합병증 (예: 자간전증, 자궁 내 성장 제한, 감염)으로 인해 의학적으로 표시된다. PAPR 바이오뱅크로부터 41개의 의학적으로 표시된 PTB 샘플을 실험실에서 분석하였고, PreTRM 스코어를 계산하였다. PreTRM™ 스코어는 자간전증에 의학적으로 표시된 것으로 주석이 달린 대상체와 다른 증상으로 주석이 달린 대상체에 대해 비교되었다. 자간전증 때문에 조산한 것으로 의학적으로 표시된 대상체는 다른 대상체들보다 유의미하게 높은 스코어를 보였다 (도 50).
도 52는 당뇨병 주석(annotation)으로 반전 강도 히트맵을 도시한다. 빨간색 화살표는 당뇨병 대상체를 나타낸다. 샘플은 스크린의 하단에 열거되고 PTB 사례는 우측에 만기 출산은 좌측에 열거된다. 당뇨병 환자가 오른쪽에 모여 있어 임신성 당뇨병을 계층화하는 반전이 식별될 수 있으며 따라서 임신성 당뇨병을 예측하기 위해 바이오마커로부터 진단 테스트를 구축하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.
실시예 7. 기타 전이물 및 펩티드
표 16은 비교 IBP4 펩티드 및 전이물 MS 데이터를 나타낸다. 4개의 상이한 중쇄 표지된 펩티드 (R* + 10 달톤)는 IBP4를 정량화하기 위해 모니터링할 수 있는 다양한 전이물과 그들의 상대적 강도를 예시한다. 당업자는 IBP4를 정량화하기 위해, 예시되지 않은 이들 펩티드 또는 전이물 또는 다른 것들 중 임의의 것을 잠재적으로 선택할 수 있다.
표 17은 비교 IBP4 펩티드 및 전이물 MS 데이터를 나타낸다. 재조합 단백질에서 유래된 IBP4 트립신 펩티드를 MRM-MS로 분석하여 후보 대용 펩티드 및 그들의 전이물을 식별하였다. 당업자는 IBP4를 정량화하기 위해, 예시되지 않은 이들 펩티드 또는 전이물 또는 다른 것들 중 임의의 것을 잠재적으로 선택할 수 있다. IBP4는 RBM으로 식별되었고 (위), 이어서 합성 펩티드가 정렬되어 에세이가 이루어졌다.
표 18은 비교 SHBG 펩티드 및 전이물 MS 데이터를 나타낸다. 재조합 단백질 또는 풀링된 임신 혈청으로부터 유래된 SHBG 트립신 펩티드를 MRM-MS로 분석하여 후보 대용 펩티드 및 이들의 전이물을 식별하였다. 당업자는 SHBG를 정량화하기 위해, 예시되지 않은 이들 펩티드 또는 전이물 또는 다른 것들 중 임의의 것을 잠재적으로 선택할 수 있다. 또한 혈청에서 식별된 이소형 특정 펩티드를 나타낸다.
표 19는 PTB 샘플에서 17-25주 GA에 걸쳐 변화된 혈청 수준을 갖는 단백질을 나타낸다. * 추가 단백질은 PTB에 있어서 19-21주 GA로 제한됨. 312명의 여성 (sPTB 사례 104개, 만기 대조군 208개)으로부터 17-25주 재태 기간 (GA)으로부터 여러 경로의 분석된 혈청 샘플로부터 148개의 단백질에 대한 LC-MS (MRM) 에세이. MRM 피크 면적 데이터는 계층적 클러스터링, t-검정, 및 GA와의 관계로 분석하였다. 분석 여과 후, 25개의 단백질은 sPTB 대 만기 대상체에서 유의미한 차이 (p <0.05)를 보였다 (표 1). 전체 GA 범위에서 14종의 단백질 수준이 sPTB 샘플에서 더 높았고 3종은 더 낮았다. 기타 단백질은 GA 기간의 하위 구간에서 동적으로 조절되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, GA 19-21주에는 sPTB에서 추가로 7개의 단백질이 증가했으며 1개는 더 낮았다.
표 20은 sPTB 대 만기 대조군에서 상향 또는 하향 조절된 분석적 필터를 충족시키는 44개의 단백질을 열거한다.
실시예 8. 자연 조산을 예측하는 혈청 프로테오믹 바이오마커로부터의 기계적 통찰
본 실시예는 특정 단백질 발현이 임신 내내 동적으로 변화함에 따라, 바이오마커 성능이 GA에 걸쳐 상당히 변화함을 입증한다. 차별적으로 발현되는 단백질은 스테로이드 대사, 태반 발달, 면역 내성, 혈관 신생 및 임신 유지에 기능을 갖는다. 도 55, 및 도 57-59. sPTB에서 보이는 이러한 단백질 프로파일의 차이는 임신 4개월 내지 6개월 동안 태아/태반 구획 내에서 손상된 발달 전이물을 반영한다.
간략하게, 이 실시예에 개시된 연구의 목적은 자연 조산 (sPTB) 예측과 관련하여 바이오마커에 대한 생리학적 근거에 대해 통찰력을 얻는 것이었다.
연구 설계
염증, 감염 및 출혈과 같은 경로가 조산의 병인학에 연루되어 왔다. 그러나, 어떤 단백질이 혈액에서 측정가능한지, 임신 중일 때 언제 그러한 단백질이 파괴되는지는 거의 알려져 있지 않다. 이러한 질문에 답하기 위해 우리는 312명의 여성 (sPTB 사례 104개, 만기 대조군 208개)으로부터 재태 기간 (GA) 17-25주로부터 여러 경로로부터 분석된 혈청 샘플로부터 148개의 단백질의 LC-MS (MRM) 에세이를 만들어 냈다.
간략하게, 혈청 샘플은 고 풍부 단백질이 제거되었고, 트립신으로 분해되었으며, 거의 모든 단백질에 대해 중-표지된 안정한 동위 원소 표준 (SIS) 펩티드로 강화되었다. 반응률을 생성함으로써 정규화를 위해 SIS 펩티드를 사용하였고, 혈청에서 측정된 펩티드 단편 이온 (즉, 전이물)의 피크 면적을 상응하는 SIS 전이물의 면적으로 나누었다. MRM 피크 면적 데이터의 반응률은 계층적 클러스터링, t-검정 및 GA와의 관계로 분석하였다.
도 53에 도시된 바와 같이, 동일한 단백질에 대한 복수의 펩티드는 서로 밀접하게 관련이 있다. 서로 다른 가지들 (색으로 분류)은 급성기 단백질, 아포지단백질(apolipoprotein) 및 알려진 임신성 특정 단백질과 같은 식별가능한 기능적 범주에 해당한다. PAPP1:PRG2, INHBE:INHBC, 및 IGF2:IBP3:ALS와 같은 생식 생물학에서 중요한 단백질 복합체가 뚜렷하다. 이러한 품질 평가 및 강조 표시된 관계는, 임신 생물학을 탐색하고 sPTB를 예측하는 피분석물을 발견에 사용하기 위해 본 명세서에 개시된 고도로 다중화된 MRM-MS 에세이를 확인한다.
도 54는 세포외 기질 상호 작용에서 기능하는 차별적으로 발현된 단백질을 나타낸다. TENX는 잠재 TGF-b를 활성화시키고 세포 영양막 분화의 전이점에서 태아 및 산모 간질에 국분해된다 [Alcaraz, L., et al. 2014 J. Cell Biol. 205(3) 409-428; Damsky, C, et al. 1992 J. Clin. Invest. 89(1) 210-222]. sPTB에서 감소된 혈청 TENX 수준은 태반에서 혈관 결함 또는 감소된 TGF-b 활성을 나타낸다. NCAM1 (CD56)은 신경 세포 및 천연 킬러 세포에서 고도로 발현된다. NCAM1은 또한 혈관 내 영양 모세포에 의해 발현되지만, PE 태반에서는 감소되거나 없다 (Red-Horse, K., et al. 2004 J. Clin. Invest. 114:744-754). sPTB 사례에서 역 혈청 NCAM1 수준은 열등한 나선형 동맥 리모델링 및/또는 불완전한 면역 조절을 반영할 수 있다. CHL1은 NCAM1에 상동적이고 인테그린-매개 세포 이동을 지시한다. BGH3 (TGFBI), 즉 혈관 내피 세포에서 발현된 세포 부착 분자는 αv/β3 인테그린과의 특이적 상호작용을 통해 혈관 신생을 억제한다 [Son, H-N., et al. 2013 Biochimica et Biophysica Acta 1833(10) 2378-2388]. sPTB 사례에서 TGFBI의 증가는 태반 혈관 신생의 감소를 의미할 수 있다.
도 55는 18주에 최대 분리를 나타내는 IGF-2 경로에서의 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸다. IGF2는 임신 초기에 융모막외 영양세포에 의한 증식, 분화 및 자궁 내막 침윤을 촉진한다. IBP4는 결합하고 산모-태아 경계에서 IGF2의 생체이용률을 조절한다. 처음 임신 3개월 기간 동안 증가된 IBP4와 감소된 IGF2는 각각 IUGR 및 SGA와 각각 상관관계가 있다(Qiu, Q., et al. 2012 J. Clin. Endocrinol Metab. 97(8):E1429-39; Demetriou, C, et al. 2014 PLOS 9(1): e85454). PAPP1은 IBP4를 분해하고 활성 IGF2를 방출하는 태반-특이적 프로테아제이다. 임신 초기에 낮은 혈청 PAPP1 수준은 IUGR, PE 및 PTB와 관련이 있다(Huynh, L., et al. 2014 Canadian Family Physician 60(10) 899-903). PRG2 (proMBP)는 태반에서 발현되고 PAPP1에 공유결합되어 이를 불활성화한다. PRG2:PAPP1 비활성 복합체는 산모 혈청에서 순환한다[Huynh, L, et al 2014 Canadian Family Physician 60 (10) 899-903]. 교란된 경로 조절은, 비정상적인 태반형성을 초래할 수 있는 sPTB 사례에서의 손상된(compromised) IGF2 활성과 일치한다. 도 56A는 sPTB 동안 상기 언급된 단백질의 동적 조절 및 생체이용률의 개략도를 나타낸다.
도 56B는 IR-B에 대한 인슐린 결합 및 IR-A 또는 IGF1R에 대한 인슐린 및 IGF 결합에 의해 우선적으로 활성화된 세포 내 신호의 개략도를 도시한다[Belfiore and Malaguarnera, Endocrine-Related Cancer (2011) 18 R125-R147]. 인슐린 및 IGF에 의한 IR-A 및 IGF1R 활성화는 IRS 1/2 및 Shc 단백질의 인산화를 통해 성장 및 증식 신호의 우세를 유도한다. Shc 활성화는 Ras/Raf/MEK1 및 Erk1/2의 후속 활성화와 함께 Grb2/Sos 복합체의 보충으로 이어진다. 전자의 키나아제는 핵으로 전위되어 세포 증식과 생존에 관여하는 여러 유전자의 전사를 유도한다. IRS1/2의 인산화는 PI3K/PDK1/AKT 경로의 활성화를 유도한다. 신진 대사 효과에서의 역할 외에도, AKT는 세포 사멸 및 생존의 조절(BAD, Mdm2, FKHR, NFkB, 및 JNK) 및 단백질 합성 및 세포 성장(mTOR)에 관여하는 작동체의 활성화를 유도한다.
도 57은 대사 호르몬 균형에서의 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸다. 태반 단백질인 성 호르몬-결합 글로불린 (SHBG)은 임신 중에 증가하고 성 스테로이드 호르몬의 생체이용률과 신진대사를 결정한다. 감소된 SHBG 수준은 더 높은 안드로겐과 에스트로겐 수준을 만든다. 자유 안드로겐은 태반 아로마타제 활성에 의해 에스트로겐으로 전환될 수 있다. 프로게스테론은 에스트로겐의 활성과 반대로 임신/출산을 촉진한다. 티록신-결합 글로불린 (THBG)은 에스트로겐에 의해 유도되고 임신 중반에 약 2.5배 증가한다. sPTB 사례에서 증가된 혈청 THBG 수준은 감소된 자유 갑상선 호르몬을 만들 수 있다. 임신 중 갑상선 기능 저하증은 유산과 조산의 위험이 증가하는 것과 관련이 있다[Stagnaro-Green A. and Pearce E. 2012 Nat. Rev. Endocrinol. 8(11):650-8]. 안지오텐시노겐은 임신 중반까지 에스트로겐에 의해 약 3배 증가하여 혈장 부피의 약 40% 증가를 촉진한다. ANGT의 상향-조절은 sPTB의 위험 증가와 관련된 상태인 임신성 고혈압으로 이어질 수 있다.
도 58은 신생 혈관 형성에서 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역 학적 도식을 나타낸다. TIE1, 즉 TIE2 안지오포이에틴 수용체의 억제성 공-수용체는 Ang-2가 혈관 신생을 촉진하는 능력을 차단한다[Seegar, T , et al. 2010 Mol. Cell. 37(5): 643-655]. 태반에서 발현된 항-혈관 신생 인자인 색소 상피 유래된 인자 (PEDF)는 감마-세크리테아제에 의해 VEGFR-1의 분해 및 비활성화를 촉진한다. 10 카뎁신 D (CATD)는 프로락틴을 분해하여 혈관 신생을 억제하는 바소인히빈(vasoinhibin)을 생성한다. 증가된 혈청 CATD와 바소인히빈은 자간전증과 관련이 있다[Nakajima, R., et al. 2015 Hypertension Research 38, 899-901]. 류신이 풍부한 알파-2-당단백 (LRG1/A2GL)은 공-수용체인 엔도글린과의 결합을 통해 TGF-β 신호 전달을 촉진한다. TGF-β는 Smad1/5/8 신호 전달 경로에 의한 내피 세포의 유사 분열 및 혈관 형성을 활성화시킨다[Wang, X., et al. 2013 Nature 499(7458)]. PSG3는 단핵 세포 및 대식세포로부터 항-염증성 사이토카인을 유도하고, TGF-β 결합을 통해 혈관 신생을 촉진한다. 낮은 수준의 PSG는 IUGR과 관련된다[Moore, T., and Dveksler, G. 2014 Int. J. Dev. Biol. 58: 273-280]. 리소포스포리파아제 D 활성을 갖는 세포외 효소인 ENPP2 (오토탁신)는 리소포스파티드산 (LPA)을 생성한다. LPA는 태반 수용체에 작용하여 NK 세포 및 단핵구의 혈관 신생 및 주화성을 촉진한다. 오토탁신의 수준은 PIH 및 조기 발병 PE의 경우 감소한다 [Chen, S-U., et al. 2010 Endocrinology 1 151(l):369-379].
도 59는 선천성 면역성에서 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸다. LBP는 선천성 면역 경로의 염증 반응을 유도하기 위해 공-수용체 CD14를 통해 Toll-형 수용체-4에 세균성 LPS를 제공한다. Fetuin-A (α-2-HS-당단백질)는 혈액내 지방산을 운반하는 단백질이며 FetA-FA 복합체는 TLR4 수용체에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있다[Pal, D., et al. 2012 Nature Med. 18(8): 1279-85].
도 60은 응고에서 기능을 갖는 차별적으로 발현된 단백질의 동역학 도식을 나타낸다.
도 61은 차별적으로 발현된 혈청/분비된 단백질의 동역학적 도식을 나타낸다.
도 62는 차별적으로 발현된 PSG/IBP의 동역학적 도식을 나타낸다.
도 63은 차별적으로 발현된 ECM/세포 표면 단백질의 동역학적 도식을 나타낸다.
도 64는 차별적으로 발현된 보체/급성기 단백질-1의 동역학적 도식을 나타낸다.
도 65는 차별적으로 발현된 보체/급성기 단백질-2의 동역학적 도식을 나타낸다.
도 66은 차별적으로 발현된 보체/급성기 단백질-3의 동역학적 도식을 나타낸다.
도 67은 차별적으로 발현된 보체/급성기 단백질-4의 동역학적 도식을 나타낸다.
실시예 9. SDT4 /SV4 동역학적 분석
이 실시예는 상기 실시예 1에서 초기에 예시된 모든 피분석물에 대해 17주 0 일로부터 28주 6일까지의 데이터로 동역학 분석을 제공한다.
도 68 내지 도 85에서, 각각의 펩티드 전이물에 대한 평균 상대적 비는 평균 평활화 함수(mean average smoothing function) (윈도우 = +/- 10일)를 사용하여 GABD에 대한 R ggplot2 패키지를 사용하여 도식화된다. 그래프는 두 가지 상이한 출산시 재태 기간 컷오프 (<37 0/7주 대 > = 37 0/7주 및 <35 0/7 대 >= 35 0/7주)를 사용하여 사례 대 대조군에 대한 별도의 도식을 특성화한다. 도식 제목은 단백질의 단축명, 밑줄 및 펩티드 서열로 표시된다. 피분석물 서열은 제목이 도식에 맞도록 잘렸을 수 있다.
본원에 예시된 동역학 분석은 여러 가지 목적을 갖는다. 이들 분석은 임신 기간 동안 피분석물 수준이 변화하는지 여부와 변화하면 어떤 방향으로 변화하는지, 사례 및 대조군에 따라 차별적으로 변화하는지 여부를 입증하며, 재태 기간의 함수로 진단 차이를 설명한다. 어떤 경우에는, 진단 신호가 좁은 재태 기간 범위에 위치하고, 시간이 지남에 따라 증가 또는 감소한다. 동역학적 도식의 모양은 또한 반전에서 쌍을 잘 이루는 단백질의 선택에 대해 시각적으로 안내한다.
예를 들어, 18주 내지 20주의 재태 기간의 샘플 수집과 같이 초기(윈도우)에 사례 대 대조군의 유의미한 분리를 나타내는 것으로 발견된 피분석물은 예를 들어 AFAM, B2M, CATD, CAH1, C1QB, C1S, F13A, GELS, FETUA, HEMO, LBP, PEDF, PEPD, PLMN, PRG2, SHBG, TENX, THRB 및 VCAM1을 포함한다. 예를 들어, 26주 내지 28주의 재태 기간의 샘플 수집과 같이 후기 윈도우에서 사례 대 대조군의 유의미한 분리를 나타내는 것으로 발견된 피분석물은 예를 들어 ITIH4, HEP2, IBP3, IGF2, KNG1, PSG11, PZP, VASN 및 VTDB를 포함한다. 예를 들어 AFAM, APOH, CAH1, CATD, CD14, CLUS, CRIS3, F13B, IBP6, ITIH4, LYAM1, PGRP2, PRDX, PSG2, PTGDS, SHBG 및 SPRL1을 포함하는 피분석물에 대해 알 수 있듯이, 사례 대 대조군의 분리는 35 0/7주 미만 대 35 0/7주 이상 대 37 0/7주 미만 대 37 0/7주 이상의 컷오프를 사용하여 향상되었다. 많은 염증 및 면역-조절 분자가 출산시 더 낮은 재태 기간 컷오프를 사용하여 향상된 분리를 나타낸다는 것을 발견하였다. 당업자는 소정의 시간 윈도우에 대해 첨부된 도면에 도시된 사례와 대조군 사이에 유의미한 분리를 나타내는 피분석물 중 임의의 것이 본 발명의 반전 쌍에서, 단일 바이오마커로서 또는 피분석물의 바이오마커 패널의 일부로 사용하기 위한 후보임을 인식할 것이다.
마지막으로, 사례 대 대조군 차이가 없지만 임신기간에 걸쳐 피분석물 강도에서 변화를 나타내는 피분석물에 대한 동역학적 도식은 본 발명의 방법에 따른 임신 시계에서 유용하다. 본원에서 "시계 단백질"이라고도 칭하는 이러한 피분석물은 다른 날짜 결정 방법 (예: 마지막 생리 일자, 초음파 날짜 결정)이 없을 때 또는 이들 방법과 함께 임신 날짜를 정하는 데 사용할 수 있다. 표 60은 본 발명의 임신 시계에서 유용한 시계 단백질의 목록을 제공한다.
실시예 10. sPTB 사례의 발견 2 분석
이 실시예는 이전의 실시예들에 기재된 바와 같이 앞서 분석된 모든 sPTB 사례, 이들의 매칭된 대조군 (매 사례마다 2개) 및 2개의 새로운 대조군의 분석을 개시한다. 이 실시예에 개시된 이러한 분석은 19주와 20주 이후로 상업용 채혈 윈도우를 확장시켰고, 모든 이전 실시예로부터의 많은 수의 샘플을 기준으로 35주 미만의 sPTB 예측과 관련된 추가 데이터를 생성하였고, 새로운 피분석물과 반전의 발견을 유도하였고, 분자 시계 단백질을 정의하였고, 위험 임계치를 확실히 하고 앞으로의 임상 연구를 위한 정확한 타당성 확인 클레임(validation claims)을 형성하였다.
샘플 처리 방법
조산 위험의 프로테오믹 평가 (Proteomic Assessment of Preterm Risk, PAPR) 임상 연구의 실시를 관리하는 표준 프로토콜이 개발되었다. 이 프로토콜은 또한 샘플 및 임상 정보가, 다른 임신 합병증을 연구하는 데 사용될 수 있다고 명시하였다. 시료를 미국 전역의 11군데의 IRB (Internal Review Board) 승인 현장에서 여성들로부터 입수했다. 사전동의서를 나눠준 후, 혈청 및 혈장 샘플뿐만 아니라 환자의 인구 통계적 특성, 과거의 의학 및 임신 경험, 현재의 임신 경험 및 병용 투약에 관한 해당 정보를 얻었다. 분만 후, 산모와 신생아의 상태와 합병증에 관한 자료가 수집되었다. 혈청 및 혈장 샘플을 표준화된 냉장 원심 분리를 필요로 하는 프로토콜에 따라 처리하고, 0.5 ml 용량 2-D 바코드 찍힌 저온유리병에 샘플을 분취한 후, -80℃에서 냉동시켰다.
분만 후, 조산 사례는 개별적으로 검토되어 자연 조산인지 의학적으로 표시된 조산인지로 그 지위를 결정하였다. 자연 조산 사례만이 이러한 분석에 사용되었다. 조산의 바이오마커를 발견하기 위해, 17 0/7 - 21 6/7주의 재태 기간에 걸쳐 413개의 샘플 (sPTB 사례 82개, 만기 대조군 331개)에 대해 LC-MS 데이터를 생성하였으며, 각 조산 샘플은 채혈시 재태 기간에 따라 4개의 만기 대조군에 매칭되었다. 17 0/7 - 21/6/7주 안에 매 재태 기간 날짜는 하루를 제외하고는 하나 이상의 sPTB 사례(및 매칭된 만기 대조군)를 포함하였다. 4개의 만기 대조군이 그 날짜로부터 채혈과 함께 선택되었다. 연구에서, 실험실 분석에서 실패한 하나의 만기 대조군은 재분석되지 않았다.
혈청 샘플은 후속적으로 가장 풍부한 단백질 14개를 제거하는 인간 14 다중 친화도 제거 시스템(MARS-14)을 사용하여 고 풍부 단백질을 제거하였다. 균등 부피의 각 임상 샘플 또는 2개의 품질 관리 혈청 풀의 복제물을 컬럼 버퍼로 희석하고 여과하여 침전물을 제거하였다. 여과된 샘플은 MARS-14 컬럼 (4.6 x 100 mm, Agilent Technologies)을 사용하여 제거되었다. 샘플을 오토샘플러에서 4℃로 냉각시키고, 제거 컬럼을 실온에서 실시하고, 수집된 분획을 추가 분석까지 4℃로 유지하였다. 결합되지 않은 분획을 추가 분석을 위해 수집하였다.
제거처리된 혈청 샘플을 디티오트레이톨로 환원시키고, 요오도아세트아미드를 사용하여 알킬화시킨 다음 트립신으로 분해하였다. 트립신 분해 후, 샘플은 대용 펩티드 피분석물의 농도에 근사한 농도에서 안정한 동위 원소 표준물질의 풀로 강화되었다. SIS 강화된 샘플들을 혼합하여 두 개의 동일한 부피로 나누었다. 작업 과정을 계속할 준비가 될 때까지, 각각 나눈 것을 -80℃ 저장고에 두었다. 각각의 샘플로부터 하나의 냉동된 나눈 것을 -80℃ 저장고에서 회수하여 해동시킨 다음, C18 고체상 추출 플레이트 (Empore, 3M)상에서 탈염시켰다. 용출된 펩티드를 동결 건조하여 건조시켰다. 동결 건조된 샘플은 LC-MS 단계의 품질만 모니터링하는 내부 표준물질을 포함하는 재구성 용액에 재용해되었다 (IS Recon).
완전히 처리된 샘플을 동적 다중 반응 모니터링 방법 (dMRM)을 사용하여 분석하였다. 펩티드는 Agilent 1290 UPLC를 사용하여 유속 0.4 mL/min의 속도로 2.1 x 100 mm Poroshell EC-C18, 2.7 μ 입자 크기 컬럼상에서 분리하였고, 전자스프레이 소스가 있는 Agilent 6490 3중 사중극 질량 분석계로 양이온 모드에서 작동시키면서 아세토니트릴 구배를 사용하여 용리시켰다. dMRM 에세이는 진단 및 품질 기능을 둘 다 하는 119개의 펩티드와 77개의 단백질에 해당하는 442개의 전이물을 측정했다. 크로마토그래피 피크는 매스헌터 정량 분석 소프트웨어 (MassHunter Quantitative Analysis software, Agilent Technologies)를 사용하여 적분되었다. 대용 펩티드 피분석물의 크로마토그래피 피크 면적의 상응하는 SIS 크로마토그래피 피크에 대한 비가 보고되었다.
dMRM 방법으로 측정된 혈청 피분석물, SIS 전이물 및 IS Recon 표준물질에 대한 단백질, 펩티드 및 전이물의 요약을 표 21에 나타낸다. MARS-14 제거 단백질은 MARS-14 면역제거 컬럼에 의해 표적화된 피분석물을 식별하고 품질 관리 목적으로 측정한다. 양적(quant) 전이물은 상대적 반응률에 사용되며 질적(qual) 전이물은 품질 관리용이다. 별표 (*)는 명칭 변경을 나타낸다. CSH는 펩티드가 CSH1 및 CSH2 둘 모두에 상응함을 나타낸다. HLAG는 여러 클래스 I HLA 이소형에서 보존되기 때문에 이제 HLACI로 칭한다. LYAM3은 펩티드 서열은 각각 존재하지만 LYAM1으로부터의 트립신 분해에 의해서만 유도되기 때문에 이제 LYAM1이라 칭한다. SOM2는 펩티드가 SOM2 및 CSH 모두에 특이적이기 때문에 이제 SOM2.CSH로 칭한다.
유의미한 단백질 및 반전 선택
각각의 피분석물에 대해, 2주 및 3주 중첩 윈도우 각각에서, BMI 제한이 있거나 없이, 2개의 SPTB 정의 (37/37 및 35/35)로, SPTB 사례 샘플의 평균이 TERM 대조군 샘플의 평균치보다 높거나 낮은지를 나타내는 배수 변화값(fold change value)을 계산하였다. 표 22와 표 23은 1주일씩 중첩되는 2주 재태 기간 윈도우 동안 단백질/전이물 AUROC를 나타낸다 (예: 119-132는 재태 기간 17주 및 18주와 동등한 임신 119-132일을 말한다). 각 2주 윈도우에서 성능은 2개의 상이한 사례 대 대조군 컷오프 (<37 0/7 대 >= 37 0/7, <35 0/7 대 >= 35 0/7)에 대해 BMI 계층화가 있는 경우(rBMI)와 없는 경우 (aBMI)에 대해 보고된다. 표 24와 표 25는 2주씩 중첩되는 3주 재태 윈도우에 대해 단백질/전이물 AUROC를 나타낸다 (일수로 나타남, 예를 들어 "119-139"란 재태 17, 18 및 19주와 동일한 임신 119-139일을 말한다). 각각 3주 윈도우에서 성능이 2개의 상이한 사례 대 대조군 컷오프 (<37 0/7 대 >= 37 0/7, <35 0/7 대 >= 35 0/7)에 대해 BMI 계층화가 있는 경우(rBMI)와 없는 경우 (aBMI)에 대해 보고된다.
도 86 내지 도 95는 <37 0/7주 대 >= 37 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 사용하여 사례 대 대조군에 대해 다양한 펩티드 전이물의 동역학적 도식을 나타낸다. 도 96 내지 도 105는 <35 0/7주 대 >= 35 0/7주의 출산시 재태 기간 컷오프를 이용한 사례 대 대조군에 대한 다양한 펩티드 전이물의 동역학적 도식을 나타낸다. 간략하게, 각각의 펩티드 전이물에 대한 평균 상대적 비는 평균 평활화 함수 (윈도우 = +/- 10 일)를 사용하여 GABD에 대한 R ggplot2 패키지를 사용하여 도식화된다. 도식 제목은 단백질의 단축명, 밑줄 및 펩티드 서열로 표시된다. 피분석물 서열은 제목이 도식에 맞도록 잘렸을 수 있다.
SPTB 사례 샘플의 평균이 TERM 대조군 샘플의 평균보다 높거나 낮은지를 나타내는 배수 변화값에 기초하여, 각 피분석물은 각각의 조합에 대해 상향 또는 하향 조절된 것으로 표시되었고 (즉, 2주 또는 3주 중첩되는 윈도우, BMI 제한 및 SPTB 한정), 피분석물이 대부분의 조합이 상향 조절된 것으로 표시되면, 총 상향 조절된 피분석물로 불리고 반대의 경우도 마찬가지이다. 이는 표 26에 나타낸다.
이러한 상향 및 하향 조절 할당 (55 상향 조절 및 30 하향 조절)에 기초하여, 하향 조절된 피분석물의 상대적 비 값으로 상향 조절된 피분석물의 상대적 비 값 각각을 나누고 그 결과의 자연 로그값을 취하여 반전값을 생성하였다. 이는 1650개의 반전값 (55 x 30 = 1650)을 생성한다. 각각의 반전에 대해, SPTB 및 TERM 분리를 나타내는 ROC 곡선 아래의 면적 (AUCROC) 및 AUCROC 값이 AUCROC = 0.5 (즉, 유의미한 SPTB 및 TERM 분리가 없음)와 유의미하게 다른지를 나타내는 p-값이 계산되었다. AUCROC가 > 0.6이고 p-값이 < 0.05인 반전의 경우, 각 반전의 성능은 여러 조건 (예: BMI 제한이 있거나 없는 재태 윈도우, 및 두개의 sPTB 컷-오프)에 대해 표로 작성되었다. 표 27 내지 표 42는 재태 17주 및 18주에 대해 반전 분류 성능을 나타낸다. 표 47 내지 표 58은 재태 17, 18 및 19주에 대해 반전 분류 성능을 나타낸다. 표 43 내지 표 46은 재태 17주 내지 21주에 대해 반전 분류 성능(reversal classification performance)을 나타낸다. 잠재적으로 유의미한 추가의 반전은 표 59에 나타낸다.
또한, 입증된 바와 같이 하나 이상의 반전 (17-21주)으로부터 형성된 예측변수의 성능이 향상되었다. 간략하게, 이 재태 기간 범위에서 초기 (예: 17-19주) 또는 후기 (예: 19-21주)에 강한 예측 성능을 나타내는 반전이 조합되었고, 전체 채혈 범위 동안 여러 개의 반전의 조합 (SumLog)로부터 형성된 예측변수의 성능이 평가되었다. 이는 표 61에 나타낸다. 예측변수 스코어는 개별 반전의 로그 값을 합산함으로써(SumLog) 도출되었지만 당업자는 다른 모델 (예: 로지스틱 회귀분석)을 선택할 수 있다. 이러한 다중 반전 접근을 만삭전 조기 양막 파열 (PPROM) 대 PPROM이 없는 조산(PTL), 태아 성별 및 임신에 특이적인 반전의 조합에 적용하는 것이 또한 고려된다. 예측변수가 채혈 기간, 태아 성별 또는 임신에 대해 알고 주어진 반전의 하위 세트를 선택하는 지시 변수를 함유할 수 있다는 것이 또한 고려된다.
도 110은 예측변수 스코어 (ln IBP4/SHBG)와 sPTB의 출현율 조정된 상대적 위험 (양(+)의 예측값, Positive Predictive Value) 사이의 관계를 임신 <37 0/7주 대 >=37 0/7주 컷오프를 사용하여 나타낸다. 샘플은 19 1/7주와 20 6/7주 사이에 BMI>22 <=37로 취하였다. 상대적 위험은 예측변수 스코어가 7.3 %의 배경 비율 (단일아 임신에서 sPTB의 평균 모집단 위험)에서 약 50%로 증가함에 따라 증가한다. 모든 스코어 임계치에 대해 스크린 양(+)의 비율 곡선이 겹쳐진다. 신뢰율 구간(회색 음영)은 이진 분포된 관측치를 가정하고 오차 분포를 정규 분포로 근사화하면서 계산했다. 분류인자 스코어에 따른 샘플 분포는 도면 범례에서 칼라 구성표에 따라 막대 그래프로 나타낸다.
도 111은 예측변수 스코어 (In IBP4/SHBG)와 sPTB의 출현율 조정된 상대적 위험 (양의 예측값) 사이의 관계를 임신 <35 0/7주 대 >=35 0/7주 컷오프를 사용하여 나타낸다. 샘플은 19 1/7주와 20 6/7주 사이에 취하였다. 상대적 위험은 예측변수 스코어가 4.4 %의 배경 비율 (단일아 임신에서 sPTB의 평균 모집단 위험 (<35))에서 약 50%로 증가함에 따라 증가한다. 모든 스코어 임계치에 대해 스크린 양(+)의 비율 곡선이 겹쳐진다. 신뢰율 구간(회색 음영)은 이진 분포된 관측치를 가정하고 오차 분포를 정규 분포로 근사화하면서 계산했다. 분류인자 스코어에 따른 샘플 분포는 도면 범례에서 칼라 구성표에 따라 막대 그래프로 나타낸다.
임상 관찰: sPTB , PPROM 및 PTL
반전 성능 (GABD 17-21주)은 sPTB, PPROM 및 PTL의 2가지 상이한 표현형에 대해 독립적으로 평가되었다. PPROM은 초기에 더 빈번히 발생하며 감염이나 염증과 관련이 있다. PTL은 나중에 발생할 수 있으며 일반적으로 덜 심각한 표현형으로 간주된다. PPROM에 대해 더욱 유의미한 반전과 더 높은 성능이 있었고 그 반전은 염증과 감염에 관여하는 것으로 알려진 단백질로 채워졌다. PPROM과 PTL의 독립적인 시험 방법을 구축하기 위한, 또는 하나의 예측변수에서 하나 이상의 반전의 조합으로 전반적인 성능을 극대화하기 위한 반전의 선택이 고려된다. 표 61 내지 표 64에 나타낸 분석에서, PPROM 또는 PTL에 대해 AUC> 0.65 및 p <0.05가 요구되었다.
표 61은 BMI 계층화 없이, <37 0/7주 대 ≥37 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, PPROM 및 PTL에 대해 별도로 나타낸다. 표 62는 BMI 계층화가 있으며 (>22 <= 37), <37 0/7주 대 >= 37 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, PPROM과 PTL에 대해 별도로 나타낸다. 표 63은 BMI 계층화 없이 <35 0/7주 대 >= 35 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, PPROM과 PTL에 대해 별도로 나타낸다. 표 64는 BMI 계층화가 있으며(>22 <=37), <35 0/7주 대 >= 35 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, PPROM과 PTL에 대해 별도로 나타낸다.
GABD 19-20주 동안 PTL에 대한 최적의 성능 피분석물 및 PPROM에 대한 최적의 성능 피분석물을 또한 결정하였고 몇 개의 반전이 최강 성능 변수로부터 구성되었다. IBP4는 PTL 및 PPROM 모두에서 sPTB에 대해 일반적으로 그의 효용을 가능하게 하는 양호한 성능 변수로서 존재한다. 표 76은 BMI 계층화 없이, <37 0/7주 대 >= 37 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 19 0/7주 내지 20 6/7주 동안 전이물 AUROC를, PTL에 대해 열거한다. 표 77은 BMI 계층화 없이, <37 0/7주 대 >= 37 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 19 1/7주 내지 20 6/7주 동안 전이물 AUROC를, PPROM에 대해 열거한다. 도 108은 PTL에서 19-20주에서 양호한 성능을 갖는 반전을 예시화한다. 도 109는 PPROM에서 19-20주에서 양호한 성능을 갖는 반전을 예시화한다.
임상 관찰: 초임부 및 경임부
반전 성능 (17-21주)을 추가로 sPTB, 초임부 및 경임부의 2가지 상이한 표현형에 대해 독립적으로 평가하였다. 표 65 내지 표 68에서, 상단 성능 반전 (17-21주)은 초임부 (첫 아이 엄마) 및 경임부 대상체에 대해 별도로 나타낸다. 첫 아이 엄마는 의사가 위험을 판단/예상하기 위한 임신 경험이 없기 때문에 PTB의 가능성을 예측하기 위한 시험을 가장 많이 필요로 한다. 이러한 결과로 이들 두 가지 그룹에 대해 독립적인 시험이 가능하거나, 모두에 대해 위험을 예측하기 위해 단일 분류인자로 고성능 반전을 조합할 수 있다. 표 65 내지 표 68에 나타낸 분석에서, 초임부 및 경임부에 대해 AUC > 0.65 및 p < 0.05가 요구되었다.
표 65는 BMI 계층화 없이, <37 0/7 대 >=37 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, 초임부 및 경임부에 대해 별도로 나타낸다. 표 66은 BMI 계층화가 있으며(>22 <=37), <37 0/7 대 >=37 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, 초임부 및 경임부에 대해 별도로 나타낸다. 표 67은 BMI 계층화 없이, <35 0/7주 대 >=35 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, 초임부 및 경임부에 대해 별도로 나타낸다. 표 68은 BMI 계층화가 있으며(>22 <=37), <35 0/7주 대 >=35 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, 초임부 및 경임부에 대해 별도로 나타낸다.
임상 관찰 : 태아 성별
남아를 임신한 대상체 대 여아를 임신한 대상체에 대해 독립적으로 반전 성능 (17-21주)을 추가로 평가하였다. 몇 개의 반전이 태아 성별 특이적 예측 성능을 갖는 것으로 밝혀졌다. 도 106은 태아 성별 특이적 IBP4 및 SHBG 피분석물 및 스코어 (IBP4/SHBG) 차이를 입증한다. IBP4는 남아를 임신한 대상체에서 유의미하게 더 높다. 반전 성능은 BMI 계층화 없이 임신 19-21주 동안 비슷하게 유지된다 (도 106). 추가로, PAPR 임상 시험에서 남아가 0.0002의 p값과 1.6의 오즈비로 sPTB의 증가된 위험이 있는 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 태아 성별이 예측변수 안으로 들어갈 수 있다 (예를 들어, 반전값 더하기 태아 성별). 표 69 내지 표 72에 나타낸 분석에서, 여아 및 남아에 대해 AUC>0.65 및 p<0.05가 요구되었다.
표 69는 BMI 계층화 없이, <37 0/7주 대 >=37 0/의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, 태아 성별에 따라 별도로 나타낸다. 표 70은 BMI 계층화가 있으며(>22 <=37), <37 0/7주 대 >=37 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, 태아 성별에 따라 별도로 나타낸다. 표 71은 BMI 계층화 없이, <35 0/7주 대 >=35 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, 태아 성별에 따라 별도로 나타낸다. 표 72는 BMI 계층화가 있으며(>22 <=37), <35 0/7주 대 >=35 0/7주의 사례 대 대조군 컷-오프를 사용하여 임신 17 0/7주 내지 21 6/7주 동안 반전 AUROC를, 태아 성별에 따라 별도로 나타낸다.
실시예 11. 질량 분석법 및 면역분석 데이터의 상관 관계
이 실시예는 MSD 플랫폼 (예를 들어, IBP4 및 SHBG에 대한 시판 ELISA 데이터 및 MS 데이터와 상호 관련된 MSD 데이터)을 사용하여 면역분석의 실행을 입증한다.
재료
다음 항체를 사용하였다: 성 호르몬 결합 글로불린 (Biospacific 카탈로그 번호 6002-100051 및 6001-100050; R&D Systems 카탈로그 번호 MAB2656 및 AF2656), IGFBP-4 (Ansh 카탈로그 번호 AB-308-AI039 및 AB-308-AI042). Origene (카탈로그 번호 TP328307), Biospacific (카탈로그 번호 J65200), NIBSC (코드 : 95/560) 및 R&D Systems (ELISA SHBG 키트의 일부로만 사용 가능)로부터 입수한 SHBG 단백질을 캘리브레이터로 시험했다. 재조합 인간 IGFBP-4 (Ansh, 카탈로그 번호 AG-308-AI050)를 캘리브레이터로 사용하였다.
개별 U- PLEX - 커플링된 항체 용액 생성
각각의 바이오티닐화된 항체를 Diluent 100 중 10 ㎍/mL로 희석하여 ≥200 ㎕의 최종 부피로 하였다. 이어서, 바이오티닐화 항체를 할당된 U-PLEX Linker 300 ㎕에 첨가하였다 (상이한 링커가 각각의 바이오티닐화 항체에 대해 사용되었다). 샘플을 볼텍싱하고(vortex) 실온에서 30분 동안 배양하였다. 정지 용액(Stop Solution) (200 μL)을 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 볼텍싱하고 실온에서 30분 동안 배양하였다.
멀티플렉스 코팅 용액의 제조
각각의 U-PLEX-결합된 항체 (600 ㎕) 용액을 단일 튜브로 합하고 볼텍싱하여 혼합하였다. 10개 미만의 항체를 조합할 때, 용액 부피가 정지 용액으로 6 mL로 되어 최종 1X 농도를 생성하였다. 이 실험에서, 웰 당 하나의 항체만 있었음에 주목한다.
U- PLEX 플레이트 코팅
멀티플렉스 코팅 용액 (50㎕)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 접착성 플레이트 실(seal)로 밀봉하고 약 700rpm에서 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 또는 2-8℃에서 밤새 배양하였다. 적어도 150μL의 1X MSD 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 플레이트는 사용할 준비가 되었다.
샘플 분석
샘플 또는 캘리브레이터의 분취액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 약 700 rpm으로 진탕하면서 배양하였다. 이어서 플레이트를 적어도 150μL의 1X MSD 세척 버퍼로 3회 세척하였다*. 검출 항체 용액 50㎕를 각 웰에 첨가하였다. 밀봉 후, 플레이트를 약 700 rpm으로 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 적어도 150μL의 1X MSD 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 각 웰에 150μL의 2X 판독 버퍼(Read Buffer)를 첨가한 후, 플레이트를 MSD 기기에서 즉시 판독하였다.
SHBG 항체 및 캘리브레이터 스크리닝
모든 항체는 포획-검출 방향 모두로 시험되었고, 모두 쌍을 이루는 식으로 조합되었다. 포획 항체는 10 ㎍/mL로 제조되었고, U-PLEX 링커에 결합되었으며 U-PLEX 플레이트 상으로 코팅되었다. SHBG R&D Systems 캘리브레이터를 Diluent 43으로 희석하여 에세이 희석액 바탕으로 7-포인트 표준 곡선을 만들었다. 샘플을 Diluent 43에서 다음과 같이 희석하고 에세이에서 시험하였다: Sera SHBG "높음" 및 "낮음" 샘플 : 100-배 및 500-배 희석 및 Sera Pregnant 풀: 100-, 200-, 400-, 800-배 희석. 검출 항체는 Diluent 3에서 1㎍/ mL로 시험하였다. 표준 곡선과 혈청 내 천연 피분석물에 대한 결합을 평가하였다. 이어서 위에 있는 피분석물 쌍을 NIBSC 및 Biospacific 캘리브레이터로 시험하였으며, 희석은 위와 같았다.
IGFBP -4 항체 및 캘리브레이터 스크리닝
두 항체를 포획-검출 방향 모두에서 시험하였다. 포획 항체는 10 ㎍/ml로 제조되었고, U-PLEX 링커에 결합되었으며 U-PLEX 플레이트 상으로 코팅되었다. IGFBP-4 캘리브레이터를 Diluent 12로 희석하였고 에세이 희석액 바탕으로 7-포인트 표준 곡선을 만들었다. 샘플을 Diluent 12에서 다음과 같이 희석하고 에세이에서 시험하였다: Sera IGFBP-4 "높음" 및 "낮음" 샘플: 5-배, Sera Pregnant 풀: 2-배 희석 2-배에서 64-배, 및 2개의 개별적 인간 혈청 샘플 (MSD 샘플): 2-, 4-, 8- 및 16-배. 검출 항체는 Diluent 12 중에 1㎍/mL에서 시험하였다. 표준 곡선 및 혈청 내 천연 피분석물에 대한 결합을 평가하였다.
60개의 혈청 샘플을 사용하는 SHBG 및 IGFBP -4 시험
항체 쌍 12는 Sera로부터의 60개의 혈장 샘플을 두 개씩 측정하기 위해 선택하였다. IGFBP-4의 경우, 쌍 2가 선택되었다. 혈장 샘플을 SHBG 및 IGFBP-4에 대해 각각 1:1000 및 1:20로 희석하였다. MSD ELISA로부터의 결과를 시판 ELISA 키트 및 MS-MRM 데이터와 비교하였다.
결과:
SHBG 항체 스크린
항체 쌍 1 (R&D 모노 포획, 폴리 검출)만이 Origene 캘리브레이터로 강한 신호를 주었는데, 이는 이 캘리브레이터가 내인성 SHBG 피분석물의 아집단을 나타낼 수 있음을 시사한다. 따라서, 이후의 연구에서 모든 쌍과 작동하는 캘리브레이터를 식별하기 위해 추가 캘리브레이터를 시험하였다. 그럼에도 불구하고, 모든 항체 쌍은 Sera High, Low, 및 Pregnant 풀 샘플의 고유 피분석물을 인식하였다. R&D 폴리 2656과 Biospacific 모노 6001-100050도 비슷한 성능을 보였다. 쌍 2, 3 및 12는 샘플 희석으로 대략 선형 적정을 보였다 (표 73). 이어서 위에 4개의 항체 쌍을 3개의 추가 캘리브레이터로 성능을 시험하였다. 위에 4개의 쌍에 대해 3개 캘리브레이터에 거쳐 양호한 캘리브레이터 곡선이 수득되었다 (표 74). 신호에서 차이는 일부는 할당된 농도에서의 차이 때문일 수 있다.
아래 패널은 R&D 캘리브레이터에 대한 NIBSC 또는 Biospacific 신호가 항체 쌍에 따라 변화함을 나타낸다. 쌍 3 및 10 (포획-검출 방향이 뒤집힌 동일한 항체)은 유사한 프로파일을 가졌다. 쌍 2는 NIBSC와 Biospacific에 대해 더 낮은 신호를 주었다 (쌍 3과 비교, 동일한 포획). 쌍 12는 Biospacific에 대해 더 높은 신호를 그리고 NIBSC 표준에 대해 3-배 이상 더 높은 신호를 제공하였다.
IGFBP -4 항체 스크린
항체 쌍 2 표준 곡선은 쌍 1과 비교하여 4-6배 더 높은 특이적 캘리브레이터 신호 및 배경을 나타냈다 (표 75). 혈청 샘플 신호는 시험된 대부분의 희석에 대해 선형 범위 안에 떨어졌다; 임산부 풀은 32배와 64배 희석에서 배경에 접근했다. 쌍 2는 샘플에 대해 약 12배 더 높은 신호를 나타냈으며 그 결과 정량적으로 2 내지 4배 차이가 났다. 신호 CV는 일반적으로 두 쌍 모두 < 5%이었다.
60개의 혈청 샘플에서 SHBG 및 IGFBP -4의 측정
1000-배 희석된 SHBG의 경우, 샘플은 캘리브레이터 표준 1 내지 3 사이에 떨어졌다. 측정된 중앙 농도는 58.4 μg/mL이었다. 중복 측정치의 CV는 중앙 CV 2.4%로 낮았다. IGFBP-4에 대해 측정된 중앙 농도는 234 ng/ml이었고, 중복 샘플 간의 중앙 CV는 2.2%였다. 도 107에 나타낸 바와 같이, 시판 ELISA 키트 및 MS-MRM 에세이와 비교하여 MSD 에세이에서 두 단백질 모두 양호한 상관 관계가 나타났다.
전술한 설명으로부터, 본원에 개시된 발명에, 그 발명이 다양한 용도 및 조건에 적용되도록 변경 및 변형이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 실시양태는 또한 하기 청구 범위 안에 있다.
본원에서 어떤 변수를 정의할 때 요소들의 나열을 인용하면 열거된 요소들 중 임의의 단일 요소 또는 조합 (또는 하위조합)으로서 그 변수의 정의를 포함하는 것이다. 본원에서 하나의 실시양태를 인용할 때, 임의의 단일 실시양태로서 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 일부와의 조합으로서 그 실시양태를 포함하는 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공보는, 마치 각각의 독립적인 특허 및 공보가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되도록 지시된 것처럼 그와 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다.
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SEQUENCE LISTING <110> SERA PROGNOSTICS, INC. <120> BIOMARKER PAIRS FOR PREDICTING PRETERM BIRTH <130> 13271-018-228 <140> PCT/US2016/038198 <141> 2016-06-17 <150> 62/290,796 <151> 2016-02-03 <150> 62/387,420 <151> 2015-12-24 <150> 62/182,349 <151> 2015-06-19 <160> 161 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Pro Gly Gly Leu Glu Pro Lys 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Cys His Pro Ala Leu Asp Gly Gln Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr His Glu Asp Leu Tyr Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys Asp Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Asp Ala Arg Pro Val Pro Gln Gly Ser Cys Gln Ser Glu Leu His 1 5 10 15 Arg <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Arg Pro Pro Val Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Asn Gly Ala Pro Arg 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Ala Ala 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Pro Asp Tyr Ala Leu Leu Gly His Arg 1 5 10 <210> 127 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Asp Gly Ser Pro Asp Val Thr Thr Ala Asp Ile Gly Ala Asn Thr Pro 1 5 10 15 Asp Ala Thr Lys 20 <210> 128 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Gly Leu Phe Ile Ile Asp Gly Lys 1 5 <210> 129 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Trp Asn Phe Ala Tyr Trp Ala Ala His Gln Pro Trp Ser Arg 1 5 10 <210> 130 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Asp Leu Tyr His Tyr Ile Thr Ser Tyr Val Val Asp Gly Glu Ile Ile 1 5 10 15 Ile Tyr Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Arg 20 25 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Phe Gln Leu Pro Gly Gln Lys 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Leu Phe Ile Pro Gln Ile Thr Pro Lys 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Ile His Pro Ser Tyr Thr Asn Tyr Arg 1 5 <210> 134 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Val Ser Ala Pro Ser Gly Thr Gly His Leu Pro Gly Leu Asn Pro Leu 1 5 10 15 <210> 135 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Asp Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asn Leu Pro Gly Tyr 1 5 10 15 Phe Trp Tyr Lys 20 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Leu Phe Ile Pro Gln Ile Thr Arg 1 5 <210> 137 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Gly Pro Gly Glu Asp Phe Arg 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg 1 5 <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 1 5 <210> 140 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Val Leu Thr His Ser Glu Leu Ala Pro Leu Arg 1 5 10 <210> 141 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Leu Asn Trp Glu Ala Pro Pro Gly Ala Phe Asp Ser Phe Leu Leu Arg 1 5 10 15 <210> 142 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Leu Ser Gln Leu Ser Val Thr Asp Val Thr Thr Ser Ser Leu Arg 1 5 10 15 <210> 143 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Ala Val Leu His Ile Gly Glu Lys 1 5 <210> 144 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Val Ser Trp Ser Leu Pro Leu Val Pro Gly Pro Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Phe Leu Leu Arg 20 <210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Tyr Leu Gly Glu Glu Tyr Val Lys 1 5 <210> 146 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Val Glu Ile Asp Thr Lys 1 5 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Glu Leu Pro Glu His Thr Val Lys 1 5 <210> 148 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Val Leu Glu Pro Thr Leu Lys 1 5 <210> 149 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Gly Gln Tyr Cys Tyr Glu Leu Asp Glu Lys 1 5 10 <210> 150 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Val Asp Thr Val Asp Pro Pro Tyr Pro Arg 1 5 10 <210> 151 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Phe Gly Phe Gly Gly Ser Thr Asp Ser Gly Pro Ile Arg 1 5 10 <210> 152 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Leu Ile Glu Ile Ala Asn His Val Asp Lys 1 5 10 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Leu Asn Ile Gly Tyr Ile Glu Asp Leu Lys 1 5 10 <210> 154 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Ser Asn Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Leu Pro Arg 1 5 10 15 <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Ser Gly Val Asp Leu Ala Asp Ser Asn Gln Lys 1 5 10 <210> 156 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 His Ala Thr Leu Ser Leu Ser Ile Pro Arg 1 5 10 <210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Asn Gly Val Asp Leu Asn Arg 1 5 <210> 158 <211> 258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Met Leu Pro Leu Cys Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Gly Pro 1 5 10 15 Gly Pro Ser Leu Gly Asp Glu Ala Ile His Cys Pro Pro Cys Ser Glu 20 25 30 Glu Lys Leu Ala Arg Cys Arg Pro Pro Val Gly Cys Glu Glu Leu Val 35 40 45 Arg Glu Pro Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Leu Gly Leu Gly 50 55 60 Met Pro Cys Gly Val Tyr Thr Pro Arg Cys Gly Ser Gly Leu Arg Cys 65 70 75 80 Tyr Pro Pro Arg Gly Val Glu Lys Pro Leu His Thr Leu Met His Gly 85 90 95 Gln Gly Val Cys Met Glu Leu Ala Glu Ile Glu Ala Ile Gln Glu Ser 100 105 110 Leu Gln Pro Ser Asp Lys Asp Glu Gly Asp His Pro Asn Asn Ser Phe 115 120 125 Ser Pro Cys Ser Ala His Asp Arg Arg Cys Leu Gln Lys His Phe Ala 130 135 140 Lys Ile Arg Asp Arg Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met Lys Val Asn Gly 145 150 155 160 Ala Pro Arg Glu Asp Ala Arg Pro Val Pro Gln Gly Ser Cys Gln Ser 165 170 175 Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gln Ser Arg Thr 180 185 190 His Glu Asp Leu Tyr Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys Asp Arg Asn Gly 195 200 205 Asn Phe His Pro Lys Gln Cys His Pro Ala Leu Asp Gly Gln Arg Gly 210 215 220 Lys Cys Trp Cys Val Asp Arg Lys Thr Gly Val Lys Leu Pro Gly Gly 225 230 235 240 Leu Glu Pro Lys Gly Glu Leu Asp Cys His Gln Leu Ala Asp Ser Phe 245 250 255 Arg Glu <210> 159 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Met Glu Leu Ala Glu Ile Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Gln Pro Ser 1 5 10 15 Asp Lys Asp Glu Gly Asp His Pro Asn Asn Ser Phe Ser Pro Cys Ser 20 25 30 Ala His Asp Arg Arg Cys Leu Gln Lys His Phe Ala Lys Ile Arg Asp 35 40 45 Arg Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met Lys Val Asn Gly Ala Pro Arg Glu 50 55 60 Asp Ala Arg Pro Val Pro Gln Gly Ser Cys Gln Ser Glu Leu His Arg 65 70 75 80 Ala Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gln Ser Arg Thr His Glu Asp Leu 85 90 95 Tyr Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys Asp Arg Asn Gly Asn Phe His Pro 100 105 110 Lys Gln Cys His Pro Ala Leu Asp Gly Gln Arg Gly Lys Cys Trp Cys 115 120 125 Val Asp Arg Lys Thr Gly Val Lys Leu Pro Gly Gly Leu Glu Pro Lys 130 135 140 Gly Glu Leu Asp Cys His Gln Leu Ala Asp Ser Phe Arg Glu 145 150 155 <210> 160 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Val Glu Val Lys Met Glu Gly Asp Ser Val Leu Leu Glu Val Asp Gly 1 5 10 15 Glu Glu Val Leu Arg Leu Arg Gln Val Ser Gly Pro Leu Thr Ser Lys 20 25 30 Arg His Pro Ile Met Arg Ile Ala Leu Gly Gly Leu Leu Phe Pro Ala 35 40 45 Ser Asn Leu Arg Leu Pro 50 <210> 161 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Val Leu Arg Leu Arg Gln Val Ser Gly Pro Leu Thr Ser Lys Arg His 1 5 10 15 Pro Ile Met Arg Ile Ala Leu Gly Gly Leu Leu Phe Pro Ala Ser Asn 20 25 30 Leu Arg Leu Pro 35

Claims (70)

  1. IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커(biomarker) 쌍을 포함하는 조성물로서, 상기 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군(term control) 사이의 반전값(reversal value)에서의 변화를 나타내는 조성물.
  2. IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍의 대용 펩티드(surrogate peptide) 쌍을 포함하는 조성물로서, 상기 바이오마커 쌍은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전값에서의 변화를 나타내는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    각각의 대용 펩티드에 대응하는 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(stable isotope labeled standard peptide)(SIS 펩티드)를 더 포함하는 조성물.
  4. IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널(panel)로서, 상기 바이오마커 쌍 각각은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전값에서의 변화를 나타내는 패널.
  5. 적어도 2 쌍의 대용 펩티드의 패널로서, 상기 각각의 대용 펩티드 쌍이 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대응하고, 상기 바이오마커 쌍 각각은 조산 위험이 있는 임산부와 만기 대조군 사이의 반전값에서의 변화를 나타내는 패널.
  6. 제5항에 있어서,
    각각의 대용 펩티드에 대응하는 SIS 펩티드를 더 포함하는 패널.
  7. 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이오마커의 적어도 1 쌍에 대한 반전값을 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2 쌍의 바이오마커의 패널에 대한 반전값에서의 변화를 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    임산부와 만기 대조군 사이의 반전값에서의 변화의 존재가 임산부에서의 조산 가능성을 나타내는 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 측정 단계가 상기 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 상기 바이오마커의 대용 펩티드를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 측정 단계가 각각의 대용 펩티드에 대한 안정 동위원소 표지 표준 펩티드(SIS 펩티드)를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 가능성이 위험 스코어(score)로서 표현되는 방법.
  13. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    생물학적 샘플이 전혈, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    생물학적 샘플이 혈청인 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 샘플이 재태 기간의 19주 내지 21주 사이에 수득되는 방법.
  16. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 측정 단계가 질량 분석법(mass spectrometry)(MS)을 포함하는 방법.
  17. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 측정 단계가 포획제(capture agent)를 사용하는 에세이(assay)를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 포획제가 항체, 항체 단편, 핵산-계 단백질 결합 시약, 이의 소분자 또는 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 에세이가 효소 면역분석법(enzyme immunoassay)(EIA), 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA), 및 방사면역측정법(radioimmunoassay)(RIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  20. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    1종 이상의 위험 징후에 대한 측정 가능한 특징을 검출하는 초기 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 위험 징후가 체질량 지수(Body Mass Index)(BMI), 임신 및 태아 성별로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    위험 징후가 BMI인 방법.
  23. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 방법이 조산에 대한 가능성을 결정하는 상기 단계 이전에 출산시 재태 기간(gestational age at birth)(GAB)의 예측을 더 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    임산부가 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는 방법.
  25. 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 표 26에 열거된 바이오마커로부터 선택되는 바이오마커 쌍에 대한 반전값을 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커 IBP4 및 SHBG의 쌍에 대한 반전값을 측정하여, 상기 임산부에서의 조산 가능성을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    임산부 및 만기 대조군 사이의 반전값에서의 변화의 존재가 임산부에서의 조산 가능성을 나타내는 방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    상기 측정 단계가 상기 임산부로부터 수득된 생물학적 샘플에서 상기 바이오마커의 대용 펩티드를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    상기 가능성이 위험 스코어로서 표현되는 방법.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    생물학적 샘플이 전혈, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  31. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    생물학적 샘플이 혈청인 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 샘플이 재태 기간의 19주 내지 22주 사이에 수득되는 방법.
  33. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    상기 측정 단계가 질량 분석법(MS)을 포함하는 방법.
  34. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    상기 측정 단계가 포획제를 사용하는 에세이를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 포획제가 항체, 항체 단편, 핵산-계 단백질 결합 시약, 이의 소분자 또는 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 에세이가 효소 면역분석법(EIA), 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 및 방사면역측정법(RIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  37. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    1종 이상의 위험 징후에 대한 측정 가능한 특징을 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 위험 징후가 체질량 지수(BMI), 임신 및 태아 성별로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    위험 징후가 BMI인 방법.
  40. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    상기 방법이 조산에 대한 가능성을 결정하는 상기 단계 이전에 출산시 재태 기간(GAB)의 예측을 더 포함하는 방법.
  41. 제39항에 있어서,
    임산부가 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는 방법.
  42. 제26항에 있어서,
    반전값이 상기 SHBG에 대한 상기 IBP4의 비(IBP4/SHBG)에 기초하여 임산부에서의 조산 가능성을 결정하고, 만기 대조군에 비해 임산부에서의 더 높은 비가 조산에 대한 증가된 위험을 나타내는 방법.
  43. 임산부에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
    a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    b. 생물학적 샘플을 상기 쌍의 제1 멤버와 특이적으로 결합하는 제1 포획제 및 상기 쌍의 제2 멤버와 특이적으로 결합하는 제2 포획제와 접촉시킴으로써, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및
    c. 상기 쌍의 제1 바이오마커와 제1 포획제 사이 및 상기 쌍의 제2 멤버와 제2 포획제 사이의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 바이오마커 쌍에 대한 반전값을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    임산부와 만기 대조군 사이의 반전값에서의 변화의 존재가 임산부에서의 조산 가능성을 나타내는 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 가능성이 위험 스코어로서 표현되는 방법.
  47. 제43항에 있어서,
    생물학적 샘플이 전혈, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    생물학적 샘플이 혈청인 방법.
  49. 제47항에 있어서,
    상기 샘플이 재태 기간의 19주 내지 21주 사이에 수득되는 방법.
  50. 제43항에 있어서,
    상기 포획제가 항체, 항체 단편, 핵산-계 단백질 결합 시약, 이의 소분자 또는 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  51. 제43항에 있어서,
    상기 방법이 효소 면역분석법(EIA), 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 및 방사면역측정법(RIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 에세이에 의해 수행되는 방법.
  52. 제44항에 있어서,
    1종 이상의 위험 징후에 대한 측정 가능한 특징을 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 위험 징후가 체질량 지수(BMI), 임신 및 태아 성별로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    위험 징후가 BMI인 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    임산부가 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는 방법.
  56. 제43항에 있어서,
    상기 단리된 바이오마커 쌍이 IBP4/SHBG인 방법.
  57. 임산부에서 IBP4 및 SHBG를 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
    a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    b. 생물학적 샘플을 IBP4에 특이적으로 결합하는 포획제 및 SHBG에 특이적으로 결합하는 포획제와 접촉시킴으로써, 상기 IBP4 및 SHBG가 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및
    c. IBP4와 포획제 사이 및 SHBG와 포획제 사이의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  58. 임산부에서 IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, 및 APOC3/LYAM1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 바이오마커 쌍을 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
    a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및
    b. 샘플을 질량 분석법 정량화로 구성된 프로테오믹스 워크-플로우(proteomics work-flow)에 처리시키는 단계를 포함하여, 단리된 바이오마커 쌍이 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  59. 임산부에서 IBP4 및 SHBG를 검출하는 방법으로서, 상기 방법이
    a. 임산부로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및
    b. 샘플을 질량 분석법 정량화로 구성된 프로테오믹스 워크-플로우에 처리시키는 단계를 포함하여, 상기 IBP4 및 SHBG가 생물학적 샘플에 존재하는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 바이오마커 쌍에 대한 반전값을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    임산부와 만기 대조군 사이의 반전값에서의 변화의 존재가 임산부에서의 조산 가능성을 나타내는 방법.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 가능성이 위험 스코어로서 표현되는 방법.
  63. 제58항 또는 제59항에 있어서,
    생물학적 샘플이 전혈, 혈장, 및 혈청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  64. 제63항에 있어서,
    생물학적 샘플이 혈청인 방법.
  65. 제63항에 있어서,
    상기 샘플이 재태 기간의 19주 내지 21주 사이에 수득되는 방법.
  66. 제58항 또는 제59항에 있어서,
    상기 프로테오믹스 워크 플로우가 SIS 펩티드의 정량화를 포함하는 방법.
  67. 제58항 또는 제59항에 있어서,
    1종 이상의 위험 징후에 대한 측정 가능한 특징을 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  68. 제67항에 있어서,
    상기 위험 징후가 체질량 지수(BMI), 임신 및 태아 성별로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    상기 위험 징후가 체질량 지수(BMI)인 방법.
  70. 제69항에 있어서,
    임산부가 22 kg/m2 초과 내지 37 kg/m2 이하의 체질량 지수(BMI)를 갖는 방법.
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10928402B2 (en) 2012-12-28 2021-02-23 Nx Prenatal Inc. Treatment of spontaneous preterm birth
WO2014143977A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preeclampsia
IL256399B (en) 2015-06-19 2022-09-01 Sera Prognostics Inc Pairs of biomarkers for predicting premature birth
EP3384076A4 (en) 2015-12-04 2019-09-25 Nx Prenatal Inc. USE OF CIRCULATING MICROPARTICLES TO STRATIFY THE RISK ON A SPONTANEOUS SPRING BIRTH
US20180143202A1 (en) * 2016-08-05 2018-05-24 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers for predicting preterm birth in a pregnant female exposed to progestogens
US20180172698A1 (en) * 2016-08-05 2018-06-21 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers for predicting preterm birth due to preterm premature rupture of membranes (pprom) versus idiopathic spontaneous labor (ptl)
WO2018071845A1 (en) * 2016-10-13 2018-04-19 Krishnamurti Tamar Priya A structured medical data classification system for monitoring and remediating treatment risks
JP2018140172A (ja) * 2017-02-28 2018-09-13 株式会社Ｎｔｔドコモ データ収集装置及びデータ収集方法
EP3668996A4 (en) 2017-08-18 2021-04-21 Sera Prognostics, Inc. CLOCK PREGNANCY PROTEIN FOR PREDICTING THE DATE AND TIME TO BIRTH
EP3746087A4 (en) * 2018-01-31 2022-02-09 Nx Prenatal Inc. METHODS FOR EARLY PREDICTION AND PREVENTION OF PRE-ECLAMPSIA USING BIOMARKERS ASSOCIATED WITH CIRCULATING MICROPARTICLES
KR20200140797A (ko) * 2018-01-31 2020-12-16 엔엑스 프리네이탈 인코포레이티드 자연 조산의 위험을 계층화하기 위한 순환 미세입자의 용도
US20220170941A1 (en) * 2019-04-04 2022-06-02 Carmentix Pte. Ltd. Biomarker Pairs of Preterm Birth
WO2020201521A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Carmentix Pte. Ltd. Biomarker pairs of preterm birth
EP3786977A1 (de) * 2019-08-29 2021-03-03 WPmed GbR Computerimplementiertes verfahren und elektronisches system zur prognose eines entbindungszeitpunkts
WO2021163034A1 (en) * 2020-02-10 2021-08-19 Somalogic, Inc. Nonalcoholic steatohepatitis (nash) biomarkers and uses thereof
WO2022034118A1 (en) 2020-08-11 2022-02-17 University College Cork - National University Of Ireland, Cork A method of predicting the risk of spontaneous pre-term birth (sptb)
CN112126683A (zh) * 2020-08-31 2020-12-25 中山大学 用于迟发型子痫前期诊断的标志物
US20230101470A1 (en) * 2020-10-27 2023-03-30 Lipocine Inc. Hydroxyprogesterone Caproate Compositions and Methods of Use in Preventing Preterm Birth
CN112730692B (zh) * 2021-01-08 2022-11-29 首都医科大学附属北京朝阳医院 用于预测胎膜早破的生物标记物和方法
CN112899360A (zh) * 2021-02-02 2021-06-04 北京航空航天大学 一种检测特雷彻·柯林斯综合征发生概率的组合物的应用方法
CN113223714B (zh) * 2021-05-11 2022-07-05 吉林大学 一种用于预测子痫前期风险的基因组合、子痫前期风险预测模型及其构建方法
CA3220282A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Sera Prognostics, Inc. Biomarker pairs and triplets for predicting preterm birth
CN113933516A (zh) * 2021-09-06 2022-01-14 山东省妇幼保健院 早产潜在预测标志物筛选方法、早产检测试剂盒及其用途
WO2023110832A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 UNIVERSITé LAVAL Biomarkers for the prediction of preterm birth

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
ATE282716T1 (de) 1989-07-11 2004-12-15 Gen Probe Inc Verfahren zur amplifikation von nukleinsäuresequenzen
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
WO1991016633A1 (en) 1990-04-12 1991-10-31 Adeza Biomedical Corporation Pregnancy induced hypertension and eclampsia immunoassay and reagents
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
CA2121680C (en) 1991-11-04 2005-03-22 Andrew E. Senyei Screening method for identifying women at increased risk for preterm delivery
US5270184A (en) 1991-11-19 1993-12-14 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid target generation
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US6678669B2 (en) 1996-02-09 2004-01-13 Adeza Biomedical Corporation Method for selecting medical and biochemical diagnostic tests using neural network-related applications
JP2000500879A (ja) 1996-09-20 2000-01-25 アセロジエニクス・インコーポレイテツド 炎症性疾患の診断及びメディエータ
ATE435237T1 (de) 2000-08-09 2009-07-15 Maruho Kk Durch homogene bluttransfusion induziertes protein und für dieses kodierende dna
GB0026823D0 (en) 2000-11-02 2000-12-20 King S College London Diagnosis of pre-eclampsia
WO2002070742A1 (en) 2001-03-01 2002-09-12 Epigenomics Ag Method for the development of gene panels for diagnostic and therapeutic purposes based on the expression and methylatoin status of the genes
AU2002251366A1 (en) 2001-05-02 2002-11-11 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of breast cancer
US7435419B2 (en) 2002-07-19 2008-10-14 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of diagnosing and treating pre-eclampsia or eclampsia
EP1540010B8 (en) 2002-08-06 2010-07-14 The Johns Hopkins University Use of biomarkers for detecting ovarian cancer
WO2004045379A2 (en) 2002-11-14 2004-06-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health Biomarkers for intra-amniotic inflammation
US7541182B2 (en) 2003-02-13 2009-06-02 Yale University In vitro test to detect risk of preeclampsia
US7191068B2 (en) 2003-03-25 2007-03-13 Proteogenix, Inc. Proteomic analysis of biological fluids
US8068990B2 (en) 2003-03-25 2011-11-29 Hologic, Inc. Diagnosis of intra-uterine infection by proteomic analysis of cervical-vaginal fluids
JP2008500952A (ja) 2003-07-15 2008-01-17 ジェノバ・リミテッド 心臓血管障害で減少する分泌ポリペプチド種
WO2005017192A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 The General Hospital Corporation Screening for gestational disorders
US20050043640A1 (en) 2003-08-21 2005-02-24 Chang Alexander C. Remote electrocardiogram for early detection of coronary heart disease
US7344892B2 (en) * 2003-09-23 2008-03-18 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Screening for gestational disorders
US20050233400A1 (en) 2004-03-03 2005-10-20 Weiner Carl P Proteomic method for predicting success of rescue cerclage
JP4938451B2 (ja) 2004-03-23 2012-05-23 オンコセラピー・サイエンス株式会社 非小細胞肺癌の診断のための方法
EP2071031B1 (en) 2004-08-27 2013-10-09 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
US20080090759A1 (en) 2004-08-30 2008-04-17 Robert Kokenyesi Methods and kits for predicting risk for preterm labor
WO2006029838A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 Geneprot Inc. Secreted polypeptide species involved in alzheimer’s disease
WO2006034427A2 (en) 2004-09-20 2006-03-30 Proteogenix, Inc. Diagnosis of fetal aneuploidy
EP1836496A2 (en) 2004-11-08 2007-09-26 Nanobac Life Sciences Methods and compositions for protein-hydroxy apatite complexes and their application in testing and modulating immunological system including a novel in vitro test for the detection of antibodies against calcium binding protein-hydroxy apatite complexes
CA2528531A1 (en) 2005-01-06 2006-07-06 Mount Sinai Hospital Markers of pre-term labor
JP2008527351A (ja) 2005-01-06 2008-07-24 イースタン バージニア メディカル スクール 前立腺癌のバイオマーカーとしてのアポリポタンパク質ａ−ｉｉアイソフォーム
US7662570B2 (en) 2005-01-26 2010-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Labor biomarkers, methods comprising same, and methods targeting same
KR101310000B1 (ko) 2005-03-11 2013-09-25 싸이퍼젠 바이오시스템즈, 인코포레이티드 난소암 및 자궁내막암에 대한 바이오마커 : 헵시딘
WO2007022248A2 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Methods of detection of cancer using peptide profiles
EP1929297B1 (en) 2005-09-29 2012-11-21 Caprion Proteomics USA, LLC Biomarkers for multiple sclerosis and methods of use thereof
EP1946121A2 (en) 2005-10-27 2008-07-23 Yale University, Inc. Urinary proteomic biomarker patterns in preeclampsia
US20070111326A1 (en) 2005-11-14 2007-05-17 Abbott Laboratories Diagnostic method for proteinaceous binding pairs, cardiovascular conditions and preeclampsia
US7790463B2 (en) 2006-02-02 2010-09-07 Yale University Methods of determining whether a pregnant woman is at risk of developing preeclampsia
NZ569765A (en) 2006-02-06 2012-03-30 Pacific Biotech Pty Ltd A method and system for estimating time elapsed within a gestation period of a pregnant or potentially pregnant ruminant
GB0605950D0 (en) 2006-03-24 2006-05-03 Jopejo Ltd Device for prediction of human or other mammalian labour onset
US20080057590A1 (en) 2006-06-07 2008-03-06 Mickey Urdea Markers associated with arteriovascular events and methods of use thereof
WO2008021115A2 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic tests using gene expression ratios
EP1914548A1 (en) 2006-10-20 2008-04-23 The University Of Newcastle Research Associates Limited Method for identifying women with an increased risk of preterm delivery
EP1914553A1 (en) 2006-10-20 2008-04-23 The University Of Newcastle Research Associates Limited Method for identifying women with an increased risk of foetal growth retardation
EP1914552A1 (en) 2006-10-20 2008-04-23 The University Of Newcastle Research Associates Limited Method for identifying women with an increased risk of pre-eclampsia
AU2007312960A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Newcastle Innovation Limited Assay for the detection of biomarkers associated with pregnancy related conditions
WO2008054764A2 (en) 2006-10-31 2008-05-08 George Mason Intellectual Properties, Inc. Biomarkers for colorectal cancer
AU2007322252A1 (en) 2006-11-01 2008-05-29 George Mason Intellectual Properties, Inc. Biomarkers for neurological conditions
US8552364B2 (en) 2006-12-26 2013-10-08 Brigham Young University Serum proteomics system and associated methods
WO2008085024A1 (en) 2007-01-12 2008-07-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Identification and detection of peptides relating to specific disorders
EP2038431A1 (en) 2007-02-01 2009-03-25 Diagnostic Technologies Ltd. Method for determining preeclampsia risk
US20080233583A1 (en) 2007-02-20 2008-09-25 Regents Of The University Of California Biomarkers for preeclampsia
GB0704764D0 (en) 2007-03-12 2007-04-18 Electrophoretics Ltd Isobarically labelled reagents and methods of their use
US20080274481A1 (en) 2007-03-28 2008-11-06 Vermillion, Inc. Methods for diagnosing ovarian cancer
EP2147309A4 (en) 2007-05-05 2010-08-04 Univ Western Ontario METHODS OF DETECTING PRECLAMPSY
WO2008146100A1 (en) 2007-06-01 2008-12-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for absolute quantification of polypeptides
KR20100058496A (ko) 2007-07-20 2010-06-03 더 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션 조산의 위험을 평가하기 위한 바이오마커의 확인 및 정량화
GB0724735D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Psynova Neurotech Ltd Methods and biomarkers for diagnosing and monitoring psychotic disorders
WO2009097584A1 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Proteogenix, Inc. Maternal serum biomarkers for detection of pre-eclampsia
WO2009097579A1 (en) 2008-01-30 2009-08-06 Proteogenix, Inc. Gestational age dependent proteomic changes of human maternal serum for monitoring maternal and fetal health
WO2009108073A1 (en) * 2008-02-28 2009-09-03 Auckland Uniservices Limited Biomarkers for prediction of preeclampsia and/or cardiovascular disease
AU2009235925A1 (en) 2008-04-09 2009-10-15 The University Of British Columbia Methods of diagnosing acute cardiac allograft rejection
EP2310859A1 (en) 2008-06-25 2011-04-20 University of Utah Research Foundation Identifying and quantifying biomarkers associated with preeclampsia
US20110256560A1 (en) 2008-10-20 2011-10-20 University Health Network Methods and compositions for the detection of ovarian cancer
US20100216250A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Lopez Mary Frances Methods for Predicting Trisomy 21 in a Fetus
US20120046261A1 (en) 2009-02-27 2012-02-23 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for diagnosing and preventing spontaneous preterm birth
RU2012110372A (ru) 2009-08-20 2013-09-27 Юниверсити Оф Юта Рисерч Фаундейшн Идентификация и количественное определение биомаркеров для оценки риска преждевременных родов
RU2012122180A (ru) 2009-10-30 2013-12-10 Нестек С.А. Способы диагностики синдрома раздраженного кишечника
GB0922240D0 (en) 2009-12-21 2010-02-03 Cambridge Entpr Ltd Biomarkers
US20130040844A1 (en) 2010-01-28 2013-02-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarkers of aging for detection and treatment of disorders
TWI390204B (zh) 2010-02-11 2013-03-21 Univ Chang Gung Biomarker of bladder cancer and its detection method
WO2011100792A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Crc For Asthma And Airways Ltd Protein biomarkers for obstructive airways diseases
EP2601532B1 (en) 2010-08-06 2016-01-27 Mycartis N.V. Perlecan as a biomarker for renal dysfunction
CN102445534A (zh) * 2010-10-15 2012-05-09 无锡市凯奥善生物医药科技有限公司 一种孕妇早产及胎膜早破联检试剂盒
US20120190561A1 (en) 2010-11-15 2012-07-26 Ludwig Wildt Means and methods for diagnosing endometriosis
WO2012109592A1 (en) * 2011-02-11 2012-08-16 Exagen Diagnostics, Inc. Methods for diagnosing systemic lupus erythematosus
AU2012267884A1 (en) * 2011-06-07 2014-01-23 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Circulating biomarkers for cancer
RU2486519C1 (ru) * 2011-11-15 2013-06-27 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразви Способ прогнозирования преждевременных родов и внутриутробного инфицирования плода
US20130130278A1 (en) * 2011-11-22 2013-05-23 Ottawa Hospital Research Institute Detection of risk for pregnancy-related medical conditions
WO2013081721A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Battelle Memorial Institute Biomarkers for lymphoma
US9797903B2 (en) 2012-10-24 2017-10-24 Winthrop-University Hospital Non-invasive biomarker to identify subject at risk of preterm delivery
US10279018B2 (en) * 2012-12-03 2019-05-07 Unity Biotechnology, Inc. Immunogenic compositions for inducing an immune response for elimination of senescent cells
WO2014110098A1 (en) 2013-01-08 2014-07-17 Duke University Biomarkers for the prediction of preterm birth
AU2014227891A1 (en) 2013-03-15 2015-10-08 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preterm birth
WO2014143977A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preeclampsia
US20140287948A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preterm birth
IL256399B (en) 2015-06-19 2022-09-01 Sera Prognostics Inc Pairs of biomarkers for predicting premature birth
US20180172698A1 (en) 2016-08-05 2018-06-21 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers for predicting preterm birth due to preterm premature rupture of membranes (pprom) versus idiopathic spontaneous labor (ptl)
US20180143202A1 (en) 2016-08-05 2018-05-24 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers for predicting preterm birth in a pregnant female exposed to progestogens
EP3668996A4 (en) 2017-08-18 2021-04-21 Sera Prognostics, Inc. CLOCK PREGNANCY PROTEIN FOR PREDICTING THE DATE AND TIME TO BIRTH

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017144232A3 (ko) 2019-12-24
US10392665B2 (en) 2019-08-27
EP3311158B1 (en) 2023-08-30
AU2016279002B2 (en) 2022-06-30
JP2018524581A (ja) 2018-08-30
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