CN111918658A - 利用循环微粒相关生物标志物早期预测和预防先兆子痫的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于确定先兆子痫风险确定和治疗先兆子痫的方法和装置。方法和装置采用了多肽生物标志物，例如表1、表3和表4中提供的那些。进一步提供了包含可用于预测先兆子痫风险的多个多肽生物标志物的组合。

Description

利用循环微粒相关生物标志物早期预测和预防先兆子痫的 方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月31日提交的美国临时专利申请号62/624,626和2018年3月9日提交的美国临时专利申请号62/641,135的35 U.S.C.§119(e)下的权益。这些申请的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
先兆子痫(PE)是孕妇的病状，其特征在于高血压(血压高)和蛋白尿(尿中有蛋白)，其可导致子痫或惊厥(convulsion)。先兆子痫通常形成于妊娠中期至晚期以及分娩后6周内，尽管其有时可早于20周或在早期妊娠出现。它通常发生在初次怀孕中，曾患PE的女性在随后的怀孕中更可能具有相同的病状。
据估计，PE每年影响全世界8,370,000名妇女，是母亲，胎儿和新生儿发病和死亡的主要原因。PE约占新生儿发病率和死亡率的7％-9％。在美国，据报道该病影响了200,000名孕妇，且估计引起了大约100亿美元的医疗保健花费。大部分费用(约80％)与早发型PE(例如，妊娠35周前形成的PE)有关。在发展中国家，先兆子痫约占母亲死亡的40-60％。
先兆子痫有时形成而无任何症状。血压正常的女性可缓慢或突然形成高血压。其他症状可包括突然肿胀(主要是面部和手部)，突然体重增加，头痛和视力改变(有时会看到闪光)，萎靡，呼吸短促，呕吐，尿排出量减少以及血液中血小板减少。一些女性可形成PE并发症，这些症状包括胎儿生长受限，早产(PTD)，胎盘早剥，HELLP综合征，子痫，其他器官损害(例如肝和肾)和心血管疾病。一些女性也可形成其他并发症，例如宫内生长受限(IUGR)和妊娠性高血压(pregnancy induced hypertension，PIH)。
PE可迅速发作，有时没有任何症状，也有可能导致严重且快速的并发症，例如子痫，癫痫和器官衰竭，这威胁胎儿和母亲的健康，除非诱导或手术分娩。
PE的原因尚不清楚。通常，患有肥胖，糖尿病，狼疮，免疫疾病，怀有多于一个胎儿及怀孕前的高血压或肾病的妇女可有更高先兆子痫风险。其他风险因素可包括年龄和新父亲(new paternity)。母亲或姐姐患有PE的妇女也有更高风险。
PE可对母婴产生长期健康影响。曾患PE的妇女在以后生活中患高血压和母亲冠状动脉疾病的风险可增加。与未患PE且怀孕足月的妇女相比，患有导致早产的PE的妇女可能更易死于心血管疾病。出生时胎儿生长降低或早产的婴儿在以后的生活中更易患心血管疾病，高血压糖尿病或精神或神经发育障碍(例如，注意缺陷障碍)。据报道，孕期患有PE的母亲所诞出的患有发育障碍(例如自闭症谱系障碍)的一些孩子的可能性超过其(未患PE且怀孕足月的妇女)两倍。
目前，PE的诊断需要高血压和蛋白尿的阳性结果。
PE的可用治疗方法可包括降低血压药物、皮质类固醇、抗惊厥药物，住院以及最终分娩。
附图说明
附图，并入本文且形成说明书一部分，示例说明了示例性的实施方案，并且与说明书一起，进一步用于使相关领域的技术人员能够做出和使用这些实施方案以及对本领域技术人员而言显而易见的其他技术方案。将结合以下附图更具体地描述本发明，其中：
图1示出了鉴定与先兆子痫相关的蛋白的示意及统计流程图，与实施例2和3有关并且与图3、4A，4B和5有关。
图2示出了与增加的先兆子痫风险的生物标志物相关的生物学功能。这代表应用图1中的统计流程图鉴定的生物标志物。
图3示出了针对STRING蛋白数据库的数据管护(curation)之前，自内部模型生成的29个组合的先兆子痫生物标志物。
图4A和图4B示出了针对STRING蛋白数据库的数据管护之前，自样品测试集上模型生成的56个组合的先兆子痫生物标志物。
图5示出了针对STRING蛋白数据库的数据管护后，24个组合的先兆子痫蛋白生物标志物。
发明概述
一方面，本文提供了一种用于评估怀孕受试者先兆子痫风险的方法，所述方法包括：(a)从来自怀孕受试者的血液样品中制备微粒富集的级分；(b)确定所述级分中一个或多个微粒相关蛋白生物标志物的定量测定值(quantitative measure)，其中所述一个或多个蛋白生物标志物选自：(i)表1中的蛋白生物标志物；(ii)一种蛋白生物标志物的集合：A2N0U6，A0A024R8D8，B2R6L0，GP1BA，Q96TB4，A0A075B6I4，Q5NV82，E3UVQ2，E9PQG4，L0R6N9，VTNC，C1RL，MBL2，B2R815，D6MJD1，ZA2G，A0A024R9I2，TPC11，CO5，A0A024R3Z1，A8K008，B2R4C5，B4E1D8，GP112，A0A075B6H9；和(iii)一种蛋白生物标志物的集合：GP1BA，VTNC，C1RL，ZA2G，APOC2，APOH，JPH1，CO5，HEP2，TPC11，MBL2，AACT，DYH3，TSP1，CAPS1，APOD，LCAT；以及(c)基于所述测量评估先兆子痫风险。在一个实施方案中，上调的生物标志物的量的增加或下调的生物标志物的量减少表明先兆子痫风险增加。在另一个实施方案中，所述方法包括确定选自表1的蛋白生物标志物的多个蛋白生物标志物的定量测定值。在另一个实施方案中，所述一个或多个蛋白生物标志物选自表1：组1、组2或组3。在另一个实施方案中，所述一个或多个蛋白生物标志物选自多个生物功能的每个，所述生物功能选自免疫功能、细胞信号传导、血管生成、细胞凋亡、基质附着、细胞功能、蛋白代谢、离子转运和未知功能。在另一个实施方案中，所述方法包括确定严重先兆子痫风险，其中一个或多个生物标志物选自：0A075B6I5_HUMAN、A2MYD2_HUMAN、AL2SA_HUMAN、AR13B_HUMAN、B3AT_HUMAN、BAI1_HUMAN、BRWD3_HUMAN、C6K6H8_HUMAN、CI040_HUMAN、CPLX1_HUMAN、CPLX2_HUMAN、E5RG74_HUMAN、E9PNW5_HUMAN、HV301_HUMAN、I6Y0B1_HUMAN、J3KPJ3_HUMAN、LAC7_HUMAN、LIPA2_HUMAN、LV104_HUMAN、LV109_HUMAN、Q68D13_HUMAN、Q9UL88_HUMAN、SCRIB_HUMAN和TTC37_HUMAN。在另一个实施方案中，所述方法包括确定多个蛋白标志物的定量测定值，所述蛋白标志物选自：A2N0U6、A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA、Q96TB4、A0A075B6I4、Q5NV82、E3UVQ2、E9PQG4、L0R6N9、VTNC、C1RL、MBL2、B2R815、D6MJD1、ZA2G、A0A024R9I2、TPC11、CO5、A0A024R3Z1、A8K008、B2R4C5、B4E1D8、GP112和A0A075B6H9。在另一个实施方案中，所述方法包括确定个蛋白标志物的定量测定值，所述蛋白标志物选自：GP1BA、VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2、APOH、JPH1、CO5、HEP2、TPC11、MBL2、AACT、DYH3、TSP1、CAPS1、APOD及LCAT在另一个实施方案中，所述生物标志物包括一组生物标志物，其选自组合1-29(图3)、组合1-56(图4A-4B)和组合1-24(图5)。在另一个实施方案中，其中所述组合包括不超过任意10、9、8、7、6、5、4或3个蛋白生物标志物。在另一个实施方案中，所述生物标志物由一组生物标志物组成，所述一组生物标志物选自组合1-29(图3)、组合1-56(图4A-4B)和组合1-24(图5)。在另一个实施方案中，所述生物标志物包括一组生物标志物，其包括5、4、3或2个选自A2N0U6、A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA和Q96TB4的生物标志物。在另一个实施方案中，所述生物标志物包括一组生物标志物，其包括A2N0U6，以及A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA和Q96TB4的至少1、2、3、或4个。在另一个实施方案中，所述生物标志物包括一组生物标志物，其包括选自GP1BA、VTNC、C1RL，ZA2G、APOC2和APOH的6、5、4、3或2个生物标志物。在另一个实施方案中，所述生物标志物包括一组生物标志物，其包括GP1BA，以及VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2和APOH的至少1、2、3、4或5个。在另一个实施方案中，所述样品采自怀孕首三月或中三月期间的怀孕受试者。在另一个实施方案中，所述样品采自受孕10-12周期间的怀孕受试者。在另一个实施方案中，所述怀孕受试者是初孕妇、经产孕妇、初产的或多产的。在另一个实施方案中，所述怀孕受试者有单胎妊娠或多胎妊娠。在另一个实施方案中，所述怀孕受试者的先兆子痫是无症状的，例如，不是高血压或没有蛋白尿。在另一个实施方案中，怀孕受试者没有先兆子痫病史。在另一个实施方案中，所述怀孕受试者没有先兆子痫的风险因素。在另一个实施方案中，所述怀孕受试者患有慢性高血压。在另一个实施方案中，所述血液样品是血浆或血清。在另一个实施方案中，所述微粒富集的级分使用尺寸排阻色谱法制备。在另一个实施方案中，所述尺寸排阻色谱法包括用水洗脱。在另一个实施方案中，所述尺寸排阻色谱法使用琼脂糖固相和含水液相进行。在另一个实施方案中，所述制备步骤进一步包括使用超滤或反相色谱法。在另一个实施方案中，所述制备步骤进一步包括在尺寸排阻色谱法之后使用尿素变性、使用二硫苏糖醇还原、使用碘乙酰胺烷基化以及使用胰蛋白酶消化。在另一个实施方案中，所述微粒经进一步纯化以富集胎盘来源的外泌体或血管内皮来源的外泌体。在另一个实施方案中，确定定量测定值包括质谱法。在另一个实施方案中确定定量测定值包括液相色谱/质谱法(LC/MS)。在另一个实施方案中，所述质谱法包括液相色谱/三重四极杆质谱法(triple quadrupole mass spectrometry)。在另一个实施方案中，所述质谱法包括多重反应监测。在另一个实施方案中，所述质谱法包括多重反应监测，并且所述液相色谱法是使用包含乙腈的溶剂完成的，和/或确定包括为蛋白生物标志物分配指数化的保留时间(indexed retention time)。在另一个实施方案中，所述质谱法包括多重反应监测，并且所述方法包括在引入质谱仪之前向样品中添加一个或多个稳定同位素标准品肽，并且检测包括由检测质谱仪的碰撞池所产生的稳定同位素肽标准品的一个或多个子离子。在另一个实施方案中，确定定量测定值包括确定蛋白生物标志物的替代肽(surrogate peptide)的定量测定值。在另一个实施方案中，质谱法包括定量一个或多个稳定同位素标记的标准品肽。在另一个实施方案中，MRM包括将对应于所述蛋白生物标志物的一个或多个稳定重同位素取代的标准品添加到微粒富集的级分中。在另一个实施方案中，其中确定定量测定值包括使所述样品与一个或多个捕获试剂接触，每种捕获试剂特异性结合所述蛋白生物标志物中的一种，并检测蛋白生物标志物中捕获试剂之间的结合。在另一个实施方案中，定量包括进行免疫测定。在另一个实施方案中，所述免疫测定选自下组：酶免疫测定(EIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。在另一个实施方案中，所述评估包括执行分类规则，该规则将处于先兆子痫风险的受试者分类，并且其中该分类规则的执行产生先兆子痫或足月生产间的相关性，p值小于至少0.05。在另一个实施方案中，所述评估包括执行分类规则，该规则将处于先兆子痫风险的受试者分类，并且其中所述分类规则的执行产生接受者操作特征(ROC)曲线，其中所述ROC曲线具有至少0.6、至少0.7、至少0.8或至少0.9的曲线下面积(AUC)。在另一个实施方案中，所述分类规则将受试者分类的值进一步包括以下的至少一项：母亲年龄、母亲体重指数、初产的，和怀孕期间吸烟。在另一个实施方案中，所述分类规则采用截断值(cut-off)，线性回归(例如，多元线性回归(MLR)、偏最小二乘(PLS)回归、主成分回归(PCR))，二元决策树(例如，递归划分过程，例如CART-分类和回归树)，人工神经网络例如反向传播网络，判别分析(例如，贝叶斯(Bayesian)分类器或Fischer分析)，逻辑分类器和支持向量分类器(例如，支持向量机)。在另一个实施方案中，其中将所述分类规则配置为具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的灵敏性、特异性、阳性预测值或阴性预测值。在另一个实施方案中，评估增加的先兆子痫风险包括确定蛋白生物标志物(如果被上调)高于或(如果被下调)低于阈值水平。在另一个实施方案中，所述阈值水平代表至少一、至少二或至少三个z分数的水平，所述z分数来自从至少50、至少100或至少200个对照受试者确定的蛋白质的集中趋势(如，均值、中位数或众数)的测量。在另一个实施方案中，所述评估包括将所述组合中每种蛋白的测量与参考标准进行比较。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括将怀孕受试者的先兆子痫风险传达给健康护理提供者。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括：(d)确定，所述级分中用于早产的一个或多个微粒相关蛋白生物标志物的定量测定值；以及(e)根据所述测量评估早产风险。
在另一方面本文提供了降低怀孕受试者的先兆子痫风险和/或减少先兆子痫的新生儿并发症的方法，所述方法包括：(a)根据如本文所述的方法评估怀孕受试者的先兆子痫风险；和(b)向受试者施用治疗干预，以有效降低先兆子痫风险和/或减少先兆子痫的新生儿并发症。在另一个实施方案中，所述治疗干预选自下组：阿司匹林(例如低剂量阿司匹林)、皮质类固醇或降低高血压的药物。在另一个实施方案中，所治疗的先兆子痫是较晚或较轻形式、高血压形式，或较早或严重形式。
在另一方面本文提供了一种方法，其包括向通过如本文所述的方法确定具有增加的先兆子痫风险的怀孕受试者施用有效减少先兆子痫的风险或减少先兆子痫的新生儿并发症的治疗干预。
在另一方面，本文提供了一种方法，所述方法向怀孕受试者施用有效量的旨在减少先兆子痫风险的治疗，与选自组合1-29(图3)、组合1-56(图4A-4B)和组合1-24(图5)的任一组合的蛋白生物标志物的参考标准相比，所述怀孕受试者具有改变的定量测定值。
在另一方面，本文提供了一种组合，其包括多个基本纯净的蛋白生物标志物或替代生物标志物，其选自表1、表3或表4的。在一个实施方案中，所述组合进一步包括与每个替代生物标志物配对的稳定同位素标准品肽。
在另一方面，本文提供了一种试剂盒，其包括一个或多个容器，其中每个容器包括多个稳定同位素标准品的每个的一个或多个，每个稳定同位素标准品对应于来自一组生物标志物的生物标志物替代肽，所述一组生物标志物选自组合1-29(图3)、组合1-56(图4A-4B)和组合1-24(图5)。
在另一方面，本文提供了一种有形的、非暂时性形式的计算机可读介质，其包括实施由如本文所述的方法生成的分类规则的代码。
在另一方面，本文提供了一种系统，其包括：(a)计算机，其包括：(i)处理器；以及(II)存储器，其耦合至处理器，所述存储器存储模块，所述模块包括：(1)来自受试者的样品的测试数据，其包括指示所述级分中的一个或多个蛋白生物标志物的定量测定值，其中所述蛋白生物标志物选自表1、表3和表4的蛋白生物标志物；(2)分类规则，基于包括所述测量值的值，其将所述受试者分类为处于早产风险，其中将所述分类规则配置为具有至少75％、至少85％或至少95％的灵敏性；以及(3)计算机可执行指令，其用于对测试数据实施分类规则。
发明详述
I.简介
本文公开了可用于确定发展为先兆子痫的风险和用于治疗先兆子痫的方法、系统和制品。这包括早期检测先兆子痫(在亚临床和/或低于正常检测阈值的情况时进行确定)和确定发展为先兆子痫的风险。其中某些涉及检测在来自孕妇血液的微粒富集的级分中发现的先兆子痫生物标志物。这些生物标志物列于表1、表4和表5。
II.受试者
预测和治疗先兆子痫的受试者是怀孕的人类女性。在一些实施方案中，所述孕妇处于怀孕的首三月(例如，受孕的1-12周)，中三月(例如，受孕的13-28周)或末三月(例如，受孕的29-37周)。在一些实施方案中，所述孕妇处于怀孕早期(例如，从8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周开始，但早于受孕21周；从20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9周开始，但至晚于受孕8周)。在一些实施方案中，所述孕妇处于怀孕8-15周，例如10-12周、8-12周或10-15周。在一些实施方案中，所述孕妇处于怀孕中期(例如，从21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周开始，但至早于受孕31周；从30、29、28、27、26、25、24、23、22或21周开始，但至晚于受孕20周)。在一些实施方案中，所述孕妇处于怀孕晚期(例如，从31、32、33、34、35、36或37周开始，但至早于受孕38周；从37、36、35、34、33、32或31周开始，但至晚于受孕30周)。在一些实施方案中，所述孕妇处于少于17周、少于16周、少于15周、少于14周或少于13周受孕；从20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9周开始，但至晚于受孕8周)。怀孕的阶段可以从怀孕受试者最后一次正常月经期的第一天开始计算。
本文所述方法中怀孕受试者可归属于一类或多类，包括初产的(分娩前无先前的孩子，在本文中可互换地称为未经产的或胎次＝0)或多产的(至少有一个先前的孩子怀有至少20周，在本文中可互换地称为胎次>0，胎次≥1)，初孕妇(首次怀孕)或经产孕妇(怀孕一次以上)。
在一些实施方案中，所述怀孕人类受试者无症状。在一些实施方案中，所述受试者可具有先兆子痫的风险因素，例如高血压、尿液中有蛋白、先兆子痫家族病史、肾脏或结缔组织疾病、肥胖症、母亲高龄，或接受医疗帮助。
III.样品制备
用于在本公开的方法中使用的样品是获取自怀孕受试者的生物样品。在某些实施方案中，所述样品采集于前一节所述的怀孕阶段。在一些实施方案中，所述样品为血液、唾液、眼泪、汗液、鼻分泌物、尿液、羊水或宫颈阴道液样品。在一些实施方案中，所述样品为血液样品，其在某些实施方案中为血清或血浆。在一些实施方案中，所述样品已经冷冻(例如-20℃或-80℃)保存。
术语“微粒”是指具有约50nm至约5000nm流体动力学直径的细胞外微囊泡或脂质筏蛋白聚集体。因此，术语微粒涵盖外泌体(约50nm至约100nm)、微囊泡(约100nm至约300nm)、核外粒体(约50nm至约1000nm)、凋亡小体(约50nm至约5000nm)和同样尺寸的脂质-蛋白聚集体。
术语“微粒相关蛋白”是指在来自哺乳动物(例如人类)受试者的微粒富集的样品中可检测到的蛋白或其片段。因此，术语“微粒相关蛋白”不限于在检测时与微粒物理上相关的蛋白或其片段。
本文所用术语“多肽”是指包括肽、多肽和蛋白的氨基酸聚合物，除非另有说明。
本文所使用的术语“约”是指数值为该值的90％至110％。比如，约1000nm的直径是900nm至1100nm范围内的直径。
先兆子痫的生物标志物可以是微粒来源的。微粒可以通过尺寸排阻色谱法从血液(例如血清或血浆)中分离。洗脱缓冲液可以是，例如，缓冲溶液如PBS，非缓冲溶液，水或去离子水。可以收集高分子量级分以获取微粒富集的样品。然后，在用蛋白水解酶如胰蛋白酶消化之前，提取微粒富集的样品中的蛋白，以获取包括多个肽的经消化的样品。然后在分析之前，将消化的样品进行肽纯化/浓缩步骤，以获取样品蛋白组学概况。在一些实施方案中，所述纯化/浓缩步骤包括反相色谱法(例如，0.2μL C18树脂的ZIPTIP移液管吸头，购自Millipore Corporation，Billerica，MA)。
在某些实施方案中，所述外泌体是胎盘来源的外泌体或内皮来源的外泌体。此类外泌体可以使用针对这些来源的细胞的表面标志物的捕获剂，例如抗体，进行分离。例如，胎盘来源的外泌体可使用定向CD34、CD44或白血病抑制因子(LIF)的抗体分离。内皮来源的外泌体可使用定向ICAM或VCAM的抗体分离。
本文提供了包括基本纯净形式的一个或多个先兆子痫生物标志物的物质的组合物。所述生物标志物可混合于容器中，或者可通过在物理上分离，例如，通过附着于不同可寻址位置(addressable location)处的固体支持物而分离。如本文所用，化学实体，例如多核苷酸或多肽，如果其在组合物中为其同类中的主要化学实体，则为“基本纯净的(substantially pure)”。这包括所述化学实体在其组合物中占其同类化学实体的50％以上、80％以上、90％以上或95％以上。如果化学实体在其组合物中占其同类化学实体的98％以上、99％以上、99.5％以上、99.9％以上或99.99％以上，则其为“大体上纯净的(essentially pure)”。大体上纯净的化学实体也是基本纯净的。
IV.生物标志物检测
A.生物标志物
如本文所用，术语“生物标志物”是指生物分子，其存在、形式或量在两种状态之间表现出统计学上的显著差异。因此，生物标志物可单独地或组合用于，将受试者分类为多个组中的一组。生物标志物可以是天然存在的或非天然存在的。例如，生物标志物可以是天然存在的蛋白或非天然存在的蛋白的片段。蛋白的片段可以起到蛋白的代理或替代肽或独立的生物标志物的作用。
本文提供了先兆子痫风险的多肽生物标志物。先兆子痫的生物标志物呈现于表1、表3和表4中。先兆子痫风险的生物标志物的组合呈现于图3、图4A和4B、以及图5中。
所述生物标志物可以使用蛋白从头测序从采自孕妇的样品(例如，血液)中分离的微粒中检测到。蛋白可通过质谱，例如单或双(MS/MS)质谱测序。亲本蛋白和亲本蛋白的肽片段均可用作先兆子痫的生物标志物。除非另有说明，否则命名的蛋白生物标志物涵盖通过替代物(例如所述蛋白的片段)的检测。
分析通过质谱法检测到的蛋白，例如肽，以鉴定与对照相比上调(量的增加)或下调(量的减少)的那些蛋白。进一步分析统计上显著的差异表达的蛋白，以鉴定亲本蛋白。此类蛋白可以在诸诸如SwissProt的蛋白数据库中鉴定。
在某些实施方案中，生物标志物作为包含多个生物标志物的组合进行分析。组合可以作为概念上的分组，作为物质的组合物(例如，包含纯化的生物标志物多肽，或作为制品，诸如附着于捕获剂(例如抗体)的固体支持物，所述捕获剂进一步结合生物标志物)存在。所述固体支持物可以是，例如一个或多个固体颗粒，如珠子，或生物标志物以阵列形式附着于其中的芯片。
在某些实施方案中，生物标志物可以包含在组合物中，其中肽生物标志物与所述肽配对，以及为所述肽的稳定同位素标准品。这样的组合物可用于多重反应监测质谱中的检测。
为了质谱的目的，蛋白可以完整地或通过片段化，例如在多重反应监测(MRM)中，进行检测。在这样的情况下，蛋白可以在分析之前通过蛋白水解片段化。蛋白水解片段化包括化学和酶促片段化。化学片段化包括，例如，用溴化氰处理。酶促片段化包括，例如，用诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、LysC、ArgC、GluC、LysN和AspN的蛋白酶消化。检测这些蛋白片段或其在质谱法中产生的片段化形式，可作为完整蛋白的替代物起作用。
1.从初步分析中鉴定的生物标志物
微粒体相关蛋白的初步统计分析鉴定出了表1的生物标志物。表1表明了所述生物标志物的鉴别力(1、2或3)的相对等级(“等级”)、所述生物标志物是否也可在以下中起作用：对PE(“也发现于极端表型中”)的极端病例进行分类、蛋白生物标志物的全称、病例与对照中生物标志物的量的比率以及差异表达的p值。关于比率，比率大于1表明标志物在PE中被上调，而比率小于1表明生物标志物在PE中被下调。极端先兆子痫，也称为严重先兆子痫，其特征在于以下的一个或多个：头痛、视力模糊、无法忍受强光、疲劳、恶心/呕吐、排尿少量、右上腹部疼痛、呼吸急促和易于瘀伤的倾向。
用于预测先兆子痫的生物标志物可以是选自下表1中所有生物标志物的一个或多于一个生物标志物，或选自表1中任何等级的生物标志物的一个或多于一个生物标志物。选择的生物标志物可以是全部上调的，全部下调的，或上调和下调的生物标志物的组合物。
在某些实施方案中，所述生物标志物选自：0A075B6I5_HUMAN、A2MYD2_HUMAN、AL2SA_HUMAN、AR13B_HUMAN、B3AT_HUMAN、BAI1_HUMAN、BRWD3_HUMAN、C6K6H8_HUMAN、CI040_HUMAN、CPLX1_HUMAN、CPLX2_HUMAN、E5RG74_HUMAN、E9PNW5_HUMAN、HV301_HUMAN、I6Y0B1_HUMAN、J3KPJ3_HUMAN、LAC7_HUMAN、LIPA2_HUMAN、LV104_HUMAN、LV109_HUMAN、Q68D13_HUMAN、Q9UL88_HUMAN、SCRIB_HUMAN和TTC37_HUMAN。此类生物标志物可能与严重形式的先兆子痫相关。
图2显示了与增加先兆子痫风险的生物标志物相关的生物学功能。这些生物学功能包括免疫功能、细胞信号传导、血管生成、凋亡、基质附着(matrix attachment)、细胞功能、蛋白代谢和离子转运。也显示了未知生物学功能的蛋白生物标志物。在某些实施方案中，可以测量来自多个(例如，至少两个，至少三个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个或至少8个)不同生物学功能的每一个的至少一个生物标志物。这也可以包括至少测量未知生物学功能的蛋白生物标志物。
2.用机器学习鉴定的生物标志物
对通过HRAM质谱分析产生的数据使用机器学习，发现了其他表现良好的生物标志物，如表3和表4所示。使用这些生物标志物的组合如图3，和图4A以及4B所示。在另一个实施方案中，蛋白生物标志物可以是1、2、3、4、5、6或更多种生物标志物，其选自以：A2N0U6、A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA、Q96TB4、A0A075B6I4、Q5NV82、E3UVQ2、E9PQG4、L0R6N9、VTNC、C1RL、MBL2、B2R815、D6MJD1、ZA2G、A0A024R9I2、TPC11、CO5、A0A024R3Z1、A8K008、B2R4C5、B4E1D8、GP112和A0A075B6H9。或者，一个组合可以包括不超过选自该组的6、5、4、3或2个生物标志物。
在本文描述的方法中可用的蛋白生物标志物包括生物标志物的组合。生物标志物的组合可以包括来自选自图3的组合1-29的组合的蛋白。也就是说，组合可以包括来自选自图3的组合1-29的组合的生物标志物以及其他生物标志物。在另一个实施方案中，生物标志物组合可以由选自图3的组合1-29的生物标志物的组合组成。就是说，所述组合仅包括指定组合中已鉴定的生物标志物。
其他生物标志物的组合包括包含蛋白生物标志物的组合，所述蛋白生物标志物来自选自图4A-4B的组合1-56的组合。在另一个实施方案中，所述组合由选自图4A-4B的组合1-56的组合中的蛋白生物标志物组成。
在其他实施方案中，所述生物标志物包含一组生物标志物，其包括选自A2N0U6、A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA和Q96TB4的5、4、3或2个生物标志物。
在其他实施方案中，所述生物标志物包含一组生物标志物，其包括A2N0U6以及A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA和Q96TB4的至少1、2、3、或4个。
3.数据管护后鉴定的生物标志物
在先前的机器学习操作中鉴定出的生物标志物是针对STRING蛋白数据库进行数据管护的。移除了未包括在STRING数据库中或鉴定为与数据库中其他蛋白相互作用少于四个的蛋白。其余蛋白具有已知的生物学功能。与其余蛋白有关的数据是供机器学习的对象。鉴定出最佳性能的蛋白生物标志物，并如表5和表6所示。包括这些蛋白生物标志物的最佳性能的组合如图5所示。
因此，在另一个实施方案中，用于确定先兆子痫风险的蛋白生物标志物可以是1、2、3、4、5、6个或更多个生物标志物，其选自GP1BA、VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2、APOH、JPH1、CO5、HEP2、TPC11、MBL2、AACT、DYH3、TSP1、CAPS1、APOD和LCAT。或者，组合可以包括不超过选自该组的6、5、4、3或2个生物标志物。
生物标志物的组合可以包括来自选自图5的组合1-24的组合的蛋白。在另一个实施方案中，所述组合由选自图5的组合1-24的组合的蛋白生物标志物组成。
在其他实施方案中，所述生物标志物包含一组生物标志物，其包括选自GP1BA、VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2和APOH的6、5、4、3或2个生物标志物。
在其他实施方案中，所述生物标志物包含一组生物标志物，其包括GP1BA，和VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2和APOH中的至少1、2、3、4或5个。
4.检测方法
可以通过本领域已知的任何方法来检测和定量生物标志物。这包括但不限于免疫测定、色谱法、质谱法、电泳和表面等离子体共振。
生物标志物的检测包括完整蛋白的检测，或蛋白的替代物，诸如片段的检测。
免疫测定方法包括例如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心式测定(Sandwich assay)和免疫印迹(Western blot)、免疫沉淀、免疫组化、免疫荧光、抗体微阵列、斑点印迹和FACS。
色谱方法包括，例如亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱/凝胶过滤色谱法、疏水相互作用色谱法和反相色谱法，包括例如HPLC。
5.质谱法
在一些实施方案中，使用基于液相色谱/质谱法(LCMS)的蛋白质组学分析来实现检测微粒相关蛋白的水平(例如，包括检测其存在)。在示例性的实施方案中，所述方法涉及对样品进行尺寸排阻色谱法并收集高分子量级分(例如，通过尺寸排阻色谱法)以获得微粒富集的样品。然后破坏所述微粒富集的样品(使用例如离液剂、变性剂、还原剂和/或烷基化剂)，并且使释放的内容物进行蛋白水解。之后，在通过质谱进行肽分析之前，使用本文所述的串联柱系统处理包含多种肽的经破坏的外泌体制剂，以提供样品的蛋白组学概况，。本文公开的方法避免与先前方法相关的蛋白浓缩/纯化、缓冲液交换和液相色谱步骤的必要性。
样品中的蛋白可以通过质谱检测。质谱仪通常包括用于离子化分析物的离子源，以及一个或多个用于确定质量的质量分析仪。质量分析仪可以与串联质谱仪一起使用。离子化的方法尤其包括电喷雾或激光解吸法。质量分析仪包括四极、离子阱、飞行时间仪器以及扇形磁场或电场仪器(magnetic or electric sector instrument)。在某些实施方案中，所述质谱仪是串联质谱仪(例如，“MS-MS”)，其使用第一质量分析仪来选择一定质量的离子，并使用第二质量分析仪来分析所选择的离子。串联质谱仪的一个示例是三重四极杆仪器，第一和第三四极作为质量过滤器，中间四极作为碰撞池。质谱也可以与上游分离技术，例如液相色谱法或气相色谱法，联用。因此，例如，液相色谱法与串联质谱联用可以称为“LC-MS-MS”。
可用于本文所述分析的质谱仪包括但不限于，来自ThermoFisher Scientific的AltisTM四极，QuantisTM四极，QuantivaTM或FortisTM三重四极杆，以及来自Perkin Elmer的QSightTM三重四极杆LC/MS/MS。
通常，能够提供有关肽质量的精确信息的任何质谱技术，优选地，还可以提供有关所选肽的片段化和/或(部分)氨基酸序列的精确信息的质谱技术(例如，在串联质谱中，MS/MS；或在源后衰变(post source decay)中，TOF MS)，可以用于本文公开的方法和组合物。合适的肽MS和MS/MS技术及系统在本领域中是已知的(参见，例如，由Chapman编辑的Methods in Molecular Biology,146卷:“Mass Spectrometry of Proteins andPeptides”,Humana Press 2000；Kassel&Biemann(1990)Anal.Chem.62:1691-1695；Methods Enzymol 193：455-79；或由Burlingame编辑的Methods in Enzymology，402卷：“Biological Mass Spectrometry”，Academic Press 2005)，且可以用于实施本文公开的方法。因此，在一些实施方案中，所公开的方法包括进行定量MS以测量一个或多个肽。这样的定量方法可以以自动化(Villanueva等人，Nature Protocols(2006)1(2)：880-891)或半自动化的形式进行。在特定的实施方案中，MS可以可操作地连接于液相色谱装置(LC-MS/MS或LC-MS)或气相色谱装置(GC-MS或GC-MS/MS)。
选择的反应监测是一种质谱方法，其中第一质谱仪选择感兴趣的多肽(前体)，碰撞细胞将多肽片段化为产物片段，然后在第二质谱仪中检测一个或多个片段。前体离子和产物离子对被称为SRM“转换”。所述方法通常在三重四极杆仪器中进行。分析多肽的多个片段时，所述方法称为多重反应监测质谱法(“MRM-MS”)。
通常，蛋白样品用蛋白水解酶(诸如胰蛋白酶)消化以产生肽片段。将这些肽的某些的重同位素标记的类似物合成为标准品。这些标准品称为稳定同位素标准品或“SIS”。SIS肽与蛋白酶处理的样品混合。将该混合物进行三重四极杆质谱法。在时域或质量域中，高精度检测对应于SIS标准品子离子的肽和目标肽。通常，使用多个子离子来明确鉴定亲本离子的存在，并且使用子离子中的一个，通常为最丰富的子离子，进行定量。SIS肽可以按订单合成，或者可以为可从供应商诸如，例如，如ThermoFisher(Waltham，MA)或Biognosys(Zurich,Switzerland)，获得的商业试剂盒。
如本文所用，术语“多重反应监测(MRM)”或“选择的反应监测(SRM)”指的是基于MS的定量方法，所述方法尤其可用于定量低丰度的分析物。在SRM实验中，通过三重四极杆仪器的两个质量过滤器选择预定义的前体离子及其一个或多个片段，并随时间监控精确定量。可以在同一实验中在色谱时间标度上通过在不同的前体/片段对之间快速切换测量多个SRM前体和片段离子对以执行MRM实验。一系列转换(前体/片段离子对)，结合靶向的分析物(例如肽或小分子，诸如化学实体、类固醇、激素)的保留时间，可以构成确定的测定。在单个LC-MS实验中可以定量大量分析物。对于MRM或SRM，术语“预定的(scheduled)”或“动态的”是指测定的一种变化，其中特定分析物的转换仅在预期保留时间附近的时间窗口内获取，大大增加了可在单个LC-MS实验中检测和定量的分析物的数量，并有助于测试的选择性，因为保留时间是一种取决于分析物的物理性质的特性。单个分析物也可以用一个以上的转换进行监控。最后，该测定可以包括对应于感兴趣的分析物的标准品(例如，具有与分析物肽相同氨基酸序列的肽)，但不同在于包括稳定同位素。可以将稳定同位素标准品(SIS)以精确水平掺入测定中，并用于定量相应的未知分析物。额外的特异性水平是由未知分析物及其对应的SIS的共洗脱以及它们的转换特性(例如，分析物的两个转换的水平的比与其对应的SIS的两个转换的比的相似性)贡献的。
因此，通过MRM-MS的蛋白靶标检测涉及蛋白的一个或多个肽片段的检测，通常通过检测将太片段与之比较的稳定同位素标准品肽。通常，SIS本身会在碰撞池中破碎为原始消化的片段，而这些片段中的一个或多个通过质谱仪检测。
适用于生物标志物肽分析的质谱测定、仪器和系统可包括但不限于基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)MS；MALDI-TOF后源衰变(PSD)；MALDI-TOF/TOF；表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)MS；电喷雾电离质谱(ESI-MS)；ESI-MS/MS；ESI-MS/(MS)n(n是大于零的整数)；ESI 3D或线性(2D)离子阱MS；ESI三重四极杆MS；ESI四极正交TOF(Q-TOF)；ESI傅里叶变换MS系统；硅上的解吸/电离(DIOS)；二次离子质谱(SIMS)；大气压化学电离质谱(APCI-MS)；APCI-MS/MS；APCI-(MS)n；离子迁移谱(IMS)；电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)大气压光电离质谱法(APPI-MS)；APPI-MS/MS；和APPI-(MS)n。串联MS(MS/MS)排列中的肽离子片段化可使用本领域已知的技术，诸如碰撞诱导解离(CID)，实现。如本文所述，通过质谱法检测和定量生物标志物可以涉及多重反应监测(MRM)，尤其诸如Kuhn等，(2004)Proteomics 4:1175-1186所述的。LC-MS/MS分析期间预定的多重反应监测(预定的MRM)模式采集提高肽定量的灵敏性和准确性。Anderson和Hunter(2006)(2006)Mol.Cell.Proteomics 5(4):573-588。基于质谱的测定可以有利于与上游肽或蛋白分离或片段化方法组合，诸如与本文所述的串联柱系统组合。
V.评估先兆子痫风险的方法
本文所用的短语“先兆子痫风险增加”表明怀孕受试者比处于相同怀孕阶段的一般受试者群体具有更大的发展先兆子痫的可能性，任选地与共享一个或多个人口统计学或风险因素的人群相比。这些可以包括例如年龄、先前怀孕的状态/结果、高血压、尿中有蛋白、种族/种族性、病史、先前怀孕史，吸烟/用药史，等。例如，测试可表明，怀孕10-12周的妇女比怀孕10-12周的普通或对照群体的妇女具有发展先兆子痫的更高风险。
本文提供了评估先兆子痫风险的方法，例如，将怀孕的人类女性分类为先兆子痫风险增加的方法。所述方法可以涉及确定表1中一个或多个生物标志物的定量测定值，并使该测量值与先兆子痫风险相关联。例如，在确定中可以使用2、3、4、5、6或更多，或者不超过2、3、4、5、6个生物标志物。通常，上调的生物标志物的相对增加量或下调的生物标志物的相对减少量的测定值与先兆子痫的风险增加相关。或者，确定基于分类算法，其可以采用非线性和/或超维方法。
在某些实施方案中，生物标志物用于区分PE亚群，诸如(i)PE，较晚/较轻形式，和(ii)PE/高血压，早期/严重形式。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括进行子宫动脉多普勒超声或测量母亲血压。
基于至少包括对本公开的至少一种生物标志物的定量测定值的信息，评估先兆子痫风险的方法可涉及将受试者分类为先兆子痫风险增加。
分类可以采用通过统计分析和/或机器学习确定的分类算法或模型。
B.数据分析
通常，分析涉及足够大量的样品的统计分析以提供统计上有意义的结果。为此目的，可以使用本领域已知的任何统计方法。此类方法或工具包括但不限于相关、Pearson相关、Spearman相关、卡方、均值比较(例如，配对T检验、独立T检验、ANOVA)回归分析(例如，简单回归、多元回归、线性回归、非线性回归、逻辑回归、多项式回归、逐步回归、岭回归、套索回归、弹性网回归)或非参数分析(例如，Wilcoxon秩和检验、Wilcoxon符号秩检验、符号检验)。此类工具包括在可商购的统计软件包中，诸如MATLAB、JMP统计软件和SAS。这样的方法产生了模型或分类器，可以用来将特定的生物标志物概况分类为特定的状态。
统计分析可以由操作员实施或通过机器学习实施。
C.机器学习
许多类型的分类算法都适用于此目的，包括线性和非线性模型，例如，诸如CART-分类和回归树的过程；人工神经网络(诸如反向传播网络)；判别分析(例如贝叶斯分类器或Fischer分析)，逻辑分类器和支持向量分类器(例如，支持向量机)。某些分类器(诸如截断值)可以通过人工检查来执行。其他分类器(诸如多元分类器)可要求计算机执行分类算法。
分类算法(也称为模型)可以通过数学分析生成，包括通过机器学习算法生成，该算法进行分类为一个或另一个组的受试者来源的生物标志物测定值的数据集的分析。许多机器学习算法在本领域中是已知的，包括生成上述分类算法类型的那些算法。
诊断测试的特征在于灵敏性(分类为阳性的百分比，所述阳性为真阳性)和特异性(分类为阴性的百分比，所述阴性为真阴性)。诊断测试的相对灵敏性和特异性可涉及权衡–较高的灵敏性可能意味着较低的特异性，而较高的特异性可能意味着较低的灵敏性。这些相对值可以显示在接受者操作特征(ROC)曲线上。通过ROC曲线的曲线下面积(AUC)反映了变量(诸如生物标志物)集的诊断能力。
在一些实施方案中，本公开的分类器具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的灵敏性。本公开的分类器的AUC为至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9或至少0.95。
分类可以基于生物标志物的测量值，其高于或低于选定的截断水平。在某些实施方案中，通过测量多个阳性和阴性参考样品，例如每种类型的至少10、20、50、100或200个样品中的生物标志物水平来获得截断值。相对于中心趋势的测定值(例如阴性样品中的均值、中位数或众数)，可以建立一个截断值。偏离该中心趋势的测定值的测量可以用于设定截断值。例如，可以基于方差或标准偏差来设置截断值。例如，截断值可以基于Z分数，即，高于正常样品的平均值的多个标准偏差，例如一个标准偏差、两个标准偏差、三个标准偏差或四个标准偏差。例如，可以选择截断值以使诊断测试具有至少80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的灵敏性、特异性和/或阳性预测值。
从数字上讲，增加的风险与超过1.0的优势比相关，对于先兆子痫，优选地超过1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
在其他实施方案中，本文进一步提供了早产的生物标志物的测量，以及它们用于预测早产风险的用途，所述早产的生物标志物来自与用于测量先兆子痫生物标志物相同的微粒富集的级分。用于早产的生物标志物描述于例如美国出版物2015-0355188(“Biomarkers for preterm birth”)和国际申请WO2017/096405(“Use of circulatingmicroparticles to stratify risk of preterm birth”)。
VI.治疗处于先兆子痫风险的受试者的方法
治疗患有先兆子痫或处于增加的先兆子痫风险的怀孕受试者的方法包括施用可用于治疗先兆子痫的治疗性干预措施。这包括，例如，施用用于治疗血压升高的药物，施用诸如阿司匹林(如，低剂量阿司匹林，如，80mg)的药物，施用他汀类药物并加强先兆子痫症状的监测。它还包括施用补体激活的靶向抑制剂。
VII.试剂盒
在另一个实施方案中，本文提供了试剂盒，其可用于检测样品中先兆子痫风险增加的生物标志物。能够检测蛋白生物标志物的试剂包括但不限于抗体。能够检测蛋白生物标志物的抗体通常也直接或间接连接至分子，诸如荧光团或酶，其可以催化可检测的反应以指示试剂与其各自靶标的结合。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含样品处理材料，该样品处理材料包含小体积(例如，1ml、3ml、5ml、10ml)垂直柱中的高分子量凝胶过滤组合物(例如，诸如SEPHAROSE的琼脂糖)，用于从血浆快速制备微粒富集的样品。比如，可以在护理时制备微粒富集的样品，然后冷冻并将其运送到分析实验室进行进一步处理。
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于评估先兆子痫风险的说明书。如本文所用，术语“说明书”是指使用试剂盒中包含的试剂以检测来自受试者的样品中感兴趣的蛋白的存在(包括确定表达水平)的指导。感兴趣的蛋白可包括先兆子痫的一个或多个生物标志物。在一些实施方案中，说明书进一步包括美国食品药物管理局(FDA)在标记体外诊断产品中要求的预期用途的声明。FDA将体外诊断分类为医疗装置，并要求其通过510(k)程序进行批准。根据510(k)的申请要求的信息包括：1)体外诊断产品的名称，包括商品名称或专有名称，通用或惯用名称以及设备的分类名称；2)产品的预期用途；3)提交510(k)提案的所有者或运营商的机构注册号(如果适用)；根据FD&C法案513条(section)所述体外诊断产品的类别，如果知道，其适当的组合，或者，如果所有者或操作者决定该设备不根据该条进行分类，则说明该决定以及决定所述体外诊断产品不如此分类的依据；4)建议的标签、标记和广告，其足以描述体外诊断产品、其预期用途和使用说明，包括照片或工程图(如适用)；5)声明，表明该装置与美国商业流通中可比类型的其他体外诊断产品相似和/或不同，并附上支持该声明的数据；6)实质等效确定依据的安全性和有效性数据的510(k)摘要；或会在书面请求30天内向任何人提供支持FDA发现实质等效的510(k)安全性和有效性信息的声明；7)声明提交者认为，据其所知，在上市前通知中提交的所有数据和信息都是真实准确的，没有遗漏重要事实；8)对FDA进行实质等效确定必要的，任何经要求的有关体外诊断产品的附加信息。
在另一个实施方案中，试剂盒包括含有对应于肽生物标志物的一个或多个稳定同位素标准品(SIS)肽的容器，所述稳定同位素标准品(SIS)肽是例如由蛋白酶(例如，胰蛋白酶)消化生物标志物蛋白产生的肽。在另一个实施方案中，大多数或全部SIS肽对应于生物标志物肽。在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括SIS肽对应的生物标志物肽。
VIII.系统
本文还提供了包括计算机的系统，该计算机包括处理器和存储器。可以配置所述计算机以将从样品测得的本文提供的一个或多个生物标志物的定量测定值接收入存储器中。所述存储器可以包括计算机可读指令，在执行时，将样品分类为处于先兆子痫风险或不处于先兆子痫风险。所述计算机系统可以借助于通信接口可操作地结合到计算机网络。所述网络可以是因特网，因特网和/或外联网，或与因特网通信的内联网和/或外联网。所述网络在一些情况下是电信和/或数据网络。所述网络可以包括一个或多个计算机服务器，其可以启用分布式计算，例如云计算。所述系统可以包括通过通信网络，诸如高速传输网络，包括但不限于数字用户线(DSL)、电缆调制解调器、光纤、无线、卫星和宽带电力线(BPL)，与第二计算机连接的第一计算机。因此，提供将样品分类为先兆子痫风险增加或无先兆子痫风险增加的结果可以从传输计算机发送到远程接收计算机，诸如位于医疗保健提供者办公室的电脑，或到移动设备，诸如智能手机。
实施例
缩写：AUC(曲线下面积)；CI(置信区间)；CMP(循环微粒)；FDR(错误发现率)；LC(液相色谱法)；LMP(末次月经期)；MRM(多重反应监测)；MS(质谱法)；ROC(接受者操作特征)；SEC(尺寸排阻色谱法)。
简介：先兆子痫(PE)病理生理的典型观点一直是首三月的滋养层侵袭/功能的异常。这项研究表明，循环微粒(CMP)蛋白独特的模式可以在这个孕龄阶段辨别出患PE的女性；这些模式会与孕妇全身和子宫胎盘水平的独特和早期功能障碍相关联。
目的：循环微粒(CMP)是大多数类型的细胞分泌的纳米级脂质双层颗粒，并且日益被人们视为细胞通讯和行为的强大调节者。先前的工作将循环CMP浓度的增加与诊断为先兆子痫的女性相关联。由于先兆子痫的特征在于在首三月结束时，异常的滋养层与母亲子宫和系统生理之间的相互作用，与血液中的循环蛋白相比，与CMP相关的蛋白的分析有望带来更多信息；因此，CMP在先兆子痫的临床表现之前很早就可以进行分析。预期在受孕12周的中位数抽样的CMP相关蛋白的模式，对比没有妊娠并发症的那些妇女，在继续发展先兆子痫的妇女中不同。
设计：进行单胎妊娠的匹配病例对照研究。为了最大程度地降低确认偏倚和潜在的批处理效应，样品随机选择自预先采集并储存的(-80℃)正在进行的出生队列中的EDTA血浆样品。
实施例1：受孕10-12周获得的样品中循环外泌体/微粒生物标志物的分离
本实施例描述了对使用血液(例如血浆和/或血清)样品的PE患者的回顾性研究。这项研究是从冷冻母亲血浆样品中检测到的蛋白组生物标志物的巢式的、病例对照的回顾性分析。所有样品均按照IRB批准的方案收集，并且所有患者均已同意用于研究目的。样品收集的入组标准包括在以下两个时间点单胎受孕的正常、健康、无症状妇女的捐赠：受孕10周(±2周)和受孕24周(±2周)。将储存在储存库中的总共150份身份不明的设盲样品(两个时间点75名受试者，25名受试者在本次怀孕中经历了PE，50名正常、健康的怀孕受试者作为对照)在干冰上过夜运输到分析实验室，并在-80℃储存。
方法：对于PE<35周，在10-12周获取的预期收集的血浆样品的25例单胎妊娠的产科结果由医师评审员进行验证。这些与50例无并发症的单胎足月分娩匹配。抽样时(+/-2周)对照与胎龄相匹配。来自这些样本的CMP通过尺寸排阻色谱法分离，并使用基于HRAM质谱的整体蛋白组进行分析。在鉴定和定量肽和蛋白后，将所得的AUC比率用于确定病例与对照之间的差异表达。对鉴定出的蛋白进行蛋白复合物扩增，以鉴定有意义的通路/相互作用。生物学相关性使用基因本体论(GO)术语检查。
样品制备。将具有缓冲液和工作流的尺寸排阻色谱法用于优化样品制备以及与质谱仪分析的兼容性。备选的样品制备方法可联合针对其他分析方法优化的缓冲液/工作流修改；或联合新富集措施，其旨在亚选择(sub-select)源自不同组织和器官的外泌体(即胎盘来源的外泌体或血管内皮来源的外泌体)。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)富集微粒，并用水(无RNAse、无DNAse、蒸馏水)等度洗脱。简而言之，PD-10柱子(GE Healthcare Life Sciences)中装有10mL来自ABT(迈阿密，佛罗里达州(Miami,FL))的2％琼脂糖珠标准品(孔径50-150μm)，洗涤并在4℃储存至少24小时，且在使用前不超过3天。在使用当天，再次洗涤柱子，并将1mL融化的纯净血浆样品施加到柱子。即，在SEC之前，血浆样品没有被过滤、稀释或处理。
将循环微粒捕获在柱子的空隙容积中，部分地从高丰度的蛋白峰中分离出来。来自各个临床样本的汇集的CMP柱级分中的一等分(包含200μg的总蛋白(由BCA确定))用于进一步分析。
更具体地说，通过尺寸排阻色谱法分离出CMP。使用基于HRAM质谱法(“高分辨率，精确质量质谱”)的整体蛋白组分析来分析数据。用胰蛋白酶消化外泌体蛋白，然后使用由ThermoFisher Scientific制造的Orbitrap FusionTM LumosTM TribridTM质谱仪进行分析。这种高质量分辨率系统对于分析诸如来自外泌体的复杂混合物尤其有用。当尝试在肽和其他分子的高度复杂背景中检测低浓度的肽时，此方法有用。
实施例2：患先兆子痫的怀孕在受孕10-12周循环外泌体/微粒中蛋白的差异表达
该实施例表明，在胎龄10-12周时，独特模式的循环微粒(CMP)蛋白区分出患PE的妇女；这些模式与母亲全身和子宫胎盘水平的独特和早期功能障碍有关。
结果：病例和对照组的平均年龄没有差异(32对比31；p＝0.50)，非白人百分比(44对比54；p＝0.38)，未经产的百分比(24对比28；p＝0.79)，但是慢性高血压的百分比(12对比0；p＝0.01)和既往PE的百分比(28对比6；p＝0.01)不同。非靶向的分析鉴定了>600种独特蛋白存在于10-12周的两个样品集。FDR为0.1时，病例对比对照，有51种蛋白展现出差异表达。
表1列出了先兆子痫的生物标志物。
表1
Figure BDA0002701464640000231
Figure BDA0002701464640000241
Figure BDA0002701464640000251
Figure BDA0002701464640000261
Figure BDA0002701464640000271
Figure BDA0002701464640000281
Figure BDA0002701464640000291
Figure BDA0002701464640000301
相关的生物学功能记载于表2。
表2：与受孕10-12周中差异表达的循环外泌体/微粒相关的生物学功能。
Figure BDA0002701464640000302
Figure BDA0002701464640000311
讨论：这研究鉴定了10至12周时CMP相关蛋白生物标志物的候选集，其在继续出现PE的怀孕中展示出差异表达。已知的蛋白功能表明涉及多种新过程的生物学合理性。
鉴定出的蛋白生物标志物可涉及关键的生理和发育过程，诸如与凝血、免疫调节和补体系统或局部组织和细胞过程(诸如细胞死亡/分化、形态发生)相关的互相关联的、系统生物学网络。可以鉴定出迄今为止未知的过程，或这些过程之间的关系，其已知或未知与先兆子痫有关。这些必需过程的运行可能部分地由多种细胞和组织之间的CMP相互作用介导。这种方法的潜在生物学和临床意义在于先兆子痫和可能的其他产科综合症和病状中蛋白失调的无创检测和监测。此外，源自蛋白生物标志物定量水平的分类器模型(基于微粒的测试)可用于对PE的风险进行分级，并通过各种干预措施(包括治疗性措施)治疗处于风险的组。
实施例3：先兆子痫风险的生物标志物和生物标志物组合。
创建了用于监督的CMP相关蛋白分类的管线。已识别的肽和蛋白的列表提交给了STRING数据库以进行已知蛋白的相互作用。string-db.org/。保留了具有大于5种有记载的相互作用的那些蛋白。使用区组随机化将数据分为训练集和测试集。在训练集中，使用整体特征选择来创建提供最大量信息的单个蛋白的子集，与对照组相比，这些子集与先兆子痫显著且一致地相关。然后使用逻辑回归模型进行5倍交叉验证，以检查从该子集中得出的所有可能的多元模型的信息内容。然后针对测试集运行最佳性能的交叉验证候选模型，以建立独立数据的性能。参考UniProt数据库确定蛋白功能。
用于生成预测模型的机器学习方法涉及“集成特征选择”、“逻辑回归”和“置换分析”几个方面。
最佳候选CMP相关蛋白的分子功能与多种重要的基于细胞和血液的生物学功能有关，包括凝血和血小板活化、细胞粘附(细胞与细胞及细胞与基质)、迁移和趋化性、细胞增殖、细胞分化和形态发生、血管生成、脂肪细胞脂质代谢、脂蛋白代谢、脂蛋白脂肪酶活性、胆固醇生物合成、亚细胞结构的细胞内组织(特别是对于肌浆网和内质网)、钙释放和信号传导、补体激活和膜攻击复合物组装、先天免疫反应、肽链内切酶抑制、基于微管的纤毛运动和精子能动性、ER应激，以及神经递质和神经肽胞吐作用。
图1示出了用于鉴定先兆子痫风险的生物标志物和生物标志物组合的示意性工作流程。该工作流程包括以下操作：提供研究的样品。在本例中，从75个原始样品中选择了73个进行研究，其中23个来自先兆子痫受试者，50个是对照组。将样品分为58个样品的训练集和15个样品的测试集。
初始机器学习分析
确定了训练集中各个样品中蛋白的定量测定值。通过机器学习对这些测定值进行分析，以开发模型预测先兆子痫风险。选择包括3至5个蛋白生物标志物组合的最高性能模型。使用五重交叉验证。性能是曲线下面积(AUC)的函数。图3显示了来自第一轮内部测试的最佳性能模型。在任意的多种公开可用的蛋白数据库诸如，例如SwissProt中，通过蛋白名称、基因名称或登录号鉴别蛋白。
表3列出了这些蛋白的某些的进一步鉴定信息。
表3
Figure BDA0002701464640000321
Figure BDA0002701464640000331
Figure BDA0002701464640000341
Figure BDA0002701464640000351
Figure BDA0002701464640000361
然后针对来自测试样品集的数据验证所得模型。来自该验证步骤的最佳性能模型示于图4A和图4B中。
在下表4中示出了此验证步骤中最高性能模型中蛋白出现的频率。
表4
Figure BDA0002701464640000362
Figure BDA0002701464640000371
接下来，将先前模型建立步骤中识别出的蛋白与STRING蛋白数据库进行比较。string-db.org/。选择(i)存在于该数据库中并且(ii)与数据库中的至少四种蛋白连接成网络的蛋白，以进一步研究。(图1–“移除STRING数据库中没有注释且在网络中>4条边缘的蛋白/肽。)
生成使用所选蛋白的新的模型，并选择如通过曲线下面积测量的具有最高性能的生物标志物组合。这些模型显示于图5中。(组合1-24。)
下表5提供了先兆子痫的蛋白生物标志物以及这些生物标志物在通过机器学习生成的生物标志物组合中出现的频率。
表5
蛋白 频率
1 GP1BA 79
2 VTNC 57
3 C1RL 49
4 ZA2G 46
5 APOC2 37
6 APOH 30
7 JPH1 28
8 CO5 16
9 HEP2 16
10 TPC11 14
11 MBL2 11
12 AACT 8
13 DYH3 7
14 TSP1 7
15 CAPS1 6
16 APOD 3
17 LCAT 1
下表6提供了表5中列出的有关蛋白生物标志物的信息。
表6
Figure BDA0002701464640000381
Figure BDA0002701464640000391
Figure BDA0002701464640000401
如本文所用，除非另有说明，以下含义适用。“可以”一词的使用是宽松意义的(即意味着有潜能)，而不是强制意义的(即必须)。词语“包括(include)”，“包括(including)”和“包括(includes)”等表示包括但不限于。单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数的指示物。因此，例如，提及“一个元件”包括两个或更多个元件的组合，尽管对于一个或更多个元件也使用其他术语和短语，诸如“一个或更多个”。除非另有说明，否则术语“或”是非排他性的，即，涵盖“和”和“或”。修饰词和序列之间的术语“任何”是指修饰词修饰序列的各个成员。因此，例如，短语“至少1、2或3中的任何一个”是指“至少1，至少2或至少3个”。术语“基本上由……组成”是指包括列举的元件以及不实质上影响要求保护的组合的基本和新颖特征的其他元件。
应当理解，说明书和附图并非旨在将本发明限制为所公开的特定形式，相反，其意图是覆盖落入由所附权利要求定义的本发明的精神和范围内的所有修改、等同物、及替代物。鉴于该描述，本发明的多个方面的进一步修改和替代实施方案对于本领域技术人员会是显而易见的。因此，该描述和附图仅应被解释为示例说明性的，并且目的是向本领域技术人员教导实施本发明的一般方式。应当理解，本文示出和描述的本发明的形式将被视为实施方案的实例。元件和材料可以代替本文示例说明和描述的元件和材料，部件和过程可以颠倒或省略，并且本发明的某些特征可以独立地利用，在受益于本发明的描述之后，所有这些对本领域技术人员而言都是显而易见的。在不脱离如随后的权利要求中所描述的本发明的精神和范围的情况下，可以对本文所描述的元件做出改变。本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用来限制本说明书的范围。

Claims (62)

1.一种评估怀孕受试者中先兆子痫风险的方法，所述方法包括：
(a)从来自所述怀孕受试者的血液样品中制备微粒富集的级分；
(b)确定所述级分中一个或多个微粒相关蛋白生物标志物的定量测定值，其中所述一个或多个蛋白生物标志物选自：
(i)表1的蛋白生物标志物；
(ii)一种蛋白生物标志物的集合：A2N0U6、A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA、Q96TB4、A0A075B6I4、Q5NV82、E3UVQ2、E9PQG4、L0R6N9、VTNC、C1RL、MBL2、B2R815、D6MJD1、ZA2G、A0A024R9I2、TPC11、CO5、A0A024R3Z1、A8K008、B2R4C5、B4E1D8、GP112、A0A075B6H9；和
(iii)一种蛋白生物标志物的集合：GP1BA、VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2、APOH、JPH1、CO5、HEP2、TPC11、MBL2、AACT、DYH3、TSP1、CAPS1、APOD、LCAT；和
(c)根据所述测量评估先兆子痫风险。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，上调的生物标志物的量增加或下调的生物标志物的量减少表明先兆子痫风险增加。
3.根据权利要求1所述的方法，其包括确定选自表1的蛋白生物标志物的多个蛋白生物标志物的定量测定值。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个蛋白生物标志物选自表1：组1、组2或组3。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个蛋白生物标志物选自多种生物功能中的每一个，所述多种生物功能选自免疫功能、细胞信号传导、血管生成、细胞凋亡、基质附着、细胞功能、蛋白代谢、离子转运和未知功能。
6.根据权利要求1所述的方法，其包括确定严重先兆子痫风险，其中一个或多个生物标志物选自：0A075B6I5_HUMAN、A2MYD2_HUMAN、AL2SA_HUMAN、AR13B_HUMAN、B3AT_HUMAN、BAI1_HUMAN、BRWD3_HUMAN、C6K6H8_HUMAN、CI040_HUMAN、CPLX1_HUMAN、CPLX2_HUMAN、E5RG74_HUMAN、E9PNW5_HUMAN、HV301_HUMAN、I6Y0B1_HUMAN、J3KPJ3_HUMAN、LAC7_HUMAN、LIPA2_HUMAN、LV104_HUMAN、LV109_HUMAN、Q68D13_HUMAN、Q9UL88_HUMAN、SCRIB_HUMAN及TTC37_HUMAN。
7.根据权利要求1所述的方法，其包括确定多个蛋白生物标志物的定量测定值，所述蛋白标志物选自：A2N0U6、A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA、Q96TB4、A0A075B6I4、Q5NV82、E3UVQ2、E9PQG4、L0R6N9、VTNC、C1RL、MBL2、B2R815、D6MJD1、ZA2G、A0A024R9I2、TPC11、CO5、A0A024R3Z1、A8K008、B2R4C5、B4E1D8、GP112、和A0A075B6H9。
8.根据权利要求1所述的方法，其包括确定多个蛋白生物标志物的定量测定值，所述蛋白标志物选自：GP1BA、VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2、APOH、JPH1、CO5、HEP2、TPC11、MBL2、AACT、DYH3、TSP1、CAPS1、APOD、和LCAT。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物包括选自组合1-29(图3)、组合1-56(图4A-4B)和组合1-24(图5)的一组生物标志物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合包括不超过任意10、9、8、7、6、5、4或3个蛋白生物标志物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物由选自组合1-29(图3)、组合1-56(图4A-4B)和组合1-24(图5)的一组生物标志物组组成。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物包括一组生物标志物，其包括5、4、3或2个选自以下的生物标志物：A2N0U6、A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA和Q96TB4。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物包括一组生物标志物，其包括A2N0U6，以及A0A024R8D8、B2R6L0、GP1BA和Q96TB4的至少1、2、3或4个。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物包括一组生物标志物，其包括选自GP1BA、VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2和APOH的6、5、4、3或2个生物标志物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物包括一组生物标志物，其包括GP1BA，以及VTNC、C1RL、ZA2G、APOC2和APOH的至少1、2、3、4或5个。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品采自怀孕首三月或中三月期间的怀孕受试者。
17.根据权利要求7所述的方法，其中所述样品采自受孕10-12周期间的怀孕受试者。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述怀孕受试者为初孕妇、经产孕妇、初产的或多产的。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述怀孕受试者具有单胎怀孕或多胎怀孕。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述怀孕受试者的先兆子痫是无症状的，例如，不是高血压或没有蛋白尿。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述怀孕受试者没有先兆子痫病史。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述怀孕受试者没有先兆子痫的风险因素。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述怀孕受试者患有慢性高血压。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血液样品是血浆或血清。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微粒富集的级分使用尺寸排阻色谱法制备。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述尺寸排阻色谱法包括用水洗脱。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述尺寸排阻色谱法使用琼脂糖固相和含水液相进行。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述制备步骤进一步包括使用超滤或反相色谱法。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述制备步骤进一步包括在尺寸排阻色谱法之后使用尿素变性、使用二硫苏糖醇还原、使用碘乙酰胺烷基化以及使用胰蛋白酶消化。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述微粒经进一步纯化以富集胎盘来源的外泌体或血管内皮来源的外泌体。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，确定定量测定值包括质谱法。
32.根据权利要求31所述的方法，其中确定定量测定值包括液相色谱/质谱法(LC/MS)。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述质谱法包括液相色谱/三重四极杆质谱法。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述质谱法包括多重反应监测。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述质谱法包括多重反应监测，并且所述液相色谱法是使用包含乙腈的溶剂完成的，和/或确定包括为所述蛋白生物标志物分配指数化的保留时间。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述质谱法包括多重反应监测，并且所述方法包括在引入质谱仪之前向所述样品添加一个或多个稳定同位素标准品肽，并且检测包括检测由质谱仪的碰撞池所产生的稳定同位素肽标准品的一个或多个子离子。
37.根据权利要求31所述的方法，其中确定所述定量测定值包括确定所述蛋白生物标志物的替代肽的定量测定值。
38.根据权利要求36所述的方法，其中质谱法包括定量对应于所述替代肽的每个的一个或多个稳定同位素标记的标准品肽(SIS肽)。
39.根据权利要求31所述的方法，其包括将对应于所述蛋白生物标志物的一个或多个稳定重同位素取代的标准品添加至微粒富集的级分。
40.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中确定定量测定值包括使所述样品与一个或多个捕获试剂接触，每种捕获试剂特异性结合蛋白生物标志物中的一种，并检测所述蛋白生物标志物中所述捕获试剂之间的结合。
41.根据权利要求39所述的方法，其包括进行免疫测定。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述免疫测定选自下组：酶免疫测定(EIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述评估包括执行分类规则，所述规则将处于先兆子痫风险的所述受试者分类，并且其中，所述分类规则的执行产生先兆子痫或足月生产间的相关性，p值小于至少0.05。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述评估包括执行分类规则，所述规则将处于先兆子痫风险的所述受试者分类，并且其中所述分类规则的执行产生接受者操作特征(ROC)曲线，其中所述ROC曲线曲线下面积(AUC)为至少0.6、至少0.7、至少0.8或至少0.9。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分类规则将受试者分类的值进一步包括以下的至少一项：母亲年龄、母亲体重指数、初产的，和在怀孕期间吸烟。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分类规则采用截断值，线性回归(例如，多元线性回归(MLR)、偏最小二乘(PLS)回归、主成分回归(PCR))，二元决策树(例如，递归划分过程，例如CART-分类和回归树)，人工神经网络，诸如反向传播网络，判别分析(例如，贝叶斯分类器或Fischer分析)，逻辑分类器和支持向量分类器(例如，支持向量机)。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述分类规则配置为具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的灵敏性、特异性、阳性预测值或阴性预测值。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中评估增加的先兆子痫风险包括确定所述蛋白生物标志物(如果被上调)高于或(如果被下调)低于阈值水平。
49.根据权利要求47所述的方法，所述阈值水平代表至少一、至少二或至少三个z分数的水平，所述z分数来自从至少50、至少100或至少200个对照受试者确定的蛋白质的集中趋势(如，均值、中位数或众数)的测量。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述评估包括将所述组合中每种蛋白的测量与参考标准比较。
51.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括将怀孕受试者的先兆子痫风险传达给健康护理提供者。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括：
(d)确定，所述级分中用于早产的一个或多个微粒相关蛋白生物标志物的定量测定值；和
(e)基于所述测量评估早产风险。
53.一种降低怀孕受试者的先兆子痫风险和/或减少先兆子痫的新生儿并发症的方法，所述方法包括：
(a)根据权利要求1至50中任一项所述的方法评估怀孕受试者的先兆子痫风险；和
(b)向受试者施用治疗干预，以有效降低先兆子痫风险和/或减少先兆子痫的新生儿并发症。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述治疗干预选自下组：阿司匹林(例如低剂量阿司匹林)、皮质类固醇或降低高血压的药物。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所治疗的先兆子痫是较晚或较轻形式、高血压形式，或较早或严重形式。
56.一种方法，其包括向通过如本文所述的方法确定具有增加的先兆子痫风险的怀孕受试者施用有效减少先兆子痫风险或减少先兆子痫的新生儿并发症的治疗干预。
57.一种方法，其向怀孕受试者施用有效量的旨在减少先兆子痫风险的治疗，相比选自组合1-29(图3)、组合1-56(图4A-图4B)和组合1-24(图5)的任一组合的蛋白生物标志物的参考标准，所述怀孕受试者具有改变的定量测定值。
58.一种组合，其包括多个基本纯净的蛋白生物标志物或替代生物标志物，其选自表1、表3或表4的蛋白生物标志物。
59.根据权利要求57所述的组合，其进一步包括与每个替代生物标志物配对的稳定同位素标准品肽。
60.一种试剂盒，其包括一个或多个容器，其中每个容器包括多个稳定同位素标准品的每个的一个或多个，每个稳定同位素标准品对应于来自一组生物标志物的生物标志物替代肽，所述一组生物标志物选自组合1-29(图3)、组合1-56(图4A-4B)和组合1-24(图5)。
61.一种有形的、非暂时性形式的计算机可读介质，其包括实施由如本文所述的方法生成的分类规则的代码。
62.一种系统，其包括：
(a)计算机，其包括：
(i)处理器；和
(II)存储器，其耦合至处理器，所述存储器存储模块，所述模块包括：
(1)来自受试者的样品的测试数据，其包括指示所述级分中的一个或多个蛋白生物标志物的定量测定值，其中所述蛋白生物标志物选自表1、表3和表4的蛋白生物标志物；
(2)分类规则，基于包括所述测量值的值，其将所述受试者分类为处于早产风险，其中将所述分类规则配置为具有至少75％、至少85％或至少95％的灵敏性；以及
(3)计算机可执行指令，其用于对所述测试数据实施所述分类规则。
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