KR20200140796A - 순환하는 마이크로입자-관련된 바이오마커를 이용하는 자간전증의 조기 예측 및 예방 방법 - Google Patents

순환하는 마이크로입자-관련된 바이오마커를 이용하는 자간전증의 조기 예측 및 예방 방법 Download PDF

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KR20200140796A
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KR
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human
protein
preeclampsia
biomarkers
biomarker
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KR1020207024673A
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케빈 피 로젠블랫
토마스 에프 맥컬라스
브라이언 디 브로먼
로버트 씨 도스
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엔엑스 프리네이탈 인코포레이티드
더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.
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Abstract

자간전증의 위험 및 치료를 확정하기 위한 방법 및 장치가 본원에 개시된다. 방법 및 장치는 표 1, 표 3 및 표 4에 제공된 것과 같은 폴리펩타이드 바이오마커를 사용한다. 자간전증의 위험을 예측하는데 유용한 다수의 폴리펩타이드 바이오마커를 포함하는 패널이 추가로 제공된다.

Description

순환하는 마이크로입자-관련된 바이오마커를 이용하는 자간전증의 조기 예측 및 예방 방법
본 발명은 순환하는 마이크로입자-관련된 바이오마커를 이용하는 자간전증의 조기 예측 및 예방 방법에 관한 것이다.
이 출원은 2018년 1월 31일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/624,626호 및 2018년 3월 9일에 출원된 제62/641,135호의 35 U.S.C. §119(e) 하에서 혜택을 주장한다. 이들 가출원의 내용은 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
자간전증(preeclampsia, PE)은 임산부의 상태이며 고혈압(높은 혈압)과 단백뇨(소변 내에 단백질)를 특징으로 하며, 자간증(eclampsia) 또는 경련을 야기할 수 있다. 자간전증은 일반적으로 중기 내지 후기 임신기 동안 및 출산 후 6주까지 발병하지만, 때로는 20주차 이전이나, 임신 첫 번째 3개월에 나타날 수 있다. 첫 임신에서 전형적으로 발병하며, PE를 가졌던 여성은 이어진 임신에서 같은 상태를 가질 가능성이 높다.
PE는 매년 전세계적으로 8,370,000명의 여성에게 영향을 미치는 것으로 추정되며, 산모, 태아 및 신생아 이환율 및 사망률의 주요 원인이다. PE는 신생아 이환율 및 사망률의 대략 7%-9%를 차지한다. 미국에서는 20만명의 임산부에게 영향을 미치는 것으로 보고되며, 보건의료 비용이 약 100억 달러에 이를 것으로 추정된다. 대부분의 비용(약 80%)은 초기-발병 PE(예: 임신 35주 전에 발병하는 PE)와 관련된다. 개발 도상국에서, 자간전증은 산모 사망의 약 40-60%를 차지한다.
자간전증은 때때로 증상없이 발병한다. 혈압이 정상인 여성에서 고혈압이 느리게 또는 갑자기 발병할 수 있다. 다른 증상으로는 주로 얼굴과 손의 갑작스러운 붓기, 갑작스러운 체중 증가, 두통, 및 시력에서 변화, 때때로 번쩍이는 불빛 보기, 불쾌감, 호흡 부족, 구토, 소변 배출량의 감소, 혈액내 혈소판 감소를 포함할 수 있다. 일부 여성은 PE의 합병증이 발병될 수 있으며, 이러한 증상은 태아 성장 제한, 조기 분만(PTD), 태반 파괴, HELLP 증후군, 자간증, 기타 장기 손상(예: 간 및 신장), 및 심혈관 질환을 포함한다. 일부 여성은 자궁내 성장 제한(IUGR) 및 임신 유발된 고혈압(PIH)과 같은 다른 합병증이 발병될 수도 있다.
PE는 때로는 아무런 증상없이 빠르게 발병할 수 있으며, 분만을 유도하거나 수술로 출산하지 않으면 태아와 어머니의 건강을 위협하는 자간, 발작 및 장기 부전과 같은 심하고 즉각적인 합병증을 유발할 수 있다.
PE의 원인은 불분명하다. 일반적으로, 비만, 당뇨병, 루푸스, 면역 장애, 한 명보다 많은 태아 및 임신전 고혈압 또는 신장 질환을 가진 여성은 자간전증의 위험이 더 높을 수 있다. 다른 위험 인자는 나이와 새로운 부성(paternity)을 포함할 수 있다. 어머니나 자매가 PE를 가진 여성도 그에 대한 더 높은 위험을 가진다.
PE는 어머니와 아기에게 장기적인 건강 영향을 야기할 수 있다. PE를 가진 여성은 나중에 고혈압 및 산모 관상동맥 질환의 증가된 위험을 가질 수 있다. 조기 분만으로 이어지는 PE를 가진 여성은 PE가 발병하지 않고 임신이 적기에 임박한 여성에 비해 심혈관 질환으로 사망하기 쉬울 수 있다. 태아 성장이 감소하거나 조산으로 태어난 아기는 나중에 심혈관 질환, 고혈압 당뇨병 또는 정신 또는 신경발달 장애(예: 주의력 결핍 장애)를 겪는 경향이 있다. 자폐 스펙트럼 장애와 같은 발달 장애가 있는 일부 어린이는 임신 중에 PE를 가진 어머니에게서 태어날 가능성이 두 배 이상인 것으로 보고되었다.
최근에는, PE의 진단은 고혈압과 단백뇨의 양성 발견이 요구된다.
PE의 가능한 치료는 혈압을 낮추기 위한 약물, 코르티코스테로이드, 항경련제, 입원, 및 궁극적으로 분만(delivery)을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 한 태양은 임신한 대상에서 자간전증의 위험을 평가하기 위한 방법이고, 상기 방법은: (a) 임신한 대상으로부터의 혈액 샘플로부터 마이크로입자-풍부 분획을 제조하는 단계; (b) 분획에서 하나 이상의 마이크로입자-관련된 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계로서, 여기서 하나 이상의 단백질 바이오마커는, (i) 표 1의 단백질 바이오마커; (ii) A2N0U6, A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA, Q96TB4, A0A075B6I4, Q5NV82, E3UVQ2, E9PQG4, L0R6N9, VTNC, C1RL, MBL2, B2R815, D6MJD1, ZA2G, A0A024R9I2, TPC11, CO5, A0A024R3Z1, A8K008, B2R4C5, B4E1D8, GP112, A0A075B6H9 세트의 단백질 바이오마커; 및 (iii) GP1BA, VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2, APOH, JPH1, CO5, HEP2, TPC11, MBL2, AACT, DYH3, TSP1, CAPS1, APOD, LCAT 세트의 단백질 바이오마커로부터 선택되는 것인 단계; 및 (c) 측정에 기반하여 자간전증의 위험을 평가하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 상향-조절된 바이오마커의 증가된 양 또는 하향-조절된 바이오마커의 감소된 양은 자간전증의 증가된 위험을 나타낸다. 다른 실시양태에서, 방법은 표 1의 단백질 바이오마커로부터 선택된 복수의 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 단백질 바이오마커는 표 1: 그룹 1, 그룹 2 또는 그룹 3으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 단백질 바이오마커는, 면역 기능, 세포 시그널링, 혈관신생, 세포자멸사, 매트릭스 부착, 세포 기능, 단백질 대사, 이온 수송 및 미지의 기능으로부터 선택된 복수의 생물학적 기능의 각각으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 방법은 심한 자간전증의 위험을 확정하는 단계를 포함하고, 여기서 바이오마커 또는 바이오마커들은 0A075B6I5_HUMAN, A2MYD2_HUMAN, AL2SA_HUMAN, AR13B_HUMAN, B3AT_HUMAN, BAI1_HUMAN, BRWD3_HUMAN, C6K6H8_HUMAN, CI040_HUMAN, CPLX1_HUMAN, CPLX2_HUMAN, E5RG74_HUMAN, E9PNW5_HUMAN, HV301_HUMAN, I6Y0B1_HUMAN, J3KPJ3_HUMAN, LAC7_HUMAN, LIPA2_HUMAN, LV104_HUMAN, LV109_HUMAN, Q68D13_HUMAN, Q9UL88_HUMAN, SCRIB_HUMAN 및 TTC37_HUMAN로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 방법은 A2N0U6, A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA, Q96TB4, A0A075B6I4, Q5NV82, E3UVQ2, E9PQG4, L0R6N9, VTNC, C1RL, MBL2, B2R815, D6MJD1, ZA2G, A0A024R9I2, TPC11, CO5, A0A024R3Z1, A8K008, B2R4C5, B4E1D8, GP112 및 A0A075B6H9로부터 선택된 복수의 단백질 바이오마커의 정량적인 측정을 확정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 GP1BA, VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2, APOH, JPH1, CO5, HEP2, TPC11, MBL2, AACT, DYH3, TSP1, CAPS1, APOD 및 LCAT로부터 선택된 복수의 단백질 바이오마커의 정량적인 측정을 확정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 바이오마커는 패널 1-29(도 3), 패널 1-56(도 4a-4b) 및 패널 1-24(도 5)로부터 선택된 바이오마커의 한 패널을 포함한다. 다른 실시양태에서, 패널은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 중 임의의 수보다 많지 않은 단백질 바이오마커를 포함한다. 다른 실시양태에서, 바이오마커는 패널 1-29(도 3), 패널 1-56(도 4a-4b) 및 패널 1-24(도 5)로부터 선택된 바이오마커의 한 패널로 구성된다. 다른 실시양태에서, 바이오마커는 A2N0U6, A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA 및 Q96TB4로부터 선택된 5, 4, 3 또는 2개의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 한 패널을 포함한다. 다른 실시양태에서, 바이오마커는 A2N0U6 및 A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA 및 Q96TB4 중 적어도 1, 2, 3 또는 4개를 포함하는 바이오마커의 한 패널을 포함한다. 다른 실시양태에서, 바이오마커는 GP1BA, VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2 및 APOH로부터 선택된 6, 5, 4, 3 또는 2개의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 한 패널을 포함한다. 다른 실시양태에서, 바이오마커는 GP1BA 및 VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2 및 APOH 중 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개를 포함하는 바이오마커의 한 패널을 포함한다. 다른 실시양태에서, 샘플은 임신기간의 첫 번째 3개월 또는 두 번째 3개월 동안 임신한 대상으로부터 채취된다. 다른 실시양태에서, 샘플은 임신기간의 10-12주 동안 임신한 대상으로부터 채취된다. 다른 실시양태에서, 임신한 대상은 초임부(primigravida), 경임부(multigravida), 초산부(primiparous) 또는 다산부(multiparous)이다. 다른 실시양태에서, 임신한 대상은 단일 임신 또는 다태 임신을 한다. 다른 실시양태에서, 임신한 대상은 자간전증에 대해 무증상이며, 예를 들어 고혈압이 아니거나 단백뇨가 없다. 다른 실시양태에서, 임신한 대상은 자간전증의 이력이 없다. 다른 실시양태에서, 임신한 대상은 자간전증에 대한 위험 인자를 가지지 않는다. 다른 실시양태에서, 임신한 대상은 만성 고혈압을 가진다. 다른 실시양태에서, 혈액 샘플은 혈장 또는 혈청이다. 다른 실시양태에서, 마이크로입자-풍부 분획은 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 제조된다. 다른 실시양태에서, 크기-배제 크로마토그래피는 물로의 용리를 포함한다. 다른 실시양태에서, 크기-배제 크로마토그래피는 아가로스 고체상 및 수성 액체상으로 수행된다. 다른 실시양태에서, 제조 단계는 한외 여과 또는 역상 크로마토그래피를 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 제조 단계는 크기-배제 크로마토그래피 후 우레아를 사용한 변성, 다이티오트레이톨을 사용한 환원, 아이오도아세트아민을 사용한 알킬화, 및 트립신을 사용한 소화를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 마이크로입자는 태반-유래 엑소좀 또는 혈관 내피-유래 엑소좀을 풍부하게 하기 위해 추가로 정제된다. 다른 실시양태에서, 정량적 측정을 확정하는 단계는 질량 분광법을 포함한다. 다른 실시양태에서, 정량적 측정을 확정하는 단계는 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC/MS)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 질량 분광법은 액체 크로마토그래피/삼중 사극(quadropole) 질량 분광법을 포함한다. 다른 실시양태에서, 질량 분광법은 다중 반응 모니터링을 포함한다. 다른 실시양태에서, 질량 분광법은 다중 반응 모니터링을 포함하고, 액체 크로마토그래피는 아세토나이트릴을 포함하는 용매를 사용하여 수행되고, 및/또는 확정하는 단계는 단백질 바이오마커에 색인된 체류 시간을 할당하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 질량 분광법은 다중 반응 모니터링을 포함하고, 방법은 질량 분광기로 도입하기 전에 샘플에 하나 이상의 안정 동위원소 표준 펩타이드를 첨가하는 단계를 포함하고, 탐지는 질량 분석기의 충돌 셀에 의해 생성된 안정 동위원소 펩타이드 표준의 하나 또는 복수의 딸 이온(daughter ion)을 탐지하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 정량적 측정을 확정하는 단계는 단백질 바이오마커의 대리(surrogate) 펩타이드의 정량적 측정을 확정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 질량 분광법은 하나 이상의 안정 동위원소 표지된 표준 펩타이드를 정량화하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, MRM은 마이크로입자 농축 분획에 상기 단백질 바이오마커에 상응하는 하나 이상의 안정 중 동위원소 치환된 표준을 첨가하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 정량적 측정을 확정하는 단계는 샘플을 하나 이상의 포획 시약과 접촉시키는 단계로, 각각의 포획 시약은 단백질 바이오마커 중 하나에 특이적으로 결합하는 것인 단계, 및 단백질 바이오마커에서 포획 시약 사이의 결합을 탐지하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 정량화는 면역분석을 수행하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역분석은 효소 면역분석(EIA), 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사성면역분석(RIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 평가하는 단계는 분류 규칙을 실행하는 것을 포함하고, 규칙은 자간전증의 위험에 처한 대상을 분류하고, 분류 규칙의 실행은 p값이 적어도 0.05 미만인 자간전증 또는 만기 출산 사이의 상관관계를 생성한다. 다른 실시양태에서, 평가하는 단계는 분류 규칙을 실행하는 단계를 포함하고, 규칙은 자간전증의 위험에 처한 대상을 분류하고, 분류 규칙의 실행은 수신자 조작 특성(ROC, receiver operating characteristic) 곡선을 생성하며, 여기서 ROC 곡선은 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.8 또는 적어도 0.9의 곡선 아래 면적(AUC, area under the curve)을 가진다. 다른 실시양태에서, 분류 규칙이 대상을 분류하는 값은 모체 연령, 모체 체질량 지수, 초산부, 및 임신 중 흡연 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 분류 규칙은 컷-오프, 선형 회귀(예: 다중 선형 회귀(MLR), 부분 최소 제곱(PLS) 회귀, 주성분 회귀(PCR)), 이진 확정 트리(예: CART와 같은 재귀 분할 프로세스 - 분류 및 회귀 트리), 역 전파 네트워크와 같은 인공 신경망, 판별 분석(예: 베이지안 분류기 또는 피셔 분석), 로지스틱 분류기 및 지원 벡터 분류기(예: 지원 벡터 기계)를 사용한다. 다른 실시양태에서, 분류 규칙은 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 민감도, 특이도, 양성 예측 값 또는 음성 예측 값을 갖도록 구성된다. 다른 실시양태에서, 자간전증의 증가된 위험을 평가하는 단계는 단백질 바이오마커가 (상향-조절된다면) 임계값 수준보다 높거나, (하향-조절된다면) 임계값 수준보다 낮은 것으로 확정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 임계값 수준은 적어도 50, 적어도 100 또는 적어도 200명의 대조군 대상으로부터 확정된 단백질에 대하여 중심 경향의 측정(예: 평균, 중앙값 또는 모드)으로부터 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 z 점수를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 평가하는 단계는 패널에서 각 단백질의 측정을 참조 표준과 비교하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 건강 관리 제공자에게 임신한 대상에 대한 자간전증의 위험을 통신하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 (d) 분획에서의 조산에 대한 하나 이상의 마이크로입자-관련된 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계; 및 (e) 측정에 기초하여 조산 위험을 평가하는 단계를 더 포함한다.
본원에 제공된 또 다른 태양은, 임신한 대상에 대한 자간전증의 위험을 감소시키고/거나 자간전증의 신생아 합병증을 감소시키는 방법이며, 상기 방법은 (a) 본원에 기재된 방법에 따라 임신한 대상에 대한 자간전증의 위험을 평가하는 단계; 및 (b) 자간전증의 위험을 감소시키고/거나 자간전증의 신생아 합병증을 감소시키는데 효과적인 치료적 개입을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 치료적 개입은 아스피린(예: 저용량 아스피린), 코르티코스테로이드 또는 고혈압을 감소시키는 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 치료된 자간전증은 후기 또는 온화한 형태, 고혈압 형태 또는 조기 또는 심한 형태이다.
본원에 제공된 또 다른 태양에서, 본원에 기술된 방법에 의해 자간전증의 증가된 위험을 가지는 것으로 확정된 임신한 대상에게, 자간전증의 위험을 감소시키거나 자간전증의 신생아 합병증을 감소시키는데 효과적인 치료적 개입을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본원에서 제공된 또 다른 태양은 패널 1-29(도 3), 패널 1-56(도 4a-4b) 및 패널 1-24(도 5)에서 선택된 단백질 바이오마커의 패널 중 어느 하나의 참조 표준에 비교된 변경된 정량적 측정을 가지는 임신한 대상에게 자간전증의 위험을 감소시키도록 설계된 치료의 유효량을 투여하는 방법이다.
본원에서 제공되는 또 다른 태양은 표 1, 표 3 또는 표 4의 단백질 바이오마커로부터 선택된 복수의 실질적으로 순수한 단백질 바이오마커 또는 대리 바이오마커를 포함하는 패널이다. 한 실시양태에서, 패널은 각각의 대리 바이오마커와 쌍을 이루는 안정 동위원소 표준 펩타이드를 추가로 포함한다.
본원에서 제공되는 또 다른 태양은 하나 또는 복수의 용기를 포함하는 키트이며, 여기서 각 용기는 하나 이상의 각각의 복수의 안정 동위원소 표준을 포함하고, 각각의 안정 동위원소 표준은 패널 1-29(도 3), 패널 1-56(도 4a-4b) 및 패널 1-24(도 5)에서 선택된 바이오마커의 한 패널로부터의 바이오마커에 대한 대리 펩타이드에 해당하는 것인 키트이다.
본원에서 제공되는 또 다른 태양에서, 본원에 설명된 방법에 의해 생성된 분류 규칙을 구현하기 위한 코드를 포함하는 유형(有形)의 비-일시적 형태의 컴퓨터 판독가능 매체이다.
본원에 제공된 다른 태양은, (a)(i) 프로세서; 및 (II) 프로세서에 연결된 메모리를 포함하는 컴퓨터를 포함하는 시스템으로, 메모리는 (1) 분획에서 하나 이상의 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 나타내는 값을 포함하는 대상으로부터의 샘플에 대한 테스트 데이터, 여기서 단백질 바이오마커는 표 1, 표 3 및 표 4의 단백질 바이오마커로부터 선택되는 것인 테스트 데이터; (2) 측정치를 포함한 값에 기반한, 대상을 조산 위험에 처한 것으로 분류하는 분류 규칙으로, 여기서 분류 규칙은 적어도 75%, 적어도 85% 또는 적어도 95%의 민감도를 가지는 것으로 구성되는 것인 분류 규칙; 및 (3) 테스트 데이터 상에 분류 규칙을 구현하기 위한 컴퓨터 실행가능한 명령어를 포함하는 모듈을 저장하는 것인 시스템이다.
본 명세서에 포함되어 있음.
본 명세서에 포함되고 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부된 도면은 예시적인 실시양태를 예시하고, 상세한 설명과 함께, 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 이들 실시양태 및 당업자에게 명백한 다른 실시양태들을 만들고 사용할 수 있게 하는 역할을 더 수행한다. 본 발명은 하기 도면과 관련하여 보다 구체적으로 설명될 것이다.
도 1은 실시예 2 및 3에 관련된, 및 도 3, 4a, 4b 및 5에 관련된 자간전증에 관련된 단백질의 확인을 위한 개략적이고 통계적인 작업 흐름도를 도시한다.
도 2는 자간전증의 증가된 위험에 대한 바이오마커와 관련된 생물학적 기능을 도시한다. 이는 도 1에서 통계적인 작업 흐름도의 적용이 확인된 바이오마커를 나타낸다.
도 3은 STRING 단백질 데이터베이스에 대항하여 큐레이션(curation) 전에 내부 모델 생성으로부터 자간전증에 대한 바이오마커의 29개 패널을 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 STRING 단백질 데이터베이스에 대항하여 큐레이션 전에 샘플의 테스트 세트 상에서 모델 생성으로부터 자간전증에 대한 바이오마커의 56개 패널을 도시한다.
도 5는 STRING 단백질 데이터베이스에 대항하여 큐레이션 후에 자간전증에 대한 단백질 바이오마커의 24개 패널을 도시한다.
I. 서론
본원에는 자간전증의 발병 위험을 확정하고 치료하는데 유용한 방법, 시스템 및 물품이 개시된다. 이것은 자간전증의 조기 탐지(상태가 준-임상 및/또는 정상 탐지 임계값 미만인 동안의 확정) 및 자간전증 발병 위험의 확정을 포함한다. 이들 중 일부는 임산부의 혈액으로부터 마이크로입자-풍부 분획에서 발견되는 자간전증 바이오마커의 탐지와 관련된다. 이러한 바이오마커는 표 1, 표 4 및 표 5에 제시된다.
II. 대상
자간전증의 예측 및 치료 대상은 임신한 인간 여성이다. 일부 실시양태에서, 임산부는 임신의 첫 번째 3개월(예: 임신 1-12주), 두 번째 3개월(예: 임신 13-28주) 또는 세 번째 3개월(예: 임신 29-37주)에 있다. 일부 실시양태에서, 임산부는 임신 초기(예를 들어임신 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주부터지만 21주 미만; 임신 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 또는 9주부터지만, 8주 이후)에 있다. 일부 실시양태에서, 임산부는 임신의 8-15주, 예를 들어 10-12주, 8-12주 또는 10-15주에 있다. 일부 실시양태에서, 임산부는 임신 중기(예: 임신 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30주로부터지만, 31주 이전; 임신 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22 또는 21주부터지만, 20주 이후)에 있다. 일부 실시양태에서, 임산부는 임신 후기(예: 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37주부터만, 임신 38주 이전; 37, 36, 35, 34, 33, 32 또는 31주부터지만 임신 30주 이후)에 있다. 일부 실시양태에서, 임산부는 임신 17주 미만, 16주 미만, 15주 미만, 14주 미만 또는 13주 미만이고; 임신 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 또는 9주부터지만, 8주 이후에 있다. 임신 단계는 임신한 대상의 마지막 정상 생리 기간의 첫날부터 계산할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 임신한 대상은, 초산부(이전에 분만한 아이 없음, 본원에서 미산부(nulliparous) 또는 출산경력(parity)=0으로 상호교환적으로 지칭됨) 또는 다산부(이전에 적어도 임신 20주를 유지한 아이 1명 이상, 본원에서 출산경력>0, 출산경력≥1로 상호교환적으로 지칭됨), 초임부(첫 번째 임신) 또는 다임부(한 번 이상의 임신)를 포함하는 하나 이상의 분류에 속할 수 있다.
일부 실시양태에서, 임신한 인간 대상은 무증상이다. 일부 실시양태에서, 대상은 고혈압, 소변내 단백질, 자간전증의 가족력, 신장 또는 결합 조직 질환, 비만, 고령 산모 연령, 또는 의학적 지원을 받은 수정과 같은 자간전증의 위험 인자를 가질 수 있다.
III. 샘플 제조
본 개시의 방법에 사용하기 위한 샘플은 임신한 대상로부터 얻은 생물학적 샘플이다. 특정 실시양태에서, 샘플은 이전 섹션에 기재된 임신 단계 동안 수집된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액, 타액, 눈물, 땀, 코 분비물, 소변, 양수 또는 자궁경부질액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 특정 실시양태에서 혈청 또는 혈장인 혈액 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 냉동 보관된다(예: -20℃ 또는 -80℃).
용어 "마이크로입자"는 약 50 내지 약 5000nm의 유체역학적 직경을 갖는 세포외 마이크로소포 또는 지질 래프트 단백질 응집체를 지칭한다. 따라서, 마이크로입자라는 용어는 엑소좀(약 50 내지 약 100nm), 마이크로소포(약 100 내지 약 300nm), 엑토좀(약 50 내지 약 1000nm), 세포자멸체(약 50 내지 약 5000nm) 및 동일한 차원의 지질-단백질 응집체를 망라한다.
용어 "마이크로입자-관련된 단백질"은 포유동물(예: 인간) 대상으로부터의 마이크로입자-풍부 샘플에서 탐지가능한 단백질 또는 이의 단편을 지칭한다. 따라서 용어 "마이크로입자-관련된 단백질"은 탐지 시점에서 마이크로입자와 물리적으로 관련된 단백질 또는 이의 단편으로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩타이드"는, 달리 명시되지 않는 한, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함하는 아미노산 중합체를 지칭한다.
수치와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "약"은 그 수치의 90% 내지 110%를 지칭한다. 예를 들어, 약 1000nm의 직경은 900nm 내지 1100nm 범위 내의 직경이다.
자간전증에 대한 바이오마커는 마이크로입자로부터 유래될 수 있다. 마이크로입자는 크기-배제 크로마토그래피에 의해 혈액(예: 혈청 또는 혈장)으로부터 단리될 수 있다. 용출 완충액은, 예를 들어 PBS와 같은 완충 용액, 비-완충 용액, 물 또는 탈이온수일 수 있다. 고 분자량 분획이 수집되어 마이크로입자-풍부 샘플을 얻을 수 있다. 마이크로입자-풍부 샘플 내의 단백질은 트립신과 같은 단백질분해 효소로 소화되기 전에 추출되어 복수의 펩타이드를 포함하는 소화된 샘플을 얻는다. 이어서 소화된 샘플은 분석 전에 펩타이드 정제/농축 단계를 거쳐, 예를 들어 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법에 의해 샘플의 단백질체 프로파일을 얻는다. 일부 실시양태에서, 정제/농축 단계는 역상 크로마토그래피(예: 0.2 μL C18 레진과 ZIPTIP 피펫 팁, 매사추세츠주 빌레리카 소재 Millipore Corporation으로부터)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 엑소좀은 태반-유래 엑소좀 또는 내피-유래 엑소좀이다. 이러한 엑소좀은 이러한 기원 세포에 대한 표면 마커에 대항하는 항체와 같은 포획제를 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 태반-유래 엑소좀은 CD34, CD44 또는 백혈병 억제 인자(LIF)에 대한 항체를 사용하여 단리될 수 있다. 내피-유래 엑소좀은 ICAM 또는 VCAM에 대한 항체를 사용하여 단리할 수 있다.
실질적으로 순수한 형태로 하나 또는 복수의 자간전증 바이오마커를 포함하는 물질의 조성물이 본원에서 제공된다. 바이오마커는 용기에서 혼합될 수 있거나, 예를 들어 다른 지정가능한 위치에서 고체 지지체에 부착을 통해 물리적으로 분리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 같은 화학 물질은 조성물에서 그 종류의 주된 화학 물질인 경우 "실질적으로 순수"하다. 이는 조성에서 50% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상을 나타내는 화학 물질 또는 이와 같은 종류의 화학 물질을 포함한다. 화학 물질은 조성에서 해당 종류의 화학 물질의 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상 또는 99.99% 이상을 나타내는 경우 "본질적으로 순수"하다. 본질적으로 순수한 화학 물질도 실질적으로 순수하다.
IV. 바이오마커 탐지
A. 바이오마커
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이오마커"는 두 상태 사이에 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 존재, 형태 또는 양을 나타내는 생물학적 분자를 의미한다. 따라서, 바이오마커는 단독으로 또는 조합하여 대상을 복수의 그룹 중 하나로 분류하는데 유용하다. 바이오마커는 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하지 않을 수 있다. 예를 들어, 바이오마커는 자연적으로 발생하는 단백질 또는 자연적으로 발생하지 않는 단백질의 단편일 수 있다. 단백질의 단편은 단백질에 대한 프록시 또는 대리 펩타이드 또는 독립형 바이오마커로 기능할 수 있다.
자간전증의 위험에 대한 폴리펩타이드 바이오마커가 본원에서 제공된다. 자간전증에 대한 바이오마커는 표 1, 표 3 및 표 4에 제시된다. 자간전증 위험에 대한 바이오마커의 패널은 도 3, 도 4a 및 4b, 및 도 5에 제시된다.
바이오마커는 임산부로부터 채취한 샘플(예: 혈액)로부터 단리된 마이크로입자로부터의 단백질의 드 노보(de novo) 시퀀싱을 사용하여 탐지될 수 있다. 단백질은 질량 분광법, 예를 들어 단일 또는 이중(MS/MS) 질량 분광법에 의해 시퀀싱될 수 있다. 모 단백질과 모 단백질의 펩타이드 단편은 모두 자간전증의 바이오마커로 유용하다. 달리 명시되지 않는 한, 명명된 단백질 바이오마커는 예를 들어 단백질의 단편과 같은 대리에 의한 탐지를 망라한다.
질량 분광법에 의해 탐지된 단백질, 예를 들어 펩타이드는 분석되어 대조군과 비교하여 상향-조절되거나(양 증가) 또는 하향-조절되는(양 감소) 것들임을 확인한다. 통계적으로 유의한 차등 발현을 나타내는 단백질은 추가로 분석되어 모 단백질을 확인한다. 이러한 단백질은 SwissProt와 같은 단백질 데이터베이스에서 확인될 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이오마커는 복수의 바이오마커를 포함하는 패널로서 분석된다. 패널은 개념적 그룹화, 물질의 조성물(예: 정제된 바이오마커 폴리펩타이드를 포함함), 또는 항체와 같은 포획 시약에 부착된 고체 지지체와 같은 물품으로서 바이오마커에 추가로 결합된 형태로 존재할 수 있다. 고체 지지체는, 예를 들어, 비드와 같은 하나 이상의 고체 입자 또는 바이오마커가 어레이 형식으로 부착된 칩일 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이오마커는 펩타이드 바이오마커가 펩타이드의 안정 동위원소 표준과 쌍을 이루는 조성물 내에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 다중 반응 모니터링 질량 분광법에서 탐지에 유용하다.
질량 분광의 목적을 위해, 단백질은, 예를 들어 다중 반응 모니터링(MRM)에서 온전하게, 또는 단편화를 통해 탐지될 수 있다. 이러한 경우 단백질은 분석 전에 단백질분해로 단편화될 수 있다. 단백질분해 단편화에는 화학적 및 효소적 단편화가 모두 포함된다. 화학적 단편화는, 예를 들어 사이아노젠 브로마이드로 처리를 포함한다. 효소적 단편화는 예를 들어 트립신, 키모트립신, LysC, ArgC, GluC, LysN 및 AspN과 같은 단백질분해효소(프로테아제)를 사용한 소화를 포함한다. 이러한 단백질 단편 또는 질량 분광법에서 생성된 그들의 단편화된 형태의 탐지는 전체 단백질에 대한 대리로서 기능할 수 있다.
1. 초기 분석으로부터 확인된 바이오마커
마이크로좀-관련된 단백질의 초기 통계 분석은 표 1의 바이오마커를 확인하였다. 표 1은, 바이오마커의 식별력(1, 2 또는 3)의 상대적 등급("등급"), 바이오마커가 극심한 PE 케이스("극단적인 표현형에서도 발견됨")를 분류하는데에도 기능하는지 여부, 단백질 바이오마커의 전체 이름, 케이스 대 대조군에서 바이오마커 양의 비율, 및 차등 발현 p 값을 나타낸다. 비율과 관련하여 비율이 1보다 크면 마커가 PE에서 상향-조절됨을 나타내고, 1 미만의 비율은 바이오마커가 PE에서 하향-조절됨을 나타낸다. 중증 자간전증이라고도 하는 극심한 자간전증은 두통, 흐린 시력, 밝은 빛을 견디지 못함, 피로, 메스꺼움/구토, 소량의 소변, 오른쪽 상복부에서 통증, 숨가쁨, 쉽게 멍이 드는 경향 중 하나 이상을 특징으로 한다.
자간전증의 예측에 사용되는 바이오마커는 아래 표 1의 모든 바이오마커로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커이거나, 또는 표 1의 바이오마커의 임의의 등급 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커일 수 있다. 선택된 바이오마커는 전부 상향-조절되거나, 전부 하향-조절되거나, 상향 및 하향-조절이 조합된 바이오마커들일 수 있다.
특정 실시양태에서, 바이오마커는: 0A075B6I5_HUMAN, A2MYD2_HUMAN, AL2SA_HUMAN, AR13B_HUMAN, B3AT_HUMAN, BAI1_HUMAN, BRWD3_HUMAN, C6K6H8_HUMAN, CI040_HUMAN, CPLX1_HUMAN, CPLX2_HUMAN, E5RG74_HUMAN, E9PNW5_HUMAN, HV301_HUMAN, I6Y0B1_HUMAN, J3KPJ3_HUMAN, LAC7_HUMAN, LIPA2_HUMAN, LV104_HUMAN, LV109_HUMAN, Q68D13_HUMAN, Q9UL88_HUMAN, SCRIB_HUMAN 및 TTC37_HUMAN으로부터 선택된다. 이러한 바이오마커는 중증 형태의 자간전증과 상관관계가 있을 수 있다.
도 2는 증가된 위험의 자간전증에 대한 바이오마커가 관련된 생물학적 기능을 보여준다. 이러한 생물학적 기능은 면역 기능, 세포 시그널링, 혈관신생, 세포자멸사, 매트릭스 부착, 세포 기능, 단백질 대사 및 이온 수송이 포함된다. 생물학적 기능이 미지인 단백질에 대한 바이오마커도 표시된다. 특정 실시양태에서, 복수의 상이한 생물학적 기능의 각각으로부터의 적어도 하나의(예: 적어도 2, 적어도 3, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7 또는 적어도 8개의) 바이오마커가 측정될 수 있다. 이는 생물학적 기능이 미지인 단백질에 대한 적어도 바이오마커 측정도 포함될 수 있다.
2. 머신 러닝으로 확인된 바이오마커
HRAM 질량 분광법 분석에 의해 생성된 데이터 상에 머신 러닝을 사용하여 표 3 및 표 4에 제시된 다른 잘 수행하는 바이오마커가 발견되었다. 이러한 바이오마커를 사용하는 패널은 도 3 및 도 4a 및 4b에 제시된다. 다른 실시양태에서, 단백질 바이오마커는 A2N0U6, A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA, Q96TB4, A0A075B6I4, Q5NV82, E3UVQ2, E9PQG4, L0R6N9, VTNC, C1RL, MBL2, B2R815, D6MJD1, ZA2G, A0A024R9I2, TPC11, CO5, A0A024R3Z1, A8K008, B2R4C5, B4E1D8, GP112 및 A0A075B6H9MBL2로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 더 많은 바이오마커일 수 있다. 대안적으로, 패널은 이 그룹으로부터 선택된 6, 5, 4, 3 또는 2개 중 임의의 수보다 많지 않은 바이오마커를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 유용한 단백질 바이오마커는 바이오마커의 패널을 포함한다. 바이오마커의 패널은 도 3의 패널 1-29로부터 선택된 패널로부터의 단백질을 포함할 수 있다. 즉, 패널은 도 3의 패널 1-29로부터 선택된 패널로부터의 바이오마커 및 기타 바이오마커를 추가적으로 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 바이오마커의 패널은 도 3의 패널 1-29로부터 선택된 바이오마커의 패널로 구성될 수 있다. 즉, 패널은 지정된 패널에서 확인된 바이오마커만 포함한다.
바이오마커의 다른 패널은 도 4a-4b의 패널 1-56으로부터 선택된 패널로부터의 단백질 바이오마커를 포함하는 패널을 포함한다. 다른 실시양태에서, 패널은 도 4a-4b의 패널 1-56으로부터 선택된 패널로부터의 단백질 바이오마커로 구성된다.
다른 실시양태에서, 바이오마커는 A2N0U6, A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA 및 Q96TB4로부터 선택된 5, 4, 3 또는 2개의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널을 포함한다.
다른 실시양태에서, 바이오마커는 A2N0U6 및 A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA 및 Q96TB4 중 적어도 1, 2, 3 또는 4개를 포함하는 바이오마커의 패널을 포함한다.
3. 큐레이션 후 확인된 바이오마커
이전 머신 러닝 작동에서 확인된 바이오마커는 STRING 단백질 데이터베이스에 대하여 큐레이션되었다. STRING 데이터베이스에 포함되지 않았거나 데이터베이스에 있는 다른 단백질과의 상호작용이 4개 미만인 것으로 확인된 단백질은 제거되었다. 나머지 단백질은 알려진 생물학적 기능을 가지고 있었다. 나머지 단백질과 관련된 데이터는 머신 러닝 주제였다. 최고 성능의 단백질 바이오마커가 확인되고 표 5 및 표 6에 제시되었다. 이들 단백질 바이오마커를 포함하는 최고 성능의 패널이 도 5에 제시된다.
따라서, 또 다른 실시양태에서 자간전증의 위험을 확정하기 위한 단백질 바이오마커는 GP1BA, VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2, APOH, JPH1, CO5, HEP2, TPC11, MBL2, AACT, DYH3, TSP1, CAPS1, APOD 및 LCAT로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 더 많은 바이오마커일 수 있다. 대안적으로, 패널은 이 그룹으로부터 선택된 6, 5, 4, 3 또는 2개 중 임의의 것보다 많지 않은 바이오마커를 포함할 수 있다.
바이오마커의 패널은 도 5의 패널 1-24로부터 선택된 한 패널로부터의 단백질을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서 패널은 도 5의 패널 1-24로부터 선택된 한 패널로부터의 단백질 바이오마커로 구성된다.
다른 실시양태에서, 바이오마커는 GP1BA, VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2 및 APOH로부터 선택된 6, 5, 4, 3 또는 2개의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 패널을 포함한다.
다른 실시양태에서, 바이오마커는 GP1BA 및 VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2 및 APOH 중 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개를 포함하는 바이오마커의 패널을 포함한다.
4. 탐지의 방법
바이오마커는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 탐지되고 정량화될 수 있다. 이는, 이에 제한되지 않지만, 면역분석, 크로마토그래피, 질량 분광법, 전기영동 및 표면 플라스몬 공명이 포함된다.
바이오마커의 탐지에는 온전한 단백질의 탐지, 또는 단편과 같은 단백질의 대리물의 탐지가 포함된다.
면역분석 방법은, 예를 들어 방사능면역분석, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 샌드위치 분석 및 웨스턴 블롯, 면역침강, 면역조직화학, 면역형광, 항체 마이크로어레이, 도트 블롯팅 및 FACS를 포함한다.
크로마토그래피 방법은, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피/겔 여과 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 예를 들어 HPLC를 포함하는 역상 크로마토그래피를 포함한다.
5. 질량 분광법
일부 실시양태에서, 마이크로입자-관련된 단백질의 수준 탐지(예: 존재 탐지 포함)는 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LCMS)-기반 단백질체 분석을 사용하여 달성된다. 예시적인 실시양태에서, 방법은 샘플을 크기-배제 크로마토그래피에 적용하고, (예: 크기-배제 크로마토그래피에 의해) 고분자량 분획을 수집하여 마이크로입자-풍부 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 그 다음, (예: 카오트로픽제, 변성제, 환원제 및/또는 알킬화제를 사용하여) 마이크로입자-풍부 샘플은 파괴되고 방출된 내용물은 단백질분해된다. 다수의 펩타이드를 함유하는 파괴 된 엑소좀 제제는 이어서 질량 분광법에 의한 펩타이드 분석 이전에 본원에 설명 된 탠덤 컬럼 시스템을 사용하여 처리되어, 샘플의 단백질체 프로파일을 제공한다. 본원에 개시된 방법은 이전 방법과 관련된 단백질 농도/정제, 완충액 교환 및 액체 크로마토그래피 단계의 필요성을 피한다.
샘플 내의 단백질은 질량 분광법으로 탐지될 수 있다. 질량 분광기(spectrometer)는 전형적으로 분석물을 이온화하는 이온 소스, 및 질량을 측정하기 위한 하나 이상의 질량 분석기(analyzer)를 포함한다. 질량 분석기는 탠덤 질량 분광기에서 함께 사용될 수 있다. 이온화 방법은 무엇보다도 전기분무 또는 레이저 탈흡착 방법을 포함한다. 질량 분석기는 사극, 이온 트랩, 비행시간(time-of-flight) 기기 및 자기 또는 전기 섹터 기기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 질량 분광기는 제 1 질량 분석기를 사용하여 특정 질량의 이온을 선택하고 제 2 질량 분석기를 사용하여 선택된 이온을 분석하는 탠덤 질량 분광기(예: "MS-MS")이다. 탠덤 질량 분광기의 한 가지 예는 삼중 사극 기기이며, 첫 번째 및 세 번째 사극은 질량 필터로서 작동하며 중간 사극은 충돌 셀로 기능한다. 질량 분광법은 액체 크로마토그래피 또는 기체 크로마토그래피와 같은 업-스트림 분리 기술과 결합될 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피는 "LC-MS-MS"로 지칭될 수 있다.
본원에 기술된 분석에 유용한 질량 분광기는, 제한없이, AltisTM 사극, QuantisTM 사극, ThermoFisher Scientific로부터 입수가능한 QuantivaTM 또는 FortisTM 삼중 사극, 및 Perkin Elmer의 QSightTM 삼중 사극 LC/MS/MS를 포함한다.
일반적으로, 펩타이드의 질량, 및 바람직하게는 또한 선택된 펩타이드의 단편화 및/또는 (부분적인) 아미노산 서열에 대한 정확한 정보를 제공할 수 있는 임의의 질량 분광(MS) 기술(예: 탠덤 질량 분광법, MS/MS; 또는 소스 붕괴 후(post source decay), TOF MS)이 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 적합한 펩타이드 MS 및 MS/MS 기술 및 시스템은 당업계에 공지되고(예: 문헌 [Molecular Biology, vol.146: "Mass Spectrometry of Proteins and Peptides", by Chapman, ed., Humana Press 2000]에 개시된 방법; 논문 [Kassel & Biemann (1990) Anal. Chem. 62: 1691-1695]; 논문 [Enzymol 193: 455-79]에 개시된 방법; 또는 논문 [Enzymology, vol. 402: "Biological Mass Spectrometry", by Burlingame, ed., Academic Press 2005]에 개시된 방법을 참고한다), 본 명세서에 개시된 방법을 실행하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 정량적 MS를 수행하여 하나 이상의 펩타이드를 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 정량적 방법은 자동화(Villanueva, et al., Nature Protocols(2006) 1(2): 880-891) 또는 반자동화 형식으로 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, MS는 액체 크로마토그래피 장치(LC-MS/MS 또는 LC-MS) 또는 기체 크로마토그래피 장치(GC-MS 또는 GC-MS/MS)에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
선택된 반응 모니터링은 첫 번째 질량 분석기가 관심의 대상인 폴리펩타이드(전구체)를 선택하고, 충돌 세포가 폴리펩타이드를 생성물 단편으로 단편화하고 하나 이상의 단편이 두 번째 질량 분석기에서 탐지되는 질량 분광법 방법이다. 전구체와 생성물 이온 쌍은 SRM "전이"로 불린다. 이 방법은 전형적으로 삼중 사극 기기에서 수행된다. 폴리펩타이드의 여러 단편이 분석될 때, 이 방법은 다중 반응 모니터링 질량 분광법("MRM-MS")으로 지칭된다.
전형적으로, 단백질 샘플은 트립신과 같은 단백질분해 효소로 소화되어 펩타이드 단편을 생성한다. 이러한 특정 펩타이드의 중 동위원소 표지된 유사체(analogue)는 표준으로서 합성된다. 이러한 표준은 안정 동위원소 표준 또는 "SIS"(Stable Isotopic Standards)로 지칭된다. SIS 펩타이드는 프로테아제-처리된 샘플과 혼합된다. 혼합물은 삼중 사극 질량 분광법에 적용된다. SIS 표준의 딸 이온에 해당하는 펩타이드 및 표적 펩타이드는 시간 도메인 또는 질량 도메인에서 높은 정확도로 탐지된다. 일반적으로 복수의 딸 이온은 모 이온의 존재를 모호하지 않게 확인하는데 사용되며, 일반적으로 가장 풍부한 딸 이온 중 하나가 정량화에 사용된다. SIS 펩타이드는 주문하여 합성될 수 있거나, 예를 들어 ThermoFisher(매사추세츠주, 월담) 또는 Biognosys(스위스, 취리히)와 같은 공급업체에서 시판 키트로 구입할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다중 반응 모니터링(MRM)" 또는 "선택된 반응 모니터링(SRM)"은 저 과다(low abundance)인 분석물을 정량화하는데 특히 유용한 MS-기반 정량화 방법을 지칭한다. SRM 실험에서, 사전정의된 전구체 이온과 하나 이상의 그 단편은 삼중 사극 기기의 두 개의 질량 필터에 의해 선택되고 정확한 정량화를 위해 시간이 지남에 따라 모니터링된다. 다수의 SRM 전구체 및 단편 이온 쌍은 MRM 실험을 수행하기 위해 상이한 전구체/단편 쌍 사이를 빠르게 토글링(toggling)함으로써 크로마토그래피 시간 스케일 상에서 동일한 실험 내에서 측정될 수 있다. 표적화된 분석물(예: 펩타이드 또는 화학 물질, 스테로이드, 호르몬과 같은 소분자)의 체류 시간과 조합된 일련의 전이(전구체/단편 이온 쌍)가 최종 분석(definitive assay)을 구성할 수 있다. 많은 분석물이 단일 LC-MS 실험 중에 정량화될 수 있다. MRM 또는 SRM과 관련하여 "예약된" 또는 "동적"이라는 용어는, 특정 분석물에 대한 전이가, 단일 LC-MS 실험에서 탐지되고 정량화될 수 있는 분석물의 수를 크게 증가시키고, 체류 시간이 분석물의 물리적 특성에 따라 달라지는 속성이기 때문에, 테스트의 선택성에 기여하는, 예상 체류 시간 주변의 시간 창에서만 획득되는 분석(assay)의 변이를 지칭한다. 단일 분석물은 하나 이상의 전이로 모니터링될 수도 있다. 마지막으로, 분석은 관심 대상인 분석물(예: 분석물 펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드)에 해당하는 표준을 포함할 수 있지만, 안정 동위원소의 포함에 의해 달라질 수 있다. 안정 동위원소 표준(SIS, stable isotopic standard)은 정확한 수준으로 분석에 통합되고 해당 미지의 분석물을 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 추가적인 특이성의 수준은 미지의 분석물과 그에 상응하는 SIS의 공동-용리에 의해, 및 이들의 전이의 특성(예: 분석물의 두 개의 전이의 수준의 비율 및 해당 SIS의 두 개의 전이의 비율의 유사성)에 의해 기여된다.
따라서, MRM-MS에 의한 단백질 표적의 탐지는, 전형적으로 펩타이드 단편이 비교되는 안정 동위원소 표준 펩타이드의 탐지를 통해, 단백질의 하나 이상의 펩타이드 단편의 탐지를 포함한다. 전형적으로, SIS 자체는 원래 소화된 단편으로서 충돌 셀에서 단편화되며, 이러한 단편 중 하나 이상은 질량 분광기에 의해 탐지될 것이다.
바이오마커 펩타이드 분석에 적합한 질량 분광 분석, 기기 및 시스템은, 제한 없이, 매트릭스-지원된 레이저 탈착/이온화 비행-시간(MALDI-TOF) MS; MALDI-TOF PSD(post-source-decay); MALDI-TOF/TOF; 표면-강화된 레이저 탈착/이온화 비행 질량 분광법(SELDI-TOF) MS; 전기분무 이온화 질량 분광법(ESI-MS); ESI-MS/MS; ESI-MS/(MS)n(n은 0보다 큰 정수); ESI 3D 또는 선형(2D) 이온 트랩 MS; ESI 삼중 사극 MS; ESI 사극 직교 TOF(Q-TOF); ESI 푸리에 변환 MS 시스템; 실리콘 상의 탈착/이온화(DIOS); 이차 이온 질량 분광법(SIMS); 대기압 화학 이온화 질량 분광법(APCI-MS); APCI-MS/MS; APCI-(MS)n; 이온 이동성 분광법(IMS); 유도 결합 플라즈마 질량 분광법(ICP-MS) 대기압 광이온화 질량 분광법(APPI-MS); APPI-MS/MS; 및 APPI-(MS)n을 포함할 수 있다. 탠덤 MS(MS/MS) 배열에서 펩타이드 이온 단편화는, 예를 들어 충돌 유도 해리(CID, collision induced dissociation)와 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 질량 분광법에 의한 바이오마커의 탐지 및 정량화는 특히 Kuhn 등이 문헌 [(2004) Proteomics 4 : 1175-1186]에 기술한 바와 같은 다중-반응-모니터링(MRM)을 포함할 수 있다. LC-MS/MS 분석 중 예약된 다중-반응-모니터링(Scheduled MRM) 모드 획득은 펩타이드 정량의 민감도와 정확도를 향상시킨다. Anderson 및 Hunter의 문헌 [(2006) Mol. 세포. Proteomics 5(4) : 573-588]. 질량 분광-기반 분석은 유리하게는 업스트림 펩타이드 또는 단백질 분리 또는 단편화 방법, 예를 들어 본원에 설명된 탠덤 컬럼 시스템과 결합될 수 있다.
V. 자간전증의 위험을 평가하는 방법
본원에 사용된 "자간전증의 증가된 위험"이라는 문구는 임신한 대상이 임신의 동일한 단계에 있는 대상의 일반적인 집단보다 자간전증이 발병할 가능성이 더 높음을 나타내며, 선택적으로 하나 이상의 인구통계학적 또는 위험 인자를 공유하는 집단과 비교된다. 이는, 예를 들어 연령, 이전 임신 상태/결과, 고혈압, 소변 내 단백질, 인종/민족, 병력, 이전 임신 이력, 흡연/약물 이력 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 검사는 임신 10~12주에 있는 여성이 임신 10~12주에 있는 일반 또는 대조군 여성보다 자간전증 발병 위험이 더 높다는 것을 나타낼 수 있다.
본원에는, 예를 들어, 임신한 인간 여성을 자간전증의 증가된 위험에 있는 것으로 분류하는 자간전증에 대한 위험을 평가하는 방법이 제공된다. 방법은 표 1의 하나 또는 복수의 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계, 및 측정을 자간전증의 위험과 상관시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 확정에서 2, 3, 4, 5, 6개 이상 또는 2, 3, 4, 5, 6개 이하의 바이오마커를 사용할 수 있다. 일반적으로, 상향-조절된 바이오마커의 상대적으로 증가된 양 또는 하향-조절된 바이오마커의 상대적으로 감소된 양의 측정은 자간전증의 증가된 위험과 상관되었다. 대안적으로, 확정은 비선형 및/또는 초차원적 방법을 사용할 수 있는 분류 알고리즘에 기반한다.
특정 실시양태에서, 바이오마커는 (i) PE, 후기/경미한 형태 대 (ii) PE/고혈압, 조기/중증 형태와 같은 PE 하위군을 구별하기 위해 사용된다.
특정 실시양태에서, 방법은 자궁 동맥 도플러 초음파를 수행하거나 산모 혈압을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
자간전증의 위험을 평가하는 방법은 본 개시의 적어도 하나의 바이오마커의 적어도 정량적 측정을 포함하는 정보에 기반하여 대상을 자간전증의 증가된 위험에 있는 것으로 분류하는 단계를 포함할 수 있다.
분류는 통계 분석 및/또는 머신 러닝에 의해 확정된 분류 알고리즘 또는 모델을 사용할 수 있다.
B. 통계 분석
전형적으로, 분석은 통계적으로 의미있는 결과를 제공하기 위해 충분히 많은 수의 샘플에 대한 통계 분석을 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 통계 방법이 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법 또는 도구는, 제한 없이, 상관관계, Pearson 상관관계, Spearman 상관관계, 카이-제곱, 평균의 비교(예: 쌍을 이룬 T-검정, 독립 T-검정, ANOVA), 회귀 분석(예: 단순 회귀, 다중 회귀, 선형 회귀, 비선형 회귀, 로지스틱 회귀, 다항 회귀, 단계적 회귀, 리지 회귀, 라소 회귀, 엘라스틱넷 회귀) 또는 비-모수 분석(예: 윌콕슨 등급-합계 테스트, 윌콕슨 부호-등급 테스트, 부호 테스트)을 포함한다. 이러한 도구는 MATLAB, JMP 통계 소프트웨어 및 SAS와 같은 상용 통계 패키지에 포함된다. 이러한 방법은 특정 바이오마커 프로파일을 특정 상태로 분류하기 위해 사용할 수 있는 모델 또는 분류기를 생성한다.
통계 분석은 운영자 구현되거나 머신 러닝을 통해 구현될 수 있다.
C. 머신 러닝
선형 및 비선형 모델(예: CART-분류 및 회귀 트리와 같은 프로세스), 역 전파 네트워크와 같은 인공 신경망, 판별 분석(예: 베이지안 분류기 또는 피셔 분석), 로지스틱 분류기, 및 지원 벡터 분류기(예: 지원 벡터 머신)를 포함하여, 많은 유형의 분류 알고리즘이 이러한 목적에 적합하다. 컷오프와 같은 특정 분류기는 사람 검사에 의해 실행될 수 있다. 다변량 분류기와 같은 다른 분류기는 분류 알고리즘을 실행하기 위해 컴퓨터가 필요할 수 있다.
모델이라고도 하는 분류 알고리즘은, 하나 또는 다른 그룹으로 분류된 대상으로부터 유래된 바이오마커 측정의 데이터세트의 분석을 수행하는 머신 러닝 알고리즘에 의한 것을 포함하여, 수학적 분석에 의해 생성될 수 있다. 상기 분류 알고리즘의 유형을 생성하는 것들을 포함하여, 많은 머신 러닝 알고리즘이 당업계에 공지되어있다.
진단 검사는 민감도(진정 양성이 양성으로 분류된 백분율)와 특이성(진정 음성이 음성으로 분류된 백분율)에 의해 특징지어진다. 진단 검사의 상대적인 민감도와 특이성은 절충안을 수반할 수 있고, 이는 민감도가 높을수록 특이도가 낮을 수 있음을 의미하고 특이도가 높을수록 민감도가 낮을 수 있음을 의미한다. 이러한 상대 값은 수신자 조작 특성(ROC, receiver operating characteristic) 곡선 상에 표시될 수 있다. 바이오마커와 같은 변수의 세트의 진단력은 ROC 곡선의 AUC(area under the curve)에 의해 반영된다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 분류기는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 민감도를 가진다. 본 개시의 분류기는 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.8, 적어도 0.9 또는 적어도 0.95의 AUC를 가진다.
분류는 선택된 컷오프 수준보다 높거나 낮은 바이오마커의 측정에 기반할 수 있다. 특정 실시양태에서, 컷오프 값은 복수의 양성 및 음성 참조 샘플, 예를 들어 각 유형의 적어도 10, 20, 50, 100 또는 200개 샘플에서 바이오마커 수준을 측정함으로써 얻어진다. 컷오프는 음성 샘플의 평균, 중앙값 또는 모드와 같은 중심 경향의 측정과 관련하여 설정될 수 있다. 이 중심 경향의 측정으로부터 편차의 측정이 사용되어 컷오프를 설정할 수 있다. 예를 들어, 분산 또는 표준 편차에 기반한 컷오프를 설정할 수 있다. 예를 들어, 컷오프는 정규 표본의 평균보다 위의 많은 표준 편차, 예를 들어 표준 편차 1개, 표준 편차 2개, 표준 편차 3개 또는 표준 편차 4개)인 Z 점수에 기반할 수 있다. 예를 들어, 컷오프 값은 진단 테스트가 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 민감도, 특이성 및/또는 양성 예측 값을 갖도록 선택될 수 있다.
수치적으로, 증가된 위험은, 자간전증에 대한 1.0 초과, 바람직하게는 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3.0 초과의 승산 비율(odds ratio)과 관련된다.
다른 실시양태에서, 본원에 자간전증 바이오마커의 측정에 사용되는 동일한 마이크로 입자-풍부 분획으로부터 조산에 대한 바이오마커의 측정, 및 조산의 위험을 예측하기 위한 이들의 사용이 추가로 제공된다. 조산에 대한 바이오마커는 예를 들어 미국 공개 2015-0355188("조산에 대한 바이오마커") 및 국제 출원 WO 2017/096405("조산의 위험을 계층화하기 위한 순환하는 마이크로입자의 사용")에 기술된다.
VI. 자간전증에 대한 위험이 있는 대상을 치료하는 방법
자간전증을 앓고 있거나 증가된 위험에 있는 임신한 대상을 치료하는 방법은 자간전증을 치료하는데 유용한 치료적 개입의 투여를 포함한다. 이는, 예를 들어 상승된 혈압을 치료하기 위한 약학적 약물의 투여, 아스피린과 같은 약물 투여(예: 저용량 아스피린, 예를 들어 80mg), 스타틴 투여 및 자간전증의 증상에 대한 강화된 모니터링이 포함된다. 또한 보체 활성화의 표적 억제제의 투여도 포함된다.
VII. 키트
또 다른 실시양태에서, 본원에서는 샘플에서 자간전증의 증가된 위험에 대한 바이오마커를 탐지하는데 유용한 시약의 키트가 제공된다. 단백질 바이오마커를 탐지할 수 있는 시약은 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 단백질 바이오마커를 탐지할 수 있는 항체는 또한 전형적으로 형광단 또는 효소와 같은 분자에 직접 또는 간접적으로 연결되며, 이는 탐지가능한 반응을 촉매화하여 각각의 표적에 시약의 결합을 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 혈장으로부터 마이크로입자-풍부 샘플의 신속한 제조를 위해, 낮은 부피(예: 1ml, 3ml, 5ml, 10ml) 수직 컬럼에서 고분자량 겔 여과 조성물(예: SEPHAROSE와 같은 아가로스)을 포함하는 샘플 처리 물질을 추가로 포함한다. 예를 들어, 마이크로입자-풍부 샘플은 동결 및 추가 처리를 위해 분석 실험실로 배송하기 전에 관리의 시점에서 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 자간전증의 위험을 평가하기 위한 지침서를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지침서"는 대상으로부터 수득한 샘플에서 관심 단백질의 존재(발현 수준의 확정을 포함함)를 탐지하기 위한 키트에 함유된 시약을 사용하기 위한 지침을 지칭한다. 관심 단백질은 자간전증의 하나 이상의 바이오마커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지침서는 시험관내 진단 제품의 라벨링에서 미국 식품의약국(FDA)에서 요구하는 의도된 사용에 대한 설명을 추가로 포함한다. FDA는 시험관내 진단을 의료 기기로 분류하고 510(k) 절차를 통해 승인받는 것을 요구한다. 510(k)에 따른 신청서에 필요한 정보는 다음을 포함한다: 1) 상품명 또는 소유권, 일반 또는 일반적인 이름, 및 기기의 분류 이름을 포함한 시험관내 진단 제품 이름; 2) 제품의 의도된 용도; 3) 해당되는 경우, 510(k) 제출을 제출하는 소유자 또는 운영자의 시설 등록 번호; 시험관내 진단 제품이 FD&C 법의 섹션 513에 따라 배치된 분류, 알려진 경우 적절한 패널, 또는 소유자 또는 운영자가 기기가 해당 섹션에 따라 분류되지 않았다고 확정한다면, 시험관내 진단 제품이 그렇게 분류되지 않았다는 확정 및 그 확정에 대한 근거의 진술; 4) 해당되는 경우 사진 또는 엔지니어링 도면 포함하는, 시험관내 진단 제품, 의도된 용도 및 사용을 위한 지시를 설명하기에 충분한 제안된 라벨, 라벨링 및 광고; 5) 기기가 미국에서 상업적으로 유통되는 비교할만한 유형의 다른 시험관내 진단 제품과 유사하거나 다르다는 것을 나타내는 진술과 함께, 그 진술을 뒷받침하는 데이터; 6) 실질적 동등성 확정의 근거가 되는 안전성 및 유효성 데이터에 대한 510(k) 요약; 또는 FDA가 실질적인 동등성을 발견하는 것을 뒷받침하는 510(k) 안전성 및 유효성 정보는 서면 요청 후 30일 이내에 모든 사람이 이용할 수 있을 것이라는 진술; 7) 제출자가 아는 한, 시판 전 통지에 제출된 모든 데이터와 정보가 진실하고 정확하며 중요한 사실이 누락되지 않았다고 믿는다는 진술; 및 8) FDA가 실질적 동등성 확정을 내리는데 필요한 시험관내 진단 제품에 대한 임의의 추가적인 정보.
다른 실시양태에서, 키트는 예를 들어 바이오마커 단백질의 프로테아제(예를 들어트립신) 소화로부터 생성된 펩타이드와 같은 펩타이드 바이오마커에 상응하는 하나 또는 복수의 안정 동위원소 표준(SIS) 펩타이드를 함유하는 용기를 포함한다. 다른 실시양태에서, SIS 펩타이드의 대부분 또는 전부는 바이오마커 펩타이드에 상응한다. 다른 실시양태에서, 키트는 SIS 펩타이드가 상응하는 바이오마커 펩타이드를 추가로 포함한다.
VIII. 시스템
본원에는 또한 프로세서 및 메모리를 포함하는 컴퓨터를 포함하는 시스템이 제공된다. 컴퓨터는 샘플로부터 측정된 본원에 제공된 하나 이상의 바이오마커의 정량적 측정을 메모리로 수신하도록 구성될 수 있다. 메모리에는 컴퓨터 판독가능한 명령어가 포함될 수 있으며, 실행시 샘플을 자간전증 위험이 있거나 자간전증 위험이 없는 것으로 분류한다. 컴퓨터 시스템은 통신 인터페이스의 도움으로 컴퓨터 네트워크에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 네트워크는 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인터넷과 통신하는 인트라넷 및/또는 엑스트라넷일 수 있다. 경우에 따라 네트워크는 통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크는 클라우드 컴퓨팅과 같은 분산 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다. 이 시스템은, 이에 제한되는 것은 아니지만, DSL(Digital Subscriber Line), 케이블 모뎀, 광섬유, 무선, 위성 및 광대역 전력선 통신(BPL)을 포함하는 고속 전송 네트워크와 같은 통신 네트워크를 통해 두 번째 컴퓨터와 연결된 첫 번째 컴퓨터를 포함할 수 있다. 따라서, 샘플의 자간전증의 증가된 위험 또는 증가된 위험이 아닌 것으로 분류를 제공하는 결과는, 전송 컴퓨터에서 의료 서비스 제공자의 사무실에 위치된 원격 수신 컴퓨터, 또는 스마트 폰과 같은 모바일 장치로 전송될 수 있다.
실시예
약어: AUC(곡선 아래 면적); CI(신뢰 구간) CMP(순환하는 마이크로입자); FDR(허위 발견율) LC(액체 크로마토그래피); LMP(마지막 생리 기간); MRM(다중 반응 모니터링); MS(질량 분광법); ROC(수신자 조작 특성); SEC(크기-배제 크로마토그래피).
서론: 자간전증(PE) 병태생리학의 표준적 관점은 임신 첫 번째 3개월의 말기에 영양막 침습/기능의 이상이었다. 이 연구는 순환하는 마이크로입자(CMP) 단백질의 독특한 패턴이 이 임신 연령에서 PE가 발병한 여성을 구별할 수 있음을 보여주고, 이러한 패턴은 산모의 전신 및 자궁태반 수준에서 독특하고 이른 기능장애와 관련될 것이다.
목적: 순환하는 마이크로입자(CMP)는 대부분의 유형의 세포에서 분비되는 나노 크기의 지질이중층 입자이며 세포 통신과 행동 모두의 강력한 매개체로 점점 인식되고 있다. 이전 연구는 자간전증으로 진단된 여성의 순환하는 CMP 농도에서 증가와 관련되었다. 자간전증은 임신 첫 번째 3개월의 말기에 산모 자궁 및 전신 생리학과 비정상적인 영양막 상호작용을 특징으로 하기 때문에, CMP-관련 단백질 분석은 혈액 내에서 순환하는 단백질보다 더 많은 정보를 생성할 것으로 예상되고, 따라서 CMP는 자간전증의 임상 증상이 나타나기 훨씬 전에 분석할 수 있다. 임신 12주 중앙값에서 샘플링된 CMP 관련 단백질의 패턴은 자간전증의 발병이 진행되는 여성과 단순 임신한 여성에서 다를 것으로 예상된다.
설계: 단일 임신의 매칭된 케이스-대조군 연구가 수행되었다. 확인 편향과 잠재적인 배치 처리 효과를 최소화하기 위해, 샘플은 운영중인 진행중 출생 코호트에서 전향적으로 수집되고 보관된(-80℃) EDTA 혈장 샘플로부터 무작위로 선택했다.
실시예 1: 임신 10-12주 사이에 얻은 샘플에서 순환하는 엑소좀/마이크로입자 바이오마커의 단리
이 실시예는 혈액(예: 혈장 및/또는 혈청) 샘플을 사용하는 PE 환자에 대한 후향 연구를 설명한다. 이 연구는 동결된 산모 혈장 샘플에서 탐지된 단백질체 바이오마커의 내포된 사례 제어된 후향 분석이다. 모든 샘플은 IRB-승인된 프로토콜에 따라 수집되며 모든 환자는 연구 목적에 동의하였다. 샘플 수집을 위한 포함 기준에는 임신 10주(±2주) 및 임신 24주(±2주)의 두 시점에서 단일 임신을 가진 정상이고 건강한 무증상 여성의 기부가 포함된다. 저장소에 보관된 총 150개의 비-확인된 맹검 혈장 샘플(두 시점에서 75명의 대상, 이번 임신에서 PE를 경험한 대상 25명과 대조군으로 정상이고 건강한 임신한 대상 50명)은 드라이 아이스에서 하룻밤 동안 분석 실험실로 이송되고, -80℃에 보관된다.
방법: 10-12주 사이에 수득된 전향적으로 수집된 혈장 샘플로 25건의 단일 임신에서 산과 결과는 PE <35주에 대해 의사 검토자에 의해 검증되었다. 이들은 50건의 단순 단일 임신 출산과 일치하였다. 대조군은 샘플링에서 임신 연령이 일치되었다(+/-2주). 이 시료로부터 CMP는 크기-배제 크로마토그래피를 통해 단리되고 HRAM 질량 분광법을 기반으로 한 글로벌 프로테옴 프로파일링을 사용하여 분석되었다. 펩타이드와 단백질이 확인되고 정량화된 후 생성된 AUC 비율이 사용되어 케이스와 대조군 사이의 차등적인 발현을 확정하였다. 확인된 단백질은 의미있는 경로상호작용을 확인하기 위해 단백질 복합체 확장에 적용되었다. 유전자 개체발생(GO, gene ontogeny) 용어를 사용하여 생물학적 관련성을 조사하였다.
샘플 제조. 버퍼 및 작업 흐름도가 포함된 크기-배제 크로마토그래피가 최적의 샘플 제조 및 질량 분광기 분석과의 호환성을 위해 사용된다. 대안적인 샘플 제조 방법은 다른 분석 접근방식에 최적화된 버퍼/작업 흐름도 변경과 결합될 수 있거나; 또는 다른 조직 및 기관에서 유래한 엑소좀(즉, 태반 유래 엑소좀 또는 혈관 내피 유래 엑소좀)을 하위-선택하도록 설계된 새로운 풍부 측정과 결합될 수 있다.
마이크로입자는 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 풍부화되고 물(RNAse 없음, DNAse 없음, 증류수)을 사용하여 등용매적으로 용출된다. 간단히 말해서, PD-10 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)은 ABT(플로리다, 마이애미)로부터 시판되는 2% 아가로스 비드 표준(기공 크기 50-150um) 10mL로 포장되고, 세척되고, 사용 전 최소 24시간 및 3일보다 길지 않게 4℃에서 보관된다. 사용 당일에, 컬럼은 다시 세척되고 해동된 순수 혈장 샘플 1mL가 컬럼에 적용된다. 즉, 플라즈마 샘플은 SEC 이전에 여과, 희석 또는 처리되지 않는다.
순환하는 마이크로입자는, 높은 풍부한 단백질 피크로부터 부분적으로 분리된 컬럼 공극 부피에 포착된다. 200ug의 총 단백질(BCA에 의해 확정됨)을 포함하는 각 임상 시료로부터 뽑은 CMP 컬럼 분획의 한 분취량이 추가 분석에 사용된다.
보다 구체적으로, CMP는 크기-배제 크로마토그래피를 통해 단리되었다. 데이터는 HRAM 질량 분광법("고분해능, 정확한 질량 질량 분광법")을 기반으로 한 글로벌 프로테옴 프로파일링을 사용하여 분석되었다. 엑소좀 단백질을 트립신으로 소화한 다음 ThermoFisher Scientific에서 제조한 Orbitrap FusionTM LumosTM TribridTM 질량 분광기를 사용하여 분석했다. 이 높은 질량 분해능 시스템은 엑소좀으로부터 수득된 것과 같은 복잡한 혼합물을 분석하는데 특히 유용하다. 이 방법론은 펩타이드 및 기타 분자의 매우 복잡한 배경에서 저농도의 펩타이드를 탐지하려고 할 때 유용하다.
실시예 2: 자간전증이 발병하는 임신에서 임신 10-12주 사이에 순환하는 엑소좀/마이크로입자에서 단백질의 차등적 발현.
이 실시예는, 임신 10-12주에서, 순환하는 마이크로입자(CMP) 단백질의 독특한 패턴이 PE가 발병한 여성을 구별한다는 것을 보여주고, 이러한 패턴은 산모의 전신 및 자궁 태반 수준에서 독특한 초기 기능 장애와 관련 있다.
결과: 사례와 대조군은 평균 연령(32 대 31; p = 0.50), 비백인 비율(44 대 54; p = 0.38), 무분만 비율(24 대 28; p = 0.79)에 따라 차이가 없었으나, 만성 고혈압 비율(12 vs. 0; p = 0.01)과 이전 PE 비율(28 vs. 6; p = 0.01)에 따라 차이가 있었다. 비표적 분석은 10-12주에 두 샘플 세트에 존재하는 >600개의 고유한 단백질을 확인하였다. 0.1의 FDR로, 51개의 단백질이 케이스 대 대조군에서 차등적 발현을 나타냈다.
자간전증에 대한 바이오마커는 표 1에 제시된다.
그룹 극단적인 표현형에서도 발견됨 전체 이름 케이스 대 대조군 비율 차등적 발현
p 값
1 1 tr|A0A075B6I5|A0A075B6I5_HUMAN 단백질 IGLV1-51(단편) 1.22 0.041999999
1 1 tr|A2MYD2|A2MYD2_HUMAN V1-19 단백질(단편) 1.22 0.041999999
1 1 tr|J3KPJ3|J3KPJ3_HUMAN 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 키나아제 1 0.778 0.019400001
1 1 sp|O75334|LIPA2_HUMAN 리프린-알파-2 0.778 0.039099999
1 1 sp|P01702|LV104_HUMAN Ig 람다 체인 V-I 부위 NIG-64 1.22 0.041999999
1 1 sp|P06888|LV109_HUMAN Ig 람다 체인 V-I 부위 EPS 1.22 0.041999999
1 0 sp|P01023|A2MG_HUMAN 알파-2-마크로글로불린 0.811 0.0306
1 0 tr|B3KXX0|B3KXX0_HUMAN cDNA FLJ46242 fis, 클론 TESTI4018506, 신탁신-결합 단백질 5에 매우 유사함 0.796 0.040899999
1 0 sp|P05156|CFAI_HUMAN 보체 인자 I 1.26 0.018300001
1 0 sp|P01031|CO5_HUMAN 보체 C5 0.894 0.043900002
1 0 tr|Q14DD4|Q14DD4_HUMAN 신탁신 결합 단백질 5(Tomosyn) 0.796 0.040899999
1 0 tr|Q3LIE1|Q3LIE1_HUMAN 추정상 특성분석되지 않은 단백질 Nbla04300(단편) 0.796 0.040899999
1 0 tr|Q59GS8|Q59GS8_HUMAN 보체 구성요소 5 variant(단편) 0.894 0.043900002
1 0 tr|Q6LAM1|Q6LAM1_HUMAN 인자 I의 중쇄(단편) 1.26 0.018300001
1 0 tr|Q8WW88|Q8WW88_HUMAN CFI 단백질 1.26 0.018300001
1 0 sp|Q5T5C0|STXB5_HUMAN 신탁신-결합 단백질 5 0.796 0.040899999
2 1 sp|Q3SXY8|AR13B_HUMAN ADP-리보실화 인자-유사 단백질 13B 0.764 0.00512
2 1 sp|P02730|B3AT_HUMAN 밴드 3 음이온 운반 단백질 1.22 0.047800001
2 1 sp|O14514|BAI1_HUMAN 뇌-특이적 혈관신생 억제제 1 0.717 0.00332
2 1 sp|Q6RI45|BRWD3_HUMAN 브로모도메인 및 WD 반복체-함유 단백질 3 0.728 0.0124
2 1 tr|C6K6H8|C6K6H8_HUMAN MHC 클래스 I 항원 0.782 0.0107
2 1 sp|Q8IXQ3|CI040_HUMAN 특성분석되지 않은 단백질 C9orf40 1.21 0.032299999
2 1 sp|O14810|CPLX1_HUMAN 컴플렉신-1 0.78 0.0195
2 1 sp|Q6PUV4|CPLX2_HUMAN 컴플렉신-2 0.78 0.0195
2 1 tr|E5RG74|E5RG74_HUMAN 뇌-특이적 혈관신생 억제제 1 0.717 0.00332
2 1 tr|E9PNW5|E9PNW5_HUMAN 특성분석되지 않은 단백질 C4orf50 0.745 0.0253
2 1 tr|I6Y0B1|I6Y0B1_HUMAN MHC 클래스 I 항원(단편) 0.795 0.0244
2 1 tr|Q68D13|Q68D13_HUMAN 추정상 특성분석되지 않은 단백질 DKFZp779C159(단편) 0.765 0.0135
2 1 sp|Q14160|SCRIB_HUMAN 단백질 스크러블 동족체 0.765 0.0124
2 1 sp|Q6PGP7|TTC37_HUMAN 테트라트리코펩타이드 반복체 단백질 37 0.753 0.024599999
2 0 sp|Q16671|AMHR2_HUMAN 안티-뮬러리안 호르몬 타입-2 리셉터 0.786 0.026699999
2 0 tr|B2RB52|B2RB52_HUMAN cDNA, FLJ95314, 호모 사피엔스 트랜스듀신(베타)-유사 2(TBL2)에 매우 유사, 전사물 변이 1, mRNA 0.793 0.0383
2 0 tr|B2RBZ5|B2RBZ5_HUMAN cDNA, FLJ95778, 호모 사피엔스 세르핀 펩티다아제 억제제에 매우 유사, 클레이드 A(알파-1 안티프로테이나아제, 안티트립신), 멤버 10(SERPINA10), mRNA 0.796 0.044300001
2 0 tr|B4DG07|B4DG07_HUMAN cDNA FLJ58159, RAB6-상호작용 단백질 2에 매우 유사 0.762 0.0484
2 0 tr|G3V2W1|G3V2W1_HUMAN 단백질 Z-의존성 프로테아제 억제제 0.796 0.044300001
2 0 tr|H3BPI9|H3BPI9_HUMAN 안티-뮬러리안 호르몬 타입-2 리셉터(단편) 0.786 0.026699999
2 0 sp|Q9HDC5|JPH1_HUMAN 정크토필린-1 0.804 0.0308
2 0 sp|Q15784|NDF2_HUMAN 신경원성 분화 인자 2 0.879 0.0449
2 0 tr|Q4KMX3|Q4KMX3_HUMAN JPH1 단백질(단편) 0.804 0.0308
2 0 tr|Q5U0R0|Q5U0R0_HUMAN 신경원성 분화 인자 0.879 0.0449
2 0 tr|Q7Z682|Q7Z682_HUMAN 추정상 특성분석되지 않은 단백질 DKFZp779I2251(단편) 0.804 0.0308
2 0 tr|Q86VR1|Q86VR1_HUMAN JPH1 단백질(단편) 0.804 0.0308
2 0 sp|Q9UK55|ZPI_HUMAN 단백질 Z-의존성 프로테아제 억제제 0.796 0.044300001
3 1 sp|Q53TS8|AL2SA_HUMAN 근위축성 측삭 경화증 2 염색체 부위 후보 유전자 11 단백질 0.795 0.0634
3 1 sp|P01762|HV301_HUMAN Ig 중쇄 V-III 부위 TRO 1.18 0.074199997
3 1 sp|A0M8Q6|LAC7_HUMAN Ig 람다-7 체인 C 부위 1.13 0.078100003
3 1 tr|Q9UL88|Q9UL88_HUMAN 마이오신-반응성 면역글로불린 중쇄 변이 부위(단편) 1.18 0.074199997
3 0 sp|P52209|6PGD_HUMAN 6-포스포글루코네이트 탈수소효소, 탈카르복실화 0.933 0.034600001
3 0 tr|A0A075B6I8|A0A075B6I8_HUMAN 단백질 IGLV1-47(단편) 1.18 0.0451
3 0 tr|A0A075B6J8|A0A075B6J8_HUMAN 단백질 IGLV3-19(단편) 0.842 0.070600003
3 0 tr|A0PJD1|A0PJD1_HUMAN ZNF200 단백질(단편) 1.19 0.0458
3 0 tr|A2MYD0|A2MYD0_HUMAN V1-17 단백질(단편) 1.18 0.0451
3 0 tr|A4F255|A4F255_HUMAN 면역글로불린 G1 Fab 중쇄 변이 부위(단편) 1.09 0.093000002
3 0 tr|B2R815|B2R815_HUMAN cDNA, FLJ93695, 호모 사피엔스 세르핀 펩티다아제 억제제에 매우 유사, 클레이드 A(알파-1 안티프로테이나아제, 안티트립신), 멤버 4(세르핀A4), mRNA 0.899 0.070799999
3 0 tr|B2R950|B2R950_HUMAN cDNA, FLJ94213, 호모 사피엔스 프레그넌시-존 단백질(PZP)에 매우 유사, mRNA 0.853 0.0506
3 0 tr|B3KNF3|B3KNF3_HUMAN cDNA FLJ14501 fis, 클론 NT2RM1000199, 호모 사피엔스 발작 관련된 6 동족체-유사 2(SEZ6L2)에 매우 유사, 전사물 변이 2, mRNA 1.18 0.0265
3 0 tr|B3KP91|B3KP91_HUMAN cDNA FLJ31448 fis, 클론 NT2NE2000950, 징크 핑거 단백질 200에 매우 유사 1.19 0.0458
3 0 tr|B7Z7M2|B7Z7M2_HUMAN cDNA FLJ51564, 프레그넌시 존 단백질에 매우 유사 0.847 0.060899999
3 0 tr|B7ZMN7|B7ZMN7_HUMAN LYST 단백질 0.859 0.077699997
3 0 sp|Q5M775|CYTSB_HUMAN 사이토스핀-B 1.17 0.046399999
3 0 sp|Q68D51|DEN2C_HUMAN DENN 도메인-함유 단백질 2C 0.793 0.057999998
3 0 tr|E9KL26|E9KL26_HUMAN 부고환 조직 단백질 Li 173 0.901 0.090400003
3 0 tr|F8VY04|F8VY04_HUMAN 아데닐레이트 키나아제 2, 미토콘드리아성 0.909 0.059999999
3 0 tr|F8VZG5|F8VZG5_HUMAN 아데닐레이트 키나아제 2, 미토콘드리아성 0.909 0.059999999
3 0 tr|F8W1A4|F8W1A4_HUMAN 아데닐레이트 키나아제 2, 미토콘드리아성 0.909 0.059999999
3 0 tr|F8W7L3|F8W7L3_HUMAN 알파-2-마크로글로불린(단편) 0.84 0.066600002
3 0 tr|G3V213|G3V213_HUMAN 아데닐레이트 키나아제 2, 아이소폼 CRA_a 0.909 0.059999999
3 0 tr|H0YFH1|H0YFH1_HUMAN 알파-2-마크로글로불린(단편) 0.859 0.063500002
3 0 tr|H0YJW9|H0YJW9_HUMAN 특성분석되지 않은 단백질(단편) 1.18 0.0506
3 0 tr|H3BN26|H3BN26_HUMAN 발작 6-유사 단백질 2(단편) 1.18 0.0265
3 0 tr|I3L1E4|I3L1E4_HUMAN 징크 핑거 단백질 200(단편) 1.19 0.0458
3 0 sp|P05155|IC1_HUMAN 혈장 프로테아제 C1 억제제 0.901 0.090400003
3 0 tr|J7HH10|J7HH10_HUMAN 비트로넥틴(단편) 1.16 0.069499999
3 0 tr|K7EM49|K7EM49_HUMAN 6-포스포글루코네이트 탈수소효소, 탈카르복실화(단편) 0.933 0.034600001
3 0 tr|K7EMN2|K7EMN2_HUMAN 6-포스포글루코네이트 탈수소효소, 탈카르복실화(단편) 0.933 0.034600001
3 0 tr|K7EPF6|K7EPF6_HUMAN 6-포스포글루코네이트 탈수소효소, 탈카르복실화(단편) 0.933 0.034600001
3 0 sp|P54819|KAD2_HUMAN 아데닐레이트 키나아제 2, 미토콘드리아성 0.909 0.059999999
3 0 sp|P29622|KAIN_HUMAN 칼리스타틴 0.899 0.070799999
3 0 sp|P55268|LAMB2_HUMAN 라미닌 서브유닛 베타-2 0.823 0.066299997
3 0 sp|P01700|LV102_HUMAN Ig 람다 체인 V-I 부위 HA 1.18 0.0451
3 0 sp|P04208|LV106_HUMAN Ig 람다 체인 V-I 부위 WAH 1.18 0.0451
3 0 sp|Q99698|LYST_HUMAN 리소좀-트래픽킹 레귤레이터 0.859 0.077699997
3 0 sp|Q13219|PAPP1_HUMAN 파파라이신-1 0.814 0.054099999
3 0 sp|P36955|PEDF_HUMAN 색소 상피-유래 인자 1.14 0.066600002
3 0 sp|Q92954|PRG4_HUMAN 프로테오글리칸 4 1.19 0.064499997
3 0 sp|P20742|PZP_HUMAN 프레그넌시 존 단백질 0.853 0.0506
3 0 tr|Q5NV73|Q5NV73_HUMAN V2-13 단백질(단편) 0.842 0.070600003
3 0 tr|Q8N2F8|Q8N2F8_HUMAN cDNA PSEC0195 fis, 클론 HEMBA1001322, 알파-ADAPTIN C에 매우 유사 0.838 0.079499997
3 0 tr|Q9Y6X7|Q9Y6X7_HUMAN KIAA0864 단백질(단편) 0.855 0.0713
3 0 sp|Q9P2N5|RBM27_HUMAN RNA-결합 단백질 27 0.823 0.067900002
3 0 sp|Q6UXD5|SE6L2_HUMAN 발작 6-유사 단백질 2 1.18 0.0265
3 0 sp|Q9NUV7|SPTC3_HUMAN 세린 팔미토일트랜스퍼라제 3 0.862 0.0682
3 0 sp|P78524|ST5_HUMAN 종양원성 5 단백질의 억제 0.794 0.057
3 0 sp|Q9ULT0|TTC7A_HUMAN 테트라트리코펩타이드 반복체 단백질 7A 0.794 0.057
3 0 tr|U3KPZ7|U3KPZ7_HUMAN RNA-결합 단백질 27 0.823 0.067900002
3 0 tr|X5D2T7|X5D2T7_HUMAN 발작 관련된 6-유사 단백질 2 아이소폼 E(단편) 1.18 0.0265
3 0 tr|X5D7P3|X5D7P3_HUMAN 발작 관련된 6-유사 단백질 2 아이소폼 B(단편) 1.18 0.0265
3 0 tr|X5D9C2|X5D9C2_HUMAN 발작 관련된 6-유사 단백질 2 아이소폼 G(단편) 1.18 0.0265
3 0 tr|X5D9G4|X5D9G4_HUMAN 발작 관련된 6-유사 단백질 2 아이소폼 C 1.18 0.0265
3 0 tr|X5DNZ5|X5DNZ5_HUMAN 발작 관련된 6-유사 단백질 2 아이소폼 D(단편) 1.18 0.0265
3 0 sp|P98182|ZN200_HUMAN 징크 핑거 단백질 200 1.19 0.0458
관련된 생물학적 기능은 표 2에 기재된다.
표 2: 임신 10-12 주에서 차등적으로 발현된 순환하는 엑소좀/마이크로입자와 관련된 생물학적 기능.
GO 이름 q-값
상피 성장 인자 시그널링의 음성 조절 1.07E-02
단백질 탈인산화의 음성 조절 1.60E-02
트롬빈 리셉터 시그널링 1.92E-02
세포 과삼투 반응 2.10E-02
세포 형태형성 2.60E-02
괴사성 세포 죽음의 음성 조절 2.80E-02
글루코코르티코이드 시그널링 경로 3.20E-02
DNA 의존성 전사의 조절 3.50E-02
단백질 헤테로올리고화 3.60E-02
형태형성에 포합된 해부학적 구조 형성 3.81E-02
나트륨 이온 트랜스멤브레인 운반자 활성의 조절 4.76E-02
응고의 조절 4.80E-02
줄기 세포 분화 4.20E-02
보체 활성의 조절 5.28E-02
토론: 이 연구는 PE와 함께 진행하는 임신에서 차등적인 발현을 증명하는 10-12주에 CMP 관련 단백질 바이오마커의 후보 세트를 확인한다. 알려진 단백질 기능은 다양한 새로운 과정을 포함하는 생물학적 타당성을 나타낸다.
확인된 단백질 바이오마커는 응고, 면역 조절 및 보체 시스템에 연결된 상호-관련된 전신적 생물학적 네트워크, 또는 세포 사멸/분화, 형태형성과 같은 국소 조직 및 세포 과정과 같은, 주요 생리적 및 발달 과정에 포함될 수 있다. 지금까지 자간전증에 포함되는 것으로 알려지거나 알려지지 않은, 이들 과정 사이의 미지의 과정 또는 관계가 확인될 수 있다. 이러한 필수 과정의 기능화는, 부분적으로, 다양한 세포와 조직 사이의 CMP 상호작용에 의해 매개될 수 있다. 이 접근법의 잠재적인 생물학적 및 임상적 중요성은 자간전증 및 가능하게는 기타 산과 증후군 및 상태에서 단백질 조절장애의 비침습적 탐지 및 모니터링에 있다. 또한 단백질 바이오마커 정량화 수준(마이크로입자 기반 테스트)에서 유래된 분류자 모델은 활용되어 PE의 위험을 계층화하고 치료를 포함한 다양한 개입을 통해 위험 그룹에서 치료할 수 있다.
실시예 3: 자간전증 위험에 대한 바이오마커 및 바이오마커 패널
감독된 CMP 관련 단백질 분류를 위한 파이프라인이 생성되었다. 확인된 펩타이드 및 단백질 목록이 알려진 단백질 상호작용을 위해 STRING 데이터베이스에 제출되었다. string-db.org/. 5개보다 많은 문서화된 상호작용을 가진 단백질은 유지되었다. 블록 무작위화가 데이터를 트레이닝 및 테스트 세트로 나누기 위해 사용되었다. 트레이닝 세트 내에서 앙상블 특징 선택이 사용되어 자간전증 대 대조군과 유의미하고 일관되게 연관된 가장 유익한 개별 단백질의 하위집합을 생성하였다. 그 다음 로지스틱 회귀 모델링을 사용한 5-배 교차 검증을 사용하여 이 하위집합에서 도출된 모든 가능한 다변량 모델의 정보 내용을 조사하였다. 그 다음 최고 성능의 교차 검증된 후보 모델이 테스트 세트에 대해 실행되어 독립 데이터에 대한 성능을 설정하였다. 단백질 기능은 UniProt 데이터베이스를 참조하여 확정되었다.
예측 모델을 생성하는데 사용되는 머신 러닝 방법에는 "앙상블 특징 선택", "로지스틱 회귀" 및 "순열 분석"과 같은 여러 태양이 포함된다.
최고 후보 CMP 관련 단백질의 분자 기능은, 응고 및 혈소판 활성화, 세포 접착(세포-대-세포 및 세포-대-매트릭스), 이동 및 화학주성, 세포 증식, 세포 분화 및 형태형성, 혈관신생, 지방세포 지질 대사, 지단백 대사, 지단백 리파제 활성, 콜레스테롤 생합성, 하위-세포 구조의 세포내 조직(특히 근소포체 및 소포체), 칼슘 방출 및 시그널링, 보체 활성화 및 막 공격 복합체 조립, 타고난 면역 반응, 엔도펩티다아제 억제, 미세관-기반 섬모 운동 및 정자 운동성, ER 스트레스, 신경전달 물질 및 신경 펩타이드 엑소사이토시스를 포함하는 다양한 중요한 세포 및 혈액-기반 생물학적 기능과 관련이 있다.
도 1은 자간전증 위험에 대한 바이오마커 및 바이오마커 패널을 확인하기 위한 개략적 작업 흐름도를 보여준다. 작업 흐름도는 다음 작업을 포함한다: 연구용 샘플이 제공된다. 이 경우, 75개의 원본 샘플 중 73개가 연구를 위해 선택되었으며, 그 중 23개는 자간전증 대상이고, 50개는 대조군이었다. 샘플은 58개 샘플의 트레이닝 세트와 15개 샘플의 테스트 세트로 나뉘어졌다.
초기 머신 러닝 분석
트레이닝 세트의 각 샘플에서 단백질의 정량적 측정이 확정되었다. 이러한 측정은 자간전증의 위험을 예측하는 모델을 개발하기 위해 머신 러닝으로 분석되었다. 3 내지 5개의 단백질 바이오마커 패널을 포함하는 최고 성능의 모델이 선택되었다. 5-배 교차 검증이 사용되었다. 성능은 곡선 아래 영역(AUC)의 함수이었다. 내부 테스트의 이 첫 번째 라운드에서 가장 성능이 좋은 모델이 도 3에 제시된다. 단백질은, 예를 들어 SwissProt와 같이 공개적으로 허용가능한 다양한 단백질 데이터베이스 중에서 임의의 것에서 단백질 이름, 유전자 이름 또는 수탁 번호로 확인된다.
이들 단백질의 일부에 대한 추가적인 확인 정보가 표 3에 제시된다.
목록 단백질 이름 유전자 이름 길이
A2N0U6_HUMAN VH6DJ 단백질(단편) VH6DJ 116
A0A024R8D8_HUMAN 프로게스타겐-관련된 자궁 내막 단백질(태반 단백질 14, 임신-관련된 자궁 내막 알파-2-글로불린, 알파 자궁 단백질), 아이소폼 CRA_d PAEP hCG_28728 180
B2R6L0_HUMAN 튜불린 베타 체인 445
GP1BA_HUMAN 혈소판 당단백질 Ib 알파 체인(GP-Ib 알파)(GPIb-알파)(GPIbA)(당단백질 Ib알파)(항원 CD42b-알파)(CD 항원 CD42b) [글리코칼리신으로 절단됨] GP1BA 652
Q96TB4_HUMAN 엔벨롭 단백질(단편) env 180
Q5NV82_HUMAN V4-2 단백질(단편) V4-2 104
E3UVQ2_HUMAN BCL6 코리프레서/레틴산 리셉터 알파 퓨전 단백질 BCOR-RARA 1931
E9PQG4_HUMAN 미오메갈린 PDE4DIP 740
L0R6N9_HUMAN 대안적인 단백질 SETD1A SETD1A 340
VTNC_HUMAN 비트로넥틴(VN)(S-단백질)(혈청-스프레딩 인자)(V75) [비트로넥틴 V65 서브유닛; 비트로넥틴 V10 서브유닛; 소마토메딘-B으로 절단됨] VTN 478
C1RL_HUMAN 보체 C1r 서브컴포넌트-유사 단백질(C1r-LP)(C1r-유사 단백질)(EC 3.4.21.-)(C1r-유사 세린 프로테아제 유사체 단백질)(CLSPa) C1RL C1RL1 C1RLP CLSPA 487
MBL2_HUMAN 만노오스-결합 단백질 C(MBP-C)(Col렉틴-1)(MBP1)(만난-결합 단백질)(만노오스-결합 렉틴) MBL2 COLEC1 MBL 248
B2R815_HUMAN cDNA, FLJ93695, 호모 사피엔스 세르핀 펩티다아제 억제제에 매우 유사, 클레이드 A(알파-1 안티프로테이나아제, 안티트립신), 멤버 4(세르핀A4), mRNA 427
D6MJD1_HUMAN MHC 클래스 I 항원(단편) HLA-A 181
ZA2G_HUMAN 징크-알파-2-당단백질(Zn-알파-2-GP)(Zn-알파-2-당단백질) AZGP1 ZAG ZNGP1 298
A0A024R9I2_HUMAN 무스카린성 아세틸콜린 리셉터 CHRM5 hCG_37416 532
TPC11_HUMAN 트래픽킹 단백질 입자 착체 서브유닛 11 TRAPPC11 C4orf41 1133
CO5_HUMAN 보체 C5(C3 및 PZP-유사 알파-2-마크로글로불린 도메인-함유 단백질 4) [보체 C5 베타 체인; 보체 C5 알파 체인; C5a 아나필라톡신; 보체 C5 알파' 체인으로 절단됨] C5 CPAMD4 1676
A0A024R3Z1_HUMAN 마이크로튜불-관련된 단백질 MAP2 hCG_1776452 1858
A8K008_HUMAN 특성분석되지 않은 단백질 472
B2R4C5_HUMAN 리소자임(EC 3.2.1.17) LYZ LYZF1 hCG_24462 148
B4E1D8_HUMAN cDNA FLJ51597, C4b-결합 단백질 알파 체인과 매우 유사 536
GP112_HUMAN 점착 G-단백질 결합된 리셉터 G4(G-단백질 결합된 리셉터 112) ADGRG4 GPR112 3080
F8VY04_HUMAN 아데닐레이트 키나아제 2, 미토콘드리아성 AK2 190
AACT_HUMAN 알파-1-안티키모트립신(ACT)(세포 성장억제 유전자 24/25 단백질)(세르핀 A3) [알파-1-안티키모트립신 His-Pro-less로 절단됨] 세르핀A3 AACT GIG24 GIG25 423
B7ZKK7_HUMAN eIF2AK2 단백질 EIF2AK2 546
FA11_HUMAN 응고 인자 XI(FXI)(EC 3.4.21.27)(혈장 트롬보플라스틴 선행물질)(PTA) [응고 인자 XIa 중쇄; 응고 인자 XIa 경쇄로 절단됨] F11 625
M0QZN2_HUMAN 40S 리보좀 단백질 S5 RPS5 134
A0A024RAW9_HUMAN WW 도메인 결합 단백질 11, 아이소폼 CRA_a WBP11 hCG_24415 641
A2MYE2_HUMAN A30 단백질(단편) A30 96
APOC2_HUMAN 아포리포단백질 C-II(Apo-CII)(ApoC-II)(아포리포단백질 C2) [프로아포리포단백질 C-II(ProapoC-II)로 절단됨] APOC2 APC2 101
APOD_HUMAN 아포리포단백질 D(Apo-D)(ApoD) APOD 189
APOH_HUMAN 베타-2-당단백질 1(APC 억제제)(활성화된 단백질 C-결합 단백질)(안티카르디오리핀 보조인자)(아포리포단백질 H)(Apo-H)(베타-2-당단백질 I)(B2GPI)(베타(2)GPI) APOH B2G1 345
B4DDG3_HUMAN cDNA FLJ51688, 절단 자극 인자 50 kDa 서브유닛에 매우 유사 418
CAPS1_HUMAN 칼슘-의존성 분비 활성자 1(분비를 위한 칼슘-의존성 활성자 단백질 1)(CAPS-1) CADPS CAPS CAPS1 KIAA1121 1353
DYH3_HUMAN 다이네인 중쇄 3, 축세사(축세사 베타 다이네인 중쇄 3)(HsADHC3)(모양체 다이네인 중쇄 3)(Dnahc3-b) DNAH3 DNAHC3B 4116
E7EVP7_HUMAN 삭제됨
F8VV57_HUMAN 케라틴, 타입 II 세포골격 5(단편) KRT5 132
HEP2_HUMAN 헤파린 보조인자 2(헤파린 보조인자 II)(HC-II)(프로테아제 억제제 류세르핀-2)(HLS2)(세르핀 D1) 세르핀D1 HCF2 499
JPH1_HUMAN 정크토필린-1(JP-1)(정크토필린 타입 1) JPH1 JP1 661
LCAT_HUMAN 포스파티딜콜린-스테롤 아실트랜스퍼라제(EC 2.3.1.43)(레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제)(포스포리피드-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제) LCAT 440
PIGR_HUMAN 폴리머성 면역글로불린 리셉터(PIgR)(폴리-Ig 리셉터)(
간세포암종-관련된 단백질 TB6)
[분비성 구성요소로 절단됨]		 PIGR 764
Q59EP2_HUMAN 안지오텐시노겐 변이체(단편) 491
Q5NV90_HUMAN V2-17 단백질(단편) V2-17 97
Q8IWX2_HUMAN 히아루로난 결합 단백질(단편) HABP2 516
TSP1_HUMAN 트롬보스폰딘-1(당단백질 G) THBS1 TSP TSP1 1170
이어서, 수득된 모델은 샘플 테스트 세트의 데이터에 대해 검증되었다. 이 검증 단계에서 가장 성능이 좋은 모델이 도 4a 및 도 4b에 제시된다.
이 검증 단계에서 최고 성능 모델에서 단백질 발생 빈도는 아래 표 4에 제시된다.
단백질 빈도
1 A2N0U6 87
2 A0A024R8D8 68
3 B2R6L0 27
4 GP1BA 25
5 Q96TB4 24
6 A0A075B6I4 19
7 Q5NV82 19
8 E3UVQ2 13
9 E9PQG4 12
10 L0R6N9 12
11 VTNC 12
12 C1RL 11
13 MBL2 10
14 B2R815 9
15 D6MJD1 9
16 ZA2G 9
17 A0A024R9I2 7
18 TPC11 7
19 CO5 6
20 A0A024R3Z1 5
21 A8K008 4
22 B2R4C5 4
23 B4E1D8 4
24 GP112 4
25 A0A075B6H9 3
다음으로, 이전 모델 구축 단계에서 확인된 단백질은 STRING 단백질 데이터베이스와 비교되었다. string-db.org/. (i) 해당 데이터베이스에 존재하고, (ii) 데이터베이스에 있는 적어도 4개의 단백질과 네트워크로 연결된 단백질이 추가 연구를 위해 선택되었다. (도 1 - STRING 데이터베이스에서 주석이 없고 네트워크에서 4개 보다 많은 에지를 가진 단백질/펩타이드 제거)
선택된 단백질을 사용하는 새로운 모델이 생성되었고, 곡선 아래 면적으로 측정된 최고 성능의 바이오마커 패널이 선택되었다. 이러한 모델은 도 5에 제시된다. (패널 1-24.)
아래 표 5는 자간전증에 대한 단백질 바이오마커와 이러한 바이오마커가 머신 러닝에 의해 생성된 바이오마커 패널에 나타나는 빈도를 제공한다.
단백질 빈도
1 GP1BA 79
2 VTNC 57
3 C1RL 49
4 ZA2G 46
5 APOC2 37
6 APOH 30
7 JPH1 28
8 CO5 16
9 HEP2 16
10 TPC11 14
11 MBL2 11
12 AACT 8
13 DYH3 7
14 TSP1 7
15 CAPS1 6
16 APOD 3
17 LCAT 1
아래 표 6은 표 5에 제시된 단백질 바이오마커에 대한 정보를 제공한다.
단백질 단백질 이름 유전자 이름 길이
GP1BA_HUMAN 혈소판 당단백질 Ib 알파 체인(GP-Ib 알파)(GPIb-알파)(GPIbA)(당단백질 Ib알파)(항원 CD42b-알파)(CD 항원 CD42b) [글리코칼리신으로 절단됨] GP1BA 652
VTNC_HUMAN 비트로넥틴(VN)(S-단백질)(혈청-스프레딩 인자)(V75) [비트로넥틴 V65 서브유닛; 비트로넥틴 V10 서브유닛; 소마토메딘-B으로 절단됨] VTN 478
C1RL_HUMAN 보체 C1r 서브컴포넌트-유사 단백질(C1r-LP)(C1r-유사 단백질)(EC 3.4.21.-)(C1r-유사 세린 프로테아제 유사체 단백질)(CLSPa) C1RL C1RL1 C1RLP CLSPA 487
ZA2G_HUMAN Zinc-알파-2-당단백질(Zn-알파-2-GP)(Zn-알파-2-당단백질) AZGP1 ZAG ZNGP1 298
APOC2_HUMAN 아포리포단백질 C-II(Apo-CII)(ApoC-II)(아포리포단백질 C2) [Pro아포리포단백질 C-II(ProapoC-II)로 절단됨] APOC2 APC2 101
APOH_HUMAN 베타-2-당단백질 1(APC 억제제)(활성화된 단백질 C-결합 단백질)(안티카르디오리핀보조인자)(아포리포단백질 H)(Apo-H)(베타-2-당단백질 I)(B2GPI)(베타(2)GPI) APOH B2G1 345
JPH1_HUMAN 정크토필린-1(JP-1)(정크토필린 타입 1) JPH1 JP1 661
CO5_HUMAN 보체 C5(C3 및 PZP-유사 알파-2-마크로글로불린 도메인-함유 단백질 4) [보체 C5 베타 체인; 보체 C5 알파 체인; C5a 아나필라톡신; 보체 C5 알파' 체인으로 절단됨] C5 CPAMD4 1676
HEP2_HUMAN 헤파린 보조인자 2(헤파린 보조인자 II)(HC-II)(프로테아제 억제제 류세르핀-2)(HLS2)(세르핀 D1) 세르핀D1 HCF2 499
TPC11_HUMAN 트래픽킹 단백질 입자 착체 서브유닛 11 TRAPPC11 C4orf41 1133
MBL2_HUMAN 만노오스-결합 단백질 C(MBP-C)(콜렉틴-1)(MBP1)(만난-결합 단백질)(만노오스-결합 렉틴) MBL2 COLEC1 MBL 248
AACT_HUMAN 알파-1-안티키모트립신(ACT)(세포 성장-억제 유전자 24/25 단백질)(세르핀 A3) [알파-1-안티키모트립신 His-Pro-less로 절단됨] 세르핀A3 AACT GIG24 GIG25 423
DYH3_HUMAN 다이네인 중쇄 3, 축세사(축세사 베타 다이네인 중쇄 3)(HsADHC3)(모양체 다이네인 중쇄 3)(Dnahc3-b) DNAH3 DNAHC3B 4116
TSP1_HUMAN 트롬보스폰딘-1(당단백질 G) THBS1 TSP TSP1 1170
CAPS1_HUMAN 칼슘-의존성 분비 활성자 1(분비 1을 위한 칼슘-의존성 활성자 단백질)(CAPS-1) CADPS CAPS CAPS1 KIAA1121 1353
APOD_HUMAN 아포리포단백질 D(Apo-D)(ApoD) APOD 189
LCAT_HUMAN 포스파티딜콜린-스테롤 아실트랜스퍼라제(EC 2.3.1.43)(레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제)(포스포리피드-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제) LCAT 440
본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한 다음 의미가 적용된다. "할 수 있다(may)"라는 단어는 의무적 의미(즉, 필수를 의미함)보다는 관용적 의미(즉, 잠재력이 있음을 의미)로 사용된다. 단어 "포함하다(include)", "포함하는(including)" 및 "포함하다(includes)" 등은 포함하지만, 이에 제한되지 않음을 의미한다. 단수형 "a", "an" 및 "the"는 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "요소(an element)"에 대한 언급은 "하나 이상(one or more)"과 같은 하나 이상의 요소에 대한 다른 용어 및 구의 사용에도 불구하고, 둘 이상의 요소의 조합을 포함한다. 용어 "또는"은, 달리 표시되지 않는 한, 비-배타적, 즉 "및" 및 "또는" 둘 다를 동반한다. 수식어와 서열 사이의 "임의의(any of)"이라는 용어는 수식어가 시퀀스의 각 구성원을 수식함을 의미한다. 따라서, 예를 들어, "1, 2 또는 3 중 적어도 임의의 것"이라는 문구는 "적어도 1, 적어도 2 또는 적어도 3"을 의미한다. 용어 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 인용된 요소 및 청구된 조합의 기본적이고 새로운 특성에 물질적인 영향을 주지 않는 기타 요소의 포함을 의미합니다.
상세한 설명 및 도면은 본 발명을 개시된 특정 형태로 제한하려는 것이 아니라, 반대로 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상 및 범위 내에 속하는 모든 변형, 균등물 및 대안을 커버하는 것을 의도하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 다양한 태양의 추가 변형 및 대안적인 실시예는 이 설명을 고려하여 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 이 설명 및 도면은 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 당업자에게 본 발명을 수행하는 일반적인 방식을 가르치기 위한 것이다. 본 명세서에 도시되고 설명된 본 발명의 형태는 실시양태의 예시로서 받아들여져야 한다는 것을 이해해야 한다. 요소 및 재료는 본 명세서에 예시되고 기술된 것들로 대체될 수 있고, 부분 및 과정은 반전되거나 생략될 수 있으며, 본 발명의 특정한 특징은 본 발명의 이 설명의 이점을 얻은 후 당업자에게 명백할 것이기 때문에 독립적으로 사용될 수 있다. 후속하는 청구범위에 기술된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기술된 요소들이 변경될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 표제는 단지 구조적 목적을 위한 것이며, 설명의 범위를 제한하기 위해 사용되는 것은 아니다.

Claims (62)

  1. 임신한 대상에서 자간전증의 위험을 평가하는 방법으로서, 방법은:
    (a) 임신한 대상으로부터의 혈액 샘플에서 마이크로입자-풍부 분획을 제조하는 단계;
    (b) 분획에서 하나 이상의 마이크로입자-관련된 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계로, 여기서 하나 이상의 단백질 바이오마커는,
    (i) 표 1의 단백질 바이오마커;
    (ii) A2N0U6, A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA, Q96TB4, A0A075B6I4, Q5NV82, E3UVQ2, E9PQG4, L0R6N9, VTNC, C1RL, MBL2, B2R815, D6MJD1, ZA2G, A0A024R9I2, TPC11, CO5, A0A024R3Z1, A8K008, B2R4C5, B4E1D8, GP112, A0A075B6H9 세트의 단백질 바이오마커; 및
    (iii) GP1BA, VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2, APOH, JPH1, CO5, HEP2, TPC11, MBL2, AACT, DYH3, TSP1, CAPS1, APOD, LCAT 세트의 단백질 바이오마커;
    로부터 선택되는 것인 단계; 및
    (c) 상기 측정에 기반하여 자간전증의 위험을 평가하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상향-조절된 바이오마커의 증가된 양 또는 하향-조절된 바이오마커의 감소된 양은 자간전증의 증가된 위험을 나타내는 것인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    표 1의 단백질 바이오마커로부터 선택된 복수의 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 단백질 바이오마커는 표 1: 그룹 1, 그룹 2 또는 그룹 3에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 단백질 바이오마커는 면역 기능, 세포 시그널링, 혈관신생, 세포자멸사, 매트릭스 부착, 세포 기능, 단백질 대사, 이온 수송 및 미지의 기능으로부터 선택된 복수의 생물학적 기능의 각각으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    심한 자간전증의 위험을 확정하는 단계를 포함하고, 여기서 바이오마커 또는 바이오마커들은 0A075B6I5_HUMAN, A2MYD2_HUMAN, AL2SA_HUMAN, AR13B_HUMAN, B3AT_HUMAN, BAI1_HUMAN, BRWD3_HUMAN, C6K6H8_HUMAN, CI040_HUMAN, CPLX1_HUMAN, CPLX2_HUMAN, E5RG74_HUMAN, E9PNW5_HUMAN, HV301_HUMAN, I6Y0B1_HUMAN, J3KPJ3_HUMAN, LAC7_HUMAN, LIPA2_HUMAN, LV104_HUMAN, LV109_HUMAN, Q68D13_HUMAN, Q9UL88_HUMAN, SCRIB_HUMAN 및 TTC37_HUMAN으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    A2N0U6, A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA, Q96TB4, A0A075B6I4, Q5NV82, E3UVQ2, E9PQG4, L0R6N9, VTNC, C1RL, MBL2, B2R815, D6MJD1, ZA2G, A0A024R9I2, TPC11, CO5, A0A024R3Z1, A8K008, B2R4C5, B4E1D8, GP112, 및 A0A075B6H9로부터 선택된 복수의 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    GP1BA, VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2, APOH, JPH1, CO5, HEP2, TPC11, MBL2, AACT, DYH3, TSP1, CAPS1, APOD, 및 LCAT로부터 선택된 복수의 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    바이오마커는 패널 1-29(도 3), 패널 1-56(도 4a-4b) 및 패널 1-24(도 5)에서 선택된 바이오마커의 한 패널을 포함하는 것인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    패널은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 중 임의의 수보다 많지 않은 단백질 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    바이오마커는 패널 1-29(도 3), 패널 1-56(도 4a-4b) 및 패널 1-24(도 5)에서 선택된 바이오마커의 한 패널로 구성되는 것인 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    바이오마커는 A2N0U6, A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA 및 Q96TB4에서 선택된 5, 4, 3 또는 2개의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 한 패널을 포함하는 것인 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    바이오마커는 A2N0U6 및 A0A024R8D8, B2R6L0, GP1BA 및 Q96TB4 중 적어도 1, 2, 3 또는 4개를 포함하는 바이오마커의 한 패널을 포함하는 것인 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    바이오마커는 GP1BA, VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2 및 APOH에서 선택된 6, 5, 4, 3 또는 2개의 바이오마커를 포함하는 바이오마커의 한 패널을 포함하는 것인 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    바이오마커는 GP1BA 및 VTNC, C1RL, ZA2G, APOC2 및 APOH 중 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개를 포함하는 바이오마커의 한 패널을 포함하는 것인 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플은 임신기간의 첫 번째 3개월 또는 두 번째 3개월 동안 임신한 대상으로부터 채취되는 것인 방법.
  17. 제 7 항에 있어서,
    샘플은 임신기간의 10-12주 동안 임신한 대상으로부터 채취되는 것인 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    임신한 대상은 초임부(primigravida), 경임부(multigravida), 초산부(primiparous) 또는 다산부(multiparous)인 것인 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    임신한 대상은 단일 임신(singleton pregnancy) 또는 다태 임신(multiple pregnancy)을 한 것인 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    임신한 대상은 자간전증에 대해 무증상이며, 예를 들어 고혈압이 아니거나 단백뇨가 없는 것인 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    임신한 대상은 자간전증의 이력이 없는 것인 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    임신한 대상은 자간전증에 대한 위험 인자를 가지지 않는 것인 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    임신한 대상은 만성 고혈압을 가진 것인 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈액 샘플은 혈장 또는 혈청인 것인 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이크로입자-풍부 분획은 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 제조되는 것인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    크기-배제 크로마토그래피는 물로의 용리를 포함하는 것인 방법.
  27. 제 25 항에 있어서,
    크기-배제 크로마토그래피는 아가로스 고체상 및 수성 액체상으로 수행되는 것인 방법.
  28. 제 25 항에 있어서,
    제조 단계는 한외 여과 또는 역상 크로마토그래피를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  29. 제 25 항에 있어서,
    제조 단계는 크기-배제 크로마토그래피 후 우레아를 사용한 변성, 다이티오트레이톨을 사용한 환원, 아이오도아세트아민을 사용한 알킬화, 및 트립신을 사용한 소화를 추가로 포함하는 것인 방법.
  30. 제 1 항에 있어서,
    마이크로입자는 태반-유래 엑소좀 또는 혈관 내피-유래 엑소좀을 풍부하게 하기 위해 추가로 정제되는 것인 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    정량적 측정을 확정하는 단계는 질량 분광법을 포함하는 것인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    정량적 측정을 확정하는 단계는 액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC/MS)을 포함하는 것인 방법.
  33. 제 31 항에 있어서,
    질량 분광법은 액체 크로마토그래피/삼중 사극(quadropole) 질량 분광법을 포함하는 것인 방법.
  34. 제 31 항에 있어서,
    질량 분광법은 다중 반응 모니터링을 포함하는 것인 방법.
  35. 제 31 항에 있어서,
    질량 분광법은 다중 반응 모니터링을 포함하고, 액체 크로마토그래피는 아세토나이트릴을 포함하는 용매를 사용하여 수행되고, 및/또는 확정하는 단계는 단백질 바이오마커에 색인된 체류 시간을 할당하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  36. 제 31 항에 있어서,
    질량 분광법은 다중 반응 모니터링을 포함하고, 방법은 질량 분광기로 도입하기 전에 샘플에 하나 이상의 안정 동위원소 표준 펩타이드를 첨가하는 단계를 포함하고, 탐지는 질량 분석기의 충돌 셀에 의해 생성된 안정 동위원소 펩타이드 표준의 하나 또는 복수의 딸 이온(daughter ion)을 탐지하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  37. 제 31 항에 있어서,
    정량적 측정을 확정하는 단계는 단백질 바이오마커의 대리(surrogate) 펩타이드의 정량적 측정을 확정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  38. 제 36 항에 있어서,
    질량 분광법은 각 대리(surrogate) 펩타이드에 상응하는 하나 이상의 안정 동위원소 표지된 표준 펩타이드(SIS 펩타이드)를 정량화하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  39. 제 31 항에 있어서,
    마이크로입자 농축 분획에 상기 단백질 바이오마커에 상응하는 하나 이상의 안정 중 동위원소 치환된 표준을 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    정량적 측정을 확정하는 단계는 샘플을 하나 이상의 포획 시약과 접촉시키는 단계로, 각각의 포획 시약은 단백질 바이오마커 중 하나에 특이적으로 결합하는 단계, 및 단백질 바이오마커에서 포획 시약 사이의 결합을 탐지하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  41. 제 39 항에 있어서,
    면역분석을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  42. 제 40 항에 있어서,
    면역분석은 효소 면역분석(EIA), 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사성면역분석(RIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가하는 단계는 분류 규칙을 실행하는 단계를 포함하고, 규칙은 자간전증의 위험에 처한 대상을 분류하고, 분류 규칙의 실행은 p값이 적어도 0.05 미만인 자간전증 또는 만기 출산 사이의 상관관계를 생성하는 것인 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가하는 단계는 분류 규칙을 실행하는 단계를 포함하고, 규칙은 자간전증의 위험에 처한 대상을 분류하고, 분류 규칙의 실행은 수신자 조작 특성(ROC, receiver operating characteristic) 곡선을 생성하며, 여기서 ROC 곡선은 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.8 또는 적어도 0.9의 곡선 아래 면적(AUC, area under the curve)을 가지는 것인 방법.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분류 규칙이 대상을 분류하는 값은 모체 연령, 모체 체질량 지수, 초산부, 및 임신 중 흡연 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인 방법.
  46. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분류 규칙은 컷-오프, 선형 회귀(예: 다중 선형 회귀(MLR), 부분 최소 제곱(PLS) 회귀, 주성분 회귀(PCR)), 이진 확정 트리(예: CART와 같은 재귀 분할 프로세스 - 분류 및 회귀 트리), 역 전파 네트워크와 같은 인공 신경망, 판별 분석(예: 베이지안 분류기 또는 피셔 분석), 로지스틱 분류기 및 지원 벡터 분류기(예: 지원 벡터 기계)를 사용하는 것인 방법.
  47. 제 1 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분류 규칙은 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 민감도, 특이도, 양성 예측 값 또는 음성 예측 값을 갖도록 구성되는 것인 방법.
  48. 제 1 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
    자간전증의 증가된 위험을 평가하는 단계는 단백질 바이오마커가 (상향-조절된다면) 임계값 수준보다 높거나, (하향-조절된다면) 임계값 수준보다 낮은 것으로 확정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  49. 제 47 항에 있어서,
    임계값 수준은 적어도 50, 적어도 100 또는 적어도 200명의 대조군 대상으로부터 확정된 단백질에 대하여 중심 경향의 측정(예: 평균, 중앙값 또는 모드)으로부터 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 z 점수를 나타내는 것인 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
    평가하는 단계는 패널에서 각 단백질의 측정을 참조 표준과 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  51. 제 1 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    건강 관리 제공자에게 임신한 대상에 대한 자간전증의 위험을 통신하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  52. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (d) 분획에서의 조산에 대한 하나 이상의 마이크로입자-관련된 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 확정하는 단계; 및
    (e) 측정에 기반하여 조산 위험을 평가하는 단계
    를 더 포함하는 것인 방법.
  53. 임신한 대상에 대한 자간전증의 위험을 감소시키고/거나 자간전증의 신생아 합병증을 감소시키는 방법으로, 상기 방법은
    (a) 제 1 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 임신한 대상에 대한 자간전증의 위험을 평가하는 단계; 및
    (b) 자간전증의 위험을 감소시키고/거나 자간전증의 신생아 합병증을 감소시키는데 효과적인 치료적 개입을 대상에게 투여하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  54. 제 52 항에 있어서,
    치료적 개입은 아스피린(예: 저용량 아스피린), 코르티코스테로이드 또는 고혈압을 감소시키는 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  55. 제 52 항에 있어서,
    치료된 자간전증은 후기 또는 온화한 형태, 고혈압 형태 또는 조기 또는 심한 형태인 것인 방법.
  56. 본원에 기술된 방법에 의해 자간전증의 증가된 위험을 가지는 것으로 확정된 임신한 대상에게 자간전증의 위험을 감소시키거나 자간전증의 신생아 합병증을 감소시키는데 효과적인 치료적 개입을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  57. 패널 1-29(도 3), 패널 1-56(도 4a-4b) 및 패널 1-24(도 5)에서 선택된 단백질 바이오마커의 패널 중 어느 하나의 참조 표준을 비교하여 변경된 정량적 측정을 가지는 임신한 대상에게 자간전증의 위험을 감소시키도록 설계된 치료의 유효량을 투여하는 방법.
  58. 표 1, 표 3 또는 표 4의 단백질 바이오마커로부터 선택된 복수의 실질적으로 순수한 단백질 바이오마커 또는 대리 바이오마커를 포함하는 패널.
  59. 제 58 항에 있어서,
    각각의 대리 바이오마커와 쌍을 이루는 안정 동위원소 표준 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 패널.
  60. 하나 또는 복수의 용기를 포함하는 키트이며, 여기서 각 용기는 하나 이상의 각각의 복수의 안정 동위원소 표준을 포함하고, 각각의 안정 동위원소 표준은 패널 1-29(도 3), 패널 1-56(도 4a-4b) 및 패널 1-24(도 5)에서 선택된 바이오마커의 한 패널로부터의 바이오마커에 대한 대리 펩타이드에 해당하는 것인 키트.
  61. 본원에 설명된 방법에 의해 생성된 분류 규칙을 구현하기 위한 코드를 포함하는 유형(有形)의 비-일시적 형태의 컴퓨터 판독가능 매체.
  62. (a)(i) 프로세서; 및 (II) 프로세서에 연결된 메모리를 포함하는 컴퓨터
    를 포함하는 시스템으로,
    메모리는
    (1) 분획에서 하나 이상의 단백질 바이오마커의 정량적 측정을 나타내는 값을 포함하는 대상으로부터의 샘플에 대한 테스트 데이터, 여기서 단백질 바이오마커는 표 1, 표 3 및 표 4의 단백질 바이오마커로부터 선택되는 것이 테스트 데이터;
    (2) 측정치를 포함한 값에 기반하여 대상을 조산 위험에 처한 것으로 분류하는 분류 규칙으로, 여기서 분류 규칙은 적어도 75%, 적어도 85% 또는 적어도 95%의 민감도를 가지는 것으로 구성되는 것인 분류 규칙; 및
    (3) 테스트 데이터 상에 분류 규칙을 구현하기 위한 컴퓨터 실행가능한 명령어
    를 포함하는 모듈을 저장하는 것인
    시스템.
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