JP4938451B2 - 非小細胞肺癌の診断のための方法 - Google Patents
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Description
本発明は生物科学の分野に関し、より詳細には癌の治療および診断の分野に関する。特に、本発明は、このような癌細胞において増加した発現を示すKIF11、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1遺伝子を利用した、非小細胞肺癌の診断方法に関する。
肺癌は、最も一般的な致命的ヒト腫瘍の一つである。肺癌の発症および進行に付随してみられる多くの遺伝子変化が報告されている。遺伝子変化は、予後の取り組みおよび転移リスクまたは特定の治療に対する応答の予測の一助となりうるが、単一または限られた数の分子マーカーに関する情報では非小細胞肺癌(NSCLC)の臨床的診断を下すのに十分な結果が得られないことが一般的である(Mitsudomiら、Clin Cancer Res 6: 4055-63 (2000);Niklinskiら、Lung Cancer. 34 Suppl 2: S53-8 (2001);Watine, BMJ 320: 379-80 (2000))。NSCLCは最も一般的な病型であり、肺腫瘍の80%近くを占める(Society, A. C. Cancer Facts and Figures 2001(2001))。集学的治療法の最近の進歩にもかかわらず10年全生存率は10%程度と低いが、これはNSCLCの大多数が進行病期になるまで診断されないためである(Fry, W.A.ら、Cancer. 86: 1867-76(1999))。プラチナを用いた化学療法措置がNSCLCの治療に関して基準となる標準治療法と見なされているが、これらの薬剤は進行したNSCLC患者の生存期間を約6週間しか延長させることができない(Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group、BMJ. 311: 899-909(1995))。チロシンキナーゼ阻害薬を含むさまざまな標的指向性療法がこの疾患に対して研究中であるが、これまでに有望な成績が得られたのはごく限られた数の患者のみであり、幾人かのレシピエントには重篤な副作用が生じている(Kris M, N.R, Herbst R.S.、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 21: 292a(A1166)(2002))。
本発明は、患者由来の生物試料におけるKIF11、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1の群より選択される非小細胞肺癌関連遺伝子の発現レベルを決定することによる、対象における非小細胞肺癌(NSCLC)に対する素因の診断または判定する方法を特徴とする。遺伝子の正常対照レベルと比較した、これらの遺伝子の任意の発現レベルの上昇が、対象がNSCLCに罹患しているかまたはNSCLCを発症するリスクを有することが示される。
本明細書で用いる「1つの(a)」「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は互換的に用いられる。さらに、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、および「核酸」という用語も、別に特記する場合を除き、互換的に用いられる。
対象由来の生体試料におけるKIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子の発現レベルを測定することにより、対象におけるNSCLCの発生、またはNSCLCを発症する素因を判定することができる。本発明は、生物試料におけるKIF11、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1遺伝子の少なくとも1つ、最大で全ての発現レベルを決定すること(例えば、測定すること)を含む。
本発明はまた、KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子のうち2つまたはそれ以上の遺伝子発現レベルのパターンを含む、NSCLCの参照発現プロファイルも提供する。この発現プロファイルは、NSCLCまたは本疾患を発症する素因の診断のための対照として、本疾患を有する対象の治療の経過のモニタリング、および予後の評価のために用いることができる。
本発明はまた、 2つまたはそれ以上の検出用試薬、例えば、KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1遺伝子のうち1つまたは複数と特異的に結合するかまたはそれらを同定する核酸を含むキットも提供する。KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1遺伝子のうち1つまたは複数と特異的に結合するかまたはそれらを同定する、このような核酸は典型的に、 KIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1、もしくはFOXM1ポリヌクレオチドの一部分に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列、またはKIF11、KOC1、GHSR1b、NTSR1、もしくはFOXM1遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する抗体により示される。試薬はキットの形態で合わせてパッケージングされる。試薬、 例えば、核酸もしくは抗体(固体マトリックスと結合した状態、またはそれらをマトリックスに結合させるための試薬と別々にパッケージ化された状態にある)、対照試薬(陽性および/または陰性)、および/または核酸もしくは抗体の検出のための手段は、別々の容器内にパッケージングされることが好ましい。アッセイ法を実施するための指示(例えば、文書、テープ、VCR、CD-ROM、その他)をキットに含めてもよい。キットのアッセイ形式は、当技術分野で公知のノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAであってよい。
本発明は、1つもしくは複数のKIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子を含む核酸基質アレイも含む。アレイ上の核酸は、KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子で表される1つもしくは複数のポリヌクレオチド配列に特異的に対応する。KIF11、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1遺伝子の2、3、または4個の発現レベルが、核酸のアレイへの結合を検出することで同定される。
DNAチップは、数多くの遺伝子の発現レベルを同時に比較するのに便利な装置である。DNAチップに基づいた発現プロファイリングは、例えば、「Microarray Biochip Technology」(Mark Schena、Eaton Publishing、2000年)等に開示されている方法によって実施することができる。
(1)マーカー遺伝子に対応するaRNAまたはcDNAを合成する段階;
(2) aRNAまたはcDNAにマーカー遺伝子のプローブをハイブリダイズさせる段階;および
(3)プローブをハイブリダイズさせたaRNAまたはcDNAを検出し、mRNAの量を定量する段階
を含む。
標的NSCLC関連遺伝子(KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子)の発現または活性を阻害する化合物は、NSCLC関連遺伝子を発現する試験細胞を試験化合物と接触させること、およびNSCLC関連遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することによって同定される。対照レベルと比較して発現が低いことは、その化合物がNSCLC関連遺伝子の阻害因子であることを意味する。本方法によって同定されるような化合物はNSCLCを抑制するために有用である。
KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子、この遺伝子によってコードされるタンパク質、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、遺伝子の発現または遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物はNSCLCの治療または予防のための薬物として役立つことが期待される。
(a)試験化合物にKIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1ポリペプチドを接触させる段階;
(b)段階(a)のKIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1ポリペプチドの生物学的活性を検出する段階;および
(c)試験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1ポリペプチドの生物学的活性を抑制する化合物を選択する段階
を含む、KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1ポリペプチドを使用してNSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
(a)試験化合物を、KIF11、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1遺伝子の1つまたは複数を発現する細胞に接触させる段階;および
(b)試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、本遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する段階
を含んでもよい。
(a) マーカー遺伝子の1つまたは複数の転写調節領域および転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞に試験化合物を接触させる段階であって、マーカー遺伝子がKIF11、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1からなる群より選択されるものである段階;
(b)上記レポーター遺伝子の活性を測定する段階;および
(c)対照と比較して上記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する段階。
(1)細胞内のカルシウムまたはcAMPの濃度を検出すること(例えば、FLIPRアッセイ、Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 435-438, 2000;Nature 406: 70-74, 2000;J. Biol. Chem. 275: 21068-21074, 2000);
(2)ポリペプチドの活性化を検出すること;
(3)ポリペプチドとGタンパク質との相互作用を検出すること(例えば、FLIPRアッセイ、Biochem. Biophys. Res. Commun. 276: 435-438, 2000;Nature 406: 70-74, 2000;J. Biol. Chem. 275: 21068-21074, 2000、または125I標識ペプチドを用いる結合アッセイ);
(4)ホスホリパーゼCまたはその下流経路の活性化を検出すること(Oncogene 20: 1563-1569, 2001);
(5)プロテインキナーゼカスケードのキナーゼ、例えばRaf、MEK、ERK、およびプロテインキナーゼD(PKD)などの活性化を検出すること(Oncogene 20: 1563-1569, 2001);
(6)チロシンキナーゼのSrcファミリー/Tecファミリー/Bmxファミリーのメンバーの活性化を検出すること(Oncogene 20: 1563-1569, 2001);
(7)RasおよびRhoファミリーのメンバーの活性化、MAPファミリーのJNKメンバーの調節、またはアクチン細胞骨格の再構成を検出すること(Oncogene 20: 1563-1569, 2001);
(8)ポリペプチド活性化によって媒介される任意のシグナル複合体の活性化を検出すること;
(9)リガンドにより誘発されるポリペプチドの内在化/エンドサイトーシスを含む、ポリペプチドの細胞内局在の変化を検出すること(J. Cell Sci., 113: 2963-2975, 2000;J. Histochem. Cytochem. 48: 1553-1563, 2000;Endocrinology October 23, 2003. as doi: 10. 1210/en. 2003-0974);
(10)ポリペプチドの下流にある任意の転写因子の活性化、またはそれらの下流遺伝子の活性化を検出すること;ならびに
(11)細胞増殖、形質転換、または細胞のその他の任意の癌性表現型を検出すること。
個体の遺伝子構成には差があるので、さまざまな薬剤を代謝する相対的能力には差があることになる。対象内で代謝されて抗NSCLC薬剤として作用する化合物は、対象の細胞における、癌性の状態に特徴的であった遺伝子発現パターンから、非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンに至る変化を誘導することで顕在化する場合がある。したがって、本明細書に開示された、発現差のあるKIF11、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1遺伝子は、選択された対象に由来する試験細胞(または試験細胞集団)中で候補化合物を試験することによって、対象に特に適すると推定される治療用または予防用のNSCLC阻害剤の選択を可能とする。
本発明は、対象のNSCLCを治療、軽減、または予防する方法を提供する。治療用化合物を、非小細胞肺癌の対象、またはNSCLCを発症する危険性のある(すなわち発症しやすい)対象に、予防的または治療的に投与する。このような対象は、標準的な臨床的方法を用いて、またはKIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1の遺伝子またはポリペプチドの異常な発現レベルもしくは活性を検出することで同定される。予防的投与は、疾患または障害の出現が妨げられるか、またはその進行が遅れるように、疾患の明瞭な臨床症状が現れる前に行う。
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中、[A]は、KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり;[B]は、約3〜約23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり;かつ[A']は、[A]に対して相補的なリボヌクレオチド配列である。本明細書において、「KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子の標的配列」という語句は、NSCLC細胞株に導入された場合に、細胞の生存能力を抑制するのに有効な配列のことを指す。KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子の好ましい標的配列には、以下のものを含むヌクレオチド配列が含まれる:SEQ ID NO:32、33、34、35、36、37、および108。相補的配列[A']および[A]は互いにハイブリダイズして二本鎖を形成し、一般式が 5'-[A]-[B]-[A']-3'であるこのsiRNA分子全体がヘアピンループ構造を形成する。本明細書で用いる場合、「相補的な」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソン-クリック型またはフーグスティーン型の塩基対合のことを指し、ヌクレオチド単位のハイブリダイゼーションまたは結合は、ミスマッチを少数しかまたは全く含まない安定な二重鎖(二本鎖構造)を形成する適切な条件下での、単位間の物理的または化学的な相互作用のことを示す。1つの好ましい態様において、このような二重鎖が10塩基対毎に含むミスマッチは1個を上回ることはない。特に好ましい二重鎖は完全に相補的であり、ミスマッチを全く含まない。本発明で用いる、KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子のmRNAに対するsiRNAには、KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1遺伝子のmRNA全体よりは短く、かつ全長として500、200、または75ヌクレオチドの配列を有する標的配列が含まれる。同じく本発明に含まれるものには、本明細書に記載の核酸の1つまたは複数を含むベクター、およびベクターを含む細胞がある。本発明の単離された核酸は、KIF11、GHSR1b、NTSR1、もしくはFOXM1に対するsiRNAのため、またはsiRNAをコードするDNAのために有用である。核酸をsiRNAまたはそれをコードするDNAのために用いる場合には、センス鎖は約19ヌクレオチドよりも長いことが好ましく、約21ヌクレオチドよりも長いことがより好ましい。
siRNA標的部位の選択:
1.転写物の開始コドンAUGを出発点として、AAジヌクレオチド配列を求めて下流をスキャンする。siRNA標的候補部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlら、Genes Dev 13(24):3191-7(1999)は、5'および3'側の非翻訳領域(UTR)、および開始コドンに近い領域(75塩基以内)に対するsiRNAの設計を推奨していない。というのは、これらの領域は、調節タンパク質結合部位に富む可能性があり、そのために、これらの領域に対して設計されたsiRNAとエンドヌクレアーゼの複合体が、UTR結合タンパク質、および/または翻訳開始複合体の結合に干渉する恐れがあるからである。
2.標的候補部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して有意な相同性をもついかなる標的配列も検討対象から除く。相同性検索は、NCBIのサーバー上(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にあるBLASTを用いて実施することができる。
3.合成に適した標的配列を選択する。Ambion社のウェブサイト上で、複数の好ましい標的配列を、評価対象遺伝子の全体に沿って選択することができる。
- 腫瘍に対する細胞傷害性リンパ球の誘導、
- 腫瘍を認識する抗体の誘導、および
- 抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1に対するsiRNAを発現するベクターのトランスフェクションは、NSCLC細胞の増殖阻害を招く。したがって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であってKIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1に対するsiRNAとして機能する分子、およびその二本鎖分子をコードするベクターを提供することは、本発明のもう1つの局面である。
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有してよく、式中、[A]は、KIF11、GHSR1b、NTSR1、またはFOXM1の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり;
[B]は、3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列(ループ配列)であり;かつ
[A']は、[A]に対して相補的なリボヌクレオチド配列である。相補的配列[A']および[A]は互いにハイブリダイズして二本鎖を形成し、一般式が5'-[A]-[B]-[A']-3'であるこのsiRNA分子全体がヘアピンループ構造を形成する。
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque, J. M.ら、Nature, Vol. 418: 435-438 (2002);
UUCG:Lee, N.S.ら、Nature Biotechnology 20: 500-505 (2002);Fruscoloni, P.ら、、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4):1639-1644 (2003);および
UUCAAGAGA:Dykxhoorn, D. M.ら、Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-467 (2002)。
guuaguguac gaacuggag-[B]-cuccaguuc guacacuaac (SEQ ID NO:32の標的配列用);
gugucucugu uggagaucu-[B]-agaucucca acagagacac (SEQ ID NO:33の標的配列用);
gaaggcaguu gaccaacac-[B]-guguugguc aacugccuuc (SEQ ID NO:34の標的配列用);
ccucuaccug uccagcaug-[B]-caugcugga cagguagagg (SEQ ID NO:35の標的配列用);
guucaucagc gccaucugg-[B]-ccagauggc gcugaugaac (SEQ ID NO:36の標的配列用);
ggucgucaua caggucaac-[B]-guugaccug uaugacgacc (SEQ ID NO:37の標的配列用); および
gcagcagaaa cgaccgaau-[B]-auucggucg uuucugcugc (SEQ ID NO:108の標的配列用)。
本発明は、NSCLC関連遺伝子の発現または活性を変化させる化合物に関する本スクリーニング方法によって選択された化合物を含む、NSCLCの治療または予防のための組成物を提供する。
材料および方法
(1)患者および組織試料
原発性NSCLC試料(このうち22例は腺癌(ADC)、14例は扁平上皮癌(SCC)、1件は腺扁平上皮癌に分類された)は、患者37例から、インフォームドコンセントを得た上で以前に入手した(Kikuchi, T.ら、Oncogene 22, 2192-2205 (2003))。さらに15例の原発性NSCLC(7例のADCおよび8例のSCCを含む)を、本発明者らの施設で手術を受ける患者から、隣接する正常肺組織試料とともに入手した。
この検討に用いた30例のヒトNSCLC細胞株および4例のSCLC細胞株は以下の通りである:腺癌(ADC)A427、A549、NCI-H23、NCI-H522、LC174、LC176、LC319、PC3、PC9、PC14、PC14-PE6、NCI-H1373、NCI-H1435、NCI-H1793、SK-LU-1、NCI-H358、NCI-H1650、およびSW1573;腺扁平上皮癌(ASC)NCI-H226、NCI-H596、およびNCI-H647;扁平上皮癌(SCC)RERF-LC-AI、SW-900、SK-MES-1、EBC-1、LU61、NCI-H520、NCI-H1703、およびNCI-H2170;大細胞癌(LCC)に関してはLX1;ならびにSCLCに関してはDMS114、DMS273、SBC-3、およびSBC-5。ヒト末梢気道上皮細胞SAECは、Cambrex Bio Science Inc.から購入した最適培地(SAGM)中で増殖させた。ヒト気管支上皮細胞株であるBEAS2B細胞も利用した。
培養細胞および臨床組織から、Trizol試薬(Life Technologies, Inc.)を製造元のプロトコールに従って使用して全RNAを抽出した。抽出したRNAおよび正常ヒト組織のポリ(A)RNAをDNアーゼI(Nippon Gene)で処理した上で、オリゴ(dT)プライマーおよびSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写させた。半定量的RT-PCR実験は、以下の合成した遺伝子特異的プライマー、または内部対照としてのβ-アクチン(ACTB)特異的プライマーを用いて行った:
KOC1, 5’-TAAATGGCTTCAGGAGACTTCAG-3’ (SEQ ID NO:7)および
5’-GGTTTTAAATGCAGCTCCTATGTG-3’ (SEQ ID NO:8);
KIF11, 5’-CTGAACAGTGGGTATCTTCCTTA-3’ (SEQ ID NO:9)および
5’-GATGGCTCTTGACTTAGAGGTTC-3’ (SEQ ID NO:10);
NMU, 5’-TGAAGAGATTCAGAGTGGACGA-3’ (SEQ ID NO:11)および
5’-ACTGAGAACATTGACAACACAGG-3’ (SEQ ID NO:12);
NMU1R, 5’-AAGAGGGACAGGGACAAGTAGT-3’ (SEQ ID NO:13)および
5’-ATGCCACTGTTACTGCTTCAG-3’ (SEQ ID NO:14);
NMU2R, 5’- GGCTCTTACAACTCATGTACCCA-3’ (SEQ ID NO:15)および
5’-TGATACAGAGACATGAAGTGAGCA-3’ (SEQ ID NO:16);
GHSR1a, 5’-TGGTGTTTGCCTTCATCCT-3’ (SEQ ID NO:17)および
5’-GAATCCCAGAAGTCTGAACA-3’ (SEQ ID NO:18);
GHSR1b, 5’-ACGGTCCTCTACAGTCTCA-3’ (SEQ ID NO:19)および
5’-CACAGGGAGAGGATAGGA-3’ (SEQ ID NO:20);
NTSR1, 5’-AGTGGGCTCAGAGTCTAGCAAAT-3’ (SEQ ID NO:21)および
5’-TATTGAGAGATACACGGGGTTTG-3’ (SEQ ID NO:22);
GHRL, 5’-TGAGCCCTGAACACCAGAGAG-3’ (SEQ ID NO:23)および
5’-AAAGCCAGATGAGCGCTTCTA-3’ (SEQ ID NO:24);
NTS, 5’-TCTTCAGCATGATGTGTTGTGT-3’ (SEQ ID NO:25)および
5’-TGAGAGATTCATGAGGAAGTCTTG-3’ (SEQ ID NO:26);
ACTB, 5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’ (SEQ ID NO:27)および
5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’ (SEQ ID NO:28)。
PCR反応は、産物量が増幅の対数期の範囲内に確実に収まるようにサイクル数を最適化した。
KOC1遺伝子およびKIF11遺伝子の発現レベルを、ABI Prism 7700配列検出システム(Applied Biosystems)を用いるQRT-PCRによって測定した。培養細胞および臨床組織から、Trizol試薬(Life Technologies, Inc.)を製造元のプロトコールに従って使用して全RNAを抽出した。抽出したRNAおよび正常ヒト組織のポリ(A)RNAをDNアーゼI(Nippon Gene)で処理した上で、オリゴ(dT)プライマーおよびSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)を用いて逆転写させた。定量用対照としてのACTB遺伝子に関してはTaqMan Pre-Developed Assay Human ACTB(Applied Biosystems;#4333762F)を用いた。各遺伝子に対するプライマー対およびTaqManプローブは、Primer Expressソフトウエアを用いて以下のように設計した:
KOC1, 5’-ACGAACTCATTTGCTCACTCCTT-3’ (センス) (SEQ ID NO:98)、
5’-ACCCACACCCAACACAATTGT-3’ (アンチセンス) (SEQ ID NO:99)、
5’-ACAGCAAAGCCC-3’ (TaqMan-MGBプローブ) (SEQ ID NO:100);
KIF11, 5’-TTCACCCTGACAGAGTTCACAAA-3’ (センス)(SEQ ID NO:101)
5’-GGGTGGTCTCCCATAATAGCAA-3’ (アンチセンス) (SEQ ID NO:102)、
5’-AGCCCACTTTAGAGTATAC-3’ (TaqMan-MGBプローブ) (SEQ ID NO:103)。
ヒト多組織ブロット(BD Biosciences Clontech)を、KOC1、KIF11、およびGHSR1の32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。KOC1、KIF11、およびGHSR1のcDNAプローブは、上記のものと同様のプライマーを用いるRT-PCRによって調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感BASスクリーン(BIO-RAD)を用いて室温(RT)で30〜168時間行った。
それぞれN末端にHisタグ付加エピトープを含むKOC1(完全長)およびKIF11(コドン361〜1056に対応する部分的アミノ酸配列)を発現するプラスミドを、pET28ベクター(Novagen)を用いて調製した。組換えタンパク質を大腸菌BL21コドン+株(Stratagene)で発現させ、TALON樹脂(BD Biosciences Clontech)を供給元のプロトコールに従い使用して精製した上で、ウサギに接種した。免疫血清を標準的な方法に従ってアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製した抗KOC1抗体および抗KIF11抗体をウエスタンブロット解析、免疫沈降、および免疫染色のために用いた。本発明者らは、内因性IMP-1、IMP-2、およびIMP-3をいずれも発現しないが、HAタグ付加IMP-1、IMP-2、およびIMP-3発現ベクターがトランスフェクトされたNCI-H520細胞の溶解物を用いて、ウエスタンブロット解析により、抗KOC1抗体がKOC1に対して特異的であり、他の相同タンパク質であるIMP-1およびIMP-2とは交差反応しないことを確認した。
KOC1およびそのドメインのいくつか(図3a)を、N末端にFLAGタグを付加しC末端にHAタグを付加したpCAGGSベクターの適切な部位にクローニングした。KOC1欠失変異体のみがトランスフェクトされたCOS-7細胞を、抗HAアガロース(SIGMA)により免疫沈降させた。ウエスタンブロット法により、内因性KIF11のバンドがアフィニティー精製した抗KIF11抗体を用いて検出された。
本発明者らは、インビボでKOC1が関与するRNA-タンパク質相互作用を解析するために、NiranjanakumariらのRNA免疫沈降プロトコール(Niranjanakumari, S.ら、Methods 26, 182-190 (2002))を採用した。免疫沈降させたRNAを、5例の肺癌細胞株(A549、LC319、PC14、RERF-LC-AI、およびSK-MES-1)から単離した。32,256種の遺伝子を提示するcDNAマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション(IP-マイクロアレイ解析)を目的として、免疫沈降した各RNA(IP-RNA)および全RNA(対照)からT7を用いて増幅したRNA(aRNA)の2.5μgアリコートを、以前の記載の通りにそれぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTPの存在下で逆転写させた(Kikuchi, T.ら、Oncogene 22, 2192-2205 (2003))。IP-マイクロアレイ解析によって同定されたmRNAのKOC1に対する結合を確認するために、本発明者らは、遺伝子特異的プライマー、および抗KOC1抗体とともに免疫沈降したNSCLC細胞抽出物由来のRNAを用いるRT-PCR実験を行った(IP-RT-PCR)。KOC1結合mRNAに対する結合のために必要なKOC1の領域を確かめるために、本発明者らは以下のようなノースウエスタンブロット解析、および、種々のKOC1欠失変異体がトランスフェクトされたこれらの免疫沈降抽出物からのKOC1結合mRNAのIP-RT-PCRも行った。
KOC1欠失変異体がトランスフェクトされた細胞からの免疫沈降抽出物(μM)を2×SDSサンプルバッファー中で煮沸し、10〜20%勾配のポリアクリルアミドゲル(BIO-RAD)による電気泳動を行って、ポリ二フッ化ビニリデン膜(Hybond-P)に移行させた。続いてこの膜を、ブロッキングバッファー(10mM Tris-HCl(pH 7.8)、150mM NaCl、1mg/ml酵母tRNA)中にて室温で1時間にわたりブロッキングし、50mlの10mM Tris-HCl(pH 7.8)による5分間の洗浄を2回行った上で、5mlのNWBバッファー(10mM Tris-HCl(pH 7.8)、1mM EDTA、50mM NaCl、0.02%Ficoll、0.02%ポリビニルピロリドン、0.02%BSA)中でDIG標識RNAプローブとともに室温で2時間インキュベートした。この膜をNWBバッファーで4回洗浄した後に、タンパク質と結合したRNAプローブを、DIG核酸検出キット(Roche)を供給元のプロトコールに従って用いて検出した。
ECFPと融合したKOC1(ECFP-KOC1)タンパク質を発現するプラスミドを、pECFP-N1ベクター(BD Biosciences Clontech)を用いて調製した。EYFPと融合したKIF11(EYFP-KIF11)タンパク質を発現するプラスミドも、pEYFP-N1ベクター(BD Biosciences Clontech)を用いて調製した。ECFP-KOC1またはEYFP-KIF11タンパク質を発現するプラスミドがトランスフェクトされたCOS-7細胞のタイムラプス画像を、Live Cell Imaging System(Power IX81, OLYMPUS)および共焦点顕微鏡(TCS SP2-AOBS, Leica Microsystems;FV1000 FLUOVIEW, OLYMPUS)により、5〜15時間にわたって取り込んだ。
本発明者らは、RAB35またはEGFPのmRNAに対して相補的なDIG標識プローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーションを60℃で16時間行った。DIG標識は、アルカリホスファターゼ呈色基質であるNBT-BCIPを用いて検出した。細胞を洗浄してマウントし、光学顕微鏡上で可視化した。固定した細胞を、RAB35 mRNAに対して相補的なDIG標識物の混合物と、50%ホルムアミド/2×SSC中、42℃で16時間ハイブリダイズさせた。細胞を洗浄してマウントし、共焦点顕微鏡上で可視化した。
低分子干渉RNA(siRNA)を発現するプラスミドベクターを調製するために、本発明者らは、それ自身のプロモーター領域を含むH1RNA遺伝子のゲノム断片を、プライマーのセット、5'-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3'(SEQ ID No:44)および5'-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3'(SEQ ID No:45)ならびにテンプレートとしてヒト胎盤DNAを用いるPCRによって増幅した。その産物を精製し、TAクローニングキットを供給元のプロトコール(Invitrogen)に従い使用してpCR2.0プラスミドベクター中にクローニングした。H1RNAを含むBamHIおよびXhoI断片をpcDNA3.1(+)のヌクレオチド1257位と56位との間に挿入し、この断片を、
5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3'(SEQ ID No:46)および
5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3'(SEQ ID No:47)
を用いるPCRによって増幅した。連結されたDNAは、プライマー、
5'-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3'(SEQ ID No:48)および
5'-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3'(SEQ ID No:49)
を用いるPCR増幅のためのテンプレートとなった。
siRNA-KIF11-1 (#1), 5’-GTTAGTGTACGAACTGGAG-3’ (SEQ ID NO:32);
siRNA-KIF11-2 (#2), 5’-GTGTCTCTGTTGGAGATCT-3’ (SEQ ID NO:33);
siRNA-KIF11-3 (#3), 5’-GAAGGCAGTTGACCAACAC-3’ (SEQ ID NO:34);
siRNA-GHSR-1 (si-GHSR-1), 5’-CCTCTACCTGTCCAGCATG-3’ (SEQ ID NO:35);
siRNA-NTSR1-1 (si-NTSR1-1), 5’-GTTCATCAGCGCCATCTGG-3’ (SEQ ID NO:36);
siRNA-NTSR1-2 (si-NTSR1-2), 5’-GGTCGTCATACAGGTCAAC-3’ (SEQ ID NO:37)、
siRNA-RAB35 (si-RAB35), 5’-GAGATGTTCAACTGCATCA -3’ (SEQ ID NO:114)、
siRNA-FOXM1 (si-FOXM1), 5’-GCAGCAGAAACGACCGAAT-3’ (SEQ ID NO:108)。
KIF11 si1 288-306 (gttagtgtac gaactggag/ SEQ ID NO:32の標的配列用)
(インサートF) Tccc gttagtgtacgaactggag ttcaagaga ctccagttcgtacactaac/SEQ ID NO:51
(インサートR) Aaaa gttagtgtacgaactggag tctcttgaa ctccagttcgtacactaac/SEQ ID NO:52
(ヘアピン) gttagtgtacgaactggag ttcaagaga ctccagttcgtacactaac/SEQ ID NO:53
KIF11 si2 612-630 (gtgtctctgt tggagatct/ SEQ ID NO:33の標的配列用)
(インサートF) Tccc gtgtctctgt tggagatct ttcaagaga agatctccaacagagacac/SEQ ID NO:54
(インサートR) Aaaa gtgtctctgt tggagatct tctcttgaa agatctccaacagagacac/SEQ ID NO:55
(ヘアピン) gtgtctctgt tggagatct ttcaagaga agatctccaacagagacac/SEQ ID NO:56
KIF11 si3 1700-1718 (gaaggcagtt gaccaacac/ SEQ ID NO:34の標的配列用)
(インサートF) Tccc gaaggcagtt gaccaacac ttcaagaga gtgttggtcaactgccttc/SEQ ID NO:57
(インサートR) Aaaa gaaggcagtt gaccaacac tctcttgaa gtgttggtcaactgccttc/SEQ ID NO:58
(ヘアピン) gaaggcagtt gaccaacac ttcaagaga gtgttggtcaactgccttc/SEQ ID NO:59
GHSR1b si1 237-255 (cctctacctg tccagcatg/ SEQ ID NO:35の標的配列用)
(インサートF) Tccc cctctacctg tccagcatg ttcaagaga catgctggacaggtagagg/SEQ ID NO:60
(インサートR) Aaaa cctctacctg tccagcatg tctcttgaa catgctggacaggtagagg/SEQ ID NO:61
(ヘアピン) cctctacctg tccagcatg ttcaagaga catgctggacaggtagagg/SEQ ID NO:62
NTSR1 si1 933-951 (gttcatcagc gccatctgg/ SEQ ID NO:36の標的配列用)
(インサートF) Tccc gttcatcagc gccatctgg ttcaagaga ccagatggcgctgatgaac/SEQ ID NO:63
(インサートR) Aaaa gttcatcagc gccatctgg tctcttgaa ccagatggcgctgatgaac/SEQ ID NO:64
(ヘアピン) gttcatcagc gccatctgg ttcaagaga ccagatggcgctgatgaac/SEQ ID NO:65
NTSR1 si2 1074-1092 (ggtcgtcata caggtcaac/ SEQ ID NO:37の標的配列用)
(インサートF) Tccc ggtcgtcata caggtcaac ttcaagaga gttgacctgtatgacgacc/SEQ ID NO:66
(インサートR) Aaaa ggtcgtcata caggtcaac tctcttgaa gttgacctgtatgacgacc/SEQ ID NO:67
(ヘアピン) ggtcgtcata caggtcaac ttcaagaga gttgacctgtatgacgacc/SEQ ID NO:68
RAB35 si 620-638 (gagatgttca actgcatca/ SEQ ID NO:114の標的配列用)
(インサートF) Tccc gagatgttca actgcatca ttcaagaga tgatgcagt tgaacatctc/SEQ ID NO:115
(インサートR) Aaaa gagatgttca actgcatca tctcttgaa tgatgcagt tgaacatctc /SEQ ID NO:116
(ヘアピン) gagatgttca actgcatca ttcaagaga tgatgcagt tgaacatctc /SEQ ID NO:117
FOXM1 si 1240-1258 (gcagcagaaacgaccgaat/ SEQ ID NO:108の標的配列用)
(インサートF) Tccc gcagcagaaa cgaccgaat ttcaagaga attcggtcg tttctgctgc /SEQ ID NO:109
(インサートR) Aaaa gcagcagaaa cgaccgaat tctcttgaa attcggtcg tttctgctgc /SEQ ID NO:110
(ヘアピン) gcagcagaaa cgaccgaat ttcaagaga attcggtcg tttctgctgc /SEQ ID NO:111。
本発明者らは、肺癌細胞の増殖または生存におけるKOC1-KIF11複合体の機能的役割を調べるために、KOC1欠失変異体を用いてドミナントネガティブアッセイを行った。KOC1DEL3およびKOC1DEL2構築物(図3a;10μg)、モックプラスミド(10μg)、または最終用量が10μg DNAとなる両方の構築物のプラスミド混合物(KOC1DEL3またはKOC1DEL2:モック(μg)がそれぞれ7.5:2.5、5:5、または2.5:7.5)をLC319細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をG418の存在下で7日間培養し、それらの生存率を3連のMTTアッセイによって測定した。
ヒト肺癌細胞株LC319細胞に対して、両側にタグを付加したpCAGGS-n3FH(NH2末端FLAG、COOH末端HA)-KOC1発現ベクターまたは空ベクター(モックトランスフェクション)をトランスフェクトした。細胞の抽出をIP-バッファー(0.5%NP-40、50mM Tris-HCl、150mM NaCl、およびプロテアーゼ阻害剤)中にて氷上で30分間行った。抽出物を14,000rpmで15分間遠心し、その上清を、抗FlagM2アガロース(Sigma-Aldrich)および抗HAビーズ(Sigma-Aldrich)を用いる免疫沈降に1〜2時間供した。ビーズをIPバッファーで6回洗浄し、最終洗浄画分を除去した後にLaemmliサンプルバッファー中でビーズを煮沸することによってタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、銀染色によって染色した。125kDaのバンドがゲル抽出によって抽出され、これをMALDI-TOF質量分析法を用いる質量分析シークエンシングのために用いた。この分析により、KIF11は125kDa産物として同定された。
カバーガラス上で増殖させたA549細胞を継代後に24時間培養し、これにFlagタグ付加KIF11およびmycタグ付加KOC1を同時トランスフェクトした。24時間のインキュベーション後に、細胞を氷上でアセトン/メタノール(1:1)により5分間固定し、CAS BLOCK(ZYMED)中で室温で7分間ブロッキングした後に、ウサギ抗Flagポリクローナル抗体(SIGMA)とともに室温で1時間インキュベートした。固定した細胞をPBSで3回洗浄し、抗ウサギ IgG-FITCと室温で1時間反応させた。続いて細胞を再びブロッキングし、抗myc抗体(9E10;Santa Cruz)とともに室温で1時間インキュベートした。最後に細胞に対して抗マウスIgG-ローダミンを室温で1時間適用した。細胞をLeica TCS SP2-AOBS共焦点顕微鏡で観察した。
ホルマリン固定したNSCLCを用いた腫瘍組織マイクロアレイを、別稿に発表されている通りに構築した(Kononen, J.ら、Nat. Med. 4, 844-847 (1998);Sauter, G.ら、Nat. Rev. Drug Discov. 2, 962-972 (2003))。KOC1およびKIF11は、臨床的な経過観察データを事前に知らされていない3人の調査者によって、染色強度に基づき半定量的に有無が評価された。
NMU-25とその候補受容体であるGHSR1a、GHSR1b、およびNTSR1との直接的な結合を同定するために、以下の実験を行った。各々の受容体遺伝子の全コード領域を、プライマー、
GHSR1a (5’-GGAATTCCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAA-3’ (SEQ ID NO:38)および
5’-CGCGGATCCGCGTGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCC-3’ (SEQ ID NO:39))、
GHSR1b (5’-GGAATTCCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAA-3’ (SEQ ID NO:40)および
5’-CGCGGATCCGCGGAGAGAAGGGAGAAGGCACAGGGA-3’ (SEQ ID NO:41))、ならびに
NTSR1 (5’-GGAATTCCATGCGCCTCAACAGCTCCGCGCCGGGAA-3’ (SEQ ID NO:42)および
5’-CGCGGATCCGCGGTACAGCGTCTCGCGGGTGGCATTGCT-3’ (SEQ ID NO:43))
を用いるRT-PCRによって増幅した。その産物をEcoR1およびBamH1で消化し、p3XFLAG-CMV10ベクター(Sigma-Aldrich Co.)の適切な部位にクローニングした。COS-7細胞に対して、上記のように、FuGENE6を用いて、GHSR1bまたはNTSR1発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされたCOS-7細胞を、0.5μMローダミン標識NMU-25ペプチド(NMU-25-ローダミン:Phoenix Pharmaceuticals. Inc.)とともに12時間培養し、PBS(-)中で5回洗浄して、4%パラホルムアルデヒド溶液中で室温で60分間固定した。続いて細胞を、Flagタグを付加したGHSR1a、GHSR1bまたはNTSR1タンパク質に対する抗体(Sigma-Aldrich Co.)とともにインキュベートし、FITCを結合させたヤギ抗マウス二次抗体(Cappel)で染色した上で、レーザー共焦点顕微鏡検査(TCS SP2 AOBS:Leica Microsystems)により観察した。さらに、3つの異なる陰性対照をこのアッセイ法のために調製した:1)NMU-25-ローダミンを添加していない非トランスフェクトCOS-7細胞;2)NMU-25-ローダミンで処理した非トランスフェクトCOS-7細胞;および3)GHSR1a、GHSR1、またはNTSR1がトランスフェクトされ、NMU-25-ローダミンで処理していないCOS-7細胞。既知のNMU受容体(NMU1R)をトランスフェクトしたCOS-7細胞を本アッセイ法の陽性対照として用いた。
トリプシン処理したLC319細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに播き(細胞5.0×104個)、10%FCS(+)RPMI-1640培地中で24時間培養した後、アッセイ法の20分前に培地を無血清RPMI-1640培地/1mM IBMX(イソブチルメチルキサンチン)に交換した。細胞をNMU-25ペプチドとともに20分間インキュベートした後に、cAMP EIA System(Amersham Biosystems)を用いてcAMPレベルを測定した。
トリプシン処理したLC319細胞を、ポリ-D-リジンをコーティングした壁が黒く底が透明な384ウェルのマイクロタイタープレート(1.0×104個/ml)に、アッセイ法の24時間前に播いた。細胞に1mM Fluo-4-AM蛍光指示色素をアッセイバッファー(ハンクス平衡塩類溶液、20mM HEPES、2.5mMプロベネシド)中で1時間負荷し、アッセイバッファーで3回洗浄し、インキュベーターに戻してから10分間後に蛍光定量画像プレートリーダー(FLIPR, Molecular Devices)でアッセイした。ベースラインに対する蛍光の最大の変化を用いて、NMU-25ペプチド刺激に対する細胞の応答を測定した。
LC319細胞に対して、NMUに対するsiRNA(si-NMU)またはルシフェラーゼに対するsiRNA(対照siRNA)のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションから12、24、および36時間後にmRNAを抽出し、Cy5またはCy3色素で標識した上で、以前に記載されたように32,256種の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイスライドに対する同時ハイブリダイゼーションに供した(Kakiuchi, S.ら、(2004). Hum. Mol. Genet. 13, 3029-3043., Ochi, K.ら、(2004). Int. J. Oncol. 24, 647-655.)。データの標準化の後に、シグナルがカットオフ値を上回った遺伝子をさらに解析した。NMU発現の時間依存的な低下に伴って強度が有意に低下した遺伝子を、SOMクラスター分析を用いてまず選択した。NMUの下流遺伝子候補の検証は、以下に列記した遺伝子特異的プライマーを用いる、マイクロアレイハイブリダイゼーションに用いたLC319細胞由来の同じmRNAの半定量的RT-PCR実験を用いて行った。
FLJ42024 (5’-AAAAAGGGGATGCCTAGAACTC-3’ (SEQ ID NO:118)および
5’-CTTTCAGCACGTCAAGGACAT-3’ (SEQ ID NO:119))、
GCDH (5’-ACACCTACGAAGGTACACATGAC-3’ (SEQ ID NO:120)および
(5’-GCTATTTCAGGGTAAATGGAGTC-3’ (SEQ ID NO:121))、
CDK5RAP1 (5’-CAGAGATGGAGGATGTCAATAAC-3’ (SEQ ID NO:122)および
(5’-CATAGCAGCTTTAAAGAGACACG-3’ (SEQ ID NO:123))、
LOC134145 (5’-CCACCATAACAGTGGAGTGGG-3’ (SEQ ID NO:124)
(5’-CAGTTACAGGTGTATGACTGGGAG-3’ (SEQ ID NO:125))、
NUP188 (5’-CTGAATACAACTTCCTGTTTGCC-3’ (SEQ ID NO:126)および
(5’-GACCACAGAATTACCAAAACTGC-3’ (SEQ ID NO:127))
(1)KOC1と相互作用するタンパク質としてのKIF11の同定
pCAGGS-n3FH-KOC1ベクターをトランスフェクトしたLC319細胞を抽出し、抗Flag M2モノクローナル抗体で免疫沈降させた後に、抗HAモノクローナル抗体で免疫沈降させた。KOC1を含むタンパク質複合体をSDS-PAGEゲル上での銀染色によって染色した。モックトランスフェクションでは存在しなかった125kDaバンドを抽出し、これがKIF11(NM_004523;SEQ ID NO:1)であることを質量分析シークエンシングによって明らかにした。
Flagタグ付加KIF11およびmycタグ付加KOC1を同時トランスフェクトしたA549細胞、KIF11またはKOC1のいずれかをトランスフェクトした細胞、ならびに非トランスフェクト細胞を、抗Flag M2アガロースにより免疫沈降させ、その後に抗myc抗体によるイムノブロット法を行った。これに対して、同じ一連のA549細胞を抗mycアガロースにより免疫沈降させ、抗Flag M2抗体によるイムノブロット法も行った。両方の構築物を同時トランスフェクトした場合にのみ単一のバンドが見いだされた(図1a)。免疫細胞化学検査では、Flagタグ付加FITC標識KIF11がA549の細胞質中でmycタグ付加ローダミン標識KOC1と共局在することが示された(図1b)。
原発性NSCLC(臨床試料)および肺癌細胞株におけるKIF11発現の検証を行った。KIF11発現の増加が16例のNSCLC症例中12例(ADC 8例のうち5例、およびSCC 8例のうち7例)で確かめられた。さらに、KIF11の上方制御は15例のNSCLC細胞株のうち14例でも観察された。
KIF11 cDNAをプローブとして用いるノーザンブロット法により、4.5kbおよび5.5kbの転写物が極めて弱いバンドとして同定され、これは試験した23例の正常ヒト組織のうち胎盤、精巣、および骨髄のみに認められた。KIF11の報告されているcDNA配列はより大きい方の転写物に対応すると考えられた。小さい方のバンドに対応する転写物について調べるために、本発明者らは精巣組織およびNSCLC細胞株から単離したmRNAを逆転写させた。本発明者らは、4種のプライマーセットを用いるPCRによってKIF11 cDNAの全配列を増幅したが、これらの試料中には選択的スプライシングを受ける転写物は見いだされなかった。したがって、小さい方のバンドはいくつかの関連遺伝子の転写物のクロスハイブリダイゼーションを反映している可能性がある。正常ヒト組織におけるKIF11の発現パターンはKOC1の発現パターンと有意に相関した(図2c)。
KIF11との相互作用のために必要なKOC1の特定ドメインを明らかにするために、本発明者らは、COS-7細胞に対して、NH2(N)末端FLAGタグまたはCOOH(C)末端HAタグを付加した配列を有するKOC1の5つの欠失構築物(KOC1DEL1〜5;図3a)の1つをトランスフェクトした。モノクローナル抗HAによる免疫沈降法により、KOC1DEL4およびKOC1DEL5構築物(どちらも2つのRNA認識モチーフ(RRM)を欠いている)は内因性KIF11と相互作用を行えないが、一方2つのRRMを有するKOC1構築物は全て、KIF11に対する結合親和性を保っていることが示された(図3b)。
KOC1タンパク質は、IGF2のリーダー3 mRNAと複数の付着を示すことが公知であり、これはおそらくその2つの機能性RRMおよび4つのK相同(KH)ドメインを介すると考えられる(Nielsen, J.ら、Mol. Cell Biol. 19, 1262-1270 (1999))。しかしながら、本発明者らが試験した肺癌細胞株またはNSCLC臨床組織試料のいずれにおいてもIGF2 mRNAの発現は検出されなかった。このため、肺癌発生におけるKOC1の機能を解明するために、本発明者らは、KOC1と相互作用すると考えられ、そのため肺癌の増殖および/または進行に重要な役割を果たす可能性のあるmRNAを検索した。本発明者らはまず、抗KOC1抗体および5つのNSCLC細胞株(A549、LC319、PC14、RERF-LC-AI、およびSK-MES-1)を用いてmRNAを免疫沈降させた。続いて、Cy-5標識した免疫沈降RNA(IP-mRNA)およびそれぞれに合致する細胞株から単離してCy-3標識した全RNAを、ヒトcDNAマイクロアレイ上で同時にハイブリダイズさせた(IP-マイクロアレイ)。スクリーニングした32,256個の遺伝子のうち、本発明者らは、5つの試験NSCLC細胞株のうち少なくとも4種でIP-mRNAにおける方が全RNAよりも豊富であったものを合計55個同定し(表2参照)、IP-mRNAをテンプレートとして用いるRT-PCR(IP-RT-PCR)によって、これらの候補が全て豊富に存在することを確かめた。RNA-免疫沈降の特異性について試験するために、本発明者らは、β-アクチン(ACTB)mRNAを用い、IP-mRNAをテンプレートとして使用するRT-PCR実験を行った。ACTBは抗KOC1抗体によっては全く沈降しなかった。RNA-免疫沈降のバックグラウンド対照として、本発明者らは正常ウサギIgGおよび5つのNSCLC細胞株を用いてmRNAを沈降させ、試験した8つのKOC1結合mRNA(CCT2、SBP2、SLC25A3、RAB35、PSMB7、GL、PKP4およびWINS1)がいずれも正常ウサギIgGによっては沈降しないことを確かめた。本発明者らはまた、RT-PCRにより、NSCLC試料における候補遺伝子の多くの発現が増加していることも確かめた(データ非提示)。これらのKOC1結合mRNAが同時に存在することがKOC1-KIF11複合体形成のために必要か否かを試験するために、本発明者らは、30単位のRNアーゼT1(SIGMA)によりインビトロで処理するかまたは処理しないままの細胞溶解物を用いて免疫沈降実験を行ったところ、mRNAの存在下または非存在下での2つのタンパク質間の相互作用には差が認められず、このことからKOC1-KIF11複合体形成にこれらの特定のmRNAが必要であることの可能性は低いことが示唆された。
KOC1結合mRNAに対する結合のために必要なKOC1の領域を明らかにするために、本発明者らは、A549細胞において発現させたKOC1欠失変異体の免疫沈降組換えタンパク質(図4a)およびKOC1結合mRNAの1つであるDIG標識RAB35 mRNAを用いたノースウエスタンブロット解析を行った。4つのKHドメインを欠くKOC1DEL3、ならびにN末端の2つのRRMおよびC末端の2つのKHドメインを欠くKOC1DEL5は、RAB35 mRNAと結合しなかった。一方、4つのKHドメインのみを有する構築物であるKOC1DEL4、およびC末端の2つのKHドメインを有さない構築物であるKOC1DEL2は、mRNAに対して、完全長KOC1構築物と比較して極めて弱い結合親和性を示し(図4b)、このことから2つのRRM およびC末端の2つのKHドメインがKOC1結合mRNAに対する結合のために重要であることが示唆された。
KOC1およびKIF11の機能的役割についてさらに調べるために、本発明者らは、ECFP-KOC1(シアン)およびEYFP-KIF11(黄色)を発現するように設計されたプラスミドを調製した。本発明者らは続いて、2つのプラスミドをともにCOS-7細胞にトランスフェクトし、それらの局在について免疫蛍光ビデオ顕微鏡検査およびリアルタイム共焦点顕微鏡検査を用いて試験した。KOC1およびKIF11の両方を発現する細胞は突起を出し、続いて隣接細胞と結合した(データ非提示)。生細胞のより詳細な観察により、KOC1がKIF11と複合体を形成し(KOC1-KIF11 RNP複合体;緑色粒子)、それが2つの細胞を連結する超微細構造を通じて一方の細胞から別の細胞に輸送されることが判明した(図5a)。KOC1-KIF11複合体の移動は一方の細胞からもう一方の細胞に一方向性であるように思われた。
KOC1-KIF11 RNP複合体によるmRNA輸送に生理的な関連があるか否かを解明するために(レシピエント細胞は輸送されたmRNAを翻訳することによってタンパク質を合成しうる)、本発明者らは、mycタグ付加配列およびEGFPタンパク質配列とインフレームで融合させた、KOC1/KIF11複合体の結合標的の1つである完全長RAB35 mRNAの発現ベクターを構築した。本発明者らは続いて、このキメラmRNAが1つの細胞から別の細胞へと輸送され、その後にレシピエント細胞で翻訳されてタンパク質産生が起こるか否かを調べた。Flagタグを付加したKOC1およびKIF11を発現するCOS7細胞に対して、これらのRAB35 mRNA発現構築物を有する構築物をトランスフェクトした(細胞A)。親mRNA-レシピエントCOS-7細胞はCellTrackerにより単染色した(青色;細胞B)。これらの2つの細胞集団を合わせて混合し、24時間共培養した。本発明者らはまず、細胞Aと細胞Bとの間でのRAB35-EGFP mRNAの細胞間輸送を、アンチセンスEGFPをプローブとして用いるインサイチューハイブリダイゼーションによって確かめた;細胞を24時間共培養した後に、CellTracker染色した細胞Bにおいて、および2つの細胞種の間での超微細構造上でも、RAB35-EGFP mRNAの弱い染色が検出された(図7a)。本発明者らは続いて、CellTracker染色したB型細胞におけるEGFPと融合させたRAB35タンパク質の存在を試験し、それぞれ免疫細胞化学およびタイムラプスビデオ顕微鏡検査を用いてそれらを見いだした(図7bおよび7c)。タイムラプスビデオ顕微鏡検査を用いたこれらの観察中に、A型細胞からB型細胞への視認しうるEGFPタンパク質粒子の輸送はみられなかったが、EGFPタンパク質は細胞質の器官内に徐々に出現し、これはB型細胞の小胞体(ER)であるように思われた(図7d)。これらの結果から、KOC1およびKIF11が、細胞増殖および/または接着を誘導すると考えられるタンパク質をコードするmRNAのサブセットと機能的に結合すること、ならびにKOC1およびKIF11の存在が細胞間輸送のために不可欠であることが示された。以前の報告は、高いKOC1レベルがIGF2リーダー3などの結合性mRNAの翻訳の妨げとなる可能性を示唆していたが、KOC1構築物および完全長RAB35-EGFP mRNA構築物を共にCOS-7細胞に同時トランスフェクトした本発明者らの実験では、RAB35-EGFP融合タンパク質レベルの低下は検出されなかった(図7e)。
KIF11に対するsiRNAプラスミドの、A549細胞(図8a)またはLC319細胞(データ非提示)へのトランスフェクションにより、3つの対照siRNAのいずれかを含む細胞およびモックトランスフェクション細胞と比較してKIF11のmRNA発現は抑制された。mRNA発現の低下に応じて、A549細胞およびLC319細胞は、MTTアッセイ(図8b)およびコロニー形成アッセイ(データ非提示)によって測定した細胞生存度およびコロニー数の有意な低下を示した。本発明者らはまた、KIF11に対するsiRNAの細胞間輸送における影響についてもタイムラプスビデオ検査を用いて調べた。モナストロール処理と類似の現象が観察された;一部の細胞では突起への突出が減少し、2つの細胞を連結する超微細構造が消失した。
本発明者らは、265例のNSCLC組織からなる組織マイクロアレイを用いる、抗KOC1ポリクローナル抗体および抗KIF11ポリクローナル抗体による免疫組織化学分析を行った(図11a)。265例のうち、KOC1染色は172例(64.9%)で陽性であり;129例はKIF11に関して陽性であった(48.7%)。これらの腫瘍においてKOC1の発現パターンはKIF11の発現と有意に一致した(Χ2=60.8、P<0.0001)。本発明者らは続いて、KOC1および/またはKIF11の過剰発現が臨床的転帰と関連性があるか否かを調べた。本発明者らは、NSCLCにおけるKOC1の発現がpT因子の状態(Χ2=23.1、P<0.0001)および腫瘍特異的5年生存率(P=0.0115、Log-rank検定による)と有意な関連性があることを見いだした(図11b、上図)。NSCLCにおけるKIF11の発現は、pT因子(Χ2=15.0、P<0.0001)、pN因子(Χ2=4.4、P=0.0356)および5年生存率(P=0.0008、Log-rank検定による)と有意な関連性があった(図11b,下図)。単変量解析によれば、pT、pN、性別、およびKOC1/KIF11発現はそれぞれ、NSCLC患者における腫瘍特異的生存度の低さと有意な関連性があった。さらに、KOC1およびKIF11は独立した予後因子であることが、Cox比例ハザードモデルを用いた多変量解析によって明らかになった(それぞれP=0.0499およびP=0.0259)。
2つの既知のNMU受容体であるNMU1R(FM3/GPR66)およびNMU2R(FM4)は、エネルギーホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしている(Fujii, R.ら、J. Biol. Chem. 275: 21068-21074 (2000);Howard, A.D.ら、Nature 406: 70-74 (2000);Funes, S.ら、 Peptides 23: 1607-1615 (2002))。NMU1Rは多くのヒト末梢組織に存在するが(Fujii, R.ら、J. Biol. Chem. 275: 21068-21074 (2000);Howard, A.D.ら、Nature 406: 70-74 (2000);Funes, S.ら、Peptides 23: 1607-1615 (2002))、NMU2Rは脳にしか局在しない。NMU1R遺伝子およびNMU2R遺伝子がNSCLCにおいて発現されるか否かを調べるために、正常なヒト脳および肺、NSCLC細胞株、ならびに臨床組織におけるこれらのNMU受容体の発現を、半定量的RT-PCR実験によって分析した。試験した細胞株および臨床試料のいずれにおいても、NMU1Rの発現もNMU2Rの発現も検出されなかったが、NMU1Rは肺で、NMU2Rは脳で発現され(データ非提示)、このことからNMUが他の受容体との相互作用を介して肺癌細胞の増殖を媒介しうることが示唆された。
NMUとGHSR1b/NTSR1との直接的な相互作用について確かめるために、COS-7細胞に対して、Flagタグを付加したGHSR1bまたはNTSR1を発現するように設計されたプラスミドを一過性にトランスフェクトし、ローダミン標識NMU-25の存在下で培養した。続いて、細胞におけるFlagタグ付加GHSR1b/NTSR1およびNMU-25-ローダミンの局在について、FITCを結合させた抗FLAG抗体を用いて調べたところ、NMU-25および両方の受容体のいずれもがともに細胞膜に位置することが見いだされた(図13c)。NMU-25とこれらの受容体の共局在は、以下のリガンド/細胞の組み合わせのいずれかを用いた対照アッセイでは観察されなかった:1)NMU-25-ローダミンと、受容体プラスミドのいずれかをトランスフェクトしていないCOS-7細胞とのインキュベーション;2)NMU-25-ローダミンを伴わずにインキュベートした非トランスフェクトCOS-7細胞;および3)受容体プラスミドのいずれかをトランスフェクトしたが、NMU-25-ローダミンは伴わずにインキュベートしたCOS-7細胞。この結果は、ローダミン標識NMU-25の、2つの受容体のいずれかを発現するCOS-7細胞の表面への結合(図13d)、およびローダミン標識NMU-25のCOS-7細胞の表面への用量依存的な様式での結合を示したフローサイトメトリーによって確かめられた。
正常ヒト組織におけるGHSR1bの発現はその時点で明確には報告されていなかったため、GHSR1bの分布をヒト多組織ノーザンブロットを用いて明らかにした。プローブとしてGHSR1b cDNAを用いるノーザンブロット法により、試験した23種の正常ヒト組織のうち心臓、肝臓、骨格筋、膵臓、および胃において、0.9kbの転写物が、1.1kbの転写物であるGHSR1aと比較してシグナルの極めて弱いバンドとして同定された(図13b)。
さらに、GHSRまたはNTSR1に対するsiRNAを発現するように設計されたプラスミド(si-GHSR-1、si-NTSR1-1、およびsi-NTSR1-2)を用いて、肺癌発生におけるNMU-受容体相互作用の生物学的意義について試験した。これらのプラスミドのいずれかをA549細胞またはLC319細胞にトランスフェクトしたところ、3種類の対照siRNAのいずれかを含む細胞と比較して内因性受容体の発現が抑制された(図14a)。受容体の発現の低下に応じて、A549細胞およびLC319細胞は細胞生存度(図14b)およびコロニー数(データ非提示)の有意な低下を示した。これらの結果から、NMUはGHSR1bおよびNTSR1との相互作用によってNSCLCの発生/進行に重大な役割を果たしている可能性が強く裏づけられた。
NMUシグナル伝達経路をさらに解明するため、およびNMUによって調節される下流遺伝子を同定するために、NMUに対するsiRNA(si-NMU)またはLUCに対するsiRNA(対照siRNA)を、NMUを過剰発現するLC319細胞に対してトランスフェクトし、遺伝子発現の下方制御を、32,256個の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイを用いてモニターした。この方法によって検出された数百もの遺伝子に対して、本発明者らは候補遺伝子をさらに選択するために自己組織化マップ(SOM)クラスタリング分析を行った。SOMクラスタリングは、Kohonen(Kohonen, T. (1990)。The self-organizing map. IEEE 78, 1464-1480)によって最初に開発され、マイクロアレイからの遺伝子発現データの解析へと応用された、データのマイニングおよび可視化の方法である。このクラスタリング法はk-meansクラスタリング(Kaech, S. M.ら、(2002)。Cell 111, 837-851.)と類似しているが、遺伝子を発現パターンに基づいて群に分類し、群間の関係を二次元マップによって示す点で異なっている。本発明者らのバリエーションフィルターを通過させる遺伝子は5×4のSOMによって群別化した。
ヒト遺伝子KIF11、GHSR1b、NTSR1、およびFOXM1の発現は、正常肺組織と比較して、非小細胞肺癌(NSCLC)において顕著に増加している。 したがって、これらの遺伝子はNSCLCの診断マーカーとして 都合良く用いることができ、それらによってコードされるタンパク質をNSCLCの診断アッセイに用いることもできる。
Claims (31)
- 対象から採取された肺細胞を含む組織における非小細胞肺癌(NSCLC)細胞を検出する方法であって、対象由来の組織試料におけるKIF11遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む方法であり、ここで該遺伝子の正常対照レベルと比較した該発現レベルの上昇がNSCLC細胞の存在を示す方法。
- 上昇が正常対照レベルを少なくとも10%上回るものである、請求項1記載の方法。
- 複数のNSCLC関連遺伝子の発現レベルを決定する段階をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
- 発現レベルが、以下のものからなる群より選択される任意の1つの方法によって決定される、請求項1〜請求項3のいずれかに記載の方法:
(1)KIF11遺伝子のmRNAを検出すること;
(2)KIF11遺伝子によってコードされるタンパク質を検出すること;および
(3)KIF11遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞増殖活性を検出すること。 - 発現レベルが、KIF11遺伝子プローブと、患者由来の生物試料の遺伝子転写物とのハイブリダイゼーションを検出することによって決定される、請求項1〜請求項4のいずれかに記載の方法。
- ハイブリダイゼーションの段階がDNAアレイ上で行われる、請求項5記載の方法。
- KIF11遺伝子の発現を検出する検出用試薬を含むNSCLC検出のためのキット。
- KIF11遺伝子と結合するポリヌクレオチドを含むNSCLC検出のためのアレイ。
- NSCLC治療薬の候補化合物を同定する方法であって、
(1)KIF11遺伝子を発現する精製された試験細胞を試験化合物と接触させる段階;
(2)KIF11遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(3)KIF11遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルを抑制する化合物を該NSCLC治療薬の候補化合物として選択する段階
を含む方法。 - 試験細胞がNSCLC細胞である、請求項9記載の方法。
- 試験細胞がNSCLC細胞から樹立された細胞系統である、請求項9記載の方法。
- NSCLCの治療または予防のための候補化合物のスクリーニングの方法であって、
(1)試験化合物を、精製されたKIF11ポリペプチドと接触させる段階;
(2)ポリペプチドと試験化合物との結合活性を検出する段階;ならびに
(3)ポリペプチドと結合する化合物を選択する段階
を含む方法。 - NSCLCの治療または予防のための候補化合物のスクリーニングの方法であって、
(a)試験化合物を、KIF11ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する培養細胞と接触させる段階;
(b)段階(a)のポリペプチドの細胞増殖活性を検出する段階;ならびに
(c)KIF11ポリペプチドの細胞増殖活性を、試験化合物の非存在下で検出される細胞増殖活性と比較して抑制する化合物を選択する段階
を含む方法。 - NSCLCの治療または予防のための候補化合物のスクリーニングの方法であって、
(1)試験化合物をKIF11遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された、精製された細胞と接触させる段階;
(2)該レポーター遺伝子の活性または発現レベルを測定する段階;および
(3)対照と比較して該レポーター遺伝子の活性または発現レベルを低下させる化合物を選択する段階
を含む方法。 - NSCLCの治療または予防のための候補化合物のインビトロにおけるスクリーニングの方法であって、
(1)KIF11ポリペプチドを、試験化合物の存在下で、KOC1ポリペプチドまたはその2つのRRM領域からなるKIF11結合ドメインを含み、かつKIF11と結合するポリペプチドと接触させる段階;
(2)ポリペプチド間の結合を検出する段階;および
(3)ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階
を含む方法。 - ポリペプチドのRNA輸送活性を測定する方法であって、
a.
i.SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;
からなる群より選択されるポリペプチドを、輸送されるRNAと、RNA輸送体の形成が可能な条件下で接触させる段階;
b.輸送されたRNAのレベルを検出する段階;ならびに
c.段階(b)の輸送されたRNAのレベルをRNA輸送活性と相関づけることによってRNA輸送活性を測定する段階
を含み、かつ前記RNA輸送体の形成が可能な条件が、(1)から(4)までの成分を発現する単離された細胞によって与えられる方法:
(1).
i.SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;
からなる群より選択されるポリペプチド;
(2) .
i.SEQ ID NO:105(KOC1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:105のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:104のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;
からなる群より選択されるポリペプチド;
(3).輸送されるRNA;ならびに
(4).DCTN1。 - RNA輸送体の形成が可能な条件が、KOC1ポリペプチドまたはその2つのRRM領域からなるKIF11結合ドメインを含み、かつKIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチドの存在下で与えられる、請求項16記載の方法。
- KOC1ポリペプチドの2つのRRM領域からなるKIF11結合ドメインを含み、かつKIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチドが、
i.SEQ ID NO:105(KOC1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:105のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:104のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項17記載の方法。 - RNA輸送活性を調節する作用因子(agent)を同定する方法であって、
a.作用因子を、
i.SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;
からなる群より選択されるポリペプチドを、輸送されるRNAと、RNA輸送体の形成が可能な条件下で接触させる段階;
b.輸送されたRNAのレベルを検出する段階;ならびに
c.輸送されたRNAのレベルを作用因子の非存在下での対照レベルと比較する段階であって、対照レベルと比較した、輸送されたRNAのレベルの上昇または低下が、試験化合物がRNA輸送活性を調節することを示す段階
を含み、かつ前記RNA輸送体の形成が可能な条件が、(1)から(4)までの成分を発現する単離された細胞によって与えられる方法:
(1).
i.SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;
からなる群より選択されるポリペプチド;
(2) .
i.SEQ ID NO:105(KOC1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:105のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:104のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;
からなる群より選択されるポリペプチド;
(3).輸送されるRNA;ならびに
(4).DCTN1。 - 試験化合物がRNA輸送活性を調節する活性を検出するためのキットであって、以下のaからdまでの成分を発現する単離された細胞、および細胞増殖を支える培養液を含むキット:
a.
i.SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KOC1と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;
からなる群より選択されるポリペプチド;
b.
i.SEQ ID NO:105(KOC1)のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii.1つまたは複数のアミノ酸が置換、除去、または挿入されたSEQ ID NO:105のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、KIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;および
iii.SEQ ID NO:104のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、KIF11と結合してRNA輸送活性を有する複合体を形成するポリペプチド;
からなる群より選択されるポリペプチド;
c.輸送されるRNA;ならびに
d.DCTN1。 - センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、センス鎖がKIF11標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖が該センス鎖に対して相補的なリボヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、かつKIF11遺伝子を発現する細胞にそれが導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子であって、前記標的配列がSEQ ID NO:1のヌクレオチド配列から選択された19〜25個の連続したヌクレオチドを含み、かつSEQ ID NO:32、33、および34からなる群より選択される塩基配列を含む二本鎖分子。
- 一本鎖リボヌクレオチド配列を介して結びついているセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のリボヌクレオチド転写物である、請求項21記載の二本鎖分子。
- 二本鎖分子が一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、
式中、[A]がSEQ ID NO:32、33、および34からなる群より選択される塩基配列に対応するヌクレオチド配列であり;[B]が3〜23ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;かつ[A']が[A]に対して相補的なヌクレオチド配列である、請求項21または22に記載の二本鎖分子。 - 請求項21〜23のいずれかに記載の二本鎖分子をコードするベクター。
- NSCLCの治療または予防のための組成物であって、KIF11遺伝子に対するsiRNAであって、siRNAの標的配列が、SEQ ID NO:32、33、および34のヌクレオチド配列から選択される、KIF11遺伝子の発現レベルを減少させるsiRNAの薬学的有効量を含む組成物。
- NSCLCの治療または予防のための組成物であって、KIF11遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を含む組成物。
- NSCLCの予後因子の検出方法であって、NSCLCの予後を予測しようとする対象から採取した標本におけるKIF11遺伝子の発現レベルを検出する段階を含み、前記予後因子は、KIF11遺伝子の発現レベルの上昇が検出された場合に予後不良と関連付けられる方法。
- 発現レベルが、以下のものからなる群より選択される方法の任意の1つによって検出される、請求項27記載の方法:
(a)SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出すること、
(b)SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、および
(c)SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むタンパク質の細胞増殖活性を検出すること。 - NSCLCの予後因子を検出するためのキットであって、以下のものからなる群より選択される任意の1つの成分を含むキット:
(a)SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出するための試薬、
(b)SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出するための試薬、および
(c)SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むタンパク質の細胞増殖活性を検出するための試薬。 - SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出するための試薬が、SEQ ID NO:1(KIF11)の塩基配列からなるポリヌクレオチドに特異的に結合するオリゴヌクレオチドである請求項29に記載の試薬。
- SEQ ID NO:2(KIF11)のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出するための試薬が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体である請求項29に記載の試薬。
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