ES2584932T3 - Métodos para el tratamiento, la evaluación pronóstica y la estadificación de cáncer no microcítico de pulmón - Google Patents

Métodos para el tratamiento, la evaluación pronóstica y la estadificación de cáncer no microcítico de pulmón Download PDF

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Abstract

Un método para determinar el pronóstico de un sujeto que padece adenocarcinoma de pulmón, que comprende la etapa de detectar la expresión del receptor de neurotensina de tipo 1 (NTSR1) en células de cáncer no microcítico de pulmón obtenidas de dicho sujeto, en el que la presencia de expresión de NTSR1 indica que el sujeto tiene un mal pronóstico.

Description

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DESCRIPCION
Metodos para el tratamiento, la evaluacion pronostica y la estadificacion de cancer no microcftico de pulmon Sector de la tecnica
La presente invencion se refiere a metodos para el tratamiento, la evaluacion pronostica y la estadificacion de adenocarcinoma de pulmon.
Estado de la tecnica
Durante el proceso neoplasico, los complejos de neuropeptido-receptores a menudo estan desregulados. Estos complejos acoplan varias rutas oncogenicas concomitantes y bien descritas, causadas por una regulacion autocrina o paracrina anomala y dan como resultado el aumento de la progresion del cancer (Heasley LE. Oncogene 20(13):1563-9, 2001). Entre estos complejos implicados en la progresion del cancer se encuentra la Neurotensina (NTS) de 13 aminoacidos y su receptor de neurotensina de tipo 1 (NTSR1) correspondiente de alta afinidad. La NTS, que esta localizada principalmente en tracto gastrointestinal, participa en funciones fisiologicas locales modulando la liberacion de sustancias importantes, tales como secreciones pancreaticas y biliares, sustancia P, prostaglandina y otras. Se encuentra expresion de NTSR1 en tumores humanos principalmente de origen epitelial, tales como colon, pancreas, prostata y mama (Evers BM. Peptides 27(10):2424-33 2006; Souaze F et al., Cancer Res 66(12):6243-9 2006).
La expresion de NTSR1 esta presente en cantidades mmimas o esta ausente en las celulas epiteliales normales. Sin embargo, esta inducida en los primeros estadios de la carcinogenesis por la activacion de la ruta Wnt/beta catenina (Elek J et al. Anticancer Res 20(1A):53-8, 2000; Souaze F et al. Carcinogenesis 27(4):708-16, 2006). La activacion de NTSR1 conduce a la proliferacion, supervivencia, movilidad e invasividad celular en tipos espedficos de celulas cancerosas mediante la senalizacion a traves de PKC, ERK1/2, RhoGTPasas, NFkappa-B, o la activacion de la quinasa de adhesion focal (FAK) (Leyton J et al., Eur J Pharmacol; 442(3):179-86, 2002; Ehlers RA et al., Biochem Biophys Res Commun 269(3):704-8, 2000; Zhao D et al., Mol Pharmacol 67(6):2025-31,2005). Se demostro que el complejo NTS-NTSR1 estaba implicado en el crecimiento tumoral al interrumpir la ruta neurotensinergica, mediante un antagonista espedfico, en tumores experimentales generados en ratones desnudos a partir de celulas cancerosas de colon, mama y celulas pequenas de pulmon, y por lo tanto causaba una fuerte reduccion en el crecimiento tumoral (Souaze F et al. Cancer Res 66(12):6243-9 2006, Moody TW et al. Peptides 22(1): 109-15, 2001; Maoret JJ et al. Int J Cancer 80(3):448-54, 1999.
El cancer no microdtico de pulmon es la causa principal de muertes relacionadas con el cancer. El tamano del tumor primario, la invasion de nodulos locorregionales y la presencia de metastasis distantes determina la tasa de supervivencia. Estos parametros se usan para definir el estadio de la enfermedad y decidir el tratamiento optimo para el paciente.
A pesar del progreso en los tratamientos medicos y quirurgicos, la supervivencia a largo plazo sigue siendo baja, variando los valores globales del 10 al 20 % a los 5 anos. La quimioterapia, en general, tiene un impacto limitado sobre la supervivencia cuando se usa como tratamiento adyuvante despues de la cirugfa, o como tratamiento primario en sujetos con metastasis. En el momento actual, el impacto de farmacos dirigidos por moleculas sobre el resultado de los pacientes con cancer de pulmon tambien esta limitado (Heasley LE. Oncogene 20(13):1563-9, 2001).
Los pacientes operables tienen una tasa de supervivencia global en 5 anos de aproximadamente un 40 % y entre ellos, los que tienen la enfermedad de estadio I experimentan cifras del 60-70 % unicamente. La identificacion de los pacientes con estadios iniciales patologicos, pero con un alto riesgo de recurrencia sena extremadamente util para adaptar individualmente los tratamientos adicionales, en lo que respecta a un seguimiento mas estricto y/o tratamientos adyuvantes (Scott WJ et al., Chest. Enero 2003; 123(1 Suppl):188S-201S). Takahashi et al., 2006, Cancer Res., 66(19), 9408-9419 y el documento W02005/090603 desvelan que la ruta de senalizacion oncogenica neuromedina U-receptor de secretagogos de hormona de crecimiento 1b/receptor de neurotensina de tipo 1 es una diana terapeutica para el cancer de pulmon.
Por lo tanto, los objetivos de la presente invencion son proporcionar metodos para el tratamiento, la evaluacion pronostica y la estadificacion del adenocarcinoma de pulmon.
Objeto de la invencion
La presente invencion describe que el receptor de neurotensina de tipo 1 (NTSR1) se expresa en celulas de adenocarcinoma de pulmon y que la activacion de NTSR1 conduce a la proliferacion, supervivencia, movilidad e invasividad celular en las celulas de adenocarcinoma de pulmon. La presente invencion tambien describe que la expresion de NTSR1 puede usarse como marcador para distinguir entre la agresividad de los tumores del cancer no microdtico de pulmon.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para determinar el pronostico de un sujeto que padece adenocarcinoma de pulmon, que comprende la etapa de detectar la expresion de NTSR1 en celulas de cancer no microcftico de pulmon, obtenidas de dicho sujeto, donde la presencia de la expresion de NTSR1 indica que el sujeto tiene un mal pronostico.
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La invencion tambien se refiere a un inhibidor de la activacion por neurotensina de NTSR1 para uso en el tratamiento de adenocarcinoma de pulmon, donde dicho inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un agente que regula negativamente la expresion de neurotensina, un anticuerpo contra neurotensina y un fragmento del mismo que se une a neurotensina.
Descripcion detallada de la invencion
Tambien se proporciona un inhibidor de la activacion por neurotensina del receptor de neurotensina de tipo 1 (NTSR1) para uso en el tratamiento de adenocarcinoma de pulmon.
La expresion “inhibidores de la activacion por neurotensina de NTSR1" debe entenderse en sentido amplio. Esta expresion se refiere a agentes que regulan negativamente la expresion de la neurotensina, a compuestos que se unen a la neurotensina (NTS).
Los inhibidores de la activacion por neurotensina de NTSR1 se seleccionan del grupo que consiste en un agente que regula negativamente la expresion de neurotensina y un anticuerpo contra neurotensina o un fragmento del mismo que se une a neurotensina.
En una realizacion de la presente invencion, el inhibidor de la activacion por neurotensina del receptor de neurotensina de tipo 1 es un agente que regula negativamente la expresion de neurotensina en celulas pulmonares. Tfpicamente, el agente que regula negativamente la expresion de neurotensina comprende un acido nucleico que interfiere con la expresion de neurotensina.
Tfpicamente, la regulacion negativa de la expresion de NTS puede medirse por inmunohistoqmmica, ensayos de union y radioinmunoensayo o ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas para NTS (Holtom PE, et al. J Neurosci Methods. 100(1-2):l51-6, 2000; Davis LG et al., J Neurosci Methods 15-23, 1985; Vincent JP Ann N Y Acad Sci., 668:90-100,1992; Souaze F et al., J Biol Chem, 272(15):10087-94, 1997).
Son ejemplos de estos agentes, moleculas antisentido o vectores que comprenden dichas moleculas antisentido. Las moleculas antisentido son cadenas complementarias de segmentos pequenos de ARNm. Son bien conocidos los metodos para disenar moleculas antisentido eficaces (vease, por ejemplo, el documento US6165990), y esta dentro de la capacidad del experto en la materia disenar moleculas antisentido capaces de regular negativamente la expresion de neurotensina o del receptor de neurotensina de tipo 1 en celulas pulmonares. Otros ejemplos son moleculas de ARN de interferencia (ARNi) tales como, por ejemplo, ARN interferentes cortos (ARNip) y ARN en horquilla cortos (ARNhp). ARNi se refiere a la introduccion de un ARN bicatenario homologo para dirigirse espedficamente a un producto genico, en el presente caso neurotensina o receptor de neurotensina, dando como resultado un fenotipo nulo o hipomorfico. Se conocen bien metodos para disenar moleculas de ARNi eficaces (como revision, vease Hannon and Rossi Nature. 2004 Sep 16; 431(7006):371-8), y esta dentro de la capacidad del experto en la materia disenar moleculas de ARNi capaces de regular negativamente la expresion de neurotensina o de un receptor de neurotensina en celulas pulmonares.
Son ejemplos de ARNip capaces de regular negativamente la expresion de neurotensina o del receptor de neurotensina en celulas pulmonares moleculas de acido nucleico que comprenden una de las siguientes secuencias:
ARNip NTSR1:
5'-AAGAAGTTCATCAGCGCCATC-3' (SEQ ID NO: 1)
ARNip NTS:
5'-GCAATGTTGACAATATACC-3' (SEQ ID NO: 2)
En una realizacion adicional de la invencion, el inhibidor de la activacion por neurotensina del receptor de neurotensina de tipo 1 es un anticuerpo contra neurotensina o un fragmento del mismo que se une a neurotensina.
El experto en la materia conocera metodos convencionales para la produccion de dicho anticuerpo espedfico o fragmento del mismo. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos espedficos o fragmentos del mismo inmunizando a un animal con neurotensina y seleccionando los anticuerpos que inhiben la activacion por neurotensina del receptor de neurotensina de tipo 1.
Tfpicamente, la inhibicion de la activacion por neurotensina del receptor de neurotensina de tipo 1 puede medirse con ensayos biologicos que estiman el nivel del segundo mensajero, o el efecto celular oncogenico, o los cambios morfologicos de las celulas (Skrzydelski D et al. Mol Pharmacol. 64(2):421-9 2003; Xu-van Opstal WY et al., Microsc Res Tech. 28(5):440-7 1994; Souaze F et al. Can Res 66(12):6243-9 2006).
El experto en la materia conocera metodos convencionales para la produccion de anticuerpos tanto policlonales como monoclonales y fragmentos de los mismos que se unen a NTS o NTSR1. Tambien son bien conocidos fragmentos de anticuerpo, particularmente fragmentos Fab y otros fragmentos que conservan la capacidad de union al epftopo y la especificidad, tales como anticuerpos quimericos y anticuerpos “humanizados” en los que deltas regiones estructurales (que no determinan la especificidad por el antfgeno) del anticuerpo se han reemplazado por regiones
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analogas o similares de otras especies. De esta manera, los anticuerpos generados en ratones pueden “humanizarse” para reducir los efectos negativos que se pueden producir tras la administracion a sujetos humanos. Los anticuerpos quimericos actualmente son modalidades terapeuticas aceptadas conocidas en el mercado. Por lo tanto, la presente invencion comprende el uso de anticuerpos espedficos para neurotensina o NTSR1 que incluyen fragmentos de anticuerpo F(ab')2, F(ab)2, Fab, Fv y Fd, anticuerpos quimericos en los que una o mas regiones se han reemplazado por partes homologas humanas o no humanas. El experto en la materia tambien sabra que pueden prepararse fragmentos tales como, por ejemplo, fragmentos ScFv y moleculas divalentes de tipo ScFv, usando metodos recombinantes.
En el contexto de la invencion, el termino “tratamiento”, como se usa en el presente documento, significa la inversion, alivio, inhibicion del progreso de o prevencion del trastorno o afeccion al que se aplica dicho termino, o inversion, alivio, inhibicion del progreso de o prevencion de uno o mas smtomas de un cancer no microdtico de pulmon.
Por “cantidad terapeuticamente eficaz” de un inhibidor de la activacion por neurotensina del receptor de neurotensina de tipo 1 se entiende una cantidad suficiente para tratar un cancer no microdtico de pulmon, con una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico. Sin embargo, se entendera que el uso diario total del inhibidor o del agente citotoxico se decidira por el medico a cargo del caso dentro del alcance de un criterio medico razonable. El nivel de dosificacion terapeuticamente eficaz espedfico para cualquier sujeto particular que lo necesite dependera de una diversidad de factores que incluyen el estadio del cancer no microdtico de pulmon a tratar y la actividad del agente inhibidor/citotoxico espedfico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, el momento de administracion, la via de administracion, la duracion del tratamiento; los farmacos usados en combinacion o al mismo tiempo y factores similares bien conocidos en las tecnicas medicas. Por ejemplo, es bien conocido dentro de la experiencia en la tecnica comenzar con dosis del compuesto a niveles menores que los necesarios para conseguir el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se consiga el efecto deseado.
Tfpicamente, los medicamentos de acuerdo con la invencion comprenden un inhibidor de la activacion por neurotensina del receptor de neurotensina de tipo 1, junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Un experto en la materia conocera vehmulos adecuados. Las formulaciones adecuadas para la administracion por cualquier via deseada pueden prepararse por metodos convencionales, por ejemplo, por referencia a un texto bien conocido tal como Remington; The Science and Practice of Pharmacy.
Un metodo de tratamiento de acuerdo con la invencion puede usarse en combinacion con cualquier otra estrategia terapeutica para tratar cancer no microdtico de pulmon, por ejemplo, cirugfa, radioterapia externa, quimioterapia o terapia hormonal o terapia con citocinas. En una realizacion preferida, se usa un inhibidor de la activacion por neurotensina de NTSR1 en combinacion con quimioterapia, es decir, en combinacion con un agente anticanceroso.
Como se usa en el presente documento, la expresion “agente anticanceroso” o “agente quimioterapeutico” se refiere a compuestos que se usan en el tratamiento de canceres.
Los agentes anticancerosos incluyen, pero sin limitacion, un antimetabolito tal como pemetrexed, fludarabina, gemcitabina, capecitabina, metotrexato, taxol, taxotere, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, complejos de platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, etoposido, teniposido, campatecinas, bleomicina, doxorubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, L-asparaginasa, doxorubicina, epimbicm, 5-fluorouracilo, taxanos tales como docetaxel y paclitaxel, leucovorina, levamisol, irinotecan, estramustina, etoposido, mostazas nitrogenadas, BCNU, nitrosoureas tales como carmustina y lomustina, alcaloides de la vinca tales como vinblastina, vincristina y vinorelbina, mesilato de imatinib, hexametilmelamina, topotecan, inhibidores de quinasa, inhibidores de fosfatasa, inhibidores de ATPasa, tirfostinas, inhibidores de proteasa, inhibidores de herbimicina A, genistema, erbstatina y lavendustina.
En una realizacion preferida, el agente anticanceroso se selecciona entre taxol; taxotere; complejos de platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino; doxorubicina; taxanos tales como docetaxel y paclitaxel; alcaloides de la vinca tales como vinblastina, vincristina y vinorelbina; genistema; erbstatina; un antimetabolito tal como pemetrexed; y lavendustina.
Tfpicamente, antes de aplicar un metodo de tratamiento de acuerdo con la presente invencion a un sujeto que padece cancer no microdtico de pulmon, puede realizarse un ensayo de diagnostico para determinar si el cancer no microdtico de pulmon presenta celulas que expresan NTSR1. Al realizar dicho ensayo de diagnostico antes del tratamiento, es posible determinar si un sujeto respondena a un metodo de tratamiento de acuerdo con la invencion. Esta dentro de la capacidad del experto en la materia realizar dicho ensayo de diagnostico. Tfpicamente, la expresion de NTSR1 puede medirse, por ejemplo, por RTC-PCR o inmunohistoqmmica realizada en una muestra obtenida por biopsia.
Como alternativa, los niveles de neurotensina, o de un precursor de la misma, tal como proneurotensina, en una muestra obtenida de los sujetos, pueden determinarse para tratar solo los sujetos que tienen un nivel elevado de neurotensina o un precursor de la misma tal como proneurotensina. Son ejemplos de muestras obtenidas de los sujetos, una muestra de sangre entera, una muestra de plasma o una muestra de suero. La medicion de neurotensina o proneurotensina tambien puede usarse para detectar una recurrencia eventual del tumor y/o de metastasis. Se proporcionan ejemplos del metodo para medir los niveles de proneurotensina en el documento WO2006/079528, en
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Ernst et al., Peptides 27 (2006) 1787-1793 y en Friry et al., Biochemical and Biophysical research Communication 290, 1161-1168 (2002).
En una realizacion de la invencion, el sujeto que lo necesita es un sujeto con cancer no microdtico de pulmon en estadio I o II que presenta celulas que expresan NTSR1. Los estadios del cancer de pulmon se definen, por ejemplo, en Clifton T. Mountain Chest 111;1710-1717 1997.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para determinar el pronostico de un sujeto que padece adenocarcinoma de pulmon, que comprende la etapa de detectar la expresion de NTSR1 en celulas de cancer no microdtico de pulmon, obtenidas de dicho sujeto, donde la presencia de expresion de NTSR1 indica que el sujeto tiene un mal pronostico.
En una realizacion de la invencion, dicho sujeto es un sujeto con cancer no microdtico de pulmon en estadio I o II.
La presente invencion, por lo tanto, permite la evaluacion del riesgo de recurrencia de un sujeto que se ha tratado quirurgicamente.
El termino “deteccion”, como se ha usado anteriormente, incluye la deteccion cualitativa y/o cuantitativa (medicion de niveles) con o sin referencia a un control. Tfpicamente, la expresion de NTSR1 puede medirse, por ejemplo, por RT-PCR o inmunohistoqmmica realizada en una muestra obtenida por biopsia.
Un metodo de pronostico de acuerdo con la invencion puede usarse en combinacion con cualquier otro metodo ya usado para la estadificacion de canceres no microdtico de pulmon (vease, por ejemplo, Clifton T. Mountain Chest 1997; 111; 1710-1717).
La divulgacion tambien proporciona un metodo para predecir la respuesta al tratamiento con un agente anticanceroso en un sujeto que padece cancer no microcftico de pulmon, que comprende la etapa de detectar la expresion de NTSR1 en celulas de cancer no microcftico de pulmon, obtenidas de dicho sujeto.
La presencia de celulas que expresan NTSR1 indica una mala respuesta al tratamiento con el agente anticanceroso.
La presente divulgacion tambien proporciona un metodo para detectar y localizar celulas de cancer no microdtico de pulmon y sus metastasis en el cuerpo de un sujeto, al que previamente se le ha administrado una cantidad suficiente para obtener imagenes de un agente marcado que se une a NTSR1, que comprende la etapa de someter dicho cuerpo a la obtencion de imagenes.
Los ejemplos de agentes marcados que se unen a NTSR1 pueden seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo marcado contra el receptor de neurotensina de tipo 1 o un fragmento del mismo que se une al receptor de neurotensina de tipo 1, una neurotensina marcada o un analogo de neurotensina marcado.
Esta dentro de la capacidad del experto en la materia realizar dicho metodo de formacion de imagenes. Tfpicamente, el marcador puede ser un fluoroforo, un isotopo radiactivo o un agente paramagnetico. Son bien conocidos los analogos de neurotensina marcados y sus usos para obtener imagenes, veanse, por ejemplo, los documentos WO98/33531, WO00/78796, WO2007/093373, US6,312,661 y US5,760,188.
A continuacion, la invencion se ilustrara por medio de los siguientes ejemplos, asf como por medio de las figuras. Descripcion de las figuras
Figura 1: Expresion de neurotensina (NTS) y del receptor de neurotensina de tipo 1 (NTSR1) en pacientes con adenocarcinomas de pulmon primarios. A) Ejemplo de inmunohistoqmmica para NTSR1 (izquierda) y NTS (derecha); parte superior: marcaje positivo de pacientes con adenocarcinomas de pulmon primarios. Aumento original X100, X200 (primera lrnea), X400 (segunda lrnea), parte inferior: marcaje negativo de neumotorax idiopatico X200. En todos los casos, los portaobjetos se obtuvieron con tejidos incluidos en cera de parafina. La inmunohistoqmmica para NTS y NTSR1 se realizo de acuerdo con una tecnica convencional que incluye una incubacion de 60 minutos con el anticuerpo primario seguida de incubacion con un complejo de estreptavidina-biotina-peroxidasa. B) porcentaje de pacientes positivos para NTSR1 o NTS o ambos. La positividad se evaluo por un anatomopatologo. C) analisis de transcritos de NTS y NTSR1 en ARN procedente de pacientes con adenocarcinomas de pulmon primarios en estadio I. Se realizo pCr en una dilucion 1/5 de una reaccion RT que contema 1 |jg de ARN, durante 28 ciclos. Los pacientes con un punto rojo o un punto verde se consideraron positivos para NTS o NTSR1 respectivamente.
Figura 2: Se muestran curvas de supervivencia con respecto a la expresion (1) o no (2) de NTS (derecha), NTSR1 (centro), o el complejo NTS/NTSR1 (izquierda). El analisis de supervivencia se realizo de acuerdo con el metodo de Kaplan-Meyer y la comparacion se realizo por la prueba log-rank. El numero de pacientes con riesgo para cada periodo de tiempo se muestra debajo de cada curva.
Figura 3: Caracterizacion de lrneas celulares de carcinoma de pulmon, LNM35 y los clones derivados, LNM-R y LNM-F. A) Caractensticas morfologicas tfpicas observadas sin (calle superior) o con (calle inferior) microscopfa de contraste de fase a 200 aumentos. B) Marcaje de inmunocitoqmmica para tincion con vinculina (superior) actina (centro) y DAPI (inferior) de LNM-R (columna izquierda) y LNM-F (columna derecha). C) Analisis RT-PCR en 200 ng de ARn total de LnM35, LMN-R y LNM-F. d) Radioinmunoensayo de NTS realizado en medio celular de 106 celulas LMN-R o LNM-F cultivadas durante 24, 48 y 72 h. Los experimentos se realizaron de 3 a 5 veces por duplicado. E) Marcaje de inmunocitoqmmica tfpico para NTSR1 de celulas LNM-R y LNM-F. Las celulas se
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sembraron en un portaobjetos Sonic Seal cultivado durante 48 horas, y la inmunocitoqmmica se realizo como se describe en la seccion de materiales y metodos.
Figura 4: Crecimiento tumoral generado por celulas LNM35, LNM-R y LMN-F xenoinjertadas en ratones desnudos. A) Un millon de celulas LNM35, LNM-R, LNM-F, o una mezcla de LNM-R y LNM-F (50/50) se inyectaron por via subcutanea en 24, 36, 34 o 12 ratones desnudos, respectivamente. Los volumenes tumorales se midieron cada semana. Se uso una formula elipsoide (4/3 PI x (L/2xl/2xh/2) para calcular el volumen. B) Peso tumoral a los 28 dfas. C) Inmunohistoqmmica tfpica para NTSR1 (izquierda) o NTS (derecha) para tumores generados a partir de celulas LNM-R (superior) o LNM-F (inferior). Diferencias significativas a *** P < 0,001 o ** P<0,01 usando analisis de varianza y prueba de Student-Neuman-Keuls.
Figura 5: Se generaron lmeas celulares de silenciamiento para NTS o NTSR1 (R-SI NTS y R-SI NTSR1, respectivamente) a partir de la lmea celular LNM-R. A) Se transcribio de forma inversa 1 |jg de ARN total de LNM35, LNM-R, LNM-F, R-SI NTSR1, y R-SI NTS. Los experimentos de PCR se realizaron usando cebadores espedficos para NTS (superior) y NTSR1 (inferior). Se sometieron a electroforesis amplicones en geles de agarosa y se tineron con bromuro de etidio. B) El radioinmunoensayo de NTS se realizo en un medio celular de 106 celulas LMN-R, R-SI NTSR1 o R-SI NTS cultivadas durante 24, 48 y 72 h. El experimento se realizo de 3 a 5 veces por duplicado. C) se inyectaron un millon de celulas LNM-R, R-SI NTS, R-SI NTSR1, o una mezcla 50/50 de R-SI NTS y R-SI NTSR1 en 36, 21, 21 y 19 ratones, respectivamente. Los volumenes tumorales se midieron todas las semanas. Se uso una formula elipsoide (4/3 PI x (L/2xl/2xh/2) para calcular el volumen. D) Peso tumoral a los 28 dfas. Diferencias significativas a *** P < 0,001 usando el analisis de varianza y la prueba de Student-Neuman-Keuls. E) Inmunohistoqmmica tfpica para NTSR1 (izquierda) o NTS (derecha) para tumores generados a partir de celulas R-SI NTS (superior) o R-SI NTSR1 (inferior). F) Analisis de transcritos de NTS y NTSR1 en tumores de celulas LNM 35 R-Si NtSr1, LNM-F, LMN-R y RSI NTS. El analisis se realizo el dfa 28. Se muestran ejemplos de dos tumores diferentes.
Figura 6: Regulacion endocrina por NTS y aumento del crecimiento tumoral. A) se inyectaron un millon de celulas R-SI NTS en los costados derechos de los ratones, y se inyectaron un millon de celulas R-SI NTSR1 en los costados izquierdos de los mismos ratones (n=18). En una segunda serie, se inyectaron un millon de celulas LNM-R solo en los costados derechos de los ratones (n=36). Los volumenes tumorales se midieron todas las semanas. Se uso la formula elipsoide (4/3 PI x (L/2xl/2xh/2) para calcular el volumen. B) Peso tumoral el dfa 28, C) Se inyectaron un millon de celulas LNM35 o una mezcla 50/50 de celulas R-SI NTS y LNM-R o una mezcla 50/50 de celulas R-SI NTS y LNM-F en los costados derechos de los ratones, se inyectaron 28, 17 y 14 ratones, respectivamente. Los volumenes tumorales se midieron cada semana. Se uso la formula elipsoide (4/3 PI x (L/2xl/2xh/2) para calcular el volumen. D) Peso tumoral el dfa 28. Diferencias significativas a *** P < 0,001 y ** p < 0,01 usando analisis de varianza y prueba de Student-Neuman-Keuls.
Figura 7: Un mecanismo hipotetico para el aumento del crecimiento tumoral por el sistema NTS. Puede producirse regulacion autocrina, paracrina y endocrina de una forma aislada o combinada. La regulacion autocrina o endocrina por NTS esta asociada con bajo crecimiento tumoral que aumenta fuertemente por la adicion de una regulacion paracrina por NTS. Se sabe que NTS potencia la proliferacion celular a traves de varios mecanismos, incluyendo la liberacion de moleculas de tipo EGF, e IL8. Una posible explicacion del estfmulo del crecimiento tumoral por NTS y la cooperacion entre las celulas con una regulacion autocrina por NTS y las celulas con regulacion paracrina sena el aumento de la liberacion de ligandos de tipo EGF en las proximidades de las celulas, causando una activacion mas fuerte de EGFR, conocido por su importante papel en la proliferacion celular. La ausencia de expresion de NTSR1 en la superficie celular da como resultado un crecimiento tumoral muy bajo, que indica la participacion de NT circulante y local en la progresion tumoral.
Figura 8: Se sembraron 5000 celulas en placas de 24 pocillos y se trataron con concentraciones crecientes de Cisplatino (A), Pemetrexed (B), o ambos (C). Se realizan ensayos de viabilidad de MTT despues de 7 dfas de tratamiento. Los resultados se expresan como la relacion entre la DO de celulas no tratadas y la DO de celulas tratadas a su concentracion de farmaco respectiva (Media ± DT)
Ejemplos
En la siguiente descripcion, todos los experimentos de biologfa molecular para los que no se proporciona un protocolo detallado se realizan de acuerdo con un protocolo convencional.
Ejemplo 1
Resumen
Se evaluo retrospectivamente la asociacion del receptor de neurotensina de tipo 1 (NTSR1), o la neurotensina (NTS), o ambos, y la supervivencia entre 71 pacientes con adenocarcinoma de pulmon primario en estadio I. Los tumores experimentales se desarrollaron usando una lmea celular de cancer de pulmon agresiva, que expresaba NTSR1, o NTS y NTSR1, o silenciada para ambos.
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Resultados: Se encontro expresion de NTS y NTSR1 en (66 %) y (59 %) de los casos, respectivamente. La expresion de ambos se produjo en (43,6 %) de los pacientes. La expresion de NTS no tuvo ningun impacto sobre la supervivencia. El marcaje positivo de NTSR1 se asocio con un pronostico significativamente peor que el marcaje negativo (tasa de supervivencia en 5 anos del 51,7 % frente al 90,2 %; p = 0,00027). El tamano tumoral de las lmeas celulares que expresaban NTS y NTSR1, o NTSR1 solo, fue un 32 % y un 51 % mas pequeno, respectivamente, que el de la mezcla de las dos lmeas celulares. El agotamiento de NTS o NTSR1 en la lmea celular que expresaba originalmente ambas moleculas va acompanado de una reduccion del 35 y 60 % en el tamano del tumor, respectivamente.
Conclusion: El complejo NTS/NTSR1 aumenta el crecimiento del tumor de pulmon. La evaluacion de la expresion de NTSR1 en tumores de bajo estadio es un marcador para distinguir la agresividad de los tumores.
Metodos
Pacientes y muestras de tejidos
Se revisaron retrospectivamente archivos clmicos de 71 pacientes consecutivos tratados por lobectoirna y diseccion nodal completa para un adenocarcinoma de pulmon primario patologico en estadio I. Todos los pacientes se operaron en el Departamento de Cirugfa Toracica de Hotel-Dieu Hospital, Paris, Francia, entre el 8 de enero de 2001 y el 27 de marzo de 2003. En todos los pacientes se realizo una reseccion completa macroscopica y microscopicamente. Ninguno se habfa sometido a quimioterapia o radioterapia preoperatoria o posoperatoria. Para todos los casos, se obtuvieron portaobjetos histologicos del tumor primario mediante tejidos incluidos en cera de parafina. Se uso la tincion convencional H&E para asegurar el caracter tumoral de la muestra y se obtuvieron secciones adyacentes para el analisis inmunohistoqmmico.
Inmunohistoquimica
La inmunotincion de NTSR1 y NTS se realizo en secciones desparafinadas del 4 pm de espesor, usando el metodo del complejo avidina biotina peroxidasa. Despues de la inhibicion de las peroxidasas endogenas con peroxido de hidrogeno al 3 %, los portaobjetos se lavaron en TBS y se incubaron con suero de conejo normal al 10 % a temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos. La inmunorreactividad de NTSR1 se detecto usando un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra el extremo carboxilo humano del receptor (1:100) (C-20 Santa Cruz EE.UU). La inmunorreactividad de NTS se realizo usando anticuerpo de conejo dirigido contra NTS (1/500) (NA1230 Biomol, EE.UU) durante 2 horas a TA en una camara humidificada en el caso del tumor humano y con el fragmento largo de NTS, FL170 (Santa Cruz) a una dilucion de 1/200 para los tumores xenoinjertados. La especificidad inmunohistoqmmica de NTS o NTSR1 se comprobo por omision del anticuerpo primario y desplazamiento con el peptido neutralizador (Santa Cruz, EE.UU) o NTS, durante 2 horas a TA. Todos los portaobjetos se aclararon tres veces con TBS; las secciones se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado (1:200) (Vector, EE.UU), durante 30 min a TA. El complejo antfgeno-anticuerpo se revelo con complejo de avidina-biotina-peroxidasa, durante 30 minutos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit Vectastain ABC (Vector, EE.UU). La tincion se realizo durante 5 minutos con tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (DAB) (Sigma, EE.UU). Todos los portaobjetos se sometieron a una tincion negativa con hematoxilina. Se uso el mismo procedimiento para los tumores de raton.
Procedimiento de cultivo
Las lmeas celulares de pulmon humano NCI-H460 y LNM35 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, EE.UU) suplementado con suero bovino fetal al 10 % y glutamina 2 mM. La lmea celular LNM35 se subclono por dilucion limitante. Despues de unos pocos dfas de cultivo, se guardaron los clones que conteman exclusivamente celulas planas o redondeadas y se denominaron LNM-F en el caso de las celulas planas y LNM-R en el caso de las celulas redondeadas.
Extraccion de ARN y RT-PCR
Los protocolos para la extraccion de ARN total, reaccion de transcripcion inversa (RT) y PCR estan documentados en Souaze et al. La RT se realizo en 2 pg de ARN total usando un cebador espedfico de NTSR1 (5'-GCTGACGTAGAAGAG-3' SEQ ID NO: 3) o 50 pmol de oligo dT y oligo dN. La amplificacion por PCR se realizo en un 1:5 v/v de la reaccion RT usando 25 pmol de cada cebador 5'-CgTGGAGCTGtAcAACTtCa-3' SEQ ID NO:4 y 5'-CAGCCAGCAGACCACAAAGG-3' SEQ ID NO:5 para NTSR1, y 5'-CAGCTCCTGGAGTCTGTGCT-3' SEQ ID NO:6 y 5'-GTTGAAAAGCCCTGCTGTGACAGA -3' SEQ ID NO:7 para NTS, S: 5'-TTCAAATGAGATTGTGGAAAA-3' SEQ ID NO:8 y AS: AGAT CAT CT CTGCCTGAGT AT SEQ ID NO:9 para Cox-2, 5'-CGGAGT CAACGGATTTGGTCG-3' SEQ ID NO:10 y 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGCT-3' SEQ ID NO:11 para GAPDH y 1 unidad de Taq polimerasa (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia). El perfil de amplificacion consistfa en desnaturalizacion a 94 °C durante 30 s, hibridacion a 57 °C durante 45 s y extension a 72 °C durante 45 s. Los ciclos de PCR se precedieron por desnaturalizacion a 95 °C durante 5 min y se continuaron por una extension final a 72 °C durante 10 min. La amplificacion se realizo en un termociclador de ADN 9700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Courtaboeuf, Francia).
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Construccion y transfeccion de ARNip de NTSR1 y NTS
Se prepararon ARNip para NTSR1 humano (5'-AAGAAGTTCATCAGCGCCATC-3' SEQ ID NO: 1) y NTS humana (5'-GcAATGTTGACAATATACC-3' SEQ ID NO: 2) usando psilencer 3.1-H1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ambion, EE.UU). Se transfectaron celulas LNM-R usando reactivo Lipofectamine (Invitrogen, EE.UU). Los transfectantes estables se seleccionaron con higromicina B (400 mg/ml) y las colonias se exploraron usando RT-PCR (Souaze F et al., Cancer Res 66(12):6243-9 2006).
Inmunohistoquimica
Se cultivaron LNM35, LNM-R y LNM-F en portaobjetos Sonic Seal de 4 pocillos (Nunc). En resumen, las celulas se fijaron durante 2 minutos por solucion de acetona/metanol (V/V) y el marcaje del receptor NTSR1 se realizo con anticuerpo policlonal (1/500) (c2206, sigma) y se revelo con anticuerpo anti-conejo FITC secundario (1/200). La polimerizacion de actina se detecto por incubacion de los portaobjetos durante 30 minutos con faloidina conjugada con TRITC (Sigma) en PBS-BSA al 1 %. Para la inmunotincion de vinculina, los portaobjetos se incubaron durante 1 h con anticuerpo de vinculina (Sigma) 1/100 en PBS-BSA al 0,5 %. Los portaobjetos posteriormente se incubaron durante 1 h con IgG de cabra anti-raton FITC (Immunotech, Marseille, Francia). Los portaobjetos se montaron usando el medio Vectashield-diamidino-fenilindol (DAPI, Vector, Burlingame, CA, EE.UU).
Radioinmunoensayo de NTS
Se cultivaron un millon de celulas en placas Petri de 60 mm, despues de 24 horas se retiro el medio y se anadio medio sin suero a las celulas durante 24, 48 o 72 h. Se recogio el medio; se centrifugo 5 min a 2000 g, y se anadieron 5000 UIK/ml de trasylol al medio. El radioinmunoensayo se realizo en 1 ml de medio liofilizado de acuerdo con el procedimiento desarrollado en Scarceriaux et al. (Scarceriaux V et al. Endocrinology; 136(6):2554-60, 1995). En resumen, se incubaron diluciones seriadas de NTS (Sigma) o muestras desconocidas en 1 ml de tampon de ensayo final (NaH2PO4 60 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4) con el anticuerpo anti-NTS (dilucion final 1/33 300) A44 (Euro Diagnostica), y [125Ityr]-NTS 5000 dpm; 2000 Ci/mmol a 4 °C durante 5 dfas. Se separo la [125Ityr]-NTS unida del radioligando libre por precipitacion con polietilenglicol al 16 % y 5 mg/ml de gammaglobulina de conejo. Despues de una centrifugacion (2.500 X g durante 20 min), se midio la radiactividad que quedaba en el sedimento en un contador gamma (Wallac modelo 1470 Wizard).
Animales
Los xenoinjertos se iniciaron por inyeccion subcutanea de LNM35, o LNM-F, LNN-R o R-SI NTS o R-SI NTSR1. Las celulas se descongelaron a partir de N2 lfquido; se cultivaron en medios apropiados, y se dividieron de 2 a 5 veces antes de cultivarse a la concentracion de 106 celulas en un matraz T75. Despues de 72 h, las celulas se tripsinizaron, se contaron dos veces usando celulas de recuento Neubauer y se resuspendieron en PBS a la concentracion de 106 celulas/100 pl. Se inyectaron 100 pl por animal. Se uso un mmimo de 6 animales por grupo. Para generar tumores a partir de la mezcla de celulas, las celulas se cultivaron conjuntamente en un matraz T150 a 106 celulas de cada clon (LNM-R y LNM-F, o R-SI NTS y R SI NTSR1). Las mezclas de celulas se cultivaron durante 72 h antes de la tripsinizacion. Se inyectaron 100 pl de PBS que contema 106 celulas por animal. Un grupo de animales se inyecto en el costado derecho con 106 celulas R-SI NTS y en el costado izquierdo con 106 celulas R-SI NTSR1. El volumen tumoral se calculo usando la formula elipsoide ((4/3xpI x (longitud/2) x (anchura/2 x (altura/2)). Los ratones se sacrificaron despues de 28 dfas, y los tumores se diseccionaron y se pesaron. La parte del tumor se congelo inmediatamente en N2 lfquido y una parte se fijo en paraformaldetndo al 4 %. Se realizaron bloques de parafina y se realizaron cortes de XX pn.
Analisis estadistico
Se uso un analisis de varianza (ANOVA) de una via seguido de una prueba de comparaciones multiples de Student-Newman-Keuls para determinar la variacion entre el volumen y el peso entre tumores de diversos ongenes de lmeas celulares. La supervivencia se calculo por el metodo de Kaplan-Meyer y la comparacion de las curvas de supervivencia se realizo mediante la prueba log-rank.
Resultados:
Expresion de NTS y NTSR1 en adenocarcinomas de pulmon humano
La expresion de NTS y NTSR1 se estudio por inmunohistoqmmica en una serie de 71 pacientes consecutivos sometidos a lobectomfa pulmonar y diseccion nodal para adenocarcinomas de pulmon patologicos en estadio I. Las caractensticas clmicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1: Caractensticas clmicas de los pacientes. Se estudiaron 71 pacientes consecutivos tratados por lobectoirna para adenocarcinoma pulmonar primario patologico en estadio I. Ninguno se habfa sometido a quimioterapia o radioterapia perioperatoria.
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Adenocarcinomas pulmonares n:
=71
Edad
59,6 ± 10,7
Hombres
59/71
T1
28/71
Enfermedades T2
43/71
Tamano tumoral (cm) [media ± DT]
3,8 ± 2,07
N0
71/71
Embolos vasculares neoplasicos intratumorales o peritumorales
24/71
Embolos linfaticos neoplasicos intratumorales o peritumorales
15/71
Tumores positivos para NTSR1 [n (% de pacientes)]
45/71 (63 %)
Tumores positivos para NTS [n (% de pacientes)]
46/71 (65 %)
Tumores positivos para NTSR1 y NTS [n (% de pacientes)]
31/71 (44 %)
Perdidas de seguimiento
1/71
Seguimiento en meses [media ± DT]
48,2±20,9
Muertes durante el seguimiento [n (% de pacientes)]
22/70 (31 %)
Terapias perioperatorias
Radioterapia [n]
0/71
Quimioterapia [n]
0/71
Neumotorax idiopatico n=26
Parenquima pulmonar positivo para NTSR1
0/26
Parenquima pulmonar positivo para NTS
0/26
Parenquima pulmonar positivo para NTSR1 y NTS
0/26
n= numero de pacientes, DT = desviacion tfpica
La tincion de NTSR1 en las celulas cancerosas era granular, restringiendose la tincion principalmente al citoplasma, y en raras ocasiones a la superficie celular, como se muestra en la Figura 1A a la izquierda. El marcaje de NTS con frecuencia era muy intenso y siempre estaba distribuido en todo el citosol. En la mayona de los casos, todas las celulas cancerosas se marcaron con NTS, mientras que el estroma del tumor era negativo. En la Figura 1A a la derecha se muestra una imagen tipica de la inmunotincion de NTS observada. Todas las muestras se evaluaron por un anatomopatologo. Se encontro expresion de NTS y NTSR1 en 46/71 (66 %) y 45/71 (59 %) de los casos, respectivamente. La expresion de NTS y NTSR1 se produjo en 31/71 (43,6 %) de los pacientes (Figura 1B). Se encontraron resultados similares cuando se estudiaron los transcritos de NTS y NTSR1, 15/23 (65 %) pacientes expresaron NTS (puntos rojos en la Figura 1C) y 16/23 (69 %) expresaron NTSR1 (puntos verdes en la Figura 1C). Diez pacientes de 23 (43 %) expresaron los dos marcadores.
La expresion de NTS como se evalua por inmunohistoqmmica no tuvo ningun impacto sobre la supervivencia (Figura 2, izquierda), mientras que la expresion de NTSR1 estaba asociada con un pronostico significativamente peor que la ausencia de expresion de NTSR1 (tasa de supervivencia en 5 anos del 51,7% frente al 90,2 %; p = 0,00027) (Figura 2 central). Los pacientes con tumores que expresaban los dos marcadores tambien tuvieron un pronostico significativamente peor que los que teman tumores que expresaban solo NTS o solo NTSR1 o ninguno de ellos (tasa de supervivencia en 5 anos del 49,5 % frente al 78,5 %; p = 0,018, Figura 2 derecha).
Este resultado suscita la cuestion de si la expresion de NTSR1 en pacientes con un peor resultado es solo un marcador del pronostico porque su expresion estana correlacionada con otros acontecimientos moleculares o asociada con la progresion del tumor o si NTSR1 tambien es un actor y participa potenciando la progresion del tumor. Para responder a esta cuestion se usaron tumores experimentales.
Caracterizacion de modelos celulares
Las celulas LNM35 se obtuvieron originalmente de un carcinoma de celulas grandes de pulmon humano, las celulas NCI-H460. Se ha demostrado que LNM35 produce metastasis en ganglios linfaticos regionales con una incidencia del 100 % como resultado de una implantacion subcutanea convencional. La observacion microscopica de la lmea celular LNM35 revela dos subpoblaciones morfologicas diferentes de celulas (Figura 3A, panel derecho). Una poblacion se caracteriza por un aspecto convexo y redondeado, denominada LNM-R, (Figura 3A, central). La otra poblacion esta aplanada y mas extendida, LNM-F. Cada poblacion se subclono por dilucion limitante. De acuerdo con la discrepancia morfologica de los dos subclones, la inmunocitoqmmica de vinculina y actina revela distintos perfiles de protemas. En las celulas LNM-R, se redujo el marcaje de actina y vinculina en comparacion con las celulas LNM-F (Figura 3B). En las celulas LNM-F, el marcaje con vinculina se concentro en focos, que se sabe que aumentan la adhesion y la extension al promover el reclutamiento de protemas del citoesqueleto en el complejo de adhesion focal. De la misma forma, el marcaje de actina confirmo la disimilitud en la extension celular y mostro una diferencia aparente de tamanos dentro de los dos subclones.
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El analisis de transcritos demostro que los dos subclones expresan NTSR1, pero solo LNM-R expresaba NTS (Figura 3C). Se confirmo la expresion diferencial de NTS en los dos subclones por RIA. El medio de cultivo de celulas LNM-R contema grandes cantidades de NTS que se acumulaban con el tiempo, mientras que el medio de las celulas LNM-F contema 20 veces menos NTS (Figura 3D). El examen por inmunocitoqmmica de NTS de los dos subtipos celulares se mantuvo negativo, lo que sugena que la mayona de la NTS se liberaba en el medio (datos no mostrados). Se confirmo la regulacion autocrina en celulas LNM-R con un experimento de inmunocitoqmmica de NTSR1 (Figura 3E). En las celulas LNM-F, NTSR1 se localiza en la superficie celular, lo que demuestra el estado virgen de las celulas. Por el contrario, en las celulas LNM-R, NTSR1 esta localizado en un area perinuclear, lo que sugiere una internalizacion intensa del receptor. Para confirmar que los dos tipos celulares teman el mismo origen, se realizo un analisis microsatelite usando D17S250 y D17S513, y mostro patrones identicos para LNM-R, LNM-F y LNM35, confirmando la derivacion de LNM35 de los dos clones.
El complejo NTS-NTSR1 potencia el crecimiento tumoral
En primer lugar, se comparo la tasa de crecimiento tumoral de LNM35 y los dos subclones derivados, LNM-R (NTS+) y LNM-F (NTS-). Como se muestra en la Figura 3A, LNM35 presentaba el perfil de tumorigenesis mas drastico con un volumen tumoral final de 3802 mm3. Los subclones LNM-R y LNM-F generaron tumores mas pequenos con un volumen final de 2582 y 1858 mm3, respectivamente. El tamano tumoral es un 32 % y 51 % mas pequeno que LNM35 cuando se genero por LNM-R o LMN-F, respectivamente. La diferencia en la tasa de crecimiento tumoral entre las celulas parentales y los dos subclones sugena una cooperacion entre las dos poblaciones celulares que aumenta el potencial tumoral de las celulas. Para confirmar esta hipotesis, se mezclaron los dos subclones a igual concentracion en el matraz de cultivo antes de inyectar la mezcla en los ratones. Se observo la misma tasa de crecimiento tumoral que la generada por celulas LNM35, con un volumen final de 3782 mm3 para la mezcla de LNM-F y LNM-R y 3802 mm3 para LMN35 (Figura 4A). El peso tumoral observado 28 dfas despues de la inyeccion siguio la misma variacion que el volumen tumoral (Figura 3B). Se realizo inmunohistoqmmica de NTS y NTSR1 sobre los tumores. Se observo la presencia de NTSR1 en tumores tanto LNM-R como LNM-F (Figura 4C), el marcaje es granular con intensidad irregular como la observada en el tejido humano (mostrado en la Figura 1A). Para visualizar NTS, se uso un anticuerpo contra un precursor de NTS. Solo en estas condiciones, NTS era detectable en los tumores LMN-R, pero no en los tumores LNM-F (Figura 4C).
Para evaluar el papel del complejo NTS-NTSR1 en el aumento del crecimiento tumoral, se generaron lmeas celulares de silenciamiento para NTS o NTSR1 a partir de celulas LMN-R. En el clon R-SI NTS, el transcrito para NTS esta completamente agotado. Se confirmo este resultado por RIA de NTS realizado en el medio de cultivo celular, y como era de esperar no se detecto NTS (Figura 5A y B). El analisis de transcritos demostro que en R-SI NTS, el transcrito de NTS-1 es similar al de las celulas LNM35 y lNm-R. En el clon R-SI NTSR1, el transcrito para NTSR1 esta casi agotado, mientras que el transcrito de NTS es similar a los encontrados en las celulas LNM35 y LMN-R (se muestra un ejemplo en la Figura 5A).
Usando estos modelos celulares, se examino el efecto del agotamiento de NTS o NTSR1 sobre el crecimiento tumoral de celulas LNM-R y sus homologas de silenciamiento de NTS y NTSR1. El agotamiento de NTS o NTSR1 en las celulas va acompanado por una reduccion del 35 y 60 % respectivamente del volumen tumoral en comparacion con el tumor LNM-R (Figura 5C). Se observo una reduccion similar en el peso tumoral (Figura 5D). Se cultivo durante 3 dfas una mezcla de los dos clones silenciados, a igual concentracion, antes de la inyeccion en los ratones. El volumen y peso tumorales finales fueron similares al volumen tumoral de LNM-R (Figura 5C y D). Esta observacion sugiere que se produjo una cooperacion entre las dos lmeas celulares R-SI NTS y R-SI NTSR1 y que estimula el crecimiento tumoral (Figura 5C), y la regulacion paracrina por NTS es uno de los actores principales de esta cooperacion. Se verifico que los transgenes de NTS y NTSR1 segman siendo eficaces despues de 28 dfas de crecimiento tumoral; por inmunohistoqmmica, no fue detectable el marcaje de NTS y NTSR1 en R-SI NTS y R-SI NTSR1 respectivamente (Figura 5E). Sin embargo, el analisis de transcritos muestra una mayor expresion de NTS y NTSR1 en el ARN tumoral en comparacion con la lmea celular original (comparense las Figuras 5F y 5A).
Para explorar el efecto de la regulacion endocrina por NTS sobre el aumento del crecimiento tumoral, se inyectaron celulas R-SI NTS en el costado derecho y celulas R-SI NTSR1 en el costado izquierdo de los ratones. La Figura 6 demuestra que las celulas R-SI NTS alcanzan el tamano y el peso de las celulas parentales, LMN-R, mientras que el tumor R-SI NTSR1 sigue teniendo el mismo tamano pequeno que se observo en los ratones que llevaban el R-SI NTSR1 solo (comparense la Figura 6 y la Figura 5C). Los presentes inventores sugieren que la NTS circulante producida por el tumor SI-NTSR1 aumentaba el crecimiento tumoral de R-SI NTS xenoinjertado en el otro costado. Desafortunadamente, la cantidad de sangre que puede obtenerse de ratones desnudos es demasiado pequena para realizar un RIA de NTS. La cooperacion entre las dos lmeas celulares para aumentar el crecimiento tumoral esta mediada por factores endocrinos. Este experimento sugena que NTS controla la cooperacion y el aumento del crecimiento del tumor.
A continuacion, se trato la cuestion de la potencia de la regulacion autocrina por NTS en comparacion con la regulacion paracrina. Se inyecto en ratones una mezcla de celulas R-SI-NTS y LNM-R a igual concentracion. Esta mezcla presentaba regulacion autocrina y paracrina por NTS. Despues de 28 dfas de crecimiento, el tamano del tumor generado por esta mezcla era similar al de los tumores generados por las celulas LNM35 parentales, 4122 mm3 en
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comparacion con 3885 mm3, respectivamente. A los 28 dfas, el peso tumoral de LNM35 y la mezcla de R-SI-NTS y LNM-R es similar (Figura 6D), lo que demuestra que la regulacion autocrina de NTS generaba acontecimientos celulares que participan con la regulacion paracrina para aumentar claramente la progresion tumoral. Por el contrario, cuando se inyectaba una mezcla de celulas que no expresaban NTS, R-SI NTS y LNM-F, el volumen tumoral y el peso tumoral eran un 39 % y 45 %, respectivamente, mas pequenos que las celulas LNM 35. El tamano y el peso tumoral eran similares a los de R-SI NTS o LNM-F cuando se inyectaban solos (1970, 1858 mm3, respectivamente) en comparacion con los 2493 mm3 observados en el caso de la mezcla. Se realizaron observaciones identicas para el peso tumoral. Cuando las celulas no secretan NTS, no hay cooperacion entre las celulas, y el crecimiento tumoral sigue siendo pequeno. El experimento global sugirio que NTS participa aumentando el crecimiento tumoral y, por consiguiente, la gravedad de la progresion tumoral.
EJEMPLO2
La expresion de NT-NTSR1 en celulas de cancer de pulmon esta correlacionada con la resistencia a la quimioterapia
Las celulas LNM R forman una subpoblacion celular de la lmea celular altamente agresiva LNM35. Esta lmea celular presenta expresion de NTS y NTSR1. La inmunohistoqmmica de NTSR1 de celulas LNM R muestra una acumulacion del receptor en el citosol y en el compartimento perinuclear, que indica la endocitosis de NTSR1 tras la estimulacion por NTS. Se generaron lmeas celulares silenciadas para NTS (R SI-NTS) o NTSR1 (R SI-NTSR1) a partir de LNM R. En el siguiente experimento se estudio la respuesta de las celulas y los clones silenciados al tratamiento de quimioterapia propuesto actualmente para los pacientes con cancer de pulmon avanzado. Se sembraron 5000 celulas en placas de 24 pocillos y se trataron con concentraciones crecientes de cisplatino (Figura 8A), Pemetrexed (Figura 8B), o ambos (Figura 8C). El ensayo de viabilidad de MTT se realiza despues de 7 dfas de tratamiento. Los resultados se expresan como la relacion de la DO de las celulas no tratadas con respecto a la DO de celulas tratadas a su concentracion de farmaco respectiva.
En estos experimentos, la regulacion autocrina por NTS se asocio con una respuesta debil a los agentes quimioterapeuticos incluso a una concentracion muy elevada, mientras que en ausencia de regulacion por NTS, la anulacion de la expresion de NTS o NTSR1 da lugar a que la celula responda a los agentes quimioterapeuticos. Las respuestas iniciales se observan a bajas concentraciones (2,5 microM).
Estos resultados confirman la hipotesis de que NTSR1 es un marcador predictivo eficaz de la respuesta a los tratamientos de quimioterapia para pacientes con cancer no microdtico de pulmon.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> INSERM
<120> Metodos para el tratamiento, la evaluacion pronostica y la estadificacion del cancer no microdtico de pulmon
<130> BEP080080 <160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> ARNip <400> 1
aagaagttca tcagcgccat c 21
<210> 2 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
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gcaatgttga caatatacc 19
<210>3 <211> 15 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> cebador <400> 3
gctgacgtag aagag 15
<210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
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<223> cebador <400> 4
cgtggagctg tacaacttca 20
<210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> cebador <400> 5 20
cagccagcag accacaaagg 20
<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
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<223> cebador <400> 6 20
cagctcctgg agtctgtgct 20
<210>7 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial
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<223> cebador <400> 7
gttgaaaagc cctgctgtga caga 24
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<223> cebador
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ttcaaatgag attgtggaaa a 21
<210>9 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> cebador <400> 9
agatcatctc tgcctgagta t 21
<210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> cebador <400> 10
cggagtcaac ggatttggtc g 21
<210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> cebador <400> 11
ttcaccacca tggagaaggc t 21

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para determinar el pronostico de un sujeto que padece adenocarcinoma de pulmon, que comprende la etapa de detectar la expresion del receptor de neurotensina de tipo 1 (NTSR1) en celulas de cancer no microdtico de
    5 pulmon obtenidas de dicho sujeto, en el que la presencia de expresion de NTSR1 indica que el sujeto tiene un mal pronostico.
  2. 2. Un inhibidor de la activacion por neurotensina de NTSR1 para su uso en el tratamiento de adenocarcinoma de pulmon, donde dicho inhibidor se selecciona del grupo que consiste en un agente que regula negativamente la
    10 expresion de neurotensina, un anticuerpo contra neurotensina y un fragmento del mismo que se une a neurotensina.
  3. 3. El inhibidor de la activacion por neurotensina de NTSR1 para su uso en la reivindicacion 2, donde dicho inhibidor de la activacion por neurotensina de NTSR1 es un agente que regula negativamente la expresion de neurotensina.
    15 4. El inhibidor de la activacion por neurotensina de NTSR1 para su uso en la reivindicacion 2, donde dicho inhibidor de
    la activacion por neurotensina de NTSR1 es un anticuerpo contra neurotensina o un fragmento del mismo que se une a neurotensina.
  4. 5. Un inhibidor de la activacion por neurotensina de NTSR1 para su uso de acuerdo con cualquiera de las 20 reivindicaciones 2 a 4, donde dicho inhibidor se usa en combinacion con un agente anticanceroso.
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