ES2301158T3 - Produccion de anticuerpos xenogenicos. - Google Patents
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Abstract
EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN HUESPEDES MAMIFEROS NO HUMANOS QUE SE CARACTERIZAN POR POSICIONES IG ENDOGENAS INACTIVAS Y POSICIONES IG HUMANAS FUNCIONALES PARA LA RESPUESTA A UN INMUNOGEN PARA LA PRODUCCION DE ANTICUERPOS HUMANOS O ANALOGOS DE LOS MISMOS. LOS HUESPEDES SE PUEDEN PRODUCIR MEDIANTE MULTIPLES MODIFICACIONES GENETICAS DE CELULAS EMBRIONICAS JUNTO CON UNA REPRODUCCION. SE UTILIZAN DIFERENTES ESTRATEGIAS PARA LA RECOMBINACION DE LAS POSICIONES HUMANAS DE FORMA ALEATORIA O EN POSICIONES DE HUESPEDES ANALOGAS. SE PRESENTAN MAMIFEROS QUIMERICOS Y TRANSGENICOS, EN PARTICULAR RATONES, QUE TIENE SEGMENTOS DE ADN XENOGENEICOS, LARGOS, INTEGRADOS DE FORMA ESTABLE. ESTOS SEGMENTOS SE INTRODUCEN MEDIANTE UNA FUSION CON ESFEROPLASTOS DE LEVADURA QUE CONTIENEN CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LA LEVADURA (YACS) QUE INCLUYEN LOS SEGMENTOS DE ADN XENOGENEICOS Y UN MARCADOR SELECTIVO TAL COMO HPRT, Y CELULAS CON TALLO EMBRIONICAS.
Description
Producción de anticuerpos xenogénicos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El campo de esta invención es la producción de
proteínas xenogénicas de unión específica en un anfitrión mamífero
no humano viable.
La capacidad para producir animales transgénicos
ha sufrido una revolución con la llegada de la capacidad para
cultivar células madre embriónicas murinas, y para introducir
modificaciones genéticas en dichas células para la posterior
transmisión a la línea germinal de ratones. Por tanto, se tiene la
oportunidad de modificar genes endógenos para producir cepas de
animales capaces de producir nuevos productos mediante la
introducción de genes extraños en el anfitrión, particularmente
genes humanos para producir proteínas xenogénicas de unión. La
expresión de dichos genes in vivo en un modelo animal puede
facilitar la investigación de la función del gen, de la regulación
de la expresión génica, de su procesado, de la respuesta a diversos
agentes, y otros similares. Adicionalmente, se pueden producir
animales con nuevos fenotipos, que incluyen los que imitan una
variedad de enfermedades. Por ejemplo, existe interés en introducir
una mutación dominante o complementar una mutación recesiva.
Dependiendo del gen concreto, la dificultad de lograr la mutación
deseada variará enormemente. Aunque algunas dianas génicas han
demostrado ser relativamente susceptibles de modificación, otras
dianas han demostrado ser extremadamente resistentes a la
modificación.
Debido a la oportunidad para generar animales
transgénicos, existe un interés sustancial en proporcionar nuevos
procedimientos que aumenten el éxito de la producción de animales
transgénicos. Particularmente, cuando se desea introducir
fragmentos grandes de ADN, que abarquen cientos de kilobases, existe
un importante preocupación acerca de la capacidad para introducir
los fragmentos grandes intactos en las células de mamífero, acerca
de la eficacia de la integración, de la capacidad funcional del
gen(es) presente(s) en el fragmento y de la
transmisión en la línea germinal de la progenie. Adicionalmente,
dichos procedimientos para la introducción de grandes fragmentos de
ADN permiten la determinación de la función de grandes fragmentos de
ADN identificados en el proyecto genoma humano en curso.
En particular, existe un interés en producir
proteínas xenogénicas de unión específica, por ejemplo anticuerpos
monoclonales humanos, en pequeños animales de laboratorio tales como
ratones. Los anticuerpos monoclonales se utilizan tanto en
diagnosis como en terapia. Debido a su capacidad para unirse a un
epítopo específico, pueden usarse exclusivamente para identificar
moléculas que portan el epítopo, o pueden dirigirse, por sí mismas o
en conjunción con otras funcionalidades, a una posición específica
para diagnosis o terapia.
Los anticuerpos monoclonales comprenden cadenas
pesadas y ligeras que se unen para definir una región de unión para
el epítopo. Cada una de las cadenas está compuesta por una región
variable y una región constante. La secuencia de aminoácidos de la
región constante es específica para un isótopo particular del
anticuerpo, así como para el anfitrión que produce el
anticuerpo.
Debido a la relación entre la secuencia de la
región constante y las especies a partir de las cuales se produce
el anticuerpo, la introducción de un anticuerpo xenogénico en el
sistema vascular del anfitrión puede producir una respuesta inmune.
Cuando el anticuerpo xenogénico se introduce repetidamente, en el
caso de enfermedades crónicas, la administración del anticuerpo
deja de ser práctica, ya que se destruye rápidamente y puede tener
efectos adversos. Por tanto, se han realizado numerosos esfuerzos
para proporcionar una fuente de anticuerpos singénicos y
alogénicos. En una técnica se recurrió al uso de tecnología de ADN
recombinante en la que se identificaron los genes de las cadenas
pesadas y ligeras y se aislaron las regiones que codifican la región
constante. Dichas regiones se agruparon junto a la porción
codificadora de región variable de otros genes de inmunoglobulina
procedentes de otras especies dirigidas a un epítopo específico.
Aunque el anticuerpo quimérico parcialmente
xenogénico resultante es sustancialmente más útil que el uso de un
anticuerpo completamente xenogénico, sigue presentando una serie de
desventajas. La identificación, aislamiento y reunión de las
regiones variable y constante requiere un trabajo sustancial.
Además, la reunión de una región constante procedente de una
especie con una región variable de otra especie puede cambiar la
especificidad y la afinidad de las regiones variables, de tal modo
que se pierden las propiedades deseadas de la región variable.
Asimismo, existen secuencias de estructura e hipervariables
específicas de una especie en la región variable. Estas secuencias
de estructura e hipervariables pueden dar como resultado respuestas
antigénicas no deseadas.
Por tanto, sería más deseable producir
anticuerpos alogénicos para la administración a un anfitrión
mediante la inmunización del anfitrión con un inmunógeno de
interés. Para primates, particularmente para humanos, esta
estrategia no es práctica. Los anticuerpos humanos que han sido
producidos se han basado en la presencia adventicia de un bazo
disponible, de un anfitrión que hubiera sido inmunizado previamente
frente al epítopo de interés. Aunque se pueden emplear linfocitos
sanguíneos periféricos humanos para la producción de anticuerpos
monoclonales, no han sido particularmente exitosos en fusiones y
normalmente sólo han conducido a IgM. Además, es particularmente
difícil generar una respuesta de anticuerpos humanos frente a una
proteína humana, diana deseable en muchas aplicaciones terapéuticas
y de diagnosis. Por lo tanto, existe un interés sustancial en
descubrir rutas alternativas a la producción de anticuerpos
alogénicos para humanos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Thomas y Capecchi (1987),
Cell, 51: 503-512, y Soller y Smithies
(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:
8932-8935, describen la desactivación de locus de
\beta2-microglobulina mediante recombinación
homóloga en células madre embrionarias. Berman y col.
(1988), EMBO J. 7: 727-738 describe el
locus de Ig VH humano. Burke y col. (1987),
Science, 236: 806-812, describe vectores de
cromosoma artificiales de levadura. Véase también, Garza y
col. (1989), Science, 246: 641-646 y
Brownstein y col. (1989), Science, 244:
1348-1351. Sakano y col., describen un
segmento de diversidad de los genes de cadena pesada de
inmunoglobulina en Sakano y col. (1981), Nature, 290:
562-565. Tucker y col. (1981),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7684-7688,
describe la secuencia génica de cadena pesada de IgA de ratón.
Blankenstein y Kruwinkel (1987), Eur. J.
Immunol., 17: 1351-1357, describe la región de
cadena pesada variable de ratón. Véase también, Joyner y col.
(1989), Nature, 338: 153-155,
Traver y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 5898-5902, Pachnis y col.
(1990), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:
5109-5113 y la solicitud PCT/US91/00245.
Bruggemann y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86:
6709-6713 (1989); Behring Inst. Mitt.
87: 21-24 (1990); Eur. J. Immunol. 21:
1323-1326 (1991), describen anticuerpos
monoclonales con cadenas pesadas humanas. Albertsen y col.,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 4256-4260
(1990), describe la construcción de una biblioteca de
cromosomas que contiene fragmentos de ADN humano. Los vectores de
cromosoma artificial de levadura se describen en Burke y
col., Science 236: 806-812 (1987).
Pavan y col., Mol. and Cell. Biol. 10(8):
4163-4169 (1990) describe la introducción de
una casete de resistencia a neomicina en el injerto derivado de
humano de un cromosoma artificial de levadura usando recombinación
homóloga y transferencia en una línea celular de carcinoma
embrional usando fusión de esferoplastos mediada por
polietilénglicol. Pachnis y col., Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 87: 5109-5113 (1990), y Gnirke
y col., EMBO Journal 10(7): 1629-1634
(1991), describe la transferencia de un cromosoma artificial
de levadura que porta ADN humano a células de mamífero.
Eliceiri y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:
2179-2183 (1991), describe la expresión en
células de ratón de cromosomas artificiales de levadura que
contienen genes humanos. Huxley y col., Genomics 9:
742-750 (1991) describen la expresión en
células de ratón de cromosomas artificiales de levadura que
contienen el gen humano HPRT. Mortensen y col., Mol. and
Cell. Biol. 12(5): 2391-2395
(1992), describe el uso de altas concentraciones de G418
para cultivar células madre embrionarias heterocigotas para la
selección de células homocigotas alteradas mutacionalmente. La
fusión de protoplasto de levadura con fibroblastos de ratón se
describe en Traver y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA
86: 5898-5902 (1989) y en Pachnis y
col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 5109-5113
(1990). Davies y col., Nucl. Acids. Res. 20:
2693-2698 (1992) describe alteraciones
dirigidas en YACs. Zachau, Biol. Chem. 371:
1-6 (1990), describe el locus humano de
inmunoglobulina ligera (kappa) (IgK); Matsuda y col.,
Nature Genetics 3: 88-94 (1993) y
Shin y col., EMBO 10: 3641-3645
(1991), describen la clonación del locus humano de
inmunoglobulina pesada (IgH) en YACs.
\vskip1.000000\baselineskip
Se producen proteínas xenogénicas de unión
específica en un anfitrión viable no humano mediante inmunización
del anfitrión con un inmunógeno apropiado.
Un anfitrión no humano preferido se caracteriza
por: (1) ser incapaz de producir cadena pesada de inmunoglobulina
endógena; (2) ser sustancialmente incapaz de producir cadenas
ligeras de inmunoglobulina endógena; y (3) ser capaz de producir
cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina xenogénica para
producir una inmunoglobulina xenogénica o un análogo de
inmunoglobulina xenogénica. Por tanto, el anfitrión puede presentar
un locus de inmunoglobulina endógeno completo sustituido por una
porción o por el total de un locus de inmunoglobulina xenogénica, o
puede presentar un locus de inmunoglobulina xenogénica insertado en
un cromosoma de la célula anfitriona y una región de
inmunoglobulina endógena desactivada. Estas diversas alternativas se
llevarán a cabo, al menos en parte, empleando recombinación
homóloga para desactivar o para sustituir en los locus de
inmunoglobulina para cadenas pesadas y ligeras.
Adicionalmente, se proporcionan nuevos métodos
para introducir segmentos grandes de ADN xenogénico de al menos 100
kb, particularmente ADN humano, en anfitriones animales no humanos,
particularmente ratones, introduciendo un cromosoma artificial de
levadura (YAC, del inglés "yeast artificial chromosome") que
contiene un segmento de ADN xenogénico de al menos 100 kb, en una
célula madre embrionaria no humana para integración en el genoma de
la célula madre, selección de células madre que comprenden YAC
integrado por medio de un marcador presente en el YAC, introducción
de las células ME (madre embrionarias) que contienen YAC en
embriones no humanos y generación de ratones quiméricos a partir de
los embriones. Los animales quiméricos pueden aparearse para
proporcionar animales que sean heterocigotos para el YAC. Los
animales heterocigotos pueden aparearse para generar una progenie
homocigota para el YAC integrado.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es un diagrama del vector de
desactivación correspondiente a la región J de cadena pesada de
ratón, tal como se describe en el Ejemplo I, ver más adelante.
La Figura 2 es un diagrama del mapa de
restricción de ADN correspondiente al plásmido pmH\deltaJ y a los
genes diana J de cadena pesada de ratón, tal como se describe en el
Ejemplo II, ver más adelante.
La Figura 3 es un esquema de citometría de flujo
de tinción de anticuerpos correspondiente a alotipos de IgM en cepas
de ratones, tal como se describe en el Ejemplo II, presentado más
adelante.
La Figura 4 es un histograma de citometría de
flujo de tinción de anticuerpos correspondiente a alotipos de IgM en
cepas de ratones, tal como se describe en el Ejemplo II, presentado
más adelante.
La Figura 5 es un diagrama del vector de
desactivación correspondiente a los genes de región constante de
inmunoglobulina kappa de ratón, tal como se describe en el Ejemplo
III, presentado más adelante.
La Figura 6 es un diagrama de la derivación del
plásmido pK.TK/Neo, tal como se describe en el Ejemplo III,
presentado más adelante.
La Figura 7 es un diagrama del mapa de
restricción del locus diana de cadena ligera, tal como se describe
en el Ejemplo III, presentado más adelante.
La Figura 8 es un diagrama del vector dirigido
para la desactivación de las regiones constante y J de cadena ligera
kappa y para el diseño del experimento de diana tal como se describe
en el Ejemplo IV, presentado más adelante.
La Figura 9 es un diagrama de la construcción de
vectores para la desactivación de las regiones constante y J de
cadena ligera kappa tal como se describe en el Ejemplo IV,
presentado más adelante.
La Figura 10 es un diagrama de los vectores de
eliminación final para la desactivación de las regiones constante y
J de cadena ligera kappa tal como se describe en el Ejemplo IV,
presentado más adelante.
La Figura 11 es una ilustración del análisis de
transferencia Southern de células eliminadas de región constante y J
de cadena ligera tal como se describe en el Ejemplo IV, presentado
más adelante.
Las Figuras 12 A-E son
fotografías de los resultados de los análisis de transferencia
Southern para caracterizar yHRPT y ADN genómico de levadura en
clones ME tal como se describe en el Ejemplo VI, presentado más
adelante (A = secuencia Alu repetitiva humana; B,C = pBR322-
secuencias específicas para los brazos de YAC derecho (B) e
izquierdo (C); D = secuencia Ty repetitiva de levadura; E = gen LYS2
de copia sencilla de levadura). También se muestran tiempos más
cortos de exposición (12 h para II en comparación con 48 h para I)
de yHRPT probado con secuencias Alu y Ty. Las posiciones de
marcadores de peso molecular están indicadas. Se muestran esquemas
de los brazos derecho (a) e izquierdo (b) de vector y las
localizaciones de fragmentos de vector YAC derivados de pBR322 ( =
telómero; = secuencias derivadas de levadura; 0 = centrómero de
levadura; = secuencias derivadas de pBR322; = injerto humano; =
posición de clonación Ncori; H = posiciones HindIII).
Las Figuras 13 A-D son
fotomicrografías de los resultados de hibridación in situ
para detectar la integración de yHPRT y de secuencias genómicas de
levadura en cromosomas de célula ME tal como se describe en el
Ejemplo VI, presentado más adelante (A, B = extensiones de metafase
de células ESY 8-7 hibridadas a secuencias genómicas
humanas biotiniladas y C = extensiones de metafase o D = núcleos de
interfase de células ESY 8-6 hibridadas a secuencias
de ADN repetidas de levadura biotinilada).
Las Figuras 14 A, B, C demuestran la retención
estable de yHPRT durante la diferenciación y transmisión de células
ME in vitro a lo largo de la línea germinal de ratón, tal
como se describe en el Ejemplo VI, presentado más adelante (A: a, b
= cuerpos embriodes; y tipos celulares diferenciados; c = islas
sanguíneas; d = músculo en contracción; e = células neuronales; f =
túbulos neurales formados por clones ESY; B: análisis de
transferencia Southern de ADN extraído de células diferenciadas ESY
5-2, 3-6, 8-5 y
8-6 (20 \mug) e yHPRT en AB1380 (40 ng) usando a =
sonda Alu humana; b = secuencias Ty de levadura; C: análisis de
transferencia Southern de ADN de cola (20 \mug) procedentes de
crías de agouti (4-2 y 4-3)
derivadas de macho quimérico ESY 394/95-2 usando a =
Alu humana y b = secuencias Ty; se muestran exposiciones más cortas
(12 h) de 8-6 y de yHPRT probadas con Ty (II).
Las Figuras 15 A y B son fotografías de un gel
de electroforesis que muestra la expresión del gen HPRT humano en
diversos tejidos de ratón, tal como se describe en el Ejemplo VI,
presentado más adelante (15 A = detección de mARN de HPRT humano
usando PCR de transcripción inversa (RT-PCR) en
células ME, ESY 3-1 y Hut 78, bazo e hígado de
ratones de control o crías de agouti ESY 4-3; 15 B =
detección de mARN de receptor de \gamma-interferón
de ratón mediante RT-PCR en muestras procedentes de
15 A; M = marcador de tamaño).
La Figura 16 es un diagrama del locus de cadena
pesada de inmunoglobulina humana, y un vector YAC de sustitución de
cadena pesada humano, tal como se describe en el Ejemplo VII,
presentado más adelante.
La Figura 17 es un diagrama de un esquema de
cría de ratón, tal como se describe en el Ejemplo VIII, presentado
más adelante.
La Figura 18 presenta los genotipos de algunos
animales anfitriones producidos mediante los métodos de la
invención.
Se proporcionan nuevos anfitriones transgénicos
no humanos, particularmente anfitriones mamíferos, habitualmente
murinos, en los que el anfitrión es capaz de armar una respuesta
inmune frente a un inmunógeno, en donde la respuesta produce
anticuerpos que tienen regiones humanas, variables y constantes. Por
"transgénico" se entiende un animal no humano que contiene una
modificación de ingeniería genética, particularmente, en lo que se
refiere a esta invención, la introducción de un gen de
inmunoglobulina humana, en todas sus células. Los anfitriones se
caracterizan por ser capaces de producir inmunoglobulinas
xenogénicas o análogos de las mismas como resultado de la
desactivación de los locus de codificación de subunidad de
inmunoglobulina endógena y la introducción de ADN humano, por
ejemplo ADN que codifica inmunoglobulina humana. Las modificaciones
pueden mantener al menos una porción de las regiones constantes
humanas que permiten la organización de la posición de unión de la
región variable unida al extremo C de un péptido funcional. Los
anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo, por ejemplo IgA, D, E,
G ó M, o de subtipos dentro de cada isotipo.
En una primera estrategia, en etapas
individuales, se introducen los genes de inmunoglobulina de cadena
ligera y pesada xenogénicos, es decir humanos, en la línea germinal
del anfitrión no humano (por ejemplo, esperma u oocitos) y en
etapas separadas los correspondientes genes del anfitrión se hacen
no funcionales mediante desactivación usando recombinación
homóloga. Se reconstruyen genes de inmunoglobulina de cadena ligera
y pesada humanos en un microorganismo eucariótico o procariótico
apropiado, y los fragmentos de ADN resultantes pueden introducirse
en el anfitrión no humano apropiado, por ejemplo en los pronúcleos
de oocitos fertilizados o de células madre embrionarias de ratón.
La desactivación de los locus de inmunoglobulina endógeno del
anfitrión se logra alterando los locus apropiados mediante
recombinación homóloga en las células de anfitrión no humano,
particularmente en células madre embrionarias no humanas o en
pronúcleos de oocitos fertilizados de ratón. La alteración dirigida
puede implicar la introducción de una lesión o de una eliminación en
el locus objetivo, o una eliminación dentro del locus objetivo
acompañada de una inserción en el locus, por ejemplo, una inserción
de un marcador seleccionable. En el caso de células madre
embrionarias no humanas, se generan animales quiméricos no humanos
que son derivados en parte de las células madre embrionarias no
humanas modificadas y que son capaces de transmitir las
modificaciones genéticas a través de la línea germinal. El
apareamiento de anfitriones a los que se ha introducido locus de
inmunoglobulina humana y cepas con locus endógenos desactivados dará
lugar a animales cuya producción de anticuerpos es puramente
xenogénica, es decir humana.
En una segunda estrategia alternativa, al menos
porciones de los locus de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada
son usadas para reemplazar directamente los correspondientes locus
de inmunoglobulina endógenos mediante recombinación homóloga en
células madre embrionarias no humanas. Esto da como resultado una
desactivación y un reemplazamiento simultáneos de la
inmunoglobulina endógena. Esto se sigue de la generación de animales
quiméricos no humanos en los que las células derivadas de células
madre embrionarias no humanas pueden contribuir a la línea
germinal.
Estas estrategias se basan en la organización
conocida de los locus de la cadena de inmunoglobulina en una serie
de animales, ya que la organización, la posición relativa de exones
que codifican dominios individuales, y la localización de
posiciones de empalme y de elementos transcripcionales, se
comprenden en diferente grado. En el ser humano, el locus de cadena
pesada de inmunoglobulina (IgH_{hu}) se localiza en el cromosoma
14. En la dirección 5'-3' de la transcripción, el
locus comprende un racimo grande de genes de región variable
(V_{H}), los genes de región de diversidad (D), seguidos de los
genes de región de unión (J_{H}) y el racimo de genes constantes
(C_{H}). Se estima que el tamaño del locus es de aproximadamente
1.500 a aproximadamente 2.500 kilobases (kb). Durante el desarrollo
de células B, se yuxtaponen segmentos de gen discontinuos
procedentes del locus de la línea germinal IgH por medio de un
reordenamiento físico del ADN. A fin de producir un polipéptido Ig
de cadena pesada funcional, deben unirse tres segmentos de ADN
discontinuos, de las regiones V_{H}, D y J_{H}, de un modo
secuencial específico; primero D con J_{H}, entonces V_{H} con
DJ_{H}, generando la unidad funcional V_{H}DJ_{H}. Una vez
que se ha formado la V_{H}DJ_{H}, se producen cadenas pesadas
específicas siguiendo la transcripción del locus de Ig, utilizando
como molde la unidad específica V_{H}DJ_{H}C_{H} que comprende
exones e intrones.
Existen dos locus para las cadenas ligeras de
inmunoglobulina (IgL), el locus kappa en el cromosoma humano 2 y el
locus lambda en el cromosoma humano 22. La organización de los locus
de IgL es similar a la del locus IgH, excepto que la región D no
está presente. Después de la reorganización de IgH, se lleva a cabo
de forma similar la reorganización de un locus de cadena ligera
mediante unido de V_{L} y J_{L} a la cadena kappa o lambda. Los
tamaños de los locus lambda y kappa son de aproximadamente entre
1000 y 2000 kb. La expresión de IgH reorganizada y de una cadena
ligera de Ig\kappa o de Ig\lambda en una célula B concreta
permite la generación de moléculas de anticuerpos.
Con el objetivo de aislar, clonar y transferir
el locus IgH_{hu}, se puede emplear un cromosoma artificial de
levadura o "YAC". Un YAC que porta el ADN humano puede
introducirse en células ME no humanas o en oocitos no humanos a
través de una variedad de métodos, que incluye la fusión de
esferoplastos de levadura: célula ME, la microinyección y la
lipofección. El YAC se integrará aleatoriamente (es decir, no
homogéneamente) en el genoma del anfitrión no humano. Si se emplea
la fusión esferoplasto de levadura: célula ME para introducir un
YAC que porta ADN humano en células ME anfitrionas no humanas,
entonces se pueden introducir dos o más YACs de una única célula
anfitriona de levadura simultáneamente en la misma célula ME del
anfitrión no humano. La ventaja de esta estrategia es que se pueden
introducir múltiples YACs que contienen cada uno ADN humano, por
ejemplo locus de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humanos,
en un único cromosoma en una célula de anfitrión no humano. Esto
elimina la necesidad de criar animales que contengan genes Ig
humanos individuales a fin de generar un anfitrión capaz de
producir inmunoglobulinas completamente humanas. Por ejemplo, una
cepa de levadura que contiene un único YAC es tratada con un vector
tal como pLUTO (descrito más adelante) para introducir un marcador
seleccionable de mamífero tal como HPRT, y un marcador seleccionable
de levadura tal como LYS2 en un brazo del YAC. El ADN cromosomal de
la cepa tratada se usa a continuación para transformar una segunda
cepa de levadura mutante lys2, normalmente haploide, que contiene un
segundo YAC diferente. A continuación se analizan Lys + colonias
mediante electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE) para
identificar clones que alojen los dos YACs y para confirmar que su
tamaño no se ha visto alterado. Mediante transformación se pueden
añadir posteriormente YACs adicionales con diferentes marcadores
seleccionables, por ejemplo ADE2 (si el anfitrión es un mutante
ade2). Alternativamente, se trata una cepa de levadura que contiene
YAC con un vector tal como pLUTO para introducir un marcador
seleccionable de mamífero (por ejemplo HPRT), tal como se ha
indicado antes, y a continuación se aparea con una segunda cepa que
contiene YAC de tipo de apareo opuesto. La presencia de dos YACs se
confirma entonces en las células de levadura diploides tal como se
ha descrito antes. La cepa de levadura diploide se usa directamente
para fusión o se somete a meiosis y ascosporogénesis (esporulación)
usando procedimientos estándar. Los productos meióticos se escrutan
a continuación para identificar un clon haploide que contiene los
dos YACs. Con cualquiera de las aproximaciones descritas
anteriormente, se puede tratar el segundo YAC con HPRT o con otro
marcador seleccionable antes de la introducción del primer YAC.
Asimismo, si cada YAC contiene un marcador seleccionable diferente,
el mantenimiento de ambos YACs durante la propagación de cepa puede
seleccionarse genéticamente. La fusión con células ME no humanas se
lleva a cabo entonces del mismo modo que con las células de
levadura que contienen un único YAC. Debido a que muchos cromosomas
de levadura pueden integrarse junto con el YAC, es de esperar que
una porción sustancial de los clones ME que expresan el marcador
seleccionable de mamífero presente en un YAC (por ejemplo, clones
HAT^{R} si el marcador de YAC es HPRT, y las células ME no
humanas son HPRT-), tenga integrados ambos YACs. Se pueden usar
métodos tales como el análisis de transferencia Southern y/o PCR
para identificar dichos clones, y el análisis de transferencia
Southern que emplea electroforesis de gel de campo pulsado usado
para caracterizar la extensión de la integración de YAC.
El locus IgH_{hu} completo puede estar
contenido en uno en unos pocos clones YAC junto con un marcador de
mamífero tal como Neo, HPRT, GPT, \beta-gal, etc.
Esto mismo es válido para los locus de cadena ligera de Ig. En
levaduras puede lograrse la reconstitución de línea germinal intacta
de locus de Ig mediante recombinación homóloga entre YACs con
regiones solapantes de homología. De este modo se obtiene el
aislamiento de fragmentos de ADN que codifican la cadena Ig humana.
Alternativamente, se puede clonar directamente un locus de línea
germinal intacta en un único YAC.
Con el objetivo de obtener un amplio espectro de
anticuerpos de alta afinidad, no es necesario que incluir la región
V completa. En los seres humanos el racimo de la región V incluye
varias familias de genes de región V. Por tanto, obteniendo un
subconjuto de los genes de región V conocidos de los locus de Ig de
cadena ligera y pesada humanos (Berman y col., EMBO J. (1998) 7:
727-738) en lugar del complemento completo de
regiones V, el anfitrión transgénico no humano puede inmunizarse y
ser capaz de armar una fuerte respuesta inmune, y proporcionar
anticuerpos de alta afinidad. De este modo, se pueden emplear
fragmentos de ADN relativamente pequeños del cromosoma. Por
ejemplo, un fragmento documentado de 670 kb del locus Ig_{Hu} está
contenido en un fragmento de restricción NotI-NotI,
que serviría para proporcionar una variedad de regiones V (Berman y
col., ver anterior). También se proporciona un aumento de la
diversidad mediante la recombinación con las diversas regiones D y J
y mutación somática.
Para hacer que los locus de inmunoglobulina de
anfitrión no humano sean no funcionales, se puede emplear
recombinación homóloga, en donde se introduce ADN en los locus de
cadena ligera y pesada de inmunoglobulina endógenos del anfitrión
que inhibe la producción de inmunoglobulina endógena. Debido a que
existen dos alelos de cadena pesada y dos locus de cadena ligera,
kappa y lambda, cada uno con dos alelos, aunque se puede elegir
ignorar los locus lambda, tendrán que producirse múltiples
transformaciones que den como resultado la desactivación de cada
uno de los alelos. Se puede emplear recombinación homóloga para
desactivar funcionalmente cada uno de los locus, mediante la
introducción del ADN homólogo vía un constructo que puede alterar o
borrar el locus diana dentro de las células madre embrionarias no
humanas, seguido de la introducción de las células modificadas en
blastocistos no humanos receptores. El cultivo posterior permite la
transmisión de línea germinal del locus desactivado. Por lo tanto
se puede elegir criar descendientes heterocigotos y seleccionar
descendientes homocigotos de los padres heterocigotos.
En la segunda estrategia alternativa descrita
antes, el número de etapas puede reducirse proporcionando al menos
un fragmento del locus de inmunoglobulina humana dentro de la
construcción usada para la recombinación homóloga con la
inmunoglobulina endógena análoga, de tal modo que el locus humano es
sustituido por al menos una parte del locus de inmunoglobulina del
anfitrión, que resulta en la desactivación del locus de subunidad
de inmunoglobulina del anfitrión. De especial interés es el uso de
transformación para una única desactivación, seguida de
reproducción de descendientes heterocigotos para producir un
descendiente homocigoto. Cuando se emplea el locus humano para
sustitución o inserción en el locus de anfitrión no humano para
desactivación, el número de transformaciones puede limitarse a tres
transformaciones y tal como se ha indicado previamente, se puede
elegir ignorar el locus menos usado y limitar las transformaciones a
dos transformaciones. Alternativamente, se puede elegir
proporcionar la desactivación en una etapa separada para cada locus,
empleando células madre embrionarias no humanas procedentes de
descendientes a los que previamente se les han desactivado uno o más
locus. En el caso de que sólo se use una transformación y que el
locus humano se integre en el genoma de anfitrión no humano de un
modo aleatorio, pueden requerirse un total de ocho o más
transformaciones.
Para la desactivación, se puede emplear
cualquier lesión del locus diana que dé como resultado la prevención
de la expresión de una subunidad de inmunoglobulina de dicho locus.
De este modo, la lesión puede encontrarse en una región que
comprende potenciadores, por ejemplo, un potenciador 5' ó 3', o
intrón, en las regiones V, J ó C, y con la cadena pesada, existe la
oportunidad en la región D, o combinaciones de los mismos. El
factor importante es que se inhibe la redisposición de la línea
germinal de Ig, o no se puede producir un mensaje funcional que
codifica la inmunoglobulina endógena, tanto debido al fallo de la
transcripción, como al fallo del procesado del mensaje, como a otra
razón similar. Dicha lesión puede adoptar la formar de una
eliminación en el gen diana, una inserción de un gen extraño, una
combinación de una inserción y una eliminación, o una sustitución
usando secuencias xenogénicas con o sin introducción de una
eliminación en el gen endógeno.
Preferiblemente, cuando interesa desactivar el
locus de subunidad de inmunoglobulina, la lesión se introducirá en
uno o más de los exones contenidos en el locus de subunidad de
inmunoglobulina, por ejemplo en la región constante o J del locus.
Por tanto, se produce una construcción dirigida que carece de exones
funcionales en esta región y que puede comprender las secuencias
adyacentes por encima o por debajo, a la región J y/o C, o que
comprende toda o parte de la región con una inserción desactivante
en los exones J ó C. La inserción puede ser de hasta 50 pb o más,
en donde dicha inserción da como resultado la alteración de la
formación de un mARN funcional. De forma deseable, habitualmente se
elimina al menos aproximadamente el 75% de la secuencia de exón,
preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de la secuencia de
exón.
De forma deseable, se usa un marcador génico en
la construcción dirigida para reemplazar las secuencias eliminadas.
Se pueden emplear varios marcadores, particularmente aquellos que
permiten una selección positiva. De especial interés es el uso de
resistencia G418 resultante de la expresión del gen correspondiente
a neomicina fosfotransferasa ("neo").
En la construcción dirigida, por encima y/o por
debajo del gen diana, puede haber un gen que proporcione la
identificación de si se ha producido un cruce doble homólogo
(selección negativa). Para este propósito, se puede emplear el gen
de timidina quinasa del virus simple de Herpes
(HSV-tk), ya que las células que expresan el gen de
timidina quinasa pueden ser eliminadas mediante el uso de análogos
de nucleósido tales como acyclovir o gancyclovir, por sus efectos
citotóxicos sobre las células que contienen una
HSV-tk funcional (Manssur y col., Nature 336:
348-352 (1988)). La ausencia de sensibilidad a
dichos análogos de nucleósido indica la ausencia del gen de
timidina quinasa de HSV y, por tanto, en donde se ha producido
recombinación homóloga, que también se ha producido un doble
cruce.
Aunque la presencia del gen marcador en el
genoma indica que se ha producido la integración, todavía será
necesario determinar si se ha producido una integración homóloga.
Esto se puede lograr de diferentes modos. En la mayor parte se
empleará análisis de ADN mediante hibridación de transferencia
Southern para establecer la localización de la integración.
Empleando sondas para el injerto y las secuencias en las regiones 5'
y 3' que flanquean la región en la que se podría producir la
integración homóloga, se puede demostrar que se ha producido una
alteración homóloga.
También se puede usar PCR con la ventaja de
detectar la presencia de recombinación homóloga. Se pueden usar
cebadores de PCR que son complementarios a una secuencia dentro de
la construcción dirigida, y complementarios a una secuencia fuera
de la construcción y en el locus diana. De este modo, se puede
obtener sólo moléculas de ADN que tienen ambos cebadores presentes
en las cadenas complementarias si se ha producido recombinación
homóloga. Demostrando el tamaño esperado de los fragmentos, por
ejemplo, usando análisis de transferencia Southern, se confirma la
aparición de recombinación homóloga.
La construcción dirigida puede incluir además un
sistema de réplica que es funcional en la célula de anfitrión no
humano. En su mayor parte, estos sistemas de réplica implicarán
sistemas de replicación viral, tales como el virus símico 40, el
virus de Epstein-Barr, el virus de polioma, el virus
de papiloma, y otros similares. Se pueden emplear diversos sistemas
de inicio transcripcional, tanto de virus como de genes de
mamíferos, tal como el SV40, los genes de metalationeina I y II, el
gen de \beta-actina, los genes temprano y tardío
de adenovirus, el gen de fosfoglicerato quinasa, el gen de ARN
polimerasa II, y otros similares. Además de los promotores, se
pueden emplear potenciadores naturales para potenciar aún más la
expresión del gen marcador.
Al preparar las construcciones dirigidas para la
recombinación homóloga, se puede incluir un sistema de réplica para
procariotas, particularmente E. coli, para preparar la
construcción dirigida, subclonar después de cada manipulación,
análisis tal como mapeo o secuenciamiento de restricción, expansión
y aislamiento de la secuencia deseada. En el caso de la estrategia
de sustitución, en la que el injerto de ADN xenogénico es grande,
excediendo generalmente aproximadamente los 50 kpb, habitualmente
excediendo los 100 kpb, y habitualmente no más de aproximadamente
1000 kpb, se puede usar un cromosoma artificial de levadura (YAC)
para clonar la construcción dirigida.
Una vez que se ha preparado una construcción
dirigida y se han eliminado cualesquier secuencias no deseadas, por
ejemplo, secuencias procariotas, la construcción puede ser
introducida en la célula diana, por ejemplo una célula ME no
humana. Se puede emplear cualquier técnica conveniente para
introducir el ADN en las células diana. Dichas técnicas incluyen la
fusión de protoplasto, por ejemplo fusión esferoplasto de
levadura:célula, la lipofección, la electroporación, la
transferencia de ADN mediada por fosfato cálcico o la microinyección
directa.
Después de la transformación o transfección de
las células diana, las células diana pueden seleccionarse por medio
de marcadores positivos y/o negativos, tal como se ha indicado
previamente, resistencia a neomicina y resistencia a acyclovir o
gancyclovir. Las células que muestren el fenotipo deseado pueden
analizarse entonces mediante análisis de restricción,
electroforesis, análisis de transferencia Southern, PCR, u otros
similares. Identificando los fragmentos que muestran la presencia
de la(s) lesión(es) en el locus diana, se pueden
identificar las células en las que se ha producido la recombinación
homóloga para desactivar una copia del locus diana.
El proceso descrito anteriormente puede llevarse
a cabo primero para desactivar un locus de cadena pesada en una
célula madre embrionaria no humana, mediante el cual las células son
microinyectadas en blastocistos del anfitrión no humano que se
desarrolla en un animal quimérico. Los animales quiméricos se crían
para obtener anfitriones heterocigotos. A continuación,
reproduciendo los anfitriones heterocigotos, se puede obtener un
anfitrión homocigoto o se pueden aislar y transformar células madre
embrionarias no humanas para desactivar el segundo locus de IgH, y
el proceso se repite hasta que se han desactivado todos los locus
deseados. Alternativamente, el locus de cadena ligera puede ser el
primero en ser desactivado. Para la completa eliminación de la
capacidad de producir inmunoglobulina de cadena ligera, es deseable
desactivar los locus de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y
lambda. En cualquier etapa se pueden introducir los locus
xenogénicos.
Tal como se ha indicado ya, el locus diana puede
ser sustituido por el locus xenogénico, es decir humano, análogo.
De esta forma, el locus xenogénico se colocará sustancialmente en la
misma región que el locus análogo del anfitrión, de tal modo que
cualquier regulación asociada a la posición del locus será
sustancialmente la misma para el locus de inmunoglobulina
xenogénica. Por ejemplo, aislando la región variable del locus de
IgH humano (que incluye las secuencias V, D y J), o una porción del
mismo, y flanqueando el locus humano con secuencias procedentes de
locus murino, preferiblemente secuencias separadas por al menos
aproximadamente 5 kpb, en el locus anfitrión, preferiblemente al
menos aproximadamente 10 kpb en el locus anfitrión, se puede
insertar el fragmento humano en dicha región en un(os)
evento(s) recombinatorio(s), sustituyendo el locus de
inmunoglobulina humano por la región variable endógena del locus de
inmunoglobulina del anfitrión. De esto modo, se puede alterar la
capacidad del anfitrión para producir una subunidad de
inmunoglobulina endógena, a la vez que se permite que el promotor
del locus de inmunoglobulina humano sea activado por el potenciador
del anfitrión y regulado por el sistema regulador del anfitrión.
A fin de proporcionar la producción de proteínas
de unión xenogénicas en un anfitrión no humano, es necesario que el
anfitrión sea competente para proporcionar las enzimas necesarias y
otros factores implicados en la producción de anticuerpos, a la vez
que carece de genes endógenos competentes para la expresión de
subunidades pesadas y ligeras de inmunoglobulinas. Por tanto, las
enzimas y otros factores asociados a la redisposición de la línea
germinal, empalme, mutación somática, y otros similares, serán
funcionales en el anfitrión. Lo que faltará es una región natural
funcional que comprenda los diversos exones asociados a la
producción de inmunoglobulina endógena.
La integración de ADN xenogénico, es decir
humano, introducido puede ser aleatoria u homóloga dependiendo de
la estrategia concreta que se vaya a emplear. De este modo, el uso
de transformación, usando etapas repetitivas o en combinación con
cría y reproducción, se pueden obtener animales transgénicos no
humanos que sean capaces de producir proteínas de unión xenogénicas
en una ausencia sustancial de inmunoglobulina endógena ligera o
pesada. Por transformación se entiende cualquier técnica introducir
ADN en una célula viable, tal como conjugación, fusión celular
mediada por PEG, transformación, transfección, transducción,
electroporación, lipofección, biolística, y otros similares.
Una vez que se han introducido los locus
xenogénicos en el genoma de anfitrión no humano, ya sea mediante
recombinación homóloga o mediante integración aleatoria, y que se
hayan producido animales anfitriones no humanos con los locus de
inmunoglobulina endógenos desactivados mediante una reproducción
apropiada de los diversos animales transgénicos no humanos o de
animales derivados de animales quiméricos no humanos, se puede
producir un anfitrión que carece de la capacidad nativa de producir
inmunoglobulina endógena, pero que presenta la capacidad de
producir inmunoglobulinas xenogénicas con al menos una porción
significativa del repertorio de la fuente xenogénica.
La desactivación funcional de las dos copias de
cada uno de los tres locus de Ig de anfitrión (pesado, kappa y
lambda), en donde el anfitrión contiene entonces IgH humana y los
locus de Ig humana kappa y/o lambda permitiría la producción de
moléculas de anticuerpos puramente humanos sin la producción de
anticuerpos quiméricos anfitrión/humano. Dicha cepa de anfitrión,
mediante inmunización con antígenos específicos, respondería a la
producción de células B murinas que producen anticuerpos humanos
específicos, células B que podrían fusionarse con células de mieloma
murino o que podrían inmortalizarse de cualquier otro modo para la
producción estable continua de anticuerpos monoclonales humanos. En
la técnica existen métodos bien conocidos para obtener una
producción estable continua de anticuerpos monoclonales.
La metodología y las estrategias del sujeto no
necesitan limitarse a la producción de inmunoglobulinas completas,
pero proporciona la oportunidad de generar regiones unidas a una
porción de la región constante, por ejemplo, C_{H1}, C_{H2},
C_{H3} ó C_{H4}, o combinaciones de las mismas.
Alternativamente, se pueden sustituir o ligar uno o más exones de
las regiones C_{H} y C_{\kappa} o C_{\lambda} a una secuencia
que codifica una proteína diferente, tal como una enzima, por
ejemplo, activador plasminógeno, superóxido dismutasa, etc.;
toxina, por ejemplo, ricina, abrina, toxina de difteria, etc.;
factor de crecimiento; agente citotóxico, por ejemplo, TNF; ligando
receptor, o otros similares. Véase, por ejemplo, WO 89/07142; WO
89/09344 y WO 88/03559. Insertando la proteína de interés en un
exón de región constante y proporcionando el empalme de la región
variable con el exón de región constante modificado, la proteína de
unión resultante puede tener una región C-terminal
diferente a la de la inmunoglobulina. Proporcionando una secuencia
de parada con el gen insertado, el producto de proteína tendrá la
proteína insertada como región C-terminal. Si se
desea, la región constante puede ser sustituida completamente por
otra región, proporcionando una construcción con las posiciones de
empalme apropiadas para la unión de la región variable de la otra
proteína.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las células B del anfitrión transgénico no
humano que producen inmunoglobulina o análogo de inmunoglobulina
pueden usarse para fusionarse a una célula mieloide murina para
producir hibridomas o pueden inmortalizarse mediante otros procesos
convencionales, por ejemplo, transfección con oncogenes. Estas
células inmortalizadas pueden cultivarse en un cultivo continuo o
pueden introducirse en el peritoneo de un anfitrión compatible para
la producción de ascites.
La presente invención proporciona la producción
de anticuerpos, o análogos de anticuerpos,
anti-suero policlonales humanos o monoclonales
humanos. Cuando el anfitrión mamífero no humano ha sido inmunizado
con un inmunógeno, los anticuerpos humanos resultantes pueden
aislarse de otras proteínas usando una columna de afinidad, que
tiene una función de unión Fc, tal como proteína A, u otra
similar.
Los hospedantes no humanos pueden ser (véase
también la Figura 18):
- I.
- Animales heterocigotos para un gen de inmunoglobulina de cadena ligera endógena inactiva (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
- II.
- Animales heterocigotos para un gen de inmunoglobulina de cadena pesada endógena inactiva (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
- III.
- Animales homocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena funcional y hemocigotos para (es decir, que contengan una copia de) genes de inmunoglobulina de cadena pesada extraña, preferiblemente humana (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
- IV.
- Animales homocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena funcional y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera extraña, preferiblemente humana (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
- V.
- Animales heterocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera endógena inactiva obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de la categoría I y animales de la categoría II (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
- VI.
- Animales heterocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena inactiva y hemicigotos para genes extraños, preferiblemente humanos, de inmunoglobulina de cadena pesada mediante reproducción cruzada de animales de la categoría III y animales de la categoría V (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para el gen extraño);
- VII.
- Animales heterocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena inactiva y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera extraños, preferiblemente humanos, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de la categoría IV y animales de la categoría V (mediante cría cruzada se obtienen los animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para el gen extraño);
- VIII.
- Animales homocigotos o heterocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena inactiva y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada extraña, preferiblemente humana, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de las categorías VI y VII (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para el gen extraño);
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales homocigotos de la categoría VIII
pueden usarse para producir anticuerpos humanos.
- IX.
- Animales homocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena funcional y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada extraños, preferiblemente humanos, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de las categorías III y IV (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
- X.
- Animales heterocigotos para gen de inmunoglobulina de cadena pesada endógena inactiva y hemicigoto para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada extraños, preferiblemente humanos, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de las categorías II y IX (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para gen extraño);
- XI.
- Animales heterocigotos para gen de inmunoglobulina de cadena ligera endógena inactiva y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada extraños, preferiblemente humanos, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de las categorías I y IX (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para gen extraño).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para introducir secuencias de ADN grandes
continuas en un anfitrión mamífero no humano, habitualmente, las
secuencias tendrán al menos 100 kb, más habitualmente al menos
aproximadamente 200 kb, generalmente en el intervalo entre
aproximadamente 200 y 1000 kb. Por tanto, puede desearse transferir
un locus de interés, tal como el locus de inmunoglobulina; regiones
del cromosoma xenogénico, es decir humano, que pueden incluir uno o
más genes de interés, que pueden haber sido caracterizados o no, tal
como el receptor de Lipoproteína de Baja Densidad (LDL),
Apolipoproteína (Apo) B, Apo E, regulador conductor transmembrana de
fibrosis quística, distrofina, o regiones de cromosomas xenogénicos
que pueden estar implicados en trisomía parcial de cromosomas (por
ejemplo, los cromosomas 21, 7 y 10); y virus.
La presente invención proporciona un método para
producir una célula madre embrionaria (ME) de mamífero no humano
que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena
ligera de inmunoglobulina humana integradas de forma estable en el
genoma de la célula ME de mamífero no humano, en donde la porción
de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es
suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina
humana, y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana
es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina
humana, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
- (a)
- combinar en condiciones de fusión las células ME no humanas y esferoplastos de levadura que contienen uno o más cromosomas artificiales de levadura (YACs) que comprenden la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y la porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, en donde los YACs incluyen un gen que codifica un marcador seleccionable, mediante lo cual las porciones de los locus de inmunoglobulina humana se integran de forma estable en el genoma de las células madre embrionarias; y
- (b)
- seleccionar las células ME que portan los locus de inmunoglobulina humana por medio del marcador o marcadores.
La presente invención también proporciona una
célula madre embrionaria (ME) de mamífero no humano que tiene al
menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina humana integradas de forma estable en el genoma de
la célula ME de mamífero no humano, en donde la porción de un locus
de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para
codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción
de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para
codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde la
célula ME de mamífero no humano es producida mediante el método de
la presente invención para producir una célula madre embrionaria
(ME) de mamífero no humano.
El ADN xenogénico, es decir humano, que se va a
introducir usando un YAC es de origen humano. Por tanto se pueden
impartir numerosas nuevas capacidades al anfitrión, crear respuestas
genéticas relacionadas con la fuente xenogénica, es decir humana,
de ADN, proporcionar la producción de anticuerpos, introducir
mutaciones dominantes o mutaciones recesivas complementarias. El
ADN xenogénico, es decir humano, puede ser modificado cuando está
presente en un YAC. Debido a que la recombinación homologa es eficaz
en levaduras, generando una elevada proporción de integración
específica respecto a la posición de ADN homólogo, cuando el ADN
homólogo flanquea otro ADN de interés, se puede modificar el ADN
xenogénico, es decir humano, antes de la introducción en una célula
ME no humana. De este modo, se pueden introducir genes defectivos en
el anfitrión no humano que expresen proteínas defectivas para
imitar estados de enfermedad del anfitrión xenogénico, para estudiar
los diversos mecanismos de interacción de proteínas defectivas con
otras proteínas xenogénicas o proteínas endógenas, o para estudiar
genes o sistemas de genes.
En general, para transferir grandes segmentos de
ADN, tal como se describe en detalle en el presente documento, se
emplean YACs que comprenden un centrómero de levadura, un origen de
replicación y telómeros que rodean al ADN de interés. Se pueden
usar varios centrómeros o telómeros, particularmente los centrómeros
procedentes de los cromosomas de levadura 4 y 5. El YAC tiene un
marcador que permite la selección o el escrutinio de células en las
que se integra el YAC. No todos los marcadores permiten una
selección eficaz. Particularmente, el gen HPRT, más particularmente
HPRT humano, permite una selección eficaz de células no humanas
deficientes en HPRT que portan el YAC. Otros marcadores
seleccionables o escrutables conocidos incluyen higromicina,
neomicina, \beta-gal y GPT. La célula ME puede
derivar de cualquier anfitrión no humano, del cual se puedan tener
disponibles células ME, y pueda expandirse en cultivo, que
permanezca viable y funcional, para el que exista un marcador de
selección, y en donde la célula ME pueda introducirse en un embrión
no humano y pueda repoblar el anfitrión no humano, incluyendo la
línea germinal. En su mayor parte, dicha capacidad se ha establecido
para roedores, por ejemplo ratones y ratas, y en menor medida para
cobayas. Se han usado ratones para la producción de anticuerpos o
de linfocitos B para la inmortalización para la producción de
anticuerpos. Debido a que los ratones son fáciles de manejar, se
pueden producir en grandes cantidades, y se sabe que poseen un
extenso repertorio inmune, habitualmente son los animales elegidos.
Si se dispone de células ME no humanas de otras especies, también
pueden emplearse de acuerdo con la presente invención. De especial
interés son los animales de laboratorio pequeños, o animales
domésticos, especialmente roedores, que incluyen ratones, ratas,
conejos, vacas, cerdos, hámsteres, caballos, perros, ovejas y
cobayas, o aves tales como pollos, pavos, etc. Las células ME no
humanas pueden tener una o más mutaciones, por ejemplo, carecer de
una actividad particular. De especial interés en esta invención son
las células ME que son deficientes en HPRT. Además, óvulos
fertilizados no humanos de determinadas especies pueden ser de
utilidad de acuerdo con la invención.
El YAC puede obtenerse mediante escrutinio de
bibliotecas de YAC humano existentes tales como las disponibles en
el Centre d'Etude du Polymorphisme Human (C.E.P.H.), París, Francia,
y en la Universidad de Washington, St. Louis, MO, usando
procedimientos estándar. Alternativamente, el YAC se prepara
fácilmente tal como se detalla en la presente memoria, uniendo los
segmentos flanqueantes de levadura que comprenden un brazo con un
centrómero y telómero y otro con un telómero junto con el ADN de
interés. Habitualmente, también habrá presente uno o más marcadores
que permitan la selección en las células anfitrionas de levadura.
Para la selección de levadura, son de especial interés los
marcadores que complementan mutaciones del anfitrión de levadura,
tal como los genes implicados en la producción de aminoácidos,
purinas o pirimidinas, URA3, TRP1, LYS2, ADE2 en el YAC para
complementar las mutaciones ura3, trp1, lys2 y ade2 en el anfitrión.
Proporcionando la complementación, en su mayoría sólo las células
de levadura que portan el YAC completo serán capaces de sobrevivir
en un medio selectivo. Además de la verificación genética de que se
mantienen ambos brazos de YAC, es deseable confirmar la integridad
del YAC usando un método tal como la electroforesis de gel de campo
pulsado.
Los anfitriones de levadura que portan el YAC
pueden ser utilizados a continuación como fuente del YAC para su
introducción en la célula ME no humana. La transferencia del YAC se
lleva a cabo de forma eficaz preparando esferoplastos de levadura
de acuerdo según métodos convencionales. Degradando la pared
externa, en condiciones suaves, en un medio isotónico, se producen
esferoplastos con un elevado rendimiento. Las células ME no humanas
en crecimiento exponencial son tratadas con proteasa, por ejemplo
son tripsinizadas, y se combinan con los esferoplastos. De forma
conveniente, se puede preparar una partícula de esferoplastos de
levadura y se hacen girar las células no humanas con la partícula y
se exponen a un agente fusogénico tal como PEG durante
1-2 minutos. A continuación las células son
resuspendidas e incubadas en un medio apropiado libre de suero.
Entonces las células son llevadas a placa sobre células
alimentadoras, seguido de la selección de acuerdo con el marcador
selectivo. Para el gen HPRT, se puede emplear medio HAT para la
selección. Las colonias de fusión supervivientes son seleccionadas,
expandidas y analizadas. El análisis puede llevarse a cabo mediante
análisis con enzimas de restricción, con análisis de transferencia
Southern combinado o mediante electroforesis de gel de campo
pulsado, o mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR),
empleando los cebadores apropiados, de los cuales al menos uno es
complementario al injerto de ADN, y probar con secuencias
repetitivas presentes en el ADN xenogénico, tal como Alu, para la
detección de secuencias de ADN humano. Se usan secuencias Ty, Y',
rADN y delta como sondas para las secuencias de levadura. Se usan
sondas para los extremos de YAC para confirmar la integridad del
YAC. Las células que demuestran la presencia de ADN de YAC intacto o
sustancialmente intacto integrado en el genoma del anfitrión se
usan a continuación en las siguientes etapas. En algunos clones,
sólo una porción o poco o nada del ADN de levadura pasa a
integrarse en el genoma de ratón. El ADN de levadura integrado
oscila entre más de aproximadamente el 90% del genoma original de
levadura y menos de aproximadamente el 10%.
La producción eficaz de anfitriones transgénicos
no humanos puede lograrse usando un proceso que integra grandes
fragmentos de ADN xenogénico, de al menos 100 kb, de un modo
sustancialmente intacto, en una célula madre embrionaria (ME) de
anfitrión no humano o en un óvulo fertilizado no humano (zigoto). La
introducción del ADN xenogénico se logra de forma eficaz mediante
la fusión de la célula ME no humana con esferoplastos de levadura
que contienen YACs que portan el ADN de 100 kb y un marcador
seleccionable, en condiciones que permitan la integración del ADN
de YAC que contiene el marcador en un genoma de célula ME no humana,
o mediante la transfección de un YAC purificado en células ME no
humanas. Las células ME no humanas que comprenden el YAC integrado
en el genoma son seleccionadas a continuación por medio de un
marcador, que es funcional en la célula ME no humana. Por ejemplo,
se puede usar el gen de hipoxantina fosforibosilo transferasa (HPRT)
como marcador en células ME deficientes en HPRT (HPRT-). Para
producir animales a partir de células madre embrionarias no
humanas, después de la transformación, las células pueden colocarse
en una capa de alimentador en un medio apropiado, por ejemplo DMEM
potenciado con suero bovino fetal. La células ME no humana puede
tener un locus diana sencilla (heterocigoto), o puede ser
manipulada mediante el proceso de homogeneización para tener ambos
locus como dianas (homocigoto). El proceso de homogeneización
(formación de homocigotos) usa presión selectiva para extraer del
cultivo las células que tengan el suceso de selección de genes en
ambos cromosomas. Las células que contienen los dos alelos diana
pueden detectarse empleando un medio selectivo y después del tiempo
suficiente para que las colonias se desarrollen, las colonias
pueden seleccionarse y analizarse para detectar la presencia de
integración o de recombinación homóloga. Tal como se ha descrito
previamente, se puede usar PCR, con cebadores dentro o fuera de la
secuencia de construcción, pero en el locus diana.
La presente invención también proporciona un
método para producir un mamífero quimérico no humano que tenga al
menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina humana integradas de forma estable en el genoma de
al menos algunas de sus células, en donde la porción de un locus de
cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para
codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción
de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana es
suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina
humana, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
- (a)
- producir una célula ME de mamífero no humano de la presente invención; y
- (b)
- transferir la célula embrionaria seleccionada a un blastocisto de anfitrión no humano, implantar el blastocisto en un receptor mamífero no humano pseudos-embarazado, y permitir que el blastocisto se desarrolle hasta el final para producir el mamífero quimérico no humano.
La presente invención también proporciona un
mamífero quimérico no humano que tiene al menos una porción de un
locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una
porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana
integrados de forma estable en el genoma de al menos algunas de sus
células, en donde la porción de un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena
pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de un locus de cadena
ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una
cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde el mamífero
quimérico no humano es producido mediante el método de la presente
invención para producir un mamífero quimérico no humano.
Las colonias que muestran recombinación homóloga
pueden usarse para la manipulación de embriones no humanos y para
la inyección de blastocistos no humanos. A continuación las células
ME no humanas son introducidas en embriones no humanos, mediante
microinyección o por otros medios, en el anfitrión no humano
apropiado. Por ejemplo, se pueden obtener blastocistos murinos a
partir de animales femeninos lavando el útero 3,5 días después de
la ovulación. Entonces las células ME modificadas no humanas son
tripsinizadas y al menos entre 1 y hasta 15 células son inyectadas
en el blastocoel del blastocisto no humano. Después de la inyección,
al menos 1, y no más de aproximadamente 10 de los blastocistos se
devuelven a cada cuello uterino de hembras pseudopreñadas. Las
hembras llegan a término y los animales quiméricos no humanos pueden
analizarse para detectar la presencia del YAC en sus células
somáticas. Por "quimérico" se entiende un animal no humano que
porta células derivadas de más de una fuente, por ejemplo del
anfitrión y de otro animal. Por ejemplo, en la presente invención
un animal murino quimérico contiene una modificación de ingeniería
genética, particularmente un gen humano, en algunas de sus células,
por ejemplo en células que se desarrollan a partir de células madre
embrionarias modificadas. Entonces se analiza la presencia del YAC
integrado en los anfitriones quiméricos generados. Se evalúa la
transmisión por apareamiento de la línea germinal del genoma de
célula ME en los anfitriones quiméricos, por ejemplo se aparean
ratones quiméricos con ratones C57BL/6J. Los anfitriones quiméricos
pueden reproducirse con anfitriones no quiméricos, tanto singénicos
como alogénicos, para escrutar las quimeras que porten el YAC en
sus líneas germinales. Los descendientes que son heterocigotos para
la modificación genética son cruzados para producir una progenie
que sea homocigoto para la modificación, transmitiendo de forma
estable la construcción YAC activa a su progenie.
El método de la invención para producir un
mamífero quimérico no humano, particularmente un roedor y
habitualmente un animal murino, proporciona una integración estable
del ADN. Los genes del ADN insertado son funcionales y los
anfitriones quiméricos no humanos son capaces de proporcionar la
transmisión de línea germinal del ADN integrado. Tras la
reproducción del anfitrión quimérico, se producen anfitriones
transgénicos no humanos heterocigotos y son apareados para producir
un animal no humano homocigoto que puede usarse para una amplia
variedad de propósitos, que incluye la producción de productos,
tales como proteínas de unión, por ejemplo inmunoglobulinas, para
escrutar diversos fármacos, para terapia génicas, por ejemplo para
complementar trastornos genéticos recesivos, para estu-
diar diversas enfermedades, para estudiar la función y la regulación de grandes fragmentos de ADN poco conocidos.
diar diversas enfermedades, para estudiar la función y la regulación de grandes fragmentos de ADN poco conocidos.
La presente invención también proporciona un
método para producir un mamífero transgénico no humano, y su
progenie, que tiene al menos una porción de un locus de cadena
pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus
de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integradas de forma
estable en el genoma de sus células somáticas y germinales, en
donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana es suficiente para codificar una cadena pesada de
inmunoglobulina humana, y la porción de un locus de cadena ligera
de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena
ligera de inmunoglobulina humana, comprendiendo dicho método las
siguientes etapas:
- (a)
- producir un mamífero quimérico no humano de la presente invención; y
- (b)
- reproducir el mamífero quimérico no humano según sea necesario para producir el mamífero transgénico no humano y su progenie.
Además, la presente invención proporciona un
mamífero transgénico no humano y su progenie que tiene al menos una
porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al
menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina
humana, integradas de forma estable en el genoma de sus células
somáticas y germinales, en donde la porción de un locus de cadena
pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una
cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de un locus de
cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para
codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde el
mamífero no humano es producido por el método de la presente
invención para producir mamíferos transgénicos no humanos y su
progenie.
En una realización preferida del método de la
presente invención, la porción del locus de cadena pesada de
inmunoglobulina humana es una secuencia de ADN idéntica a la
secuencia de ADN de línea germinal del cromosoma humano 14 de los
genes del segmento D del locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana, que continúa a través de los genes del segmento J y los
genes de región constante a través del C\mu de dicho locus, en
donde dicha secuencia de ADN no incluye una región constante gamma,
y en donde dicho fragmento de ADN está ligado operativamente a al
menos un gen de segmento V humano.
En otra realización preferida del método de la
presente invención, el genoma de la célula ME de mamífero no humano
comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar
la redisposición del locus y para prevenir la formación de un
tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
reorganizado.
En una realización más preferida del método de
la presente invención, el genoma de la célula ME de mamífero no
humano comprende además al menos un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus es desactivado
para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación
de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina
reorganizado.
En una realización preferida de la presente
invención, la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana de la célula ME no humana o de la célula ME de mamífero no
humano es una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN de la
línea germinal del cromosoma humano 14, desde los genes del segmento
D del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana, que
continúa a través de los genes del segmento J y de los genes de la
región constante hasta C\mu de dicho locus, en donde dicha
secuencia de ADN no incluye una región constante gamma, y en donde
dicho fragmento de ADN está ligado operativamente a al menos un gen
de segmento V humano.
Además, en otra realización preferida de la
presente invención, el genoma de la célula ME de mamífero no humano
comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar
la redisposición del locus y para prevenir la formación de un
tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
reorganizada.
En una realización más preferida de la presente
invención, el genoma de la célula ME de mamífero no humano
comprende además al menos un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está
desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina reorganizado.
En otra realización preferida de la presente
invención, el genoma de las células del mamífero quimérico no
humano que tiene una porción del locus de cadena pesada de
inmunoglobulina humana y una porción de un locus de cadena ligera
de inmunoglobulina humana comprende al menos un locus de cadena
pesada de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está
desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina reorganizada.
En una realización más preferida de la presente
invención, el genoma de las células del mamífero quimérico no
humano que tiene una porción del locus de cadena pesada de
inmunoglobulina humana y una porción de un locus de cadena ligera
de inmunoglobulina humana comprende además al menos un locus de
cadena ligera de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el
locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para
prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera
de inmunoglobulina reorganizado.
En otra realización preferida de la presente
invención, el genoma de las células somáticas y germinales del
mamífero transgénico no humano comprende al menos un locus de cadena
pesada de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está
desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina reorganizado.
En una realización más preferida de la presente
invención, el genoma de las células somáticas y germinales del
mamífero transgénico no humano comprende además al menos un locus de
cadena ligera de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el
locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para
prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera
de inmunoglobulina reorganizado.
En otra realización más preferida de los métodos
de la presente invención, al menos un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina endógeno es desactivado mediante la eliminación de
todos los genes del segmento J.
Además, en una realización aún más preferida, al
menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno de
célula ME no humana o de célula ME de mamífero no humano de la
presente invención es desactivado mediante la eliminación de todos
los genes del segmento J.
En otra realización más preferida del método de
la presente invención al menos un locus de cadena ligera kappa de
inmunoglobulina endógeno es desactivado mediante eliminación del gen
C_{\kappa}.
Finalmente, en una realización más preferida de
la presente invención, al menos un locus de cadena ligera kappa de
inmunoglobulina endógeno de célula ME no humana o de célula ME de
mamífero no humano es desactivado mediante la eliminación del gen
C_{\kappa}.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no como limitación.
Se clona un fragmento Ncori de 6,4 kb que
contiene los genes de cadena pesada J de ratón y las secuencias
flanqueantes a partir de una biblioteca genómica de embriones de
ratón Balb/c usando las sondas descritas en Sakano y col. (1981),
Nature 290: 562-565. Dicho fragmento (mDJ) se
inserta en un plásmido pUCI9 digerido con EcoRI (pmDJ). Se elimina
un fragmento de 2,9 kb que contiene los 4 genes J mediante digestión
con XhoI-ScaI (pmD\deltaJNeo, véase la Figura 1).
Se aísla un fragmento de XhoI-BamHI de 1150 pb a
partir de pMCINeo, que contiene un gen de resistencia a neomicina
dirigido por el promotor de gen de timidina quinasa del virus de
Herpes simple (HSV-tk) y un potenciador de polioma
(Thomas y Capecchi (1987), Cell, 51, 503-512). Se
añade un adaptador sintético a dicho fragmento para convertir el
extremo BamHI en un extremo ScaI y el fragmento resultante se une
al XhoI-ScaI pmD\deltaJ para formar el vector de
desactivación (pmD\deltaJ.Neo) en el que la orientación 5' a 3'
de la neomicina y de los promotores de cadena pesada es idéntica.
Este plásmido es linealizado mediante digestión NdeI antes de su
transfección a células ME. Las secuencias que conducen el evento de
recombinación homóloga son fragmentos de 3 kb y de 0,5 kb,
localizados a 5' y 3' respecto del gen de neomicina,
respectivamente.
La línea de células ME E14TG2a (Hooper y col.
(1987), Nature, 326: 292-295) se cultiva sobre capas
de alimentador de fibroblasto embriónico primario tratadas con
mitomicina esencialmente como se ha descrito (Doetschman y col.
(1985), J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45). Los
fibroblastos embriónicos se preparan a partir de embriones de
hembras C57BL/6 que han sido apareadas entre 14 y 17 días antes con
machos homocigotos para un transgén de neomicina (Gossler y col.
(1986), PNAS 83: 9065-9069). Estas células son
capaces de crecer en un medio que contiene G418. Las condiciones de
electroporación se describen en Boggs y col. (1986), Ex. Hematol.
(NY) 149: 988-994. Las células ME son
tripsinizadas, resuspendidas en medio de cultivo a una concentración
de 4x10^{7}/mL y electroporadas en presencia de la construcción
de ADN dirigido a una concentración 12 nM en el primer experimento
y 5 nM en el segundo. El voltaje óptimo es de 300 V con una
capacitancia de 150-250 \muF con una célula de
electroporación de 5 mm de longitud y 100 mm^{2} de sección
transversal. Se llevan a placa 5x10^{6} células electroporadas
sobre fibroblastos tratados con mitomicina en platos de 100 mm en
presencia de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado
con un 15% de suero fetal bovino (FBS) y con
2-mercaptoetanol 0,1 mM. El medio se cambia 24
horas después de la electroporación por otro medio que contiene 200
\mug/mL de G418.
Se seleccionan las colonias de células ME que
resultan 10-14 días después de la electroporación
con pipetas capilares de extracción para realizar análisis de PCR.
La mitad de las colonias seleccionadas se guarda en placas de 24
pocillos ya sembradas con células alimentadoras tratadas con
mitomicina. La otra mitad, combinadas en grupos de
3-4, es transferida a tubos Eppendorf que contienen
aproximadamente 0,5 mL de PBS y es analizada para determinar
recombinación homóloga mediante PCR. Las condiciones de las
reacciones PCR son esencialmente como se ha descrito previamente
(Kim y Smithies (1988), Nucleic Acid Res. 16:
8887-8893). Después de formar una partícula, las
células ME son resuspendidas en 5 \muL de PBS y son lisadas
mediante la adición de 55 \muL de H_{2}O a cada tubo. Se
desactivan las ADNasas calentado los tubos a 95ºC durante 10
minutos. Tras un tratamiento con proteinasa K a 55ºC durante 30
minutos, se transfieren 30 \muL de cada lisato a un tubo que
contiene 20 \muL de una mezcla de reacción que incluye tampón de
PCR: 1,5 \mug de cada cebador, 3 U de Taq polimerasa, un 10% de
DMSO y dNTPs, a 0,2 mM. La expansión PCR emplea 55 ciclos usando un
termociclador con 65 segundos fundido a 92ºC y un tiempo de
recocido y extensión de 10 minutos a 65ºC. Los dos oligonucleótidos
de cebado son TGGCGGACCGCTATCCCCCAGGAC y TAGCCTGGGTCCCTCCTTAC, que
corresponden respectivamente a una región a 650 bases 3' del codón
de inicio del gen de neomicina y de las secuencias localizadas en el
gen de cadena pesada de ratón, a 1100 bases 3' de la posición de
inserción. Se someten a electroforesis 20 \muL de la mezcla de
reacción en geles de agarosa y se transfieren a membranas de nylon
(Zeta Bind). Los filtros se sondan con un fragmento marcado con
^{32}P del fragmento XbaI de 991 pb de la región
J-C.
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió un fragmento EcoRI de 6,1 Kb, que
contiene los genes de región J de cadena pesada de inmunoglobulina
de ratón y las secuencias flanqueantes, clonado a partir de una
biblioteca genómica de embriones de ratón BALB/c y insertado en
pUC18 (pJ_{H}), con XhoI y NaeI para eliminar un fragmento de
aproximadamente 2,3 kb que contiene los cuatro genes J (véase la
Figura 2A). Un fragmento XhoI-BamHI de
aproximadamente 1,1 kb, tratado en la posición BamHI, que contiene
un gen de resistencia a neomicina conducido por un promotor de gen
de timidina quinasa de virus de Herpes simple
(HSV-tk) y un potenciador de polioma, fue aislado a
partir de pMC1Neo (Thomas y Capecchi (1987), Cell, 51,
503-512). Este fragmento se insertó en el pJH
borrado con XhoI-NaeI para formar el vector de
eliminación (pmH\deltaJ, véase la Figura 2B), en donde la
orientación transcripcional de los genes de neomicina y de cadena
pesada es la misma. Este plásmido fue linealizado mediante
digestión NdeI antes de su transfección a células EM. Las secuencias
que conducen el evento de recombinación homóloga son fragmentos de
aproximadamente 2,8 kb y aproximadamente 1,1 kb, localizados 5' y 3'
respecto al gen de neomicina, respectivamente.
La línea de células ME E14TG2a (Koller y
Smithies (1989), PNAS USA, 86: 8932-8935) se cultivó
en capas de alimentador de fibroblasto embriónico tratado con
mitomicina C, tal como se ha descrito antes (Koller y Smithies
(1989), PNAS USA, 86: 8932-8935). Las células ME
fueron tripsinizadas, resuspendidas en tampón HBS (pH 7,05; NaCl
137 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,7 mM, HEPES
21 mM, pH 7,1) a una concentración de 2x10^{7}/mL, y se
electroporaron en presencia de 50 \mug/mL del vector de
desactivación linealizado. La electroporación se llevó a cabo con
BioRad Gene Pulser usando 240 voltios y 500 \muF de capacitancia.
5x10^{6} células electroporadas se llevaron a placa sobre
fibroblastos tratados con mitomicina C en platos de 100 mm en
presencia de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado
con un 15% de suero bovino fetal y 2-mercaptoetanol
0,1 mM. El medio fue reemplazado 24 h después de la electroporación
con medio que contenía 200 \mug/mL de G418. Las colonias ME
resistentes a G418 resultantes del cultivo durante
12-14 días tras la electroporación fueron
seleccionadas con pipetas capilares de extracción para su análisis
usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La mitad de cada
colonia seleccionada fue transferida a un pocillo individual de una
placa de 24 pocillos, previamente sembrada con células alimentadoras
tratadas con mitomicina C. Las otras mitades, combinadas en grupos
de cuatro, fueron transferidas a tubos Eppendorf que contenían 0,3
mL de PBS, y se prepararon lisatos celulares para el análisis PCR
tal como se describe en Joyner y col. (1989) Nature, 338:
153-155. La reacción PCR incluyó
5-20 \muL del lisato celular, 1 \muM de cada
cebador, 1,5 U de polimerasa Taq y 200 \muM de dNTPs. La
amplificación PCR empleó 45 ciclos usando un ciclador térmico
(Perkin-Elmer Cetus), con 1 minuto de fusión a 94ºC,
2 minutos de recocido a 55ºC y 3 minutos de extensión a 72ºC. Los
dos nucleótidos de cebado son ACGGTATCGCCGCTCCCGAT y
AGTCACTGTAAAGACTTCGGGTA, que corresponden respectivamente a
aproximadamente 120 bases 5' respecto a la posición BamHI del gen de
neomicina, y a las secuencias localizadas en el gen de cadena
pesada de ratón, aproximadamente a 160 bases 3' de la posición de
inserción. La recombinación homóloga exitosa da lugar a un fragmento
de aproximadamente 1,4 kb. Se someten a electroforesis 20 \muL de
la mezcla de reacción sobre geles de agarosa al 1%, se tiñen con
bromuro de etidio y se transfieren a membranas de nylon (Gene
Screen). Los filtros fueron sondados con un fragmento
EcoRI-PstI marcado con ^{32}P de aproximadamente
1,4 kb localizado en la cadena pesada de ratón, 3' respecto a la
posición de inserción (véase la Figura 2). Para análisis
posteriores, se preparó ADN genómico a partir de células ME, se
digirió con enzimas de restricción tal como recomiendan los
fabricantes, y se separó el fragmento con geles de agarosa al 1%.
El ADN fue transferido a membranas de nylon (Gene Screen) y se sondó
con el fragmento marcado con ^{32}P descrito antes.
En el primer experimento, el análisis PCR de las
colonias reunidas detectó una señal PCR positiva del tamaño
esperado (aproximadamente 1,4 kb) entre los 34 grupos que
representaban 136 colonias resistentes a G418. Las cuatro colonias
individuales que habían contribuido a este grupo positivo fueron
analizadas individualmente mediante PCR, y se identificó un clon
positivo, ES33D5. Un análisis similar de las 540 colonias
resistentes a G418 obtenidas en el segundo experimento dio lugar a
4 clones positivos adicionales (ES41-1,
ES61-1, ES65-1,
ES110-1).
A fin e verificar la alteración dirigida de una
copia de los genes J (el gen es autosomal y por tanto está presente
en dos copias), los clones positivos en PCR fueron expandidos y se
preparó ADN genómico, se digirió con HindIII o con SacI y se
analizó mediante análisis de transferencia Southern tal como se ha
descrito para el uso de sonda EcoRI-PstI.
La sustitución de los genes J mediante inserción
del gen de neomicina mediante un evento de recombinación homóloga
da como resultado un fragmento HindIII, detectable con la sonda
EcoRI-PstI, que es aproximadamente 1,9 kb más larga
que el fragmento equivalente en el locus nativo, debido a la pérdida
de dos posiciones HindIII localizadas en la región de gen J
eliminada (véase la Figura 2C). El análisis de transferencia
Southern de los 5 clones positivos mediante digestión HindIII
proporcionó una tendencia que indicó que una de las dos copias de
los genes de cadena pesada J había sido alterada. Se detectaron tres
fragmentos marcados: un fragmento (de aproximadamente 760 pb),
idéntico en tamaño al presente en las células no tratadas con la
misma intensidad, un fragmento (de aproximadamente 2,3 kb) idéntico
en tamaño al presente en las células no tratadas, pero con menor
intensidad en el clone positivo en PCR, y un fragmento adicional de
aproximadamente 4,2 kb, el tamaño predicho para un evento de
recombinación homóloga, presente solo en los clones positivos en
PCR. De forma similar, la sustitución de los genes J por el gen de
neomicina mediante un evento de recombinación homóloga da como
resultado la pérdida de una posición SacI y la aparición de un
fragmento, detectable con la sonda EcoRI-PstI, que
es aproximadamente 570 pb más pequeño que el fragmento equivalente
del locus nativo (véase la Figura 2C). El análisis de transferencia
Southern de los clones mediante digestión con SacI proporcionó el
resultado esperado de un alelo nativo y un alelo diana: fragmento de
aproximadamente 4,0 kb, idéntico en tamaño al detectado en las
células no tratadas, pero de menor intensidad en los 5 clones
positivos, y un fragmento adicional de aproximadamente 3,4 kb, el
tamaño predicho para un evento de recombinación homóloga dirigida,
presente sólo en los clones identificados. La rehibridación de las
manchas Southern con una sonda para el gen de neomicina demostró
que sólo los fragmentos de 4,2 kb y de 3,4 kb, resultantes de las
digestiones con HindIII y SacI, respectivamente, se hibridaron a la
sonda tal como había predicho el evento dirigido.
Se obtuvieron blastocistos de C57BL/6J (Jackson
Laboratorios, Bar Harbor, ME) de tres días y medio de edad a partir
de hembras superovuladas de 4-5 semanas de edad tal
como se describe en Koller y col. 1989 (ver anterior). Las células
ME fueron tripsinizadas, lavadas una vez con medio DMEM fresco, y
diluidas hasta 1 X 10^{6}/mL en medio DMEM que contiene un 10% de
suero bovino fetal y HEPES 20 mM, pH 7,5. Se inyectaron de 10 a 15
células en el blastocoel para cada blastocisto. A continuación, los
blastocistos que contienen células ME fueron transferidos
quirúrgicamente a un cuello uterino de hembras C57BL/6J X DBA/2 ó
C57BL/6J X CBA F1 pseudopreñadas.
La contribución de las células ME a la
descendencia se evaluó visualmente mediante examen del color de la
piel de las crías. Los ratones C57BL/6J son de color negro sólido.
La línea celular parental ME E14TG2a se aisló a partir de embriones
129/Ola, que portan tres genes de color de piel, el alelo dominante
A^{W} en el locus de agouti, el alelo recesivo diluido de ojos
rosa en el locus p, y el C^{ch} recesivo en el locus c. Los
descendientes quiméricos en los que participaron las células ME en
la formación del animal presentan pieles que contienen pelo agouti y
crema.
La capacidad de transmisión de la línea germinal
de los ratones quiméricos se evaluó apareando con ratones C57BL/6J
y puntuando para descendiente F1 con color agouti. Sería de esperar
que el 50% de estos ratones agouti heredaran el alelo mutado de
cadena pesada, que puede identificarse mediante análisis de
transferencia Southern de ADN aislado de las colas.
La línea celular ME ES65-1
tratada con J_{H}, que porta un alelo de cadena pesada diana, fue
inyectada en blastocistos de ratón C57BL/6J. Aproximadamente el 45%
de las crías supervivientes eran quimeras. Dos hembras quiméricas,
238-2 y 244-3, tras apareamiento con
machos C57BL/6J, dieron lugar a transmisión de la línea germinal
con una frecuencia del 100% y del 15%, determinado por el porcentaje
de descendientes agouti. El análisis de transferencia Southern del
ADN procedente de descendientes heterocigotos indicó la presencia de
la cadena pesada diana además de un alelo nativo en 2 de cada 5
descendientes agouti evaluados.
Los ratones homocigotos para la mutación fueron
obtenidos mediante reproducción cruzada de ratones machos y hembras
que fueron identificados como heterocigotos con J_{H} eliminado
(\deltaJ_{H}). Los descendientes de dichos apareamientos fueron
analizados para determinar la presencia de dos alelos diana de
cadena pesada mediante análisis de transferencia Southern.
\vskip1.000000\baselineskip
Si la eliminación de la región J_{H} es
suficiente para desactivar el locus de cadena pesada, entonces daría
como resultado un completo bloqueo del desarrollo de células B que
expresan IgM y de la producción de anticuerpos. Los ratones que son
heterocigotos en el locus J_{H} portan un alelo de cadena pesada
funcional e intacto, derivado de los ascendientes C57BL/6J, y un
alelo de cadena pesada con J_{H} eliminado que deriva de las
células ME (cepa 129/Ola). Las cepas 129 y B6 difieren en los
alotipos de cadena pesada de Ig. Las células B derivadas de ME
(alotipo IgM^{a}) pueden distinguirse de las células B derivadas
de B6 (alotipo IgM^{b}) con anticuerpos monoclonales específicos
de alotipo, usando análisis de citometría de flujo de B que expresan
anticuerpos.
La especificidad de dichos anticuerpos se
muestra en la Figura 3 (A-C). Se tiñeron linfocitos
sanguíneos periféricos con anticuerpos para el marcador específico
de células B, B220, y con anticuerpos para el alotipo IgM. Células
B procedentes de ratones C57BL/6J teñidas con anticuerpos dirigidos
contra el alotipo IgM^{b} pero no contra el alotipo IgM^{a}
(Figura 3B). Células B procedentes de ratones 129/Ola teñidas con
anticuerpos dirigidos contra el alotipo IgM^{a} pero no contra el
alotipo IgM^{b} (Figura 3A). En ratones heterocigotos (a/b F1)
que portan un alelo de cadena pesada derivado de ME intacto y un
alelo de cadena pesada derivado de C57BL/6J intacto, ambos alotipos
estaban presentes en cantidades iguales (Figura 3C).
Cuando se analizaron células B de ratones que
eran heterocigotos para la eliminación de J_{H}, en las que el
alelo de cadena pesada de J_{H} eliminado procedía del ascendente
129/Ola, no había células positivas para el alotipo IgM^{a}.
Todas las células B fueron positivas para IgM^{b}, del alelo de
cadena pesada de C57BL/6J intacto (Figura 3D). Estos resultados
indicaron que el locus de cadena pesada con J_{H} eliminado está
desactivado y no puede codificar un anticuerpo IgM funcional.
Los ratones que eran homocigotos para la
eliminación J_{H} también fueron analizados para determinar su
capacidad para producir anticuerpos funcionales. Se analizaron
linfocitos sanguíneos periféricos procedentes de ratones mutantes
homocigotos mediante citometría de flujo, usando anticuerpos para el
marcador B220 específico de células B, y con los marcadores
específicos de alotipo (véase la Figura 4). Al contrario que con los
ratones de control (Figura 4D-F), no pudieron
detectarse células B220+ ó células productoras de IgM en los ratones
mutantes (Figura 4A-C). Además, los ratones
mutantes no presentaron IgM detectable en el suero. Estos resultados
indican que la eliminación de la región J_{H} de ambos alelos de
cadena pesada conduce a la completa inhibición del desarrollo de
células B hasta células B maduras y la producción de
anticuerpos.
El efecto de la eliminación de JH en células B
también puede analizarse generando células ME con ambos alelos
diana de cadena pesada, que son usados entonces para producir
ratones quiméricos que contienen una población de células linfoides
homocigotos para la mutación.
Se generaron células ME mutantes \deltaJ_{H}
homocigotos sometiendo uno de los clones ME mutante heterocigoto,
el ES110-1, a niveles elevados de G418 (1,4 mg/mL)
seleccionado de este modo para la homogeneización del alelo diana.
Se escrutaron siete de las colonias supervivientes mediante análisis
de transferencia Southern usando digestión con SacI para determinar
la pérdida de alelo de cadena pesada natural y la adquisición de un
segundo alelo diana. Uno de estos clones, el ESDK207, presentó una
perdida del alelo de cadena pesada nativo, tal como se evidenció
por la incapacidad de las sondas para detectar el fragmento natural
de 4,0 kb y por el aumento de la intensidad del fragmento diana de
3,4 kb. El análisis cariotípico de ESDK207 indicó que, como la línea
parental ES110-1, aproximadamente el 80% de las
células tenía 40 cromosomas, lo que sugiere la presencia de dos
alelos diana. Las células ME mutantes homocigotos fueron
microinyectadas en blastocistos de C57BL/6J y se generaron ratones
quiméricos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron las células B de ratones
quiméricos para determinar el efecto de la eliminación de J_{H}
sobre el desarrollo de células B y la producción de anticuerpos.
Los linfocitos procedentes de la línea de células ME (129/Ola)
pueden distinguirse de los linfocitos derivados de blastocistos
(C57BL/6J) mediante un anticuerpo monoclonal para el marcador
Ly-9.1, que se encuentra en los linfocitos de origen
129, pero no en los de origen B6. Adicionalmente, las dos cepas
difieren en su alotipo IgM, tal como se ha descrito previamente.
Las quimeras analizadas habían derivado de
células ME naturales E14TG2a (WT), o de células ME que eran
heterocigotos (ES110-1, ES65-1) u
homocigotos (ESDK207) en la región J_{H} diana. Las células
mononucleares sanguíneas periféricas fueron teñidas con anticuerpos
para el marcador B220 específico de células B, y con anticuerpos
para cualquier de los alotipos Ly-9.1 o IgM, y a
continuación fueron analizadas mediante citometría de flujo
bicolor. Para evaluar el quimerismo del linaje de células T, las
células fueron teñidas con anticuerpos para el marcador de células
T Thy 1.2, y con anticuerpo
anti-Ly-9.1. La tinción de las
células procedentes de cepas parentales de ratones proporcionó
controles para la especificidad y la sensibilidad del ensayo.
Se compararon ratones con grados similares de
quimerismo, según el color de la piel. Se detectaron células B y T
derivadas de ME en la sangre periférica de ratones quiméricos
generados a partir de células ME E14TG2a naturales, lo que confirma
la capacidad de esta línea celular para proporcionar un aumento de
las células linfoides in vivo. El análisis de quimeras
generadas a partir de células sencillas ES65-1 y
ES110-1 con J_{H} tratado demostró la presencia
de células B B220^{+}/IgM^{a+}/Ly-9.1 que
contenían un único locus intacto de cadena pesada de Ig derivado de
célula ME.
Al contrario que las quimeras WT y de
eliminación sencilla, los ratones generados a partir de la línea
mutante ESDK207 homocigota carecían de células B
Ly-9.1^{+}/B220^{+} ó IgM^{a+}/B220^{+}1 en
la sangre periférica. La carencia observada de células B derivadas
de ESDK207 no se debió a una falta de linfopoiesis, ya que las
células Ly-9.1^{+}/B220 derivadas de ME
representaron el 12% del conjunto total de células mononucleares
sanguíneas periféricas. De estas, aproximadamente la mitad eran
células T Thy-1.2^{+}. Por tanto, la eliminación
de la región J_{H} de ambos alelos bloquea el desarrollo de
células B maduras que producen IgM^{a}. Se obtuvieron
observaciones similares con las células de bazo quimérico.
También se evaluó la presencia de IgM en suero
derivado de células ME en las quimeras. Los niveles de IgM^{a}
fueron elevados en las quimeras procedentes de células ME naturales
y en células con una mutación diana sencilla, pero fueron
indetectables en ratones derivados de la línea celular ESDK207.
Un análisis más profundo demostró que la médula
ósea de ratones ESDK207 contenía células B IgM^{b+} normales
derivadas de los blastocistos del anfitrión, pero carecía de células
B IgM^{a+} derivadas de ME. Sin embargo, la médula ósea derivada
de DK207 no contenía una población de células que fuera
B220^{dull}/Ly-9.1^{+} derivada de células ME.
Por tanto, la médula ósea probablemente contiene una subpoblación de
precursores de células B derivadas de ME, cuya maduración está
bloqueada por la eliminación homocigota de la región J_{H}.
Las células de médula ósea también fueron
analizadas con citometría de flujo tricolor, usando anticuerpos
para Ly-9.1, B220 y tanto CD43 como
Thy-1.2. Los resultados muestran que la mayoría de
las células derivadas de ME eran CD43 positivas, lo cual es
consistente con un bloqueo temprano de la maduración. Muchas de las
células también eran positivas para Thy-1.2, como
cabría esperar de precursores de células B muy tempranos. Estos
datos muestran que la eliminación de la región J_{H} da como
resultado la incapacidad del locus de cadena pesada para
reorganizar y producir IgM funcional. La carencia de una
reorganización de IgH da como resultado el bloqueo de la maduración
de células B, restringiendo a los progenitores de células B a una
etapa temprana de desarrollo.
La región kappa se desactivó con un vector de
tipo de sustitución, que fue diseñado para eliminar la región
constante del locus kappa, y para reemplazarlo con el marcador de
resistencia a fármaco G418 mediante recombinación homóloga. La
recombinación homóloga fue conducida por regiones de homología que
flanquean la región constante (véase la Figura 5).
Se escrutó una biblioteca genómica de ADN de
hígado fetal de ratón 129/Ola (Stratagene) clonado en fago lambda
para determinar la presencia del gen C_{\kappa} de ratón con
fragmento HpaI/BamHI de aproximadamente 1,6 kb (Steinmetz y Zachau
(1980) Nucleic Acids Research 8: 1693-1706) que
extiende la región constante kappa de ratón. Se identificó un clon
de fago lambda que se hibridó a esta sonda, a continuación se
purificó y se usó como fuente de ADN de C_{\kappa}. El análisis
del ADN de fago mostró que la sonda de región constante kappa se
hibridó a un fragmento SphI/BamHI de 5,6 kb. Dicho fragmento
contenía los genes de región J kappa, un elemento potenciador
intrónico y la región constante kappa. Entonces se aisló y subclonó
en las posiciones SphI y BamHI del plásmido pUC218 para dar lugar al
plásmido pUC218/5.6kappa.
A fin de construir el vector de eliminación, los
fragmentos que contienen la región 5' de la región constante kappa,
un gen de timidina quinasa para selección negativa, un gen de
resistencia a neomicina y una región 3' de homología con la región
constante kappa, fueron ligados juntos (véase la Figura 6).
Se subclonó un fragmento SphI/Bsu361 de 4,0 kb
procedente del plásmido pUC218/5.6kappa en las posiciones SphI y
Bsu361 del vector pSK.A para dar lugar al plásmido pSK.A/5'K. El
vector pSK.A es una modificación de pBluescript SK- que tiene un
poliligando sintético:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
insertado entre las posiciones
pBluescript KpnI y
SacI.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento EcoRI/HindIII de 2,7 kb que
contiene el gen de timidina quinasa (TK) de herpes conducido por el
promotor de gen de fosfoglicerato quinasa de ratón (PGK) procedente
del plásmido pKJtk (Tybulewicz y col. (1991) Cell 65:
1153-1163) se insertó en las posiciones EcoRI y NotI
de pSK.A/5'K usando un adaptador HindIII/NotI con la secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En el plásmido resultante, pSK.A/5'/TK, el
extremo 5' del gen TK y el gen de región constante kappa están
adyacentes uno al otro, con orientaciones transcripcionales
opuestas.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento XhoI/BamHI de 1,1 kb procedente de
pMC1Neo, que contiene el marcador seleccionable de fármaco de
mamífero para resistencia a neomicina, fue clonado en las posiciones
XhoI y BamHI del plásmido pSK.B para dar lugar al plásmido
pSK.B/Neo. El vector pSK.B es una modificación de pBluescript SK-
que tiene un poliligando sintético:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
insertado entre las posiciones
pBluescript KpnI y
SacI.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento BgIII/BamHI de 1,1 kb procedente de
pUC218/5.6kappa, que contiene homología con respecto al extremo 3'
de la región kappa, fue clonado en vector pSK.C tratado con
fosfatasa alcalina y digerido con BamHI. El vector pSK.C es una
modificación de pBluescript SK- que tiene un poliligando
sintético:
insertado entre las posiciones
pBluescript KpnI y SacI. El plásmido resultante, pSK.C/3'K está
orientado de tal modo que la transcripción procede desde la posición
SacI del plásmido poliligando en la dirección de la posición
KpnI.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido dirigido final fue construido con
una ligación de tres partes, usando (A) un fragmento NotI/NdeI de
6,1 kb procedente de pSK.A/5'K/TK, (B) un fragmento NdeI/SacI de 1,2
kb procedente de pSK.B/Neo y (C) un fragmento SacI/NotI de 4,0 kb
procedente de pSK.C/3'K ligados para formar el plásmido
pK.TK/neo.
\vskip1.000000\baselineskip
ADN de plásmido purificado procedente de
pK.TK/Neo fue cortado con PvuI, extraído con fenol/cloroformo y
precipitado en etanol. El ADN fue resuspendido después de la
precipitación con una concentración de 1 mg/mL en
Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM.
Se cultivó la línea de células madre
embrionarias E14-1, un subclon de E14 (Hooper y col.
(1987) Nature 326: 292-295) en DMEM con 4,5 g/L de
glucosa (J.R.H. Biosciences) suplementado con un 15% de suero fetal
de ternero desactivado térmicamente, factor inhibidor de leucemia
murina recombinante (ESGRO de Gibco BRL, 1000 U/mL),
\beta-mercaptoetanol 0,1 mM, glutamina 2 mM y 100
U/mL de penicilina a 37ºC en un 5% de CO_{2}.
Las células fueron cultivadas en capas de
alimentador de fibroblasto embriónico primario tratado con
mitomicina esencialmente como se ha descrito (Koller y Smithies
(1989), ver anterior). Se prepararon fibroblastos embriónicos a
partir de embriones de 14 días que portan la mutación homocigota
dirigida de \beta_{2}-microglobulina (Koller y
Smithies (1990) Science 248: 1227-1230). Estas
células alimentadoras son capaces de crecer en un medio que contiene
G418.
Con una confluencia del 80%, se prepararon
células ME para electroporación mediante tripsinización,
concentración mediante una breve centrifugación y resuspensión en
disolución salina tamponada con HEPES a 2 x 10^{7} células/mL.
Las células son equilibradas a temperatura ambiente, y se añade ADN
de vector dirigido linealizado (20 \mug). La mezcla fue sometida
a electroporación a 960 \muF y a 250 V con un Pulsador BioRad
Gene. Se dejó que las células se asentaran a temperatura ambiente
durante 10 minutos antes de llevarlas a platos de 4 x 10 cm de
alimentadores de fibroblasto tratado con mitomicina (3 x 10^{6}
células alimentadoras/plato). Después de incubar a 37ºC durante 48
horas, las células fueron alimentadas con medio que contiene 150
\mug/mL de G418 para seleccionar en función de la resistencia a
neomicina. Después de otras 48 horas se alimentó a las células con
un medio que contiene 150 \mug/mL de G418 y gancyclovir 2 \muM
(Syntex) para seleccionar en función de la pérdida del gen de
timidina quinasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de diez días de selección con fármacos
con G418 y gancyclovir, se seleccionaron las colonias individuales
supervivientes y se disociaron con una gota de tripsina en una placa
de 96 pocillos, a continuación fueron incubadas a 37ºC durante 2
minutos. Las células de cada colonia fueron transferidas a un
pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene células
alimentadoras tratadas con mitomicina C y medio selectivo con G418
pero no con gancyclovir. Después de otros 5-8 días,
se congeló el 20% de las células de cada pocillo, y el resto se usó
para preparar ADN genómico. Las células fueron lisadas con 0,4 mL de
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, EDTA 10 mM,
SDS al 1% y proteinasa K (1 mg/mL) mediante incubación de una noche
a 50ºC. El ADN fue purificado mediante extracción con fenol y
precipitación en etanol, a continuación se lavó con etanol al 70% y
se resuspendió en 20 \muL de Tris-HCl 10 mM, EDTA
1 mM.
Se llevó a cabo el análisis de transferencia
Southern de cada muestra usando ADN genómico digerido con BgIII.
Como sonda se usó un fragmento de aproximadamente 1,2 kb que
contiene la región contigua al fragmento de homología 3' del vector
dirigido. El locus de célula ME nativo proporcionó un fragmento de
aproximadamente 2,3 kb, mientras que el locus de célula ME dirigida
proporcionó un fragmento de aproximadamente 5,7 kb. El aumento de
tamaño es debido a la pérdida de una posición BgIII durante la
construcción del vector de eliminación.
Un análisis de transferencia Southern de 166
clones mostró dos líneas celulares que tenían la mutación
pretendida. Dichos clones fueron analizados mediante un resondeo de
los filtros con un fragmento de aproximadamente 1,1 kb que expande
el gen neo. Como era de esperar, la sonda sólo se hibridó con el
alelo diana.
\newpage
Un análisis adicional del ADN genómico
procedente de los dos clones positivos, 1L2-850 y
1L2-972, después de ser congelado y expandido,
reconfirmó las observaciones iniciales. Una tercera sonda, se usó un
fragmento HindIII/BgIII de aproximadamente 1,7 kb que expande el
locus de región J kappa para comprobar el correcto modelo de
integración desde el extremo 5' del vector dirigido. Usando esta
sonda con ADN genómico digerido con EcoRI, se detecta un fragmento
de aproximadamente 1,5 kb en el alelo nativo, y un fragmento de
aproximadamente 5 kb a partir del locus diana. La posición EcoRI
adicional se introduce mediante el gen neo durante el tratamiento de
recombinación homóloga (véase la Figura 7).
Se ha descubierto que las células
E14-1 no modificadas contribuyen a la línea germinal
con una frecuencia elevada después de la inyección en blastocistos
C57BL/6J. Para generar quimeras de líneas germinales que contienen
la región kappa diana, las líneas celulares diana
1L2-850 y 1L2-972 fueron cultivadas
en células alimentadoras primarias, a continuación fueron
tripsinizadas y resuspendidas en medio de inyección, que consistía
en DMEM suplementado con un 15% de suero fetal de ternera, HEPES 20
mM (pH 7,3), antibióticos y \beta-mercaptoetanol.
Las células ME fueron inyectadas en cada blastocisto, y los
blastocistos fueron transferidos a continuación a un cuello uterino
de un ratón hembra pseudopreñado. Las crías quiméricas fueron
identificadas a través del color quimérico de la piel. Los machos
quiméricos fueron cruzados con hembras C57BL/6J, y se detectó la
transmisión de la línea germinal de células ME derivadas de 129/Ola
a través del color agouti de la piel de los descendientes.
Un macho quimérico de la línea celular
1L2-972 (derivado aproximadamente en un 40% de
células ME según el color de su piel), tras apareamiento con
hembras C57B1/6J dio lugar a la transmisión de la línea germinal
con una frecuencia del 25%, determinada por el porcentaje de
descendientes agouti. Los machos quiméricos, quiméricos en
aproximadamente un 40%, un 70% y un 90%, de la línea celular
1L2-850 dieron lugar a transmisión de la línea
germinal con frecuencias del 90%, 63% y 33%, respectivamente. Entre
los descendientes agouti generados a partir de machos quiméricos al
70% de 1L2-850, se descubrió que ocho de cada 12
animales F1 evaluados eran heterocigotos en el locus kappa para la
mutación dirigida C_{\kappa} mediante análisis de transferencia
Southern (una digestión BgI II usando el fragmento Bam HI/BgI de 1,2
kb descrito antes como una sonda) usando ADN genómico derivado de
muestras de cola. La reproducción posterior de un macho y una hembra
de este grupo de 8 animales F1, ambos heterocigotos para la
mutación C_{\kappa}, dio lugar a un descendiente hembra que era
homocigoto para dicha mutación según se confirmó mediante análisis
de transferencia Southern.
Si el locus de cadena ligera kappa (\kappa)
está desactivado debido a la eliminación de la región constante de
cadena ligera (C_{\kappa}), de la región de unión (J_{\kappa}),
o de ambos C_{\kappa} y J_{\kappa}, entonces se produciría un
completo bloqueo del desarrollo de las células B que expresan
\kappa. Se introdujeron células madre embrionarias de ratón que
contenían una única copia de la eliminación C_{\kappa} completa
(\DeltaC_{\kappa}) en blastocistos de ratón tal como se ha
descrito antes para producir ratones quiméricos. Entonces, dichos
ratones quiméricos fueron apareados con ratones C57BL/6 (B6)
naturales, y la progenie F1 fue evaluada para determinar la
presencia de la mutación \DeltaC_{\kappa} mediante análisis de
transferencia Southern de ADN de cola. Los ratones F1 que portaban
la mutación \DeltaC_{\kappa} fueron apareados y los
descendientes F2 fueron evaluados de forma similar para determinar
\DeltaC_{\kappa}. Uno de 5 descendientes F2 portaba una
eliminación C_{\kappa} homocigota, y otro era heterocigoto,
portando ambos \DeltaC_{\kappa} y un alelo C_{\kappa}
natural. Los otros 3 descendientes eran de tipo natural. La
presencia o la ausencia de células B positivas en \kappa se
evaluó mediante análisis de citometría de flujo de células B
sanguíneas periféricas teñidas con anticuerpos fluorescentes que
reaccionan con un marcador de células pan-B (B220) o
con la cadena ligera \kappa. Para el ratón F2 homocigoto en
\DeltaC_{\kappa} no se detectaron células B positivas en
\kappa, y en el heterocigoto, se produjo una reducción en la
frecuencia de células B positivas en \kappa, consistente con la
presencia de un alelo natural y un alelo \DeltaC_{\kappa} no
funcional. Estos resultados demuestran que la eliminación de
C_{\kappa} del cromosoma previene la expresión de \kappa debida
a células B de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector dirigido se diseñó como un vector de
tipo sustituto inicialmente para eliminar la región constante así
como la región J del locus kappa, y para sustituirlo con tres
elementos mediante recombinación homóloga usando regiones de
homología que flanquean la región constante (Figura 8). En algunos
casos se incluyó un gen de la toxina de difteria (cadena A)
flanqueando una o las dos regiones de homología como marcador
seleccionable negativo. Los tres elementos consistieron en el
marcador de fármaco de resistencia a G418, una secuencia de
homología de ADN (ADH) adicional de ADN de ratón homóloga a una
región del locus kappa localizado por encima de la región J, y un
gen de timidina quinasa. Como resultado de la inclusión de la
secuencia ADH en el vector, este ataque inicial colocó una segunda
copia del ADH en el locus. Esta duplicación fue usada a continuación
para efectuar una eliminación definida de las secuencias entre los
segmentos aplicando una presión selectiva. En este caso la célula
elimina el gen de timidina quinasa que subyace entre los dos
segmentos a fin de sobrevivir a la selección de gancyclovir.
Las regiones de homología fueron derivadas de
una biblioteca genómica de hígado fetal de ratón 129 (Stratagene)
que fue escrutada usando dos sondas, tal como se ha descrito en el
anterior Ejemplo III. Este subclon contenía la región J, un
elemento potenciador intrónico y la región constante del locus de
cadena ligera kappa. La segunda sonda era un fragmento EcoRI de 0,8
kb (Van Ness y col. (1981), Cell 27: 593-602) que
subyace a 2,8 kb por encima de la región J. El ADN de fago
procedente de un clon lambda positivo para esta sonda mostró que la
sonda se hibridaba con un fragmento SacI de 5,5 kb que fue
subclonado en la posición SacI de pBluescript SK- (Stratagene) para
dar lugar al plásmido pSK.5'kappa (Figura 8).
Los vectores de desactivación que contenían una
región 5' de homología, un gen de timidina quinasa, una ADH, un
gene de resistencia a neomicina y una región 3' de homología (Figura
9) flanqueados en algunos casos por genes de toxina de difteria
fueron construidos a partir de tres plásmidos (Figura 8) que
contenían: (a) el fragmento 5' de homología con o sin el gen de
toxina de difteria (DT) conducido por el promotor de gen de
fosfoglicerato quinasa (PGK) de ratón como marcador seleccionable
negativo, (b) el gen de timidina quinasa (tk) de herpes conducido
por el promotor de gen de fosfoglicerato quinasa (PGK) de ratón como
marcador seleccionable negativo junto con el DSH y el gen
seleccionable de neomicina (neo) de G418 de pMC1Neo (Thomas y
Capecchi (1987), Cell 51: 503-12), y (c) el
fragmento 3' de homología con o sin el gen DT conducido por PGK.
Estos tres plásmidos (Figura 8) fueron construidos a partir de
pSK.A, pSK.B y pSK.C, respectivamente, derivaron todos del plásmido
pBluescript SK- mediante modificación del poliligando.
El poliligando del plásmido pBluescript SK fue
modificado mediante clonación entre las posiciones KpnI y SacI un
poliligando sintético definido por los oligonucleótidos
5'-GCATATGCCTGAGGGTAAGCATGCGGTACCGAATTC
TATAAGCTTGCGGCCGCAGCT-3' y 5'-GCGGCCGCAAGCTTATAGAATTCGGTACCGCATGCTTACCTCAGG
CATATGCGTAC-3' para crear el plásmido pSK.A, 5'- GAGCTCGGATCCTATCTCGAGGAATTCTATAAGCTT
CATATGTAGCT-3' y 5'-ACATATGAAGCTTATAGAATTCCTCGAGATAGGATCCHA GCTCGTAC-3' para crear el plásmido pSK.8, 5'-AAGCTTATAGAATTCGGTACC TGGATCCTGAGCTCATAGCGGCCGCAGCT-3' para
crear el plásmido pSK. B y 5'- GCGGCCGCTATGAGCTCAGGATCCAGGTACCGAATTCTATAAGCTTGTAC-3' para crear el plásmido pSK. C.
TATAAGCTTGCGGCCGCAGCT-3' y 5'-GCGGCCGCAAGCTTATAGAATTCGGTACCGCATGCTTACCTCAGG
CATATGCGTAC-3' para crear el plásmido pSK.A, 5'- GAGCTCGGATCCTATCTCGAGGAATTCTATAAGCTT
CATATGTAGCT-3' y 5'-ACATATGAAGCTTATAGAATTCCTCGAGATAGGATCCHA GCTCGTAC-3' para crear el plásmido pSK.8, 5'-AAGCTTATAGAATTCGGTACC TGGATCCTGAGCTCATAGCGGCCGCAGCT-3' para
crear el plásmido pSK. B y 5'- GCGGCCGCTATGAGCTCAGGATCCAGGTACCGAATTCTATAAGCTTGTAC-3' para crear el plásmido pSK. C.
Se creó una casete de gen de toxina de difteria
en la que el gen estaba flanqueado por el promotor PGK y la señal
de poliadenilación de hormona del crecimiento bovino (Woychik y col.
(1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 81:
3944-3948; Pfarr y col. (1986) DNA 5:
115-122). Se clonó un fragmento XbaI/EcoRI de 2,3 kb
de pTH-1 (Maxwell y col. (1986), Cancer Res. 46:
4660-4664) que contenía la cadena A de toxina de
difteria conducida por el promotor de metalotioneína humana (hMTII)
en pBluescript SK- cortado con XbaI y EcoRI para proporcionar el
plásmido pSK.DT. El promotor hMTII de pSK.DT fue sustituido por el
promotor PGK de pKJ1 (Tybulewicz y col. (1991), Cell 65:
1153-1163). Se unió un fragmento XbaI/PstI de 0,5 kb
procedente de pKJ1 a un fragmento XbaI/NcoI de 3,1 kb procedente de
pSK.DT usando un adaptador PstI/NcoI formado a partir de los
nucleótidos 5'-GGGAAGCCGCCGC-3' y
5' CATGGCGGCGGCTTCCCTGCA-3' para proporcionar el
plásmido pSK.pqkDT. Un fragmento de 248 pb que contiene la señal de
poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino, obtenida
mediante amplificación PCR de ADN genómico bovino usando los
oligonucleótidos cebadores
5'-CAGGATCCAGCTGTGCCTTCTAGTTG-3' y
5'-CT
GAGCTCTAGACCCATAGAGCCCACCGCA-3', se clonó en PCR1000 (Invitron Corp., San Diego, CA). La secuencia de poliadenilación fue clonada entonces detrás del gen DT como un fragmento HindIII/PvuII en pSK.pgkDT cortado con HindIII y HpaI para dar lugar al plásmido pSK.pgkDTbovGH. La casete de gen DT de pSK.pgkDTbovGH fue trasladada como un fragmento EcoRI/HindIII de 2,1 kb a pSK.A cortado con EcoRI y NotI usando un adaptador HindIII/NotI formado a partir de los oligonucleótidos 5'-AGCTGGAACCCCTTGC-3' y 5'-GGCCGCAAGGGGTTCC-3' para generar el plásmido pSK.A/DT. Entre las posiciones SphI y Bsu36I del pSK.A y del pSK.A/DT se clonó la región 5' de homología para el locus kappa. Para este propósito se ligó un fragmento SphI/Bsu36I de 4,0 kb, resultante de una digestión parcial con Bsu36I seguida de una digestión completa con SphI de subclon de plásmido pUC218/5.6kappa, con pSK.A o con pSK.A/DT para generar los plásmidos pSK.A/5'K y pSK.A/DT/5'K, respectivamente. En el plásmido, pSK.A/DT/5'K, el extremo 5' del gen DT y el fragmento kappa estaban adyacentes uno al otro dispuestos en orientaciones transcripcionales opuestas.
GAGCTCTAGACCCATAGAGCCCACCGCA-3', se clonó en PCR1000 (Invitron Corp., San Diego, CA). La secuencia de poliadenilación fue clonada entonces detrás del gen DT como un fragmento HindIII/PvuII en pSK.pgkDT cortado con HindIII y HpaI para dar lugar al plásmido pSK.pgkDTbovGH. La casete de gen DT de pSK.pgkDTbovGH fue trasladada como un fragmento EcoRI/HindIII de 2,1 kb a pSK.A cortado con EcoRI y NotI usando un adaptador HindIII/NotI formado a partir de los oligonucleótidos 5'-AGCTGGAACCCCTTGC-3' y 5'-GGCCGCAAGGGGTTCC-3' para generar el plásmido pSK.A/DT. Entre las posiciones SphI y Bsu36I del pSK.A y del pSK.A/DT se clonó la región 5' de homología para el locus kappa. Para este propósito se ligó un fragmento SphI/Bsu36I de 4,0 kb, resultante de una digestión parcial con Bsu36I seguida de una digestión completa con SphI de subclon de plásmido pUC218/5.6kappa, con pSK.A o con pSK.A/DT para generar los plásmidos pSK.A/5'K y pSK.A/DT/5'K, respectivamente. En el plásmido, pSK.A/DT/5'K, el extremo 5' del gen DT y el fragmento kappa estaban adyacentes uno al otro dispuestos en orientaciones transcripcionales opuestas.
El gen PGKtk del plásmido pKJtk (Tybulewicz y
col. (1991), Cell 65: 1153-1163) fue clonado como un
fragmento EcoRI/HindIII de 2,7 kb entre las posiciones únicas EcoRI
e HindIII del pSK.B para generar pSK.B/(TK/0.8K) de tal modo que el
extremo 5' del gen tk y el fragmento kappa estuvieran adyacentes el
uno al otro y dispuestos en orientaciones transcripcionales
opuestas. El gen neo de 1,1 kb de pMC1Neo fue clonado como un
fragmento XhoI/BamHI entre las mismas posiciones de
pSK.B(TK/0.8K) para generar pSK.B/(TK/0.8K/Neo). El plásmido
pSK.C/3'K que contiene el fragmento 3' de homología fue construido
ligando pSK.C digerido con BamHI y tratado con fosfatasa alcalina
al fragmento BgIII/BamHI de 1,1 kb aislado a partir de
pUC218/5.6kappa. En el pSK.C/3'K, el fragmento kappa fue orientado
de tal modo que la transcripción se produjo desde el SacI del
plásmido poliligando en la dirección de la posición KpnI. La casete
DT de 2,1 kb de pSK.pgkDTbovGH fue clonada como un fragmento
EcoRI/HindIII en las mismas posiciones de pSK.C para generar
pSK.C/3'K/DT.
Se llevaron a cabo ligaciones de tres partes
para construir los plásmidos dirigidos finales (Figura 9). El
fragmento NotI/NdeI de 4,0 kb procedente de pSK.A/5'K, el fragmento
NdeI/SacI de 4,8 kb procedente de pSK.B/(TK/0.8K/Neo) (obtenido
mediante una digestión parcial con SacI seguida de una digestión con
NdeI del plásmido), y el fragmento SacI/NotI de 4,0 kb procedente
de pSK.C/3'K, fueron aislados y ligados juntos para crear pK.
(TK/0.8K/Neo). El fragmento NotI/NdeI de 6,1 kb procedente de
pSk.A/DT/5'K, el fragmento NdeI/SacI de 4,8 kb procedente de
pSK.B/(TK/0.8K/Neo), y el fragmento NotI/NdeI de 4,0 kb procedente
de pSK.C/3'K fueron aislados y ligados juntos para crear
pK.DT/(TK/0.8K/Neo). El fragmento NotI/NdeI de 6,1 kb procedente de
pSK.A/DT/5'K, el fragmento NdeI/SacI de 4,8 kb procedente de
pSK.B/(TK/0.8K/Neo), y el fragmento SacI/NotI de 6,1 kb procedente
de pSK.C/3'K/DT (obtenido mediante una digestión SacI parcial
seguida de una digestión NotI del plásmido) fueron aislados y
ligados juntos para crear pK.DT/(TK/0.8K/Neo)/DT. Para la
electroporación, los ADNs de plásmido purificados fueron cortados
en primer lugar con PvuI o con ApaLI, a continuación fueron
extraídos con fenol/cloroformo y precipitados mediante adición de
etanol antes de centrifugación. Las partículas de ADN resultantes
fueron resuspendidas con una concentración de 1 mg/mL en
Tris-HCl 10 mM, EDTA (TE) 1 mM.
La línea de células madre embrionarias
E14-1 fue cultivada tal como se ha descrito en el
anterior Ejemplo III. Las células fueron equilibradas a temperatura
ambiente, y se añadió ADN (20 \mug) linealizado con PvuI (tal
como se ha descrito antes). La mezcla fue sometida a electroporesis
tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo III.
Tras 7-10 días bajo selección de
fármaco con G418, las colonias individuales supervivientes fueron
seleccionadas y disociadas en una gota de tripsina tal como se ha
descrito anteriormente en el Ejemplo III.
Se llevó a cabo un análisis de transferencia
Southern usando ADN genómico digerido de cada muestra. Se detectó
un fragmento de 2,3 kb del locus de células ME nativas, mientras que
se detectó un fragmento mayor de 4,9 kb de un locus de células ME
diana (Figura 11), usando como sonda el fragmento BamHI/BgIII de 1,2
kb aislado del ADN fago original contiguo con el fragmento usado
para la homología 3' del vector dirigido. El fragmento aumentó de
tamaño debido a que la posición BgIII del fragmento BgIII/BamHI se
perdió en el plásmido dirigido debido a la unión de una posición
BgIII a una posición BamHI en la ligación, y a que se introdujo una
nueva posición BgIII localizada en el gen de timidina quinasa en el
locus diana.
De un bazo, mediante el análisis de
transferencia Southern descrito anteriormente, de un total de 103
clones derivados de experimentos que usan tres plásmidos dirigidos
diferentes, se identificaron 5 líneas celulares que portaban la
mutación pretendida (Tabla 1).
Un análisis más profundo del ADN genómico
producido a partir de 4 de los clones positivos (clones 625, 604,
611 y 653) después de ser descongelados y expandidos, reconfirmó las
observaciones iniciales. Usando una segunda sonda, un fragmento
HindIII/BgIII de 1,7 kb que extendía la región J del locus kappa, se
comprobó el correcto modelo de integración para el ataque homólogo
en el extremo 5' del vector dirigido. De este modo, usando dicha
sonda con una digestión EcoRI del ADN genómico, se detectó un
fragmento de 15 kb a partir del alelo no modificado. Por el
contrario, se observó un fragmento de 7,8 kb del alelo diana como
resultado de la introducción de una nueva posición EcoRI en el gen
de timidina quinasa durante la integración homóloga (Figura 11).
A fin de efectuar la eliminación deseada del
locus kappa diana de forma homóloga, se llevaron a placa células
del clon 653 sobre células alimentadoras con una densidad de
0,5-1 x 10^{6} células/plato de 10 cm en presencia
de gancyclovir (2 \muM) y G418 (150 \mug/mL). Después de un
cultivo de 5 días en presencia de ambos fármacos, se seleccionaron
los clones tal como se ha descrito antes en placas de 24 pocillos y
se cultivaron únicamente bajo selección con G418. Después de otros
5-8 días, se congeló el 20% de las células de cada
pocillo y el resto se usó para preparar ADN genómico tal como se ha
descrito previamente.
Se llevó a cabo un análisis de transferencia
Southern usando ADN genómico digerido con BamHI para cada muestra.
Usando como sonda el fragmento EcoRI de 0,8 kb usado como ADH en los
vectores dirigidos, se detectó un fragmento de 12,7 kb procedente
del locus de células ME nativas, a la vez que se detectó un
fragmento mayor, de 15,8 kb, procedente del locus de células ME con
región constante diana (Figura 11) usando ADN del clon 653. El
fragmento aumentó de tamaño debido a la inserción del gen tk, el ADH
y el gen neo en el fragmento BamHI de 12,7 kb. También había una
nueva posición BamHI introducida en el extremo 3' del gen neo.
Usando ADN de las células con región J/constante eliminada, se
detectó un fragmento de 5,5 kb procedente del locus modificado,
además del fragmento de 12,7 kb procedente del alelo no atacado tal
como predecía el análisis del mapa de restricción. A partir de este
escrutinio con análisis de transferencia Southern de 2 clones
producidos a partir de 1,5 x 10^{6} células ME en placa (clon
653), se identificó una línea celular (clon 653B) que portaba la
eliminación pretendida de las regiones J y constante.
Un análisis más profundo del ADN genómico
producido a partir del clon 653B después de ser descongelado y
expandido reconfirmó las observaciones iniciales. Usando el
fragmento EcoRI de 0,8 kb, se comprobó la eliminación con otras dos
digestiones de restricción que deberían cortar por fuera de la
región escindida en los extremos 5' y 3' del vector dirigido. De
este modo, usando dicha sonda con una digestión BgIII del ADN
genómico procedente del clon 653 no escindido, se detectó un
fragmento de 2,6 kb procedente de ambos alelos, el modificado y el
no modificado, a la vez que se observó un fragmento adicional de 4,9
kb procedente únicamente del alelo diana (Figura 11). Este
fragmento de 4,9 kb era el mismo que el detectado con el fragmento
BamHI/BgIII de 1,2 kb usado previamente. Usando ADN del clon 653B,
una digestión BgIII reveló un fragmento de 5,8 kb además del
fragmento de 2,6 kb de ambos alelos, modificado y no modificado, y
un fragmento de 3,1 kb procedente únicamente del alelo diana
(Figura 11). El fragmento de 5,5 kb también fue detectado en ADN del
clon 653B y un fragmento adicional de 2,0 kb. El fragmento BgIII de
5,8 kb y el fragmento ScaI de 2,0 kb fueron consistentes con un
análisis del mapa de restricción predicho para una etapa de escisión
precisa en la que 10,3 kb de ADN fueron eliminadas, incluyendo la
región J, el gen tk y una copia del ADH.
Las células E14-1 no modificadas
contribuyeron a la línea germinal con una elevada frecuencia después
de la inyección en blastocistos C57BL/6J. Las células procedentes
de la línea de células ME 691, en la que sólo se ha eliminado la
región constante kappa mediante recombinación homóloga sin ninguna
selección negativa, fueron microinyectadas y se produjeron animales
quiméricos tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo III. Las
células procedentes de la línea de células ME 653B en la que se han
eliminado ambas regiones, constante y J, también fueron
microinyectadas y se produjeron animales quiméricos tal como se ha
descrito anteriormente. Las crías quiméricas fueron identificadas
mediante el color de la piel. La transmisión de la línea germinal
de las células Me es detectada mediante el color agouti de la piel
de los descendientes F1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aísla un fragmento SpeI, que expande la
región
VH6-D-J-C\mu-C\delta
de cadena pesada humana (Berman y col. (1988), EMBO J. 7:
727-738; véase la Figura 15) de una biblioteca de
YAC humano (Burke y col., Science, 236: 806-812)
usando sondas de ADN descritas por Berman y col. (1988) EMBO J. 7:
727-738. Se obtiene un clon que se estima que es de
aproximadamente 100 kb. El clon de YAC aislado es caracterizado
mediante electroforesis de gel de campo pulsado (Burke y col., ver
anterior; Brownstein y col., Science, 244:
1348-1351), usando sondas radiomarcadas para la
cadena pesada humana (Berman y col., ver anterior).
Se prepara ADN de elevado peso molecular en
pistones de agarosa a partir de células de levadura que contienen
el YAC de interés (es decir, un YAC que contiene el anteriormente
mencionado fragmento SpeI procedente del locus IgH). El ADN se
fracciona en tamaño en un aparato de gel CHEF, y se corta la banda
de YAC del gel de agarosa de bajo punto de fusión. El fragmento de
gel es equilibrado con poliaminas y a continuación se funde y se
trata con agarasa para digerir la agarosa. El ADN recubierto de
poliaminas se inyecta a continuación en pronúcleos masculinos de
embriones de ratón fertilizados que son introducidos quirúrgicamente
en el útero de una hembra pseudopreñada tal como se ha descrito
anteriormente. La naturaleza transgénica de los recién nacidos es
analizada mediante slot-blot y se aísla ADN de las
colas, y la producción de cadena pesada humana se analiza
obteniendo una pequeña cantidad de suero y evaluándola para
determinar la presencia de cadenas de Ig con anticuerpos
anti-humanos de conejo.
Como alternativa a la microinyección, se
transfiere ADN de YAC a células ME murinas mediante fusión célula
ME:protoplasto de levadura (Traver y col. (1989) Proc. Nat. Acad.
Sci., USA, 86: 5898-2902; Pachnis y col., (1990),
Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 87: 5109-5113). En
primer lugar, se inserta el gen de resistencia a neomicina
procedente de pMC1Neo, o HPRT u otro marcador seleccionable de
mamífero, y un marcador seleccionable de levadura en secuencias de
vector de YAC no esenciales en un plásmido. Esta construcción se usa
para transformar una cepa de levadura que contiene el YAC de IgH, y
se integra pMC1Neo (u otro marcador seleccionable) en secuencias de
vector del YAC de IgH mediante recombinación homóloga. A
continuación el YAC modificado es transferido a una célula ME
mediante fusión de protoplastos (Traver y col. (1989); Pachnis y
col., 1990), y las células ME resistentes a G418 resultantes (o que
exhiben otro fenotipo seleccionable), que contienen las secuencias
de IgH humana intacta, son usadas para generar ratones quiméricos.
Alternativamente, se transfecta un YAC purificado, por ejemplo
mediante lipofección o transferencia de ADN mediada por fosfato
cálcico, en células ME.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron cebadores de PCR para el gen VH6
humano (V6A = 5' GCA GAG CCT GCT GAA TTC TGG CTG 3' y V6B = 5' GTA
ATA CAC AGC CGT GTC CTG G 3') para escrutar conjuntos de ADN
procedentes de la biblioteca de YAC humano de la Universidad de
Washington (Washington University, St. Louis, MO). Los conjuntos
positivos fueron escrutados posteriormente mediante hibridación de
colonia y se identificó un pocillo de placa de microtitulación
positivo, A287-C10. Se aislaron dos YACs que
contienen VH6 de dos tamaños diferentes (205 kb y 215 kb) a partir
del pocillo de microtitulación. Además del VH6, el más pequeño de
los dos YACs de IgH, A287-C10 (205 kb), se hibridó
a sondas para las siguientes secuencias: delta, mu, JH, D, VH1, VH2
y VH4. El mayor de los dos YACs de IgH, A287-C10
(215 kb), se hibridó a las siguientes sondas: delta, JH, D, VH1, VH2
y VH4, pero no a mu. Los YACs contenían secuencias de al menos 5
genes VH incluyendo dos genes VH1, uno VH2, uno VH4 y uno VH6. El
análisis de la digestión de restricción indicó que el YAC de 205 kb
contiene una eliminación (de aproximadamente 20 kb de tamaño) que
elimina parte, aunque no todo el racimo de gen D, apareciendo el
resto del YAC intacto y en una configuración de línea germinal. El
análisis de PCR y de digestión de restricción detallada del YAC de
205 kb demostró la presencia de varios miembros diferentes de la
familia de genes D. El YAC de 215 kb parecía contener el principal
racimo de gen D completo pero tenía una eliminación (de
aproximadamente 10 kb) que eliminaba el gen mu. Esta eliminación no
parece afectar al racimo JH o al potenciador localizado entre los
genes JH y mu.
El progenitor putativo de los dos anteriores
YACs de IgH relacionados, un YAC de aproximadamente
225-230 kb que contiene la región genómica completa
entre el gen VH2 y el gen delta (Shin y col., 1991, ver anterior)
(véase la Figura 15), no había sido identificado en el pocillo de
microtitulación A287-C10. Por tanto, se examinó una
alícuota anterior de la placa de microtitulación de
A287-C10 con el fin de buscar el YAC progenitor
asumiendo que se había perdido durante el pasaje de la biblioteca.
El pocillo de microtitulación A287-C10 fue pasado
rápidamente (Washington University, St. Louis, MO), y 2 de 10 clones
analizados contenían un YAC de IgH de 230 kb con otro YAC
aparentemente no relacionado. El clon 1 contenía además el YAC de
IgH, un YAC de aproximadamente 220 kb, y el clon 3 contenía además
un YAC de aproximadamente 400 kb. El YAC de IgH contenía mu, el
perfil D completo (basado en una digestión BamHI, véase más
adelante) y JH. El YAC de IgH del clon 1 fue separado físicamente
del YAC no relacionado mediante segregación meiótica en un cruce
entre A287-C10/AB1380 y YPH857 (genotipo = MATa
ade2 lys2 ura3 trp1 HIS5 CAN1 his3 leu2 cyh2, para generar
A287-C10 (230 kb)/MP 313 (genotipo anfitrión =
MAT\alpha ade2 leu2 lys2 his3 ura3 trp1 can1 cyh2).
Se generó un vector dirigido a brazo derecho de
YAC denominado pLUTO (15,6 kb) mediante subclonación de un minigen
de HPRT humano contenido en un fragmento BamHI de 6,1 kb (Reid y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4299-4303
(1990)) en la posición BamHI del poliligando de pLUS (Hermanson y
col., Nucleic Acids Research 19: 4943-4938 (1991)).
Un cultivo de A287-C10/AB1380 que contiene el YAC de
IgH de 230 kb y un YAC no relacionado fue transformado con pLUTO
linealizado y se seleccionaron transformantes Lys+. Los clones Lys+
fueron escrutados mediante hibridación de colonia para determinar
la presencia de mu. Se identificó un clon que contenía un único YAC
de aproximadamente 245 kb que se hibridó a sondas para mu, HPRT y
LYS2.
El análisis de transferencia Southern del YAC
A287-C10 de 230 kb atacado con pLUTO se llevó a cabo
usando una variedad de sondas para demostrar la naturaleza intacta
y no redispuesta de las secuencias de IgH humana clonadas. En la
mayoría de los casos, los resultados de las digestiones BamHI,
HindIII y EcoRI fueron comparados con los datos de restricción para
WI38 (una línea de células derivada de pulmón fetal embriónico
humano), con los derivados de eliminación de 205 kb y 215 kb de
A287-C10, y con valores aún no publicados. El perfil
génico de diversidad (D) determinado mediante hibridación con una
sonda de región D (fragmento 0.45 NcoI/PstI; Berman y col., 1988)
demostró los cuatro segmentos de gen D esperados
(D1-D4 (Siebenlist y col., 1981; Nature 294:
631-635). Por ejemplo, con BamHI, se observaron
cuatro fragmentos de restricción, de 3,8 kb, 4,5 kb, 6,9 kb y 7,8
kb, en A287-C10 y WI38. WI38 tenía una banda
adicional más grande, que supuestamente procede de la región D5 del
cromosoma 16 (Matsuda y col., 1988, EMBO J. 7:
1047-1051). Los análisis de PCR y de transferencia
Southern con cebadores y sondas específicos de familia D demostraron
en el YAC derivado de eliminación de 215 kb (que parecía tener una
región D intacta con la misma estructura de restricción que el YAC
de 230 kb) la presencia de 2 a 4 miembros de cada una de las
siguientes familias de genes D: DM, DN, DK, DA, DXP y DLR. El
potenciador intrónico J-mu, que se secuenció de los
productos PCR clonados procedentes del YAC de 230 kb
A287-C10 (cebadores EnA = 5' TTC CGG CCC CGA TGC GGG
ACT GC 3' y EnB1 = 5' CCT CTC CCT AAG ACT 3') y se determinó que
estaban intactos, también generó fragmentos de restricción sencillos
con aproximadamente los tamaños predichos con BamHI, EcoRI y
HindIII cuando se sondaron con el producto PCR de 480 pb. La región
JH se evaluó con una sonda fragmento BamHI/HindIII de
aproximadamente 6 kb que extiende el DHQ52 y la región JH completa
(Ravetch y col., 1981, Cell 27: 583-591). El
A287-C10 generó fragmentos de restricción de
aproximadamente los tamaños esperados. Además, se detectaron
fragmentos de restricción del mismo tamaño con el potenciador y las
sondas JH (Ravetch y col., ver anterior; Shin y col., 1991, ver
anterior). El fragmento JH BamHI de aproximadamente 18 kb detectado
en A287-C10 y WI38 también se hibridó con una
secuencia sonda de mu de 0,9 kb (Ravetch y col., ver anterior). La
hibridación con la sonda de mu de fragmento EcoRI de 0,9 kb (Ravetch
y col., ver anterior) mostró fragmentos de restricción de
aproximadamente los tamaños esperados (Ravetch y col., ver anterior;
Shin y col., ver anterior): BamHI de > 12 kb (esperado
aproximadamente 17 kb); EcoRI de 0,9 kb (esperado aproximadamente
0,9 kb) y HindIII de aproximadamente 12 kb (esperado aproximadamente
11 kb). El WI38 generó el mismo tamaño de fragmento BamHI que el
A287-C10. Las regiones JH y DHQ52 fueron
secuenciadas a partir de los YACs derivados de eliminación, y ambas
estaban en configuración de línea germinal. Se analizó el delta con
un producto PCR de exón 1 (que contenía la región de
aproximadamente 160 pb entre los cebadores D1B = 5' CAA AGG ATA ACA
GCC CTG 3' y D1D = 5' AGC TGG CTG CTT GTC ATG 3'); los fragmentos
de restricción correspondientes a A287-C10 estaban
próximos a los esperados por bibliografía (Shin y col., ver
anterior) y a los determinados para el WI38. La posición 3' de
clonación del YAC puede ser la primera posición EcoRI 3' de delta
(Shin y col., ver anterior) u otra posición EcoRI más allá de 3'.
Las sondas de gen VH para VH1, VH4 y VH6 (Berman y col., ver
anterior), y para VH2 (Takahashi y col., 1984, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 81: 5194-5198) se usaron para evaluar el
contenido variable de gen del YAC. El A287-C10
contiene dos genes VH1 que se aproximan a los tamaños esperados
(Shin y col., ver anterior; Matsuda y col., 1993, ver anterior); el
análisis de restricción con las tres enzimas estuvo cerca de los
tamaños de fragmento esperados; por ejemplo, para las bandas
observadas de EcoRI son 3,4 y 7,8 kb (esperado 3,4 y 7,2 kb). En
A287-C10 estaban presentes los fragmentos EcoRI de
tamaño predicho para VH4 (5,3 kb observado, 5,1 kb esperado) y para
VH6 (0,8 kb esperado, 0,9 kb esperado) (Shin y col., ver anterior;
Matsuda y col., ver anterior). El fragmento EcoRI de tamaño esperado
fue observado para VH2 (5,5 kb observado, 5,4 kb esperado), pero
los fragmentos BamHI y HindIII eran diferentes a los predichos. La
hibridación coincidente de los fragmentos BamHI y HindIII con una
sonda pBR322 sugirió que la posición EcoRI que se encuentra en el
extremo 5' del gen VH2 (Shin y col., ver anterior) es la posición de
clonación 5', eliminando de este modo la posición HindIII 5' y las
posiciones BamHI naturales. El tamaño global del injerto de YAC
(estimado en aproximadamente 220 kb) se ajusta bien con el tamaño
predicho para un segmento no redispuesto intacto que comienza en el
extremo 5' del gen VH2 de mayoría 3' y que se extiende hasta una
posición 3' EcoRI del locus delta (Shin y col., ver anterior).
Se identificaron dos YACs en un escrutinio de
conjuntos de gel de campo pulsado (PFG) procedente de la biblioteca
de YAC humano de la Universidad de Washington (St. Louis, MO) con
una sonda del gen de región constante kappa (CK) humana (fragmento
EcoRI de 2,5 kb con Nº ATCC 59173, Parklawn Dr, Rockville, MD). Los
YACs, designados A80-C7 (170 kb) y
A276-F2 (320 kb), contienen el elemento kde de
eliminación kappa, CK, JK y el potenciador intrónico
C-J y se extienden 3' más allá de kde. Extendiéndose
5' desde JK, los YACs también contienen los genes B1, B2 y B3 VK
determinados mediante hibridación y/o PCR, y posiblemente otras
secuencias VK. La cepa A80-C7/AB1380 incluía,
además del YAC de IgK, un YAC no relacionado de tamaño similar. Por
tanto, se usó segregación meiótica para separar dichos YACs; se
cruzó A80-C7 con YPH857 y se obtuvo un producto
meiótico que contenía únicamente el YAC de IgK
(MP8-2; genotipo de anfitrión = \alpha ade2 leu2
his3 his5 lys2 ura3 trp1 can1 cyh2). Los YACs
A80-C7 y A276-F2 han sido tratados
con pLUTO para incorporar el minigen HPRT humano en el brazo vector
derecho del YAC.
El análisis de restricción de los YACs de IgK
A80-C7 y A276-F2 usando una serie de
enzimas apoya la conclusión de que ambos YACs no han sido
reorganizados (es decir, están en configuración de línea germinal).
Por ejemplo, la digestión BamHI seguida de hibridación con la sonda
CK demuestra el fragmento de restricción de 13 kb esperado (Klobeck
y col., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 370:
1007-1012 (1989)). La banda del mismo tamaño se
hibrida con una sonda JK (un producto de 1,2 kb de PCR usando un
conjunto de cebadores para ampliar la región JK1-5),
tal como predice el mapa genómico (Klobeck y col., ver anterior).
El gen IV de clase B3 (la sonda es un producto de PCR de 123 pb
procedente del gen B3) proporciona un fragmento BamHI de 4,9 kb y un
fragmento BgIII de 2,2 kb, cercanos a los valores publicados de 4,6
kb y 2,3 kb, respectivamente (Lorenz y col., Molec. Immunol. 25:
479-484 (1988)). El análisis PCR de ambos YACs de
IgK, así como de ADN genómico, para las siguientes secuencias de
locus kappa reveló los tamaños de banda predichos: Kde (120 pb), CK
(304 pb), potenciador intrónico C-J (455 pb),
JK1-5 (1204 pb), B3 VK (123 pb) y pseudogen B1 VK
(214 pb). Las secuencias usadas para diseñar cebadores PCR para las
regiones de potenciador CK, JK y C-J proceden de
Whitehurst y col., Nucl. Acids. Res. 20: 4929-4930
(1992); Kde procede de Klobeck y Zachau, Nucl. Acids. Res. 14:
4591-4603 (1986); B3 procede de Klobeck y col.,
Nucl. Acids. Res. 13: 6515-6529 (1985); y B1 de
Lorenz y col., ver anterior.
El yHPRT de 680 kb es un YAC que contiene una
copia funcional del gen de hipoxantina fosforibosiltransferasa
humana (HPRT) clonado de una biblioteca de YAC, tal como se describe
en Huxley y col. (1991), Genomics 9: 742-750. La
cepa de levadura que contiene el yHPRT se cultivó en medio líquido
deficiente en uracilo y triptófano, tal como se describe en Huxley y
col. (1991), ver anterior.
Para preparar los esferoplastos de levadura, se
giró un cultivo de 400 mL de levadura que contenía yHPRT y la
partícula de levadura se lavó una vez en agua y una vez con sorbitol
1 M. La partícula de levadura se resuspendió en SPEM (sorbitol 1 M,
fosfato sódico 10 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, pH 8,0,
\beta-mercaptoetanol 30 mM) en una concentración
de 5 x 10^{8} células de levadura/mL. Se añadió Zymolase 20T en
una concentración de 150 \mug/mL de células de levadura, y se
incubó el cultivo a 300ºC hasta que el 90% de las células eran
esferoplastos (habitualmente durante 15-20
minutos). Las células fueron lavadas dos veces en STC (sorbitol 1 M,
Tris 10 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 10 mM) y resuspendidas en STC a una
concentración de 2,5 x 10^{8}/mL.
La línea de células ME negativas en HPRT,
E14TG2a, fue cultivada tal como se ha descrito previamente.
Células ME E14TG2a en crecimiento exponencial
cultivadas en platos recubiertos de gelatina fueron tripsinizadas y
lavadas tres veces con DMEM libre de suero. Se recubrió con cuidado
una partícula de 2,5 x 10^{8} esferoplastos de levadura con 5 x
10^{6} células ME que fueron giradas sobre la partícula de
levadura. La partícula combinada fue resuspendida en 0,5 mL de
polietilenglicol (PEG) 1500 al 50% o en PEG 4000 al 50% (Boeringer
Mannheim) que contiene CaCl_{2} 10 mM. Después de 1,5 minutos de
incubación a temperatura ambiente o a 37ºC, se añadieron lentamente
5 mL de DMEM libre de suero, y se dejó las células a temperatura
ambiente durante 30 minutos. A continuación, las células fueron
paletizadas y resuspendidas en 10 mL de medio completo de células ME
(tal como se ha descrito previamente) y se llevaron a una placa de
100 mm recubierta con células alimentadoras. Después de 24 horas el
medio fue sustituido con medio fresco. Cuarenta y ocho horas después
de la fusión, se impuso selección HAT (medio ME que contiene
hipoxantina 1 x 10^{-4} M, aminopterina 4 x 10^{-7} M, timidina
1,6 x 10^{-5} M). Se observaron colonias ME resistentes a HAT a
los 7-10 días después de la fusión en las placas
procedentes de las diferentes condiciones de fusión usadas. Se
seleccionaron las colonias yHPRT-ME ("ESY") y
se llevaron a pocillos recubiertos con alimentador, y se expandieron
para un análisis más profundo.
El ADN extraído de 23 colonias de fusión
yHPRT-ME se digirió con HindIII y fue sometido a
análisis de transferencia Southern (Figura 12) usando las
siguientes sondas: una secuencia Alu repetitiva humana (A);
secuencias específicas de pBR322 para los brazos vectores de YAC
derecho (B) e izquierdo (C); secuencia repetitiva Ty de levadura
(D); gen de copia sencilla de levadura LYS2 (E). La sonda HPRT
humana, un cADN de 1,6 kb de longitud completa (Jolly y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80: 477-481 (1983)) se usó para
confirmar la presencia del gen HPRT humano en los clones ESY. La
sonda Alu fue un fragmento BamHI de 300 pb procedente del elemento
BLUR8 Alu en pBP63A (Pavan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:
1300-1304 (1990)). Las sondas de brazo vector
derecho e izquierdo fueron fragmentos BamHI-PuvII
de 1,7 y de 2,7 kb, respectivamente, derivados de pBR322, que
corresponden a las secuencias de vector de pYAC4 (esquema a, b
(Burke y col., en: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,
Methods in Enzymology, Guthrie y Fink, eds., Academic Press, 194:
251-270 (1991)). El fragmento de 4,5 kb, detectado
mediante la sonda de brazo derecho, expande la región entre la
posición HindIII en el telómero del extremo 5' y la primera
posición HindIII del injerto humano (esquema a). Los fragmentos de 3
kb y de 4,1 kb detectados mediante la sonda del extremo izquierdo
corresponden a la región entre la posición HindIII en el extremo
del telómero y la posición HindIII 5' de las secuencias de levadura,
y la región que extiende desde la posición HindIII 3' del
centrómero del injerto humano, respectivamente (esquema b). La
diferencia en la intensidad de hibridación de estas dos bandas está
relacionada con la diferencia en la cantidad de homología entre
dichos fragmentos y la sonda. La sonda repetitiva Ty de levadura
(Philippsen y col., en Gene Expression in Yeast, Proceedings of the
Alko Yeast Symposium, Helsinki, Korhola y Vaisanen, eds., Foundation
for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, 1:
189-200 (1983)) era un fragmento XhoI de 5,6 kb
aislado de pJEF742 que contiene Tyl, que también podría detectar el
fragmento HindIII 3' de Ty2, debido a la homología entre los dos
elementos. La sonda génica LYS2 era un fragmento BamHI de 1,7 kb
procedente de pLUS (Hermanson y col., Nuc. Acids. Res. 19:
4943-4948 (1991)).
La hibridación con una sonda HPRT humana (sonda
de cADN de 1,6 kb de longitud completa) demostró que todos los
clones analizados contenían los mismos fragmentos de 15,7 y 5 kb que
contienen exón del gen HPRT humano que el YAC yHPRT. El resondado
de las mismas manchas con una sonda de secuencia Alu repetitiva
humana de 300 pb indicó que todos los clones analizados contenían
casi todos, si no todos, los fragmentos que contienen Alu presentes
en yHPRT (Figura 12A). Estos datos indican que en la mayoría de los
clones analizados el injerto humano de 680 kb no había sido
redispuesto o eliminado de forma detectable después de la
integración en el genoma de la célula ME. La integración de
secuencias vector de YAC se examinó usando sondas específicas para
los brazos del vector. La rehibridación de las mismas manchas con
una sonda para el brazo vector derecho de YAC, que detecta un
fragmento HindIII de 4,5 kb, indicó que en 10 de cada 23 clones
analizados, todavía estaba intacto y no redispuesto desde el brazo
derecho de YAC hasta el telómero, y ligado al injerto humano (Figura
12B), proporcionando de este modo una evidencia adicional de la
integridad del YAC en estos clones. La sonda de brazo izquierdo
detectó los fragmentos HindIII de yHPRT de 3 kb y de 4,1 kb en 18 de
cada 20 clones analizados (Figura 12C), lo que indica una elevada
frecuencia de retención de brazo izquierdo.
La integridad estructural de yHPRT en clones ESY
se evaluó con más detalle con dos clones (ESY 5-2 y
8-7) usando un análisis de restricción de gel de
campo pulsado. En levadura que porta yHPRT, se definieron cinco
fragmentos Sfi con los siguientes tamaños aproximados empleando
diferentes sondas: 315 kb (Alu, brazo izquierdo), 145 kb (Alu,
brazo derecho), 70 y 50 kb (únicamente Alu). En ambos clones ME, los
fragmentos específicos de HPRT y de Alu eran de tamaño similar a
los fragmentos yHPRT. Los fragmentos de extremo detectados para
ambos clones fueron de mayor tamaño que los de yHPRT, como era de
esperar para YACs integrados en un cromosoma de ratón: 185 y 200 kb
para el fragmento de extremo derecho, respectivamente, y más de 800
kb para el fragmento de extremo izquierdo para ambos clones. Estos
datos, junto con el perfil Alu, proporcionan una evidencia adicional
de la retención de la integridad estructural del YAC en estos
clones. Estos estudios fueron complementados mediante hibridación
de fluorescencia in situ llevada a cabo con extensiones
cromosomales de metafase de ESY 8-7 (Figura 13 A,
B) y ESY 8-6, en los que se detectó una única
posición de integración para las secuencias humanas.
Fotomicrografías de extensiones de metafase representativas (Figura
13 A, B, C) o de núcleos de interfase (Figura 13 D) de células ESY
8-7 (Figura 13 A, B) hibridadas con secuencias
genómicas humanas biotiniladas y con células ESY
8-6 (Figura 13 C, D) hibridadas con secuencias de
ADN repetidas de levadura biotinilada. La sonda human se generó a
partir de ADN placental genómico humano (Clontech, Palo Alto, CA).
La sonda de levadura consistió en una mezcla de fragmentos de ADN
que codifican los elementos repetidos de levadura; delta (un
fragmento Sau3A de 1,08 kb de pdelta6 (Gafner y col., EMBO J. 2:
583-591 (1983)) y Ty (un fragmento
EcoRI-SaII de 1,35 kb de p29 (Hermanson y col.,
Nuc. Acids. Res. 19: 4943-4948 (1991)), los radas
(un fragmento EcoRI-SaII de 1,35 kb y otro
BgIII-B L92 de 4,4 kb (Keil y Roeder, Cell 39:
377-386 (1984)), y los elementos de telómero Y'
(fragmentos BgIII-HindIII de 2,0 y 1,5 kb de p198
(Chan y Tye, Cell 33: 563-573 (1983)). La
hibridación de secuencias en extensiones de metafase de cromosoma
con sondas biotiniladas y la detección mediante
Avidin-FITC seguida de amplificación de
biotin-anti-Avidin y
Avidin-FITC se llevó a cabo tal como se ha descrito
en Trask y Pinkel, Methods Cell Biol. 30: 383-400
(1990), usando un microscopio Zeiss Axiophot. Los cromosomas fueron
contrateñidos con yoduro de propicio. Las fotomicrografías mostradas
son representativas de un 95% de las extensiones de metafase o de
núcleos de interfase escaneados en tres experimentos independientes
llevados a cabo con las sondas humanas o de levadura. Se detectó
una única posición de integración para las secuencias humanas.
También se probaron las mismas manchas con la
secuencia de elemento repetitivo Ty de levadura para detectar la
presencia de secuencias de ADN genómicas de levadura en los clones
ESY (Figura 12 D). Aunque se observó que algunos de los clones
contenían la mayoría de los fragmentos que contienen Ty presentes en
la cepa de levadura parental, se descubrió que algunos de los
clones tenían una fracción muy pequeña, o nada, de los fragmentos
que contienen Ty. Estos resultados indican que en algunos clones ME,
aunque el ADN de YAC se ha integrado intacto, poco o ningún ADN
genómico de levadura se ha integrado. Para determinar si el ADN
cromosomal de levadura estaba integrado en una única posición o en
múltiples posiciones dentro del genoma de la célula ME, se llevó a
cabo una hibridación fluorescente in situ con el clon ESY
8-6 que tenía un perfil de Ty completo. Se detectó
un único sitio de integración usando una sonda repetitiva de
levadura combinada (Figura 13 C, D), lo que indica que dentro de
los límites de resolución, todos los fragmentos de ADN se integraron
en un bloque.
Usando la capacidad de las células ME para verse
sometidas a una diferenciación in vitro ordenada, se
investigó la estabilidad del YAC y el efecto del ADN integrado
sobre la pluripotencia de las células ME. Cuatro clones ME, que
contenían diferentes cantidades de ADN de levadura (ESY
5-2, 3-6, 8-6 y
8-7) exhibieron un modelo de diferenciación
indistinguible del de las células ME no fusionadas: formación de
cuerpos embriodes que dan lugar a una variedad de tipos celulares
diferenciados (Figura 14 A). Se llevó a cabo un análisis de
transferencia Southern sobre el ADN extraído de los clones ESY no
diferenciados 5-2, 3-6,
8-5 y 8-6 (20 \mug) e yHRPT en
AB1380 (40 ng) usando (a) una sonda Alu humana; (b) secuencias Ty de
levadura. Los clones ME fueron inducidos a formar cuerpos embriodes
cultivándolos como agregados en suspensión durante
10-14 días tal como se describe en Martin y Evans,
Cell 6: 467-474 (1975). Después de su reacoplamiento
al sustrato de cultivo de tejido, los cuerpos embriodes derivados
de ESY dieron lugar a tipos celulares diferenciados. Las secuencias
de YAC y de ADN de levadura fueron retenidas de forma estable
mediante los clones ME diferenciados durante 40 días de cultivo en
medio no selectivo, lo que demuestra que el ADN extraño integrado
establemente no afectó negativamente a la pluripotencia de células
ME (Figura 14 B). Los cultivos diferenciados mantuvieron un gen HRPT
humano funcional, tal como evidencia su crecimiento y
diferenciación normales cuando son transferidos a medio selectivo de
HAT.
La capacidad de las células ESY para repoblar
ratones, incluyendo la línea germinal, quedó demostrada mediante la
microinyección de células ME en blastocistos de ratones y la
generación de ratones quiméricos. Las células ESY fueron
microinyectadas en blastocistos de ratón C57BL/6J, y se generaron
ratones quiméricos tal como se ha descrito previamente. Los machos
quiméricos fueron apareados con hembras C57BL/6J y se determinó la
transmisión de la línea germinal a través de la presencia de
retoños agouti. El ADN genómico preparado a partir de las colas de
los ratones quiméricos fue analizado para determinar la presencia
del ADN de yHPRT en el genoma de ratón mediante análisis PCR. Se
analizó la presencia del brazo izquierdo de YAC usando los dos
oligonucleótidos de cebado, 5' TTCTCGGAGCACTGTCCGACC y 5'
CTTGCGCCTTAAACCAACTTGGTACCG, que fueron derivados, respectivamente,
de las secuencias de pBR322 y del gen SUP4 del brazo vector
izquierdo de YAC. Se obtuvo un producto de PCR de 259 pb del
análisis de la levadura que contiene las líneas celular yHPRT y ESY.
El análisis de PCR de ADN de cola preparado a partir de 18 ratones
quiméricos generados a partir de las líneas celulares ESY
ESY-3, ESY-6 y
ESY-2, dio lugar al producto de PCR esperado,
indicando de este modo la presencia del brazo vector izquierdo de
YAC en el genoma de los ratones quiméricos.
Se prepararon machos quiméricos, con un
30-60% de quimerismo en el color de la piel,
derivados de las líneas celulares ESY ESY3-1 y
ESY5-2, para apareamiento a fin de evaluar la
transmisión de la línea germinal, es decir, determinar si la
modificación genética era transferida a través de las células
germinales (esperma u oocitos) a la progenie de los animales. Tres
de los machos quiméricos derivados de ESY3-1,
394/95-1, 394/95-2 y
411-1 transmitieron el genoma de célula ME a sus
descendientes con una frecuencia de 20%, 30% y 30%, respectivamente.
El análisis de transferencia Southern de ADN de cola de las crías
agouti indicó la presencia del yHPRT en el genoma de tres ratones,
4-2, 4-3 y 5-1,
derivados de la quimera 394/395-2. El perfil Alu
obtenido de dicho análisis era indistinguible del de la línea de
células ES3-1 parental (Figura 14 C), lo que
demuestra que el injerto humano de 680 kb se había transmitido
fielmente a través de la línea germinal del ratón.
Usando un ensayo PCR específico para HPRT humano
sobre cADNs derivados de mARN procedente de un descendiente que
contiene yHPRT, se detectó la expresión del gen HPRT humano en todos
los tejidos evaluados (Figura 15 A y B), demostrando de este modo
que el YAC transmitido retiene su función con fidelidad. En este
experimento, se detectó mARN de HPRT humano mediante transcripción
inversa (RT)-PCR en células ME, ESY
3-1 y Hut 78 (humana), en bazo e hígado de un ratón
de control (C) o en el descendiente agouti 4-3
(derivado de la quimera 394/95-2), y en una muestra
que no contenía ningún ADN de molde (indicado como "-" en la
Figura 15 A). Se llevó a cabo la transcripción inversa de poli (A+)
ARN y la amplificación PCR de secuencias de cADN específicas usando
el cDNA Cycle Kit (Invitrogen). La amplificación específica de un
fragmento de 626 pb procedente de cADN de HPRT humano en presencia
de cADN de HPRT murino se llevó a cabo como se ha descrito en Huxley
y col., ver anterior. La integridad de todas las muestras de ARN se
demostró mediante amplificación PCR de cADNs correspondientes al
receptor \gamma-interferón de ratón. Los cebadores
usados para amplificar un fragmento de 359 pb fueron:
GTATGTGGAG
CATAACCGGAG y CAGGTTTTGTCTCTAACGTGG. Los cebadores de HPRT humano y de receptor \gamma-interferón se diseñaron para eliminar la posibilidad de obtener productos PCR procedentes de contaminación de ADN genómico. Los productos PCR fueron analizados mediante electroforesis y visualizados con bromuro de etidio. Los marcadores de tamaño son escaleras de 1 kb (BRL). Los resultados de la detección de mARN de receptor \gamma-interferón de ratón mediante RT-PCR en las muestras descritas anteriormente se muestran en la Figura 15B. También se detectó el mARN de HPRT humano específico en los otros tejidos evaluados (cerebro, riñón y corazón) derivados del ratón 4-3. Se detectaron niveles comparables de estado estacionario de mARN de HPRT humano y de ratón en el hígado de progenie que contiene yHPRT. Estos resultados indican que la captación de hasta 13 megabases de ADN genómico de levadura no fue perjudicial para un correcto desarrollo, para la transmisión de la línea germinal o para la expresión génica.
CATAACCGGAG y CAGGTTTTGTCTCTAACGTGG. Los cebadores de HPRT humano y de receptor \gamma-interferón se diseñaron para eliminar la posibilidad de obtener productos PCR procedentes de contaminación de ADN genómico. Los productos PCR fueron analizados mediante electroforesis y visualizados con bromuro de etidio. Los marcadores de tamaño son escaleras de 1 kb (BRL). Los resultados de la detección de mARN de receptor \gamma-interferón de ratón mediante RT-PCR en las muestras descritas anteriormente se muestran en la Figura 15B. También se detectó el mARN de HPRT humano específico en los otros tejidos evaluados (cerebro, riñón y corazón) derivados del ratón 4-3. Se detectaron niveles comparables de estado estacionario de mARN de HPRT humano y de ratón en el hígado de progenie que contiene yHPRT. Estos resultados indican que la captación de hasta 13 megabases de ADN genómico de levadura no fue perjudicial para un correcto desarrollo, para la transmisión de la línea germinal o para la expresión génica.
Los anteriores resultados demuestran que los
esferoplastos de levadura son un vehículo eficaz para la entrega de
una copia sencilla de fragmento de ADN de elevado peso molecular en
células ME, y que dichas moléculas son transmitidas de forma
estable y funcional a través de la línea germinal. Los perfiles Alu,
complementados con análisis PFGE e hibridación in situ para
algunos de los clones ME, indican firmemente que la mayoría de los
clones contenía virtualmente todo el injerto humano de un modo
redispuesto (es decir, en "configuración de línea germinal"),
con una elevada frecuencia de clones (40%) que retienen ambos brazos
YAC. La captación significativa de ADN genómico de levadura no fue
perjudicial para la diferenciación apropiada de células ME in
vitro e in vivo, y no previno la transmisión de línea
germinal o la expresión génica mediante dichos métodos, se pueden
transmitir grandes fragmentos de ADN genómico como injertos en
genomas de animales no humanos, en donde los injertos pueden
transmitirse intactos mediante transmisión de la línea germinal. Por
tanto, se puede introducir una amplia variedad de ADN xenogénico en
anfitriones no humanos tales como mamíferos, particularmente
animales pequeños de laboratorio, que puede conferir nuevos
fenotipos o nuevos genotipos. Por ejemplo, se puede proporcionar a
animales pequeños de laboratorio genes de un mamífero, tal como un
humano, para estudiar la etiología de una enfermedad, la respuesta
a genes humanos de una amplia variedad de agentes. Alternativamente,
se pueden introducir grandes locus en un anfitrión mamífero para
producir productos de otras especies, por ejemplo humanos, para
proporcionar secuencias proteicas humanas de proteínas tales como
inmunoglobulinas, receptores de células T, antígenos de complejo
principal de histocompatibilidad, etc.
Levadura que contenía la cadena pesada humana de
YAC A287-C10 tratada con pLUTO
(yA287-C10) fue esferoplastada y fusionada con la
línea de células ME deficiente en HPRT E14.1TG3B1, tal como se ha
descrito antes. Se seleccionaron diez clones ME (ESY) resistentes a
HAT (2B, 2C, 2D, 3A, 3B, 5C, 1125A, 1125E, 100/1500 y 100/4000) y se
expandieron para análisis de ADN. La evaluación del YAC integrado
se llevó a cabo mediante análisis de transferencia Southern de ADN
digerido con HindIII procedente de dichos clones, usando sondas de
cadena pesada humana para las regiones D, J_{H}, \mu y VH2,
descritas anteriormente. Se descubrió que todos los clones contienen
los fragmentos esperados > 10 kb J_{H} y \mu. Se determinó
que todos los clones ESY, excepto los clones 2D y 5C, contenían el
fragmento VH2 kb de 4,8 kb. Se descubrió que todos los clones ESY,
excepto el 2D y el 3B, contenían los fragmentos de gen D esperados
de 10 y 7,6 kb. Se detectaron secuencias genómicas de levadura
mediante hibridación con el elemento Ty repetitivo de levadura en
todos los clones ESY, excepto en 2B, 2D, 100/1500 y 5C. Los clones
ESY 2B, 3A y 5C fueron microinyectados en blastocistos C57B/6 tal
como se ha descrito anteriormente, y se generaron ratones
quiméricos (10 del clon 2B, 1 del clon 3A y 1 del clon 5C). El
análisis de transferencia Southern de ADN de cola de 10 de dichos
animales quiméricos indicó la presencia de la mayoría, si no todos,
de los 10 fragmentos Alu aparentes, detectados en
yA287-C10 en levadura, así como la presencia de
fragmentos de gen D y VH_{2}. Los ratones quiméricos generados
fueron cruzados con ratones C57BL/6J para evaluar la transmisión de
la línea germinal. Un macho quimérico 78K-3 derivado
del clon 2B transmitió el genoma de célula ME a su descendencia con
una frecuencia del 100%. El análisis de transferencia Southern de
ADN de cola de 4 de 6 crías de ratón agouti indicó la presencia de
secuencias de cadena pesada humanas.
Los experimentos de fusión con levadura que
contiene la cadena kappa humana de YAC A80-C7
tratada con pLUTO (yA80-C7) con células ME
E14.1TG3B1 generó 2 clones ESY resistentes a HAT: M4.4.1 y M5.2.1.
El análisis de transferencia Southern de ADNs digeridos con HindIII
procedentes de dichos clones reveló la presencia de todos los 10
fragmentos Alu aparentes detectados en yA80-C7 en
levadura. En ambos clones, las secuencias genómicas de levadura
estaban integradas. Los clones ESY fueron microinyectados en
blastocistos de C57B1/6J y se generaron ratones quiméricos.
\vskip1.000000\baselineskip
Como estrategia alternativa a la establecida en
los Ejemplos I-VI, se introducen genes de Ig humana
en el locus de Ig de ratón mediante la sustitución de locus de
inmunoglobulina de cadena pesada y ligera directamente con
fragmentos de locus de cadena pesada y ligera humanos usando
recombinación homóloga. Posteriormente se realiza la generación de
animales transgénicos quiméricos en los que las células derivadas de
células madre embrionarias contribuyen a la línea germinal.
La sustitución de las secuencias humanas incluye
el fragmento SpeI de 100 kb de ADN genómico que abarca la región
humana de cadena pesada
VH6-D-J-C\mu-C\delta
aislada de una biblioteca de YAC humana, tal como se ha descrito
anteriormente. Las secuencias flanqueantes de cadena pesada de
ratón, que conducen el evento de sustitución de la recombinación
homóloga, contienen un fragmento BamHI de 10 kb de la cadena pesada
C\varepsilon-C\alpha de ratón y un fragmento 5'
J558 que comprende la mitad 5' del fragmento J558 de la región
variable de cadena pesada de ratón, en los extremos 3' y 5' de las
secuencias humanas, respectivamente (Figura 16). Estas secuencias
de ratón se aíslan de una biblioteca genómica de embriones de ratón
usando las sondas descritas en Tucker y col. (1981), PNAS USA, 78:
7684-7688 y Blankenstein y Krawinkel (1987, ver
anterior), respectivamente. El fragmento de 1150 pb de XhoI a
BamJI, que contiene un gen de resistencia a neomicina conducido por
el promotor de gen de timidina quinasa de virus de herpes simple
(HSV-tk) y un potenciador de polioma se aísla a
partir de pMC1Neo (Koller y Smithies, 1989, ver anterior). Se añade
un adaptador sintético sobre este fragmento para convertir el
extremo XhoI en un extremo BamHI y el fragmento resultante se une al
BamHI C\varepsilon-C\alpha de ratón en un
plásmido.
Del clon de YAC que contiene el locus de cadena
pesada humana, se recuperan las secuencias de ADN de cada extremo
del injerto mediante PCR inversa (Silverman y col. (1989), PNAS, 86:
7485-7489), o mediante rescate de plásmido en E.
coli, (Burke y col., (1987); Garza y col. (1989) Science, 246:
641-646; Traver y col., 1989) (véase la Figura 8).
La secuencia humana aislada procedente del extremo 5'V6 del YAC se
liga a la secuencia J558 de ratón en un plásmido, y asimismo, la
secuencia humana derivada del extremo 3'Cd del YAC se liga al gen
Neo del plásmido que contiene Neo y
C\varepsilon-C\alpha de ratón descritos
anteriormente. El segmento J558 de ratón V6 se subclona en un
vector de clonación medio YAC que incluye un marcador seleccionable
de levadura (HIS3) no presente en el YAC de IgH original, un
centrómero (CEN) y un telómero (TEL) sencillo. Asimismo, el
C\varepsilon-C\alpha de ratón
C\delta-Neo humano se subclona en un vector de
medio YAC separado con un marcador seleccionable de levadura
diferente (LEU2) y un TEL sencillo. El vector de medio YAC que
contiene el ADN V6 humano se linealiza y se usa para transformar
una cepa de levadura que es eliminada para los locus cromosomales
HIS3 y LEU2, y que porta el YAC de IgH. La selección de prototrofia
de histidina da lugar a colonias de levadura que han sido sometidas
a recombinación homóloga entre las secuencias de ADN V6 humanas y
que contienen un YAC recombinante. El vector medio YAC que contiene
el ADN C\delta humano se linealiza a continuación y se usa para
transformar la cepa de levadura generada en la etapa previa. La
selección para prototrofia de leucina da como resultado una cepa de
levadura que contiene el YAC completo de sustitución de IgH (véase
la Figura 16). Preferiblemente, ambos eventos de alteración se
llevan a cabo en una única etapa de transformación, seleccionando
simultáneamente para prototrofia de leucina y de histidina. Esto es
particularmente útil cuando los brazos originales de YAC céntricos
y acéntricos tienen una orientación opuesta a la mostrada en la
Figura 16. Este YAC se aísla y se introduce en células ME mediante
microinyección, tal como se ha descrito previamente para los
embriones.
Los ratones que contienen el locus de
inmunoglobulina humana son apareados con ratones con genes de
inmunoglobulina murina inactivos para generar ratones que produzcan
únicamente los anticuerpos humanos. Comenzando con cuatro cepas
heterocigotas, se requieren tres generaciones para crear un ratón
que es homocigoto para las inmunoglobulinas de cadena pesada y
kappa de murina inactivas, y heterocigoto para los locus de
inmunoglobulina de cadena kappa y pesada humana. El esquema de
reproducción se muestra en la Figura 17.
Los ratones quiméricos de línea germinal que
contienen ADN humano integrado procedente de locus de
inmunoglobulina son inmunizados mediante inyección de un antígeno
en adyuvante. Los ratones son tratados con antígeno 14 días después
de la inmunización primaria, y se repite a los 35 y a los 56 días.
Se extrae sangre de los animales inmunizados para evaluar el título
de anticuerpos en suero contra el antígeno inmunizante. El ratón con
el mayor título es sacrificado y se extrae el bazo.
Las células de mieloma usadas como compañero de
fusión para las células de bazo son descongeladas 6 días antes de
la fusión, y cultivadas en cultivo de tejido. Un día antes de la
fusión, las células se dividen en medio fresco que contiene un 10%
de suero fetal de ternero en una concentración de 5 x 10^{5}
células/mL. La misma mañana de la fusión, las células son diluidas
con un volumen igual de medio suplementado con un 20% de suero
fetal de ternero y 2X disolución OPI (3 mg/mL de oxaloacetato, 0,1
mg/mL de piruvato sódico y 0,4 UI/mL de insulina).
Después de sacrificar el ratón, se extrae
asépticamente el bazo y se coloca en un plato con medio de cultivo.
Se separan las células hasta que el bazo queda en piezas pequeñas y
la mayoría de las células han sido extraídas. Las células se lavan
en medio esterilizado fresco, y se deja que los grumos se
sedimenten.
Los esplenocitos se lavan dos veces mediante
centrifugación en medio sin suero. Durante el segundo lavado,
también se lavan las células de mieloma en un tubo separado. Después
del lavado final, las dos partículas son combinadas y se centrifuga
todo junto.
Se añade lentamente una disolución de
polietilénglicol al 50% (PEG) a la partícula de células a la vez que
las células son resuspendidas, durante un total de dos minutos. Se
añaden 10 mL de medio precalentado a la disolución celular,
agitando lentamente durante 3 minutos. Las células son centrifugadas
y se retira el sobrenadante. Las células son resuspendidas en 10 mL
de medio suplementado con un 20% de suero fetal de ternero, 1 X
disolución OPI y 1 X disolución AH (azaserina 58 \muM,
hipoxantina 0,1 mM). Las células fusionadas son divididas en
alícuotas en placas de 96 pocillos, y se cultivan a 37ºC durante una
semana.
Se toma asépticamente el sobrenadante de cada
pocillo y se reúne en grupos. Estos grupos son evaluados para
determinar la reactividad frente al antígeno inmunizante. Los grupos
positivos se evalúan con más detalle para determinar pocillos
individuales. Cuando se ha identificado un pocillo positivo, las
células se transfieren de la placa de 96 pocillos a 0,5 mL de medio
suplementado con un 20% de suero fetal de ternero, 1 X OPI y 1 X AH
en una placa de 24 pocillos. Cuando dicho cultivo se densifica, las
células son expandidas en 5 mL, y a continuación en 10 mL. En este
punto las células son sub-clonadas de tal modo que
en el cultivo sólo hay una célula productora de anticuerpos.
De acuerdo con los anteriores procedimientos, se
puede producir un anfitrión quimérico no humano, particularmente un
anfitrión murino, que puede ser inmunizado para producir anticuerpos
humanos o análogos específicos para un inmunógeno. De este modo, se
evitan los problemas asociados a la obtención de anticuerpos
monoclonales humanos, ya que el anfitrión transgénico puede ser
inmunizado con inmunógenos que no podrían ser usados con un
anfitrión humano. Además, se pueden utilizar inyecciones y
adyuvantes que no estarían permitidos con un anfitrión humano.
Entonces las células B resultantes pueden ser usadas para
inmortalización para la producción continua del anticuerpo deseado.
Las células inmortalizadas pueden usarse para el aislamiento de
genes que codifican la inmunoglobulina, o análogos, y pueden
someterse a modificaciones moleculares adicionales mediante métodos
tales como la mutagénesis in vitro u otras técnicas para
modificar las propiedades de los anticuerpos. Estos genes
modificados pueden entonces ser devueltos a las células
inmortalizadas mediante transfección para proporcionar una fuente
celular continua de mamífero de los anticuerpos deseados. La
presente invención proporciona una fuente conveniente de
anticuerpos humanos, en la que los anticuerpos son producidos de un
modo análogo a la producción de anticuerpos en un anfitrión humano.
Las células de anfitrión animal proporcionan de forma conveniente
la activación y la redisposición de ADN humano en las células de
anfitrión para la producción de anticuerpos humanos.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
producir anticuerpos humanos para inmunógenos humanos, por ejemplo
proteínas, mediante inmunización del mamífero anfitrión con
inmunógenos humanos. Los antisueros resultantes serán específicos
para el inmunógeno humano y pueden ser recolectados del suero del
anfitrión. Las células B de anfitrión inmunizado pueden usarse para
inmortalización, por ejemplo fusión de célula de mieloma,
transfección, etc., para proporcionar células inmortales, por
ejemplo hibridomas, para producir anticuerpos monoclonales. Los
anticuerpos, el antisuero y los anticuerpos monoclonales serán
glicosilados de acuerdo con la especie de la célula que produce los
anticuerpos. Se pueden reclutar regiones variables poco comunes del
locus de Ig en la producción de anticuerpos, de tal modo que puedan
obtenerse anticuerpos que tengan regiones variables poco
comunes.
Aunque la invención precedente ha sido descrita
con un determinado detalle a modo de ilustración y ejemplo para
propósitos de claridad de entendimiento, es fácilmente evidente para
los especialistas en la técnica a la luz de lo mostrado en esta
invención que se pueden realizar determinados cambios y
modificaciones en la misma, sin alejarse del alcance de las
reivindicaciones anexas.
Claims (20)
1. Un método para producir una célula madre
embrionaria (ME) de mamífero no humano que tiene al menos una
porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al
menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina
humana, integrados establemente en el genoma de la célula ME de
mamífero no humano, en donde la porción de un locus de cadena pesada
de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena
pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de una cadena ligera
de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena
ligera de inmunoglobulina human, comprendiendo dicho método las
etapas de:
- (a)
- combinar en condiciones de fusión las células ME de mamífero no humano y esferoplastos de levadura que contienen uno o más cromosomas artificiales de levadura (YACs) que comprenden la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y la porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, en donde los YACs incluyen un gen que codifica un marcador seleccionable, mediante el cual las porciones de los locus de inmunoglobulina humana se integran establemente en el genoma de las células madre embrionarias; y
- (b)
- seleccionar las células ME que portan los locus de inmunoglobulina humana por medio del marcador o marcadores.
2. Una célula madre embrionaria (ME) de mamífero
no humano que tiene al menos una porción de un locus de cadena
pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus
de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados establemente
en el genoma de la célula ME no humana, en donde la porción de un
locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para
codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción
de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para
codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde la
célula ME de mamífero no humano es producida de acuerdo con el
método de la reivindicación 1.
3. Un método de producción de un mamífero
quimérico no humano que tiene al menos una porción de un locus de
cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un
locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados
establemente en el genoma de al menos algunas de sus células, en
donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana es suficiente para codificar una cadena pesada de
inmunoglobulina humana y la porción de una cadena ligera de
inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena
ligera de inmunoglobulina humana, comprendiendo dicho las etapas
de:
- (a)
- producir una célula ME de mamífero no humano de acuerdo con la reivindicación 2; y
- (b)
- transferir la célula embrionaria seleccionada a un blastocisto del anfitrión no humano, implantar el blastocisto en un receptor de mamífero no humano pseudopreñado, y permitir que el blastocisto se desarrolle hasta término para producir el mamífero quimérico no humano.
4. Un mamífero quimérico no humano que tiene al
menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina humana, integrados establemente en el genoma de al
menos algunas de sus células, en donde la porción de un locus de
cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar
una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de una
cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar
una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde el mamífero
quimérico no humano es producido mediante el método de acuerdo con
la reivindicación 3.
5. Un método para producir un mamífero
transgénico no humano y su progenie que tiene al menos una porción
de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos
una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana,
integrados establemente en el genoma de sus células somáticas y
germinales, en donde la porción de un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena
pesada de inmunoglobulina humana y la porción de una cadena ligera
de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena
ligera de inmunoglobulina humana, comprendiendo dicho método las
etapas de:
- (a)
- producir un mamífero quimérico no humano de acuerdo con la reivindicación 4; y
- (b)
- reproducir el mamífero quimérico no humano como sea necesario para producir el mamífero transgénico no humano y su progenie.
6. Un mamífero transgénico no humano y su
progenie que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada
de inmunoglobulina human y al menos una porción de un locus de
cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados establemente en
el genoma de sus células somáticas y germinales, en donde la porción
de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente
para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana y la
porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente
para codificar una cadena ligera de inmuno-
globulina humana, y en donde el mamífero no humano es producido mediante el método de la reivindicación 5.
globulina humana, y en donde el mamífero no humano es producido mediante el método de la reivindicación 5.
\global\parskip0.900000\baselineskip
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1, 3 ó 5, en el que la porción del locus de
cadena pesada de inmunoglobulina humana es una secuencia de ADN
idéntica a la secuencia de ADN de línea germinal del cromosoma 14
humano procedente de los genes del segmento D del locus de cadena
pesada de inmunoglobulina humana, que continúa a través de los genes
del segmento J y de los genes de la región constante a través de
C\mu de dicho locus, en donde dicha secuencia de ADN no incluye
una región constante gamma, y en donde dicho fragmento de ADN está
ligado operativamente a al menos un gen del segmento V humano.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1, 3, 5 ó 7, en el que el genoma de la célula
ME de mamífero no humano comprende al menos un locus de cadena
pesada de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus
está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para
prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada
de inmunoglobulina reorganizado.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende
además al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina
endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para
prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de
un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina
reorganizado.
10. La célula ME de acuerdo con la
reivindicación 2 o el mamífero no humano de acuerdo con la
reivindicación 4 ó 6, en donde la porción del locus de cadena pesada
de inmunoglobulina humana es una secuencia de ADN idéntica a la
secuencia de ADN de línea germinal del cromosoma 14 humano
procedente de los genes del segmento D del locus de cadena pesada de
inmunoglobulina humana, que continúa a través de los genes del
segmento J y de los genes de región constante a través de C\mu de
dicho locus, en donde dicha secuencia de ADN no incluye una región
constante gamma, y en donde dicho fragmento de ADN está ligado
operativamente a al menos un gen de segmento V humano.
11. La célula ME de acuerdo con la
reivindicación 2 ó 7, en donde el genoma de la célula ME de mamífero
no humano comprende al menos un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está
desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina reorganizada.
12. La célula ME de acuerdo con la
reivindicación 11, en la que el genoma de la célula ME de mamífero
no humano comprende además al menos un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está
desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina reorganizado.
13. El mamífero quimérico no humano de acuerdo
con la reivindicación 4 ó 10, en el que el genoma de las células que
tienen una porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana y una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina
humana comprende al menos un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está
desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina reorganizada.
14. El mamífero quimérico no humano de acuerdo
con la reivindicación 13, en donde el genoma de las células que
tienen una porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina
humana y una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina
humana además comprende al menos un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está
desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina reorganizado.
15. El mamífero transgénico no humano de acuerdo
con la reivindicación 6 ó 10, en el que el genoma de las células
somáticas y germinales comprende al menos un locus de cadena pesada
de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está
desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de
inmunoglobulina reorganizado.
16. El mamífero transgénico no humano de la
reivindicación 15, en el que el genoma de las células somáticas y
germinales comprende además al menos un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está
desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir
la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de
inmunoglobulina reorganizada.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 8
ó 9, en el que al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina
endógeno está desactivado por la eliminación de todos los genes del
segmento J.
18. La célula ME o el mamífero no humano de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde
al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno está
desactivado por la eliminación de todos los genes del segmento
J.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 8
ó 9, en el que al menos un locus de cadena ligera kappa de
inmunoglobulina endógeno está desactivado por la eliminación del gen
C_{\kappa}.
20. La célula ME o el mamífero no humano de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde
al menos un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina endógeno
está desactivado por la eliminación del gen C_{\kappa}.
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