JP5469456B2 - ADCC活性又はCDC活性を有する抗Prominin−1抗体 - Google Patents
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Description
Yin et al. (1997) Blood 90, 5002-12. Miraglia et al. (1997) Blood 90, 5013-21. Gehling et al. (2000) Blood 95, 3106-12. Thill et al. (2004) Invest Opthalmol Vis Sci 45:U160, 3519. Bussolati et al. (2005) Am J Path 166, 545-55. Richardson et al. (2004) J Cell Sci 117, 3539-45. Smith et al. (2007) AACR 100th Annual Meeting, poster session #1332. Florek et al. (2005) Cell Tissue Res 319, 15-26. Sheila et al. (2004) Nature 432, 396-401. Taylor et al. (2005) Cancer Cell 8, 323-35. Collins et al. (2005) Cancer Res 65, 10946-10951. Al-Hajj et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100, 3983-8. O’Brien et al. (2007) Nature 445, 106-110. Ricci-Vitiani et al. (2007) Nature 445, 111-5.
さらに、本発明者らはAC133抗体のCDRをヒト抗体配列に移植したヒト化抗体の作製を試みた。CDRを移植する抗体配列として、AF174028(H鎖)、AB064105(L鎖)を用いてヒト化を行ったがヒトキメラ抗体と比較して、抗原に対する結合アフィニティーが低かった。しかし、ヒト化L鎖配列にアミノ酸置換を導入することでさらに検討を重ね、ヒト化L鎖可変領域FR1の15番目のアミノ酸がPhe、さらにヒト化L鎖可変領域FR1の18番目のアミノ酸がGlnである場合に、キメラ抗体と同等の結合活性を有することを見出した。
マウス抗体からのヒトIgG1/kまたはヒト化抗体への変換は、抗体をヒトに医薬組成物として投与する際、免疫原性を低減するという点において優っており、分子としてより望ましい形である。本発明により抗腫瘍作用を有する非標識のAC133ヒトキメラ抗体、そしてヒト化抗体が提供される。
〔1〕 Prominin-1に結合する抗体であって、かつADCC活性又はCDC活性を有する抗体。
〔2〕 AC133抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識することを特徴とする〔1〕に記載の抗体。
〔3〕 キメラ抗体又はヒト化抗体である〔1〕または〔2〕に記載の抗体。
〔4〕 重鎖可変領域CDR1として配列番号12のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域CDR2として配列番号14のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域CDR3として配列番号16のアミノ酸配列を有することを特徴とする〔1〕〜〔3〕いずれかに記載の抗体。
〔5〕 軽鎖可変領域CDR1として配列番号20のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域CDR2として配列番号22のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域CDR3として配列番号24のアミノ酸配列を有することを特徴とする〔1〕〜〔4〕いずれかに記載の抗体。
〔6〕 配列番号34のアミノ酸配列の15位に相当する、軽鎖可変領域FR1の15番目のアミノ酸がPheである〔5〕に記載の抗体。
〔7〕 配列番号34のアミノ酸配列の18位に相当する、軽鎖可変領域FR1の18番目のアミノ酸がGlnである〔6〕に記載の抗体。
〔8〕以下の(a)〜(f)いずれかに記載の抗体。
(a) 配列番号32(h133Hアミノ酸配列)の1番目〜114番目のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号42(h133VL(c)アミノ酸配列)の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) 配列番号46(h133VL(e)アミノ酸配列)の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号32(h133VHアミノ酸配列)の1番目〜114番目のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号42(h133VL(c)アミノ酸配列)の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号32(h133VHアミノ酸配列)の1番目〜114番目のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号46(h133VL(e)アミノ酸配列)の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(f) (a)〜(e)いずれかに記載の抗体と機能的に同等な抗体
〔9〕 重鎖定常領域がマウスIgG1でないことを特徴とする〔1〕〜〔8〕いずれかに記載の抗体。
〔10〕 重鎖定常領域がヒトIgG1であり、軽鎖定常領域がヒトIgκである〔9〕記載の抗体。
〔11〕 細胞傷害性物質が結合していないことを特徴とする〔10〕に記載の抗体。
〔12〕 〔1〕〜〔11〕いずれかに記載の抗体を有効成分とする医薬組成物。
〔13〕 抗癌剤である〔12〕に記載の医薬組成物。
〔14〕 〔1〕〜〔11〕いずれかに記載の抗体を対象に投与する工程を含む癌を予防または治療する方法。
〔15〕抗癌剤の製造における、〔1〕〜〔11〕いずれかに記載の抗体の使用。
〔16〕 癌を治療するための方法に使用するための、〔1〕〜〔11〕いずれかに記載の抗体。
本発明は、Prominin-1に結合し、ADCC活性及び/又はCDC活性を有する抗体、並びに該抗体を有効成分とする医薬組成物に関する。
これらの抗Prominin-1抗体は、後述の方法によって得ることができる。
具体的には、例えば以下の方法により測定することが可能である。
(1)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
(3)標的細胞の調製
Prominin-1タンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。Prominin-1タンパク質を発現する細胞としては、Prominin-1タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、癌細胞(癌幹細胞、ヒト網膜芽腫細胞株WERI-Rb-1など)等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
(1)配列番号32の1〜30番目のアミノ酸配列を有するFR1
(2)配列番号32の36〜49番目のアミノ酸を有するFR2
(3)配列番号32の67〜98番目のアミノ酸を有するFR3
(4)配列番号32の104〜114番目のアミノ酸を有するFR4
また、本発明のヒト化抗体に移植する軽鎖可変領域FRの具体的な例として、以下の(5)〜(8)のFRを挙げることができる。
(5)配列番号34の1〜23番目のアミノ酸配列を有するFR1
(6)配列番号34の40〜54番目のアミノ酸配列を有するFR2
(7)配列番号34の62〜93番目のアミノ酸配列を有するFR3
(8)配列番号34の103〜112番目のアミノ酸配列を有するFR4
また、本発明のヒト化抗体に移植する軽鎖可変領域FRの具体的な例として、以下の(9)〜(12)のFRを挙げることができる。
(9)配列番号42の1〜23番目のアミノ酸配列を有するFR1
(10)配列番号42の40〜54番目のアミノ酸配列を有するFR2
(11)配列番号42の62〜93番目のアミノ酸配列を有するFR3
(12)配列番号42の103〜112番目のアミノ酸配列を有するFR4
また、本発明のヒト化抗体に移植する軽鎖可変領域FRの具体的な例として、以下の(13)〜(16)のFRを挙げることができる。
(13)配列番号46の1〜23番目のアミノ酸配列を有するFR1
(14)配列番号46の40〜54番目のアミノ酸配列を有するFR2
(15)配列番号46の62〜93番目のアミノ酸配列を有するFR3
(16)配列番号46の103〜112番目のアミノ酸配列を有するFR4
本発明のヒト化抗体に使用されるFRは上記配列に限定されるものではない。また、ヒト化抗体の機能を向上させるために、ヒトFRアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたFR配列も本願のFRに含まれる。
放射性物質とは、放射性同位体を含む物質のことをいい、32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Reが含まれる。
糖鎖が改変された抗体の例としては、例えば、グリコシル化された抗体(WO99/54342など)、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体(WO00/61739、WO02/31140、WO2006/067847、WO2006/067913など)、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体(WO02/79255など)などを挙げることができる。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるProminin-1タンパク質を得る。すなわち、Prominin-1をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトProminin-1タンパク質を公知の方法で精製する。
(a)重鎖定常領域がマウスIgG2aであるキメラ抗体(重鎖塩基配列、配列番号1;重鎖アミノ酸配列、配列番号2)(アミノ酸番号1〜19はシグナル配列)
(b)軽鎖定常領域がマウスIgκであるキメラ抗体(軽鎖塩基配列、配列番号3;軽鎖アミノ酸配列、配列番号4)(アミノ酸番号1〜20はシグナル配列)
(c)重鎖定常領域がヒトIgG1であるヒトキメラ抗体(重鎖塩基配列、配列番号5;重鎖アミノ酸配列、配列番号6)(アミノ酸番号1〜19はシグナル配列)
(d)軽鎖定常領域がヒトIgκであるヒトキメラ抗体(軽鎖塩基配列、配列番号7;軽鎖アミノ酸配列、配列番号8)(アミノ酸番号1〜20はシグナル配列)
(i) 配列番号34のアミノ酸配列の15位に相当する、軽鎖可変領域FR1の15番目のアミノ酸がPheであるヒト化抗体。
(ii) 配列番号34のアミノ酸配列の15位に相当する軽鎖可変領域FR1の15番目のアミノ酸がPheであり、かつ配列番号34のアミノ酸配列の18位に相当する軽鎖可変領域FR1の18番目のアミノ酸がGlnであるヒト化抗体。
上述の抗体は特に限定されないが、重鎖可変領域CDR1として配列番号12のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域CDR2として配列番号14のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域CDR3として配列番号16のアミノ酸配列を有することが好ましい。又、軽鎖可変領域CDR1として配列番号20のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域CDR2として配列番号22のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域CDR3として配列番号24のアミノ酸配列を有することが好ましい。
さらに、本発明の抗体の具体的な例として、以下のようなヒト化抗体が挙げられるが、本発明はこれらの抗体に限定されるものではない。
(1)重鎖がヒト化抗体H鎖(h133H)であるヒト化抗体(重鎖塩基配列、配列番号31;重鎖アミノ酸配列、配列番号32)(アミノ酸番号−19〜−1はシグナル配列)
(2)軽鎖がヒト化抗体L鎖(h133L)であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号33;軽鎖アミノ酸配列、配列番号34)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(3)軽鎖がFR1マウス配列(シグナル配列もマウス抗体配列由来)をもつヒト化抗体L鎖(hybridL1)であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号35;軽鎖アミノ酸配列、配列番号36)(アミノ酸番号−20〜−1はシグナル配列)
(4)軽鎖がFR1ヒト化配列(シグナル配列もヒト化抗体配列由来)をもつヒト化抗体L鎖(hybridL2)であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号37;軽鎖アミノ酸配列、配列番号38)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(5)軽鎖がヒト化抗体L鎖(h133L(b))であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号39;軽鎖アミノ酸配列、配列番号40)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(6)軽鎖がヒト化抗体L鎖(h133L(c))であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号41;軽鎖アミノ酸配列、配列番号42)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(7)軽鎖がヒト化抗体L鎖(h133L(d))であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号43;軽鎖アミノ酸配列、配列番号44)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(8)軽鎖がヒト化抗体L鎖(h133L(e))であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号45;軽鎖アミノ酸配列、配列番号46)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(9)軽鎖がヒト化抗体L鎖(h133L(f))であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号47;軽鎖アミノ酸配列、配列番号48)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(10)軽鎖がヒト化抗体L鎖(h133L(g))であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号49;軽鎖アミノ酸配列、配列番号50)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(11)軽鎖がヒト化抗体L鎖(h133L(h))であるヒト化抗体(軽鎖塩基配列、配列番号51;軽鎖アミノ酸配列、配列番号52)(アミノ酸番号−22〜−1はシグナル配列)
(12)(1)のH鎖(h133H)と(6)のL鎖(h133L(c))を有するヒト化抗体
(13)(1)のH鎖(h133H)と(8)のL鎖(h133L(e))を有するヒト化抗体
(14)配列番号32の1番目〜114番目のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(h133VH)を含むヒト化抗体
(15)配列番号34の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(h133VL)を含むヒト化抗体
(16)配列番号36の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(hybridL1)を含むヒト化抗体
(17)配列番号38の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(hybridL2)を含むヒト化抗体
(18)配列番号40の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(h133VL(b))を含むヒト化抗体
(19)配列番号42の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(h133VL(c))を含むヒト化抗体
(20)配列番号44の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(h133VL(d))を含むヒト化抗体
(21)配列番号46の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(h133VL(e))を含むヒト化抗体
(22)配列番号48の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(h133VL(f))を含むヒト化抗体
(23)配列番号50の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(h133VL(g))を含むヒト化抗体
(24)配列番号52の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(h133VL(h))を含むヒト化抗体
(25)(14)の重鎖可変領域と(19)の軽鎖可変領域を含むヒト化抗体
(26)(14)の重鎖可変領域と(21)の軽鎖可変領域を含むヒト化抗体
(27)(1)〜(26)いずれかの抗体と機能的に同等なヒト化抗体。
本発明において、「同等」とは、必ずしも同程度の活性である必要はなく、活性が増強されていてもよいし、又、活性を有する限り活性が減少していてもよい。活性が減少している抗体としては、例えば、もとの抗体と比較して30%以上の活性、好ましくは50%以上の活性、より好ましくは80%以上の活性を有する抗体を挙げることができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
AC133.1抗体を発現するマウスハイブリドーマ細胞(HB-12346)をATCCより入手した。10%胎児牛血清(FBS)を含むDMEM培地を用いてハイブリドーマ細胞を培養し、細胞を回収した。約3 × 106細胞よりRNeasy mini(QIAGEN)を用いてtotal RNAを精製した。Smart RACE cDNA Amplification kit(Clontech)を用いて精製total RNA 1μgより、添付マニュアルの指示に従い5’ RACE cDNAライブラリを作製した。抗体重鎖可変領域(VH)(塩基配列、配列番号9;アミノ酸配列、配列番号10)および軽鎖可変領域(VL) (塩基配列、配列番号17;アミノ酸配列、配列番号18)をそれぞれ抗体定常領域部分にアニールするプライマーとSmart RACE cDNA Amplification kitに付属するUniversal Primer Mixの組み合わせでPCR増幅した。
重鎖(IgG1)増幅プライマー:5'-CCATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGATCC-3'(配列番号25)
軽鎖(Igκ)増幅プライマー:5'-GGCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3'(配列番号26)
抗体可変領域をクローニングして作製した組換え抗体がハイブリドーマ産生抗体と同じ結合特性を有することを、フローサイトメトリー法で確認した。AC133.1抗体はヒト網膜芽腫細胞株WERI-Rb-1に結合することが報告されている[Yin et al. (1997) Blood 90, 5002-12]。WERI-Rb-1細胞(HTB-169)をATCCより入手した。WERI-Rb-1細胞は10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地を用いて37℃、5% CO2条件下で培養した。細胞培養液を遠心し、上清を取り除き、細胞をFACSバッファー(2%牛胎児血清を含むリン酸緩衝液)に懸濁した。組換え抗体、ハイブリドーマ抗体、陰性対照となるマウスIgG抗体をそれぞれ終濃度5μg/mlとなるように添加し、4℃、30分間インキュベーションした。遠心し、上清を取り除き、FACSバッファーで再懸濁し、もう一度遠心した。細胞沈殿物をFACSバッファーで150倍希釈したFITC標識ヤギF(ab’)2抗マウスIgG(H+L)抗体液(Beckman-Coulter, IM0819)で懸濁し、暗所にて4℃、30分間インキュベーションした。遠心後、細胞をFACSバッファーで懸濁し、細胞への抗体の結合をFACSCalibur(BD)で解析した。組換え抗体がハイブリドーマ産生抗体同様に、WERI-Rb-1細胞に結合することを確認した(図1)。
特異的クロム放出=(A-C)/(B-C) × 100
ここで、Aは各ウェルにおける放射活性、Bは終濃度1% Nonidet P-40で細胞溶解して培地へ放出される放射活性平均値、Cは培地のみ添加した場合における放射活性平均値である。
重鎖可変領域配列を以下に示すプライマーを用いてPCR増幅し、EcoRI/NheI処理後、ヒトキメラ抗体発現ベクター重鎖クローニングサイトに組み込んだ。軽鎖可変領域配列も同様にして以下に示すプライマーセットでPCR増幅し、BamHI/BsiWI処理後、上述の重鎖を組み込んだヒトキメラ抗体発現ベクターの軽鎖クローニングサイトに組み込んだ。構築した細胞発現ベクターにおいて重鎖、軽鎖ともに抗体遺伝子はマウスCMVプロモーター下で転写されるように設計されている。
VHキメラ化プライマー1: 5'-CTTGAATTCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC-3'(配列番号27)
VHキメラ化プライマー2: 5'-CGCGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC-3'(配列番号28)
VLキメラ化プライマー1: 5'-CAGGGATCCACCATGAATTTGCCTGTTCATCTCTT-3'(配列番号29)
VLキメラ化プライマー2: 5'-CGGCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3'(配列番号30)
Prominin-1(NM_006017)はAC133.1の抗原分子である。ヒト腎臓cDNAライブラリを鋳型にPCR法によりProminin-1翻訳配列を含むDNA断片を増幅し、動物細胞発現ベクターにクローニングした。エレクトロポレーション法で発現ベクターをDG44細胞に導入し、ジェネティシンを用いて、組換え細胞の選抜を行った。組換え細胞において、Prominin-1組換え蛋白質が発現していることを、組換え蛋白質C末端に人工的に付加したFLAGタグを利用した抗FLAG M2抗体によるウェスタンブロットで確認した。Prominin-1強制発現細胞特異的にA133.1抗体が結合することをフローサイトメトリー法で確認した。
ヒトに抗体を投与した際の免疫原性を低減させる目的で、AC133.1抗体のCDR をヒト抗体配列に移植したヒト化抗体を作製した。GenBank塩基配列データベースに対してAC133.1抗体可変領域フレームワークアミノ酸配列をクエリとしてBLAST相同性配列検索(プログラムTBLASTN2.2.12)を行った。検索の結果ヒットした相同性の高いヒト抗体配列の中から、CDR移植する抗体配列としてAF174028(H鎖)、AB064105(L鎖)を選択した。AC133抗体可変領域フレームワーク配列とCDR移植の鋳型として選択したヒト抗体配列のアライメントを図5に示した。CDR配列を移植したヒト化抗体H鎖配列(h133H)の塩基配列を配列番号31、アミノ酸配列を配列番号32に、ヒト化抗体L鎖配列(h133L)の塩基配列を配列番号33、アミノ酸配列を配列番号34に示した。
huHf1(配列番号55);gcgaattcaccatggactggacctggagcatccttttcttggtggcagcagcaacaggtgcccactcccaggttcagctg
huHf2(配列番号56);gaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccGACTTTGAAATGCACtgggtgc
huHf3(配列番号57);cttgagtggatgggaGATATTGATCCTGGAACTGGTGATACTGCCTACAATCTGAAGTTCAAGGGCagagtcaccatgac
huHf4(配列番号58);cagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgttgGGGGCCTTTGTTTACtgg
huHr1(配列番号59);gagaccttcactgaggccccaggcttcttcacctcagctccagactgcaccagctgaacctgggagtgggcacctgttgc
huHr2(配列番号60);TCCAGGATCAATATCtcccatccactcaagcccttgtccaggggcctgtcgcacccaGTGCATTTCAAAGTCggtaaagg
huHr3(配列番号61);atctcaggctcctcagctccatgtaggctgtgctcgtggatgtgtctgtggtcatggtgactctGCCCTTGAACTTCAGA
huHr4(配列番号62);gcgctagctgaggagacggtgaccagggttccctggccccaggggtcgaaccaGTAAACAAAGGCCCCcaacgcacagta
huKf1(配列番号63);gctgtcgaccaccatgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggccg
huKf2(配列番号64);ccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcAGGTCTAGTCAGAGTCTTGCAAACAGTTATGG
huKf3(配列番号65);acctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatGGGATTTCCAACAGATTTTCTggggtccctgacaggttc
huKf4(配列番号66);agattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcTTACAAGGTACACATCAGCCGT
huKr1(配列番号67);ctctccaggggtgacgggcagggagagtggagactgagtcatcacaacatcggccatggccggctgggccgcgagtaata
huKr2(配列番号68);gctgtggagactgccctggcttctgcaggtaccaAGACAAATAGGTGTTCCCATAACTGTTTGCAAGACTCTGACTAGAC
huKr3(配列番号69);tccactctgctgattttcagtgtaaaatctgtgcctgatccactgccactgaacctgtcagggaccccAGAAAATCTGTT
huKr4(配列番号70);cggcgtacgtttgatctccagcttggtcccctggccaaaCGTGTACGGCTGATGTGTACCTTGTAAgcagtaat
hu133VHfEco(配列番号71);GCGAATTCACCATGGACTGGACCTGGAGCA
hu133VHrNhe(配列番号72);CGCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT
hu133VKfSal(配列番号73);GCTGTCGACCACCATGAAATACCTATTGCC
hu133VKrBsi(配列番号74);CGGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC
FR4delta_f(配列番号75);GGGGCCTTTGTTTACTGGGGCCAGGGAACC
FR4delta_r(配列番号76);GGTTCCCTGGCCCCAGTAAACAAGGCCCC
MCMV-F1(配列番号77);TAACACCGCCCCGGTTTTCC
G1kCH-r3(配列番号78);AGTAGAGTCCTGAGGACTGTAGG
G1kCL-r1(配列番号79);TCTAGGTGCTGTCCTTGCTGTCC
AC133CDR1f(配列番号80);TAGTCAGAGTCTTGCAAACAGTTATGGGAA
AC133CDR1r(配列番号81);CAAATAGGTGTTCCCATAACTGTTTGCAAG
M4V_f(配列番号82);atggccgatgttgtgGtgactcagtctcca
M4V_r(配列番号83);tggagactgagtcaCcacaacatcggccat
P15Ff(配列番号84);ctgcccgtcaccTTtggagagccggcctcc
P15Fr(配列番号85);ggaggccggctctccaAAggtgacgggcag
P18Qf(配列番号86);cacccctggagagcAAgcctccatctcctg
P18Qr(配列番号87);caggagatggaggcTTgctctccaggggtg
PPFQf(配列番号88);ccgtcaccTTtggagagcAAgcctccatct
PPFQr(配列番号89);agatggaggcTTgctctccaAAggtgacgg
A19V_f(配列番号90);TGGAGAGCCGGTCTCCATCTCCTGCAGGTC
A19V_r(配列番号91);GACCTGCAGGAGATGGAGACCGGCTCTCCA
PAQV_f(配列番号92);TGGAGAGCAAGTCTCCATCTCCTGCAGGTC
PAQV_r(配列番号93);GACCTGCAGGAGATGGAGACTTGCTCTCCA
マウス抗体に比較してヒト化抗体で抗原に対する結合アフィニティが弱まった原因は、結合活性保持のために保存すべきアミノ酸残基をヒト化のプロセスで置換してしまったことにある。保存すべきアミノ酸残基がH鎖、L鎖のどちらに存在するのかをマップする目的で、キメラ抗体、ヒト化抗体のH鎖、L鎖の組み合わせを相互に変えて抗原に対する結合活性が保存されるかどうかを評価した。以下の組み合わせで抗体をCOS-7細胞で一過的に発現させ、その結合活性を評価した。
(1) キメラH鎖(配列番号6)とキメラL鎖(配列番号8)
(2) キメラH鎖(配列番号6)とヒト化L鎖(配列番号34)
(3) ヒト化H鎖(配列番号32)とキメラL鎖(配列番号8)
(4) ヒト化H鎖(配列番号32)とヒト化L鎖(配列番号34)
hybridL1可変領域5’側断片として、キメラ抗体L鎖発現ベクターを鋳型にMCMV-F1とAC133CDR1rプライマーの組み合わせで増幅した。hybridL1の 3’側断片は、ヒト化抗体L鎖発現ベクターを鋳型にG1kCLr1とAC133CDR1fプライマーの組み合わせで増幅した。反応はKOD DNA polymeraseを用いて製造者の指示通りに行った。アガロース電気泳動を行い目的サイズの断片を回収して精製後、二つの断片を混合し、MCMV-F1とG1kCLr1プライマーを用いてPCR増幅した。増幅後、アセンブルされた断片を切り出し、SalI/BsiWI処理したのちにL鎖発現ベクターへと組みこんだ。hybridL2可変領域も同様にして、hybridL2可変領域の5’側断片としてヒト化抗体L鎖発現ベクターを鋳型にMCMV-F1とAC133CDR1rプライマーの組み合わせで、3’側断片としてキメラ抗体L鎖発現ベクターを鋳型にG1kCLr1とAC133CDR1fプライマーの組み合わせでPCR増幅、その後アセンブル、発現ベクターにクローニングした。構築した発現ベクターが期待通りの配列をもつことを塩基配列解析により確認した。
(5) ヒト化H鎖とhybridL1
(6) ヒト化H鎖とhybridL2
その結果、hybridL1鎖にキメラL鎖同等の活性があることが明らかになった。以上の結果より、ヒト化L鎖フレームワーク1上にキィとなるアミノ酸残基があると考えられた。そこで図8(B)に示したL鎖フレームワーク1上でヒト化に伴いのアミノ酸残基残基置換を伴う部位に変異を導入した改変体を作製し、結合活性への影響をみた。
h133L(b)鎖(塩基配列、配列番号39;アミノ酸配列、配列番号40)の構築。ヒト化抗体L鎖発現ベクターを鋳型に5’側断片としてMCMV-F1とM4V_rプライマーの組み合わせで、3’側断片としてG1kCLr1とM4V_fプライマーの組み合わせでPCR増幅、その後アセンブルし、SalI/BsiWI制限酵素切断後、発現ベクターにクローニングした。
h133L(c)鎖(塩基配列、配列番号41;アミノ酸配列、配列番号42)の構築。ヒト化抗体L鎖発現ベクターを鋳型に5’側断片としてMCMV-F1とP15Frプライマーの組み合わせで、3’側断片としてG1kCLr1とP15Ffプライマーの組み合わせでPCR増幅、その後アセンブルし、SalI/BsiWI制限酵素切断後、発現ベクターにクローニングした。
h133L(d) 鎖(塩基配列、配列番号43;アミノ酸配列、配列番号44)の構築。ヒト化抗体L鎖発現ベクターを鋳型に5’側断片としてMCMV-F1とP18Qrプライマーの組み合わせで、3’側断片としてG1kCLr1とP18Qfプライマーの組み合わせでPCR増幅、その後アセンブルし、SalI/BsiWI制限酵素切断後、発現ベクターにクローニングした。
h133L(e) 鎖(塩基配列、配列番号45;アミノ酸配列、配列番号46)の構築。ヒト化抗体L鎖発現ベクターを鋳型に5’側断片としてMCMV-F1とPPFQrプライマーの組み合わせで、3’側断片としてG1kCLr1とPPFQfプライマーの組み合わせでPCR増幅、その後アセンブルし、SalI/BsiWI制限酵素切断後、発現ベクターにクローニングした。
h133L(f) 鎖(塩基配列、配列番号47;アミノ酸配列、配列番号48)の構築。ヒト化抗体L鎖発現ベクターを鋳型に5’側断片としてMCMV-F1とA19V_rプライマーの組み合わせで、3’側断片としてG1kCLr1とA19V_fプライマーの組み合わせでPCR増幅、その後アセンブルし、SalI/BsiWI制限酵素切断後、発現ベクターにクローニングした。
h133L(g) 鎖(塩基配列、配列番号49;アミノ酸配列、配列番号50)の構築。ヒト化抗体L(c)鎖発現ベクターを鋳型に5’側断片としてMCMV-F1とA19V_rプライマーの組み合わせで、3’側断片としてG1kCLr1とA19V_fプライマーの組み合わせでPCR増幅、その後アセンブルし、SalI/BsiWI制限酵素切断後、発現ベクターにクローニングした。
h133L(h) 鎖(塩基配列、配列番号51;アミノ酸配列、配列番号52)の構築。ヒト化抗体L(e)鎖発現ベクターを鋳型に5’側断片としてMCMV-F1とPAQV_rプライマーの組み合わせで、3’側断片としてG1kCLr1とPAQV_fプライマーの組み合わせでPCR増幅、その後アセンブルし、SalI/BsiWI制限酵素切断後、発現ベクターにクローニングした。
構築した発現ベクターすべてが期待通りの配列をもつことを塩基配列解析により確認した。
Claims (5)
- 以下の(a)および(b)を含むADCC活性を有する抗体。
(a) 配列番号32の1番目〜114番目のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ならびにヒトIgG1の重鎖定常領域、および
(b) 以下のいずれかの軽鎖可変領域ならびにヒトIgκの軽鎖定常領域:
(i) 配列番号42の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または
(ii) 配列番号46の1番目〜112番目のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域。 - CDC活性を有することを特徴とする請求項1に記載の抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体を有効成分とする医薬組成物。
- 抗癌剤である請求項3に記載の医薬組成物。
- 抗癌剤の製造における、請求項1または2に記載の抗体の使用。
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