ES2283005T3 - Composiciones y procedimientos para catalizar la hidrolisis de gp 120 de hiv. - Google Patents
Composiciones y procedimientos para catalizar la hidrolisis de gp 120 de hiv. Download PDFInfo
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Abstract
SE DESCRIBE UN ANTICUERPO CATALITICO Y COMPONENTES DEL MISMO QUE ROMPE EL GP120 DE VIH. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA AISLAR, CLONAR Y PURIFICAR DICHOS ANTICUERPOS O COMPONENTES DEL ANTICUERPO A PARTIR DE PACIENTES. LAS COMPOSICIONES DESCRITAS PUEDEN RESULTAR UTILES EN EL TRATAMIENTO DE LA INFECCION POR VIH.
Description
Composiciones y procedimientos para catalizar la
hidrólisis de gp120 de HIV.
Esta invención está relacionada con el
tratamiento de la infección por VIH y con las patologías asociadas.
En particular, se proporcionan anticuerpos catalíticos
(proteolíticos), o derivados de los mismos, que catalizan la
hidrólisis de la proteína gp120 del VIH.
Las glicoproteínas de la membrana de
VIH-1 se sintetizan inicialmente como un solo
precursor de 160 kD, el cual cortado por una proteasa celular en el
enlace Arg511-Ala512, produciendo gp120 y la
proteína integral gp41 de membrana (Kido, H., et al., J.
Biol. Chem. 268:13406-13413 (1993)). La
actividad biológica de gp120 es un elemento clave en la unión
inicial del VIH-1 a las células hospedadoras, en la
propagación del virus y en sus efectos tóxicos sobre las neuronas
no infectadas y otras células (Kieber-Emmons, T.,
et al., Biochim. Biophys. Acta.
989:281-300, (1987); Capon et al.,
Ann. Rev. Immunol. 9:649-678). Así, la gp120
es una diana para la inmunización pasiva o activa contra el SIDA
(Kahn, J.O., et al., J. Infec. Dis.
170:1288-1291 (1994); Birx, D.L., et
al., Curr. Opn. Immunol.
5:600-607(1993); Berman, P.W., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:5200-5204 (1988). La primera etapa en la
infección por VIH-1 es la unión de un epítopo
conformacional de gp120 a receptores CD4 de las células
hospedadoras. Los aminoácidos individuales que constituyen este
epítopo parecen estar localizados en el segundo (C2), tercero (C3),
y cuarto (C4) segmentos conservados de gp120 (Olshevsky, T.J.,
et al., J. Virol. 64:5701-5705 1990)).
Estos son los residuos 256, 257, 368-370,
421-427 y 457 de gp120. Se han descrito anticuerpos
monoclonales que se unen al sitio de unión de CD4 (Tahalí, M.,
et al., J. Virol. 65:6188-6193
(1991); tahalí, M., et al., J. Virol.
66:5635-5641 (1992). Puesto que el sitio de
unión a CD4 es un epítopo conformacional, los residuos distantes
que por sí mismos no son constitutivos del epítopo podrían ser
importantes en el mantenimiento de la capacidad para unirse a CD4.
Las interacciones de gp120 con otras proteínas de la célula
hospedadora son también esenciales para la propagación del virus.
Por ejemplo, la unión de gp120 por la calmodulina podría estar
implicada en la infectividad de VIH-1, según se
revela por el efecto inhibidor de los antagonistas de calmodulina
(Srinivas, R.V., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses
108:1489-1496 (1994). Asp180 localizado
entre las regiones V1 y V2 de gp120 es crítico para la replicación
vírica (Wang, W-K., et al., J. Virol.
69:538-542 (1995). De manera similar, el
bucle V3 es esencial para la infectividad (Ivanoff, L.A., et
al., Virology 187:423-432 (1992). Por lo
tanto, está claro que probablemente sean necesarios determinantes
estructurales en gp120 diferentes de los constitutivos del sitio de
unión a CD4 para la replicación del genoma vírico, la síntesis de
proteínas de la cubierta, y el empaquetamiento de las partículas
víricas.
Se ha propuesto la restricción de gp120 por las
partículas víricas como un factor en la patogénesis del SIDA
(Gelderblom, H.R. et al., Lancett
ii:1016-1017 (1985)). La gp120 purificada es tóxica
para las neuronas cultivadas (Brenneman, D.E. et al., Nature
335:639-642 (1988); Muller, W.E.G. el al.,
Eur. J. Pharmacol. 226:209-214 (1992)). Los
monocitos dependientes del anticuerpo pueden provocar la lisis de
los linfocitos T no infectados recubiertos con gp120 (Hober, D.
et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol.
10:83-92 (1995)). Las células CD4+ no
infectadas pueden morir porque la unión del complejo
gp120-gp41 induce apoptosis
(Laurent-Crawford, A.G. et al., Res. Virol
146:5-17 (1995)). La gp120 se une también a
componentes complementarios (Stoiber, H. et al., AIDS
9:19-26 (1995)).
Ha habido un interés considerable en la
posibilidad de que gp120 contribuya en el daño neuronal observado
en pacientes con SIDA (Everall, l.Petal., J. Neuropathol. Exp.
Neurol. 52:561-566 (1993)). La infección
productiva en el cerebro ocurre en un número relativamente pequeño
de células, que incluyen microglías, células gigantes
multinucleadas y macrófagos derivados de la sangre (Epstein. L.G
et al., Ann. Neurol. 52:561-566
(1993)). Sin embargo, hay un daño generalizado del cerebro en áreas
que no han sido infectadas por el virus. Esto ha sugerido que la
gp120 soluble liberada por el virus y las citoquinas producidas por
las células infectadas podrían ser responsables del daño (Lipton,
S.A., Brain Pathol. 1:193-199 (1991),
Giulian, D. et al., Science
250:1593-1595 (1990); Benos, D.J. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:494-498
(1994)). Los efectos neurotóxicos de gp120 pueden ser indirectos,
implicando la estimulación del receptor NMDA (Benos, D.J. et
al.,Proc. Natl. Acad. USA 91:494-498
(1994)) o la inducción de citoquinas (Yeung, M.C. et al.,
AIDS 9:137-143, (1995)). Gp120 también
estimula la liberación de neurotoxinas procedentes de los monocitos
(Giulian, D. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA
90:2769-2773, (1993)), indicando que sus
efectos neurotóxicos podrían requerir la participación de este tipo
de células. La evidencia de la neurotoxicidad de la gp120 soluble
incluye:
- (a)
- ratones transgénicos que expresan gp120 en el cerebro muestran daño neuronal generalizado (Toggas, S.M. et al., Nature 367:188-193 (1994));
- (b)
- gp120 pura en concentraciones sub-picomolares mata los astrocitos cultivados y células corticales cerebrales (Brenneman, D.E. et al., Nature 335:639-642 (1988); Muller, W.E.G. et al., Eur. J. Pharacol. 226:209-214 (1992));
- (c)
- inyecciones de gp120 pura in vivo producen daño cerebral (Hill, J.M. et al., Brain Res. 603:222-223 (1993));
- (d)
- se ha descrito una actividad neurotóxica similar a la de gp120 presente en el fluido espinal (Buzy, J. et al., Brain Res. 598:10-18 (1992));
- (e)
- el péptido-T, un octapéptido que corresponde a un segmento de gp120 y que tiene cierta homología con el neuropéptido VIP, podría mejorar la disfunción neuronal en pacientes con SIDA (Bridge, T.P. et al., Psychopharmacol. Bull 27:237-245(1991)).
Gp120 expresa muchos epítopos antigénicos
lineales y conformacionales para los que se producen anticuerpos.
Estos incluyen los anticuerpos neutralizantes del bucle V3
producidos por individuos infectados con VIH (Dreyer, E.B. et
al., Science 248:364:367 (1990); Meylan, P.R. et
al., AIDS 6:128-130 (1992); Pollard, S.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:11320-11324 (1991)). Estos anticuerpos son
específicos de tipo porque el bucle V3 es una región hipervariable,
con actividad neutralizante dirigida únicamente contra variantes del
VIH con secuencias V3 similares a la cepa del virus responsable de
la infección inicial. Por otro lado, los anticuerpos liberados en
las últimas fases de la enfermedad pueden ser, por lo general,
protectores, si los medimos según la inhibición de la capacidad de
diferentes cepas de VIH-1 para infectar líneas de
células y cultivos susceptibles in vitro de células
linfoides primarias. Un subconjunto de estos anticuerpos protectores
se dirigen contra regiones conservadas de gp120 esenciales para la
unión al receptor CD4 y para la propagación del virus (Hattori, T.
et al., FEBS Lett 248:48-52 (1989);
Schulz, T. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses
9:159-166 (1993); Clements, G.J. et
al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 7:3-16
(1991). Se cree ampliamente que el reclutamiento de respuestas con
anticuerpos neutralizantes en las regiones conservadas de gp120 será
necesario para la vacuna efectiva contra el SIDA. De igual manera,
el éxito de la inmunización pasiva con anticuerpos dependerá de la
capacidad de reconocer las regiones conservadas de gp120.
Otros han observado que los autoanticuerpos
encontrados en pacientes con lupus eritematoso sistémico son
capaces de unirse a gp120 (Gu, R. et al., AIDS Res. Hum.
Retroviruses 9:1007-1015 (1993); Callebaut,
C. et al., Science 262:2045-2050
(1993)). Se ha sugerido una reactividad cruzada entre anticuerpos
contra gp120 y contra las cadenas pesadas de clase l de HLA
(cadenas H) (Sattentau, Q.J. et al., J. Virol.
67:7383-7393 (1993). Se han descrito también
anticuerpos catalíticos que hidrolizan el ADN en pacientes con SIDA
(Woolley, D.W. et al., John Wiley & Sons, Inc. 1952
pp82).
Las especulaciones sobre la posibilidad de que
los anticuerpos desarrollen actividad catalítica se remontan a
Woolley en 1952 (Gao, Q:S:, et al., J. Biol. Chem.
269:32389-32393 (1994)) quien sugirió que si
se expone a un antígeno durante un periodo de tiempo suficientemente
largo, el sistema inmune podría sintetizar anticuerpos catalíticos.
Existe una homología de secuencia detectable entre las cadenas L de
anticuerpo y las proteasas de serina (Sun, M. et al., J.
Immunol 153:5121-5126 (1994); Paul, S. et
al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:241-255
(1994)). Kohen et al., publicaron que la inmunización con
esteroides o dinitrofenol conjugado a proteínas portadoras
provocaban la formación de anticuerpos con capacidad esterasa (Sun,
M. et al., J. Immunol 153:5121-5126
(1994); Paul, S. et al., Appl. Biochem. Biotechnol.
47:241-255 (1994)). Se ha demostrado que los
autoanticuerpos humanos hidrolizan el neuropéptido VIP (Ll, L. et
al., Mol. Immunol. 1996, in press.) Se ha reproducido la
hidrólisis de VIP catalizado por autoanticuerpo (Ll, L. et
al., J. Immunol. 154:3328-3332 (1995)).
Otros grupos han mostrado hidrólisis de ADN mediada por
autoanticuerpo (Tyutyulkova, S. et al., Biochimica
Biophysica Acta 1996, in press.; Kalaga, R. et al., J.
Immunol. 155:2695-2702 (1995)).
Los anticuerpos con actividad enzimática ofrecen
la posibilidad de conversión química catalítica de ligandos
específica y con alta eficacia. Muchos mediadores biológicos son
péptidos o proteínas, incluyendo los antígenos de organismos
patógenos, hormonas, neurotransmisores y antígenos específicos de
tumores. Es posible utilizar el enorme repertorio de
especificidades que el sistema inmune abarca para catalizar
reacciones químicas que no están incluidas en los enzimas que se
encuentran de manera natural. La combinación de la especificidad de
anticuerpo con el poder catalítico de los enzimas tiene el potencial
de generar agentes terapéuticos potentes, p. e., anticuerpos
catalíticos capaces de hidrolizar específicamente las proteínas de
la cubierta vírica de cierre.
No se ha desarrollado aún una cura para la
infección por VIH. Los tratamientos disponibles hasta la fecha
tienen como finalidad inhibir la replicación vírica para prolongar
el periodo de latencia de la enfermedad. La presente invención
proporciona procedimientos y composiciones que se pueden utilizar en
pacientes con SIDA para reducir el nivel de VIH y de gp120 soluble
en el cuerpo. La administración de estas composiciones a pacientes
puede aliviar los síntomas neurológicos en pacientes que sufren de
demencia relacionada con el SIDA.
La presente invención comprende anticuerpos
anti-gp120 hidrolíticos y componentes de anticuerpos
de cadena L aislados de sueros de pacientes que cortan
eficientemente gp120 en subfragmentos inactivos. Se proporcionan
procedimientos para el aislamiento y la purificación de anticuerpos
catalíticos y de componentes de anticuerpos que median la
hidrólisis de gp120.
Realizaciones preferidas de la invención son los
anticuerpos y componentes de los anticuerpos producidos utilizando
procedimientos recombinantes. Siguiendo al cribado de los sueros por
actividad de escisión de gp120, se aíslan los linfocitos de la
sangre periférica y se usan como una fuente de ARNm que codifica la
actividad para generar una librería de ADNc. Se consigue el
aislamiento de los genes que codifican los anticuerpos catalíticos
y los componentes de anticuerpo de la invención utilizando
procedimientos ampliamente conocidos por los expertos en la
materia. Se contemplan la exhibición en fagos de las cadenas L de la
invención para el aislamiento de los clones que expresan cadenas L.
También se prevé la clonación del repertorio inmune a partir de
linfocitos aislados procedentes de pacientes con
VIH-1 y de pacientes con SLE utilizando cebadores
para las regiones conservadas de los genes de IgG.
Después del aislamiento, expresión y
purificación de los anticuerpos y componentes de anticuerpo
recombinantes que hidrolizan gp120, se proporciona la metodología
para la administración a pacientes infectados por VIH. Se puede
administrar por vía intravenosa el anticuerpo catalítico que escinde
gp120 o sus componentes en una preparación farmacéuticamente
adecuada. Alternativamente, los anticuerpos hidrolíticos de gp120 de
la invención se pueden administrar vía cánula al compartimiento
intraventricular del cerebro. Las cadenas L catalíticas de la
invención se pueden fusionar traduccionalmente con transferrina para
mediar el paso a través de la barrera hematoencefálica en pacientes
infectados con VIH-1.
Figura 1 es un gel teñido con plata de proteínas
de Bence Jones y sus dominios V_{L} en condiciones reductoras (A)
y no reductoras (B).
Figura 2A es un autoradiograma que ilustra la
hidrólisis de gp120 radiomarcada incubada con la cadena L
Lay-2 durante 6 horas a 37ºC.
Figura 2B es un gel SDS-page
teñido con plata que muestra la hidrólisis de gp120 no marcada por
parte de la cadena L Lay2.
Figura 3 es un gráfico que muestra la progresiva
depleción del sustrato de gp120 radiomarcado en presencia de
concentraciones crecientes de la cadena L Lay2.
Figura 4 es un gráfico que representa la
dependencia del pH de la hidrólisis catalizada por la cadena L
Lay-2 de gp120 radiomarcada.
Figura 5 es un gráfico que muestra la reducción
de neurotoxicidad de gp120 en células neuronales siguiendo un
tratamiento con la cadena L de Lay2.
Figura 6 es un gráfico que muestra la inhibición
de la infectividad de VIH-1 mediante pretratamiento
con la cadena L Lay2.
Figura 7 es un gel que muestra el tamaño del
ADNc que codifica el dominio V_{L} de Lay2 sintetizado por PCR
recursivo.
Figura 8 es un autorradiograma que muestra la
hidrólisis de gp120 radiomarcada por parte de cadenas L aisladas a
partir de un paciente con SLE.
Figura 9 es un autorradiograma que muestra la
hidrólisis de gp120 radiomarcada por cadenas L aisladas procedentes
de un paciente con VIH.
El descubrimiento no anticipado de que una
proteína humana normal es capaz de reconocer específicamente a
gp120 y catalizar la lisis de un enlace peptídico en gp120, abre la
posibilidad de desarrollar una nueva intervención terapéutica en el
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se puede utilizar
farmacológicamente un anticuerpo hidrolítico
anti-gp120 en el tratamiento de enfermos con SIDA,
por ejemplo en el tratamiento de la demencia relacionada con el
SIDA. Datos preliminares han indicado que la proteólisis de
anti-gp120 elimina la neurotoxicidad mediada por
gp120. Otra y más directa aplicación sería una solución de proteína
inyectable que mediante unión a, y escisión de gp120, disminuiría
la infectividad del VIH, ya sea destruyendo el sitio de unión al
receptor de gp120 o desestabilizando el sitio de unión del receptor
vírico. Se puede utilizar el anticuerpo hidrolítico de gp120 como
un suplemento del sistema inmune para potenciar la capacidad de los
mecanismos naturales del cuerpo para controlar la enfermedad. Se
aisló una de las cadenas L con actividad hidrolizante de gp120
ejemplificada en esta solicitud procedente de un paciente con
mieloma múltiple (Lay2). Se desconoce el estimulo antigénico
original responsable de la especificidad de la cadena L del mieloma.
La reacción de la cadena L con gp120 puede reflejar un fenómeno de
reactividad cruzada, debido a un ajuste estructural fortuito entre
el sitio de unión y gp120. En el momento de la muerte del paciente,
el SIDA no era una entidad clínica reconocida y se desconoce cuándo
el paciente dio positivo para los anticuerpos del
VIH-1. El mieloma múltiple se puede dar con
frecuencia aumentada en pacientes con SIDA (Erhan, S., et
al., Nature 251:353-355 (1974)), pero no
hay ninguna evidencia de que el donante de la cadena L catalítica
tuviera SIDA.
Recientes informes han demostrado que la
infección por VIH implica un equilibrio entre la replicación rápida
del VIH y una alta renovación de las células T de CD4 (Wei et
al., Nature 373:123-126 (1995). Un
tratamiento proteolítico agresivo específico del virus en esta
etapa, cuando el sistema inmune aún esta fuerte y que contiene la
infección, potenciaría la posibilidad de eliminar la infección, o de
prolongar el periodo de latencia.
Se proporcionan los siguientes ejemplos para
describir el invento con mayor detalle. No tienen la intención de
limitar en absoluto la invención.
Se han descrito veintinueve cadenas L de
anticuerpo monoclonal purificadas de pacientes con mieloma múltiple
(Solomon, A., Meth. Enzym. 116:101-121
(1985); se cribaron anticuerpos policlonales
anti-VIP en muestras proporcionadas por el Dr.
Solomon, University of Tennessee), una cadena L recombinante con
actividad hidrolizante de VIP (Gao, Q-S., et
al., J. Biol. Chem. 269:32389-32393
(1994)) y (Paul, S., et al., J. Biol. Chem
266:16128-16134 (1991) por su capacidad para
hidrolizar gp120 marcada con I^{121}. Se utilizó el procedimiento
de la cloramina T para el marcaje con radio de gp120
electroforéticamente pura (IIIB; AIDS Research and Reference
Reagente Program, NIH) seguido de una filtración por gel para la
purificación de gp120-I^{121}. Se observó una
única banda de gp120 radiomarcada a 120 kD con
SDS-PAGE y con autorradiografía. La figura 1 es un
gel de SDS-PAGE teñido con plata que muestra la
pureza de la preparación de cadena L. Se incubaron las cadenas L con
gp120-I^{121} y se analizaron las mezclas de la
reacción mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y autorradiografía cuantitativa
(Brugger, C., et al., J. Biol. Chem.
266:18358-18362 (1991). Se identificó una
cadena L humana con actividad hidrolizante de gp120 (Lay2). El
resto de cadenas L y de anticuerpos anti-VIP estaban
desprovistos de actividad. La actividad hidrolizante de gp120
proviene de la coelución a partir de una columna de filtración en
gel con el pico de la cadena L de la proteína. Se observó la
escisión casi equivalente de gp120 por parte de Lay2 en tampones
fisiológicos y en medios con nutrientes (salino tamponado con
fosfato (PBS), solución salina tamponada de Hank (HBSS) y RPMI
1640). Fueron evidentes, por electroforesis no reductora, cuatro
productos de escisión de gp120 marcadas con radio con masas de
aproximadamente 80 kD, una mancha alrededor de 50 kD, 20 kD, y
<6 kD. Ver Figura 2A. La banda de 80 kD pareció sufrir
fragmentación bajo condiciones reductoras, sugiriendo que contenía
fragmentos unidos a disulfuro. Se observaron perfiles idénticos de
productos utilizando preparaciones de
gp120-I^{121} derivadas a partir de cepas de
VIH-1, IIIB, SF2 y MN. La banda de 80 kD
radiomarcada pareció sufrir una nueva digestión bajo incubación
prolongada de hasta 36 horas. Los perfiles de escisión de gp120 sin
marcar y de gp120 radiomarcada fueron similares, excepto por la
intensidad de las bandas individuales que fueron diferentes, lo
cual, probablemente, fuera un reflejo de los procedimientos
utilizados para la detección de los dos tipos de sustratos (teñido
con plata versus marcaje con I^{121} en residuos Tyr seguidos por
autoradiografía). Se hidrolizó con Lay2 (250 nM; 6 horas) la gp120
no marcada, aislada a partir de cepas de VIH-1
IIIB, SF2 y MN, hasta niveles similares (50, 44 y 60%,
respectivamente), y se estimó las intensidades de las bandas con el
Scanning cuantitativo.
La inmunotransferencia de geles reductores con
un anticuerpo de anti-gp120 que reconoce los
productos de la ruptura proteolítica de la proteína (Pollard, S.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:11320-11324 (1991)) produjo bandas de
productos bien definidas generadas por Lay2. Ver Figura 2B. El
aumento de la hidrólisis de gp120 fue evidente a concentraciones
aumentadas de Lay2, como se muestra en la Figura 3, estimado como
la reducción en intensidad de la banda del sustrato de 120 kD. Esto
iba acompañado de un aumento de la acumulación de los productos de
80 kD y de los otros productos de escisión.
Las estimaciones de las cinéticas obtenidas por
incubación de 20 nM de Lay2 con concentraciones aumentadas de Lay2
(10-300 nM) produjeron tasas iniciales que se
pudieron ajustar a la ecuación de Michaelis-Menten.
El valor Km aparente de la reacción fue de 30 nM y la Vmax fue de
0,06 nmol gp120/nmolLay2/h. Se muestra comparativamente la alta
afinidad de gp120 para Lay2 mediante observaciones de que la
hidrólisis catalizada por tripsina analizada en reacciones en
paralelo no fue saturable en concentraciones de hasta 1 \mumol,
sugiriendo que la Km de tripsina para gp120 era sustancialmente
mayor que el de Lay2.
No hubo hidrólisis de
albúmina-I^{121} mediada por Lay2, sugiriendo que
la hidrólisis de gp120 observada no es un fenómeno no específico,
Figura 2A. Concentraciones aumentadas de VIP inhibieron la
hidrólisis de gp120-I^{121} mediada por Lay2 (Ki
aparente de VIP, 620 nM). Lay2 también hidrolizó VIP marcado con
radio, con un Km de 144 nM. Basado en la comparación de sus Km para
gp120 y Ki/Km para VIP, Lay2 aparece unido a gp120 alrededor de
5-21 veces mas fuertemente plegado que a VIP, gp120
tiene dos regiones cortas de homología con VIP (LaRosa, G.J., et
al., Science 149:932-935 (1990); Gomy, M., et
al., J. Immunol. 150:635-643 (1993)),
que podrían ser fundamentales en la reactividad de ambos
polipéptidos con Lay2.
El pH óptimo para la hidrólisis de gp120 por
parte de Lay2 estuvo en la franja neutra, como se muestra en la
Figura 4, sugiriendo la implicación de residuos de aminoácidos con
valores de pKa neutros como los residuos catalíticos (Ser, Thr,
Tyr, His) en presencia de un inhibidor de la proteasa sérica (0,3 mM
de diisopropilfluorofosfato), la hidrólisis catalizada por Lay2
esencialmente fue inhibida por completo. En comparación, los
inhibidores de las metalproteasas, proteasas de la cisteína y
proteasas ácidas (EDTA, yodoacetamida, Pepstatina A) no tuvieron
ningún efecto en la reacción. Estas observaciones sugieren que un
residuo de Ser puede estar implicado en la hidrólisis de gp120.
Se ha determinado la secuencia de Lay2. Lay2 es
un miembro del subgrupo kappa IIc. El número de residuos de Ser/Thr
en los CDR de esta cadena L es inusualmente alto. La mutagénesis
dirigida de una cadena L anti-VIP ha demostrado que
su Ser27a y His93 son los residuos catalíticos. Un residuo de Ser
está también presente en la posición 27 de Lay2. La posición 93 en
Lay2 está ocupada por Glu (en vez de His en la cadena L de
anti-VIP). En un modelo preliminar de Lay2 generado
utilizando el programa de ordenador AbM (Martin, A.C.R., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:9268-9272 (1989)), Ser27a y Glu93 se
encuentran dentro de la distancia de enlace de hidrógeno (2,9
amgstrons). Si estos residuos se unen a hidrógeno, el aumento
resultante en la nucleofilicidad del residuo de Ser podría permitir
su participación en la hidrólisis del enlace peptídico mediante un
mecanismo análogo al que tiene lugar en la catálisis de la proteasa
de serina.
Se compararon los efectos de gp120 control y
gp120 tratada con Lay2 (10 \muM, 30 horas) en cuanto a la
viabilidad de las células corticales del cerebro cultivadas de
ratón. Como se ha referido previamente (Brenneman, D.E., et
al., Nature 335:639-642 (1988)),
concentraciones subpicomolares de gp120 control eran tóxicas para
estas células. Brevemente, se prepararon las células corticales del
cerebro a partir de ratas Wistar recién nacidas, utilizando 0,25%
de tripsina para disociar el tejido. Se cultivaron las células en un
medio MEM con suplemento de suero fetal de ternero al 10%. Después
de 2 días, alrededor del 80% de las células eran neuronas y
alrededor del 20% eran astrocitos gliales positivos a la proteína
acídica fibrilar. Siguiendo el tratamiento con Lay2, se redujo la
potencia de gp120 por más de 10 pliegues, correspondiendo
directamente al nivel de hidrólisis. Ver Figura 5. La
electroforesis y la tinción con plata de gp120 tratada con Lay2
mostraron que alrededor del 85% de la proteína había sido digerida.
Lay2 control sin gp120 no manifestó un efecto neurotóxico.
Se probó Lay2 por su capacidad para inhibir la
infectividad de VIH-1. Bajo condiciones libres de
suero, el pretratamiento con esta cadena L catalítica inhibió de
manera efectiva la infección por VIH-1 (IIIB) en
células MT-2, una línea de células T, según se
determinó a través de la observación microscópica de los efectos
citopáticos (formación del sincitio) y del ensayo del microcultivo
en tetrazolio (MTA) utilizando el hidróxido del
2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)5-[(fenilamino)-2H-tetrazolio.
Ver Figura 6. La multiplicidad de infección (MOI) en este
experimento fue de 3,2. A valores menores de MOI, es posible que la
cadena L manifieste incluso una mejor potencia. El tratamiento de
las células con la cadena L en ausencia de VIH-1 no
produjo un efecto citopático. Estos resultados indican que la
cadena L es capaz de reconocer y romper la gp120 natural.
Como se ha mencionado previamente, el Dr. Alan
Solomon, University of Tennessee proporcionó la proteína humana de
Bence Jones llamada Lay2, recogida de un paciente ahora fallecido.
Se hizo frente a la necesidad de un suministro regenerable del
catalizador con la construcción de una forma recombinante de Lay2 en
un sistema de expresión bacteriano. Se espera que esto permita la
manipulación genética de derivados de Lay2 con características
catalizadoras mejoradas.
En la patente U.S. Nº. 5.229.272, se ha
descrito la clonación y el aislamiento con éxito de una cadena L
con actividad contra el péptido intestinal vasoactivo, cuya completa
descripción está incorporada como referencia en el presente
documento.
Se ha determinado previamente la secuencia del
dominio variable de la cadena L de Lay2 en el laboratorio del Dr.
Solomon. La porción codificada de exón V difiere de aquella de uno
de los tres genes de línea germinal (011-01)
(Klein, R., et al., Eur. J. Immunol.
23:3248-3271 (1993)) que codifican la familia
de cadenas L II humanas en seis posiciones. De estas diferencias,
que presumiblemente reflejan mutaciones somáticas, una implica una
posición CDR. En la posición 92 de CDR3, Lay2 tiene un residuo Leu
en vez de IIe. Las cinco diferencias restantes entre la proteína
Lay2 y el gen 011-01 implican los sitios FR lejanos
de los segmentos CDR; Lay2 también tiene un residuo adicional, Glu,
en la posición 0, que representa una séptima variación de
significado desconocido. Es notable la similitud entre la secuencia
de Lay2 y la secuencia 011-01 de línea germinal, en
eso se podría reflejar la capacidad de otros dominios V_{L}
derivados de este gen de línea germinal de unirse e hidrolizar
gp120.
Se ha sintetizado el ADNc que codifica la
proteína del dominio V_{L} de Lay2 por medio de PCR recursiva.
Ver Figura 7. Se podría expresar la forma recombinante de la
proteína completamente funcional tal como la descrita más abajo. Se
han utilizado previamente estos procedimientos para construir con
éxito genes que codifican dominios humanos variables
(Wilkins-Stevens. P., et al., Prot. Science
4:421-432 (1995). Brevemente, la construcción
del ADNc del dominio V_{L} implica el uso de PCR recursiva
(Prodromou, C., et al., Prot. Eng.
5:827-829 (1992)) para unir ocho
oligonucleótidos sintéticos solapados que proporcionan codones que
se extendien al dominio V_{L} completo, una secuencia señal
N-terminal y secuencias flanqueadoras que contienen
los sitios de restricción Sfil y Notl para permitir la inserción en
un vector de expresión. El ADNc también incluye un segmento corto
C-terminal de unión que se usa para construir un
Fv.
Se aisló la cadena L descrita en la sección
anterior mediante cribado aleatorio de pacientes con mieloma
múltiple. Se sabe que los anticuerpos catalíticos se forman a altos
niveles en enfermedades autoinmunes como el Lupus, y se han
encontrado anticuerpos unidos a gp120 en pacientes con SLE. Esta
observación nos ha motivado a analizar pacientes seropositivos con
VIH-1 y pacientes con Lupus por la presencia de
anticuerpos catalíticos de gp120.
La fracción IgG purificada a partir del suero
(-0,5 ml) de pacientes con SIDA y de pacientes con SLE se purificó
mediante cromatografía en DEAE-celulosa (DE52
matrix, Whatman) o Sefarosa-Proteína G (Pharmacia)
en 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,002% de azida
sódica. Se obtuvieron las fracciones de IgG como material no unido
a partir de la columna de DEAE-celulosa y como
proteína ácida eliminada a partir de la columna de Proteína G. La
eliminación se hizo utilizando 100 mM de glicina, a pH 2,7, seguida
de una neutralización de la solución con base Tris 1M, a pH 9,0.
Desde que se sabe que las preparaciones de IgG contienen pequeñas
cantidades de cadenas L libres, la IgG purificada con
celulosa-DEAE se somete a otra cromatografía en
columna de filtración en gel de alta resolución
(Superosa-12, Pharmacia) en 50 mM de
Tris-HCl, 100 ml de glicina, 150 mM de NaCl, 0,025%
de Tween 20, 0,02% de azida sódica, a pH 7,5 (velocidad de flujo 0,5
ml/minuto; tamaño de fracción 0,5 ml). Se identificaron las cadenas
L presentes en la IgG purificada mediante la
celulosa-DEAE como la fracción que se elimina con
masa de 25 kD basada en la calibración de la columna con proteínas
estándares con masa conocida. Se obtuvieron las concentraciones de
proteínas mediante la medición de la absorbancia de la luz
ultravioleta a 280 mn (0,8 mg/ml de solución de proteína da una
lectura de 1,0 de densidad óptica a 280 mn utilizando una cubeta de
longitud de recorrido de 1 cm). Se midió la escisión de gp120
mediante electroforesis SDS y autoradiografía como se describe en
la sección anterior.
Los sueros descritos arriba son policlonales. Se
podría llevar a cabo la resolución de cadenas L individuales
utilizando dos electroforesis en gel dimensional seguidas de
electroelución de las cadenas L individuales. Un vez aisladas las
cadenas L del monómero, se llevaría a cabo un péptido amino terminal
secuenciante para generar sondas de oligonucleótidos específicos
con el propósito de clonar.
La Figura 8 muestra que la incubación de
gp120-I^{125} (2 nM) con IgG (3 \muM) purificada
con sefarosa de proteína G a partir de un paciente con SLE (código
de laboratorio #530) durante 18 horas a 37ºC terminó con la
aparición de productos de escisión de gp120 que corresponden a una
mancha a alrededor de 110 kD y bandas de resolución con masas de 37
kD, 24 kD y 10 kD. La gp120 intacta es evidente como la banda de 120
kD. La mancha de 110 kD podría ser una mezcla de polipéptidos o
podrían ser unos productos individuales que están demasiado
próximos en masa a gp120 intacta para permitir su separación limpia
mediante los procedimientos experimentales aplicados en este
experimento.
La Figura 9 muestra la incubación de
gp120-I^{125} (2 nM) con cadenas L purificadas a
partir de un paciente VIH positivo (código de laboratorio #005)
durante 17 horas a 37ºC que terminó con la aparición de con la
aparición de productos de escisión de gp120 que corresponden a 90
kD, 25 kD, 12 kD y < 10 kD. Fracciones similares de cadenas L
procedentes de controles negativos de VIH no manifestaron actividad
de escisión de gp120. Se sabe que las concentraciones de cadenas L
en preparaciones de IgG como la utilizada para la filtración en gel
de este experimento, son muy pequeñas. La
electroforesis-SDS y la tinción con plata mostraron
que la concentración de cadena L en esta fracción de IgG fue de
< del 1,5%. Se puede calcular la actividad específica (%
escisión de la concentración de gp120/proteína) de las cadenas L
utilizadas como catalizadoras, para que sea por lo menos 112
pliegues más grande que la cadena L del anticuerpo catalítico de
Lay2 descrita en la sección precedente.
Estas observaciones demuestran que la síntesis
de cadenas L con actividad de escisión de gp120 podría ser un
componente bastante común de la respuesta inmune en pacientes con
VIH-1 y SLE. Se puede obtener un suministro
regenerador de cadenas L clonando el repertorio inmune de los
pacientes arriba mencionado utilizando técnicas que han conseguido
aislar con éxito las cadenas L que cortan VIP procedentes de un
paciente con asma, como se describe en Gao et al., en
Antibody Engineering Protocols paginas
51:286-291, ed. S. Paul, Humana Press,
Totowa, NJ, (1995).
Se pueden aislar rápidamente anticuerpos poco
comunes mediante cromatografía de afinidad específica del ligando
de partículas de fago, que muestran fragmentos de anticuerpos
recombinantes en su superficie, como las proteínas de fusión del
gen III. Se ha preparado una biblioteca de fagos que exhiben cadena
VL a partir de linfocitos de sangre periférica de un paciente con
asma (Tyutyulkova, S. et al., Appl. Biochem. Biotech.
47:191-198 (1994); Tyutyulkova, S. et al., en
Antibody Engineering Protocols, páginas
5121:377-394, ed. S. Paul, Humana Press,
Totowa, NJ, (1995). En estos experimentos, se enriquecieron las
partículas de fago con actividad de unión a VIP mediante
cromatografía de afinidad sobre VIP inmovilizado. Se expresaron, en
E. coli, dos cadenas L que se unen a VIP en forma soluble, se
dedujo su estructura primaria mediante secuenciación de ADNc y se
purificaron las proteínas hasta la homogeneidad electroforética
mediante quelación con metal y cromatografía de afinidad con
proteína L.
Se midió la actividad proteolítica de las
cadenas L utilizando el sustrato de VIP
(Tir10-I^{125}). Fue evidente un aumento lineal
de la hidrólisis de VIP con concentraciones incrementadas de cadenas
L recombinantes. La reacción de ambas cadenas L mostró cinéticas de
saturación con respecto a la concentración del sustrato. Las
eficiencias cinéticas (kcat/km), utilizando VIP como sustrato,
fueron mejores o comparables a la de la tripsina, una proteasa
altamente desarrollada. Las cadenas L no catalizaron el corte de
resorufina, un sustrato no específico de proteasa. La forma
monomérica de la cadena L fue la responsable de la hidrólisis de
VIP, se demostró con la pérdida de la actividad a -26 kD a partir
de una columna de filtración en gel.
Se pueden adaptar procedimientos similares para
clonar y expresar las cadenas L de los pacientes con VIH y con SLE
descritos arriba. Se recogerían linfocitos de sangre periférica, y
ADNc de cadena L preparada mediante el procedimiento PCR de
transcriptasa inversa. Se clonarían entonces los productos de PCR en
el vector del fago pCANTABhis6, que permite la manifestación de las
cadenas L en la superficie de las partículas de fago o su expresión
como proteínas solubles. Después de la electroporación de células
TG1 de E. coli competentes con ADN del fago, se rescataron
partículas de fago que mostraban cadenas L fusionadas a proteína 3
mediante una superinfección con el fago auxiliar VCSM13,
precipitado con polietilenglicol y sujeto a cromatografía de
afinidad sobre una columna de gp120-sefarosa. Se
aislarán clones mediante elución a pH bajo y se probará su unión a
gp120 mediante radioinmunoensayo y/o ELISA. Los clones crecerían en
células de E. coli y se inducirían los cultivos con IPTG (1
mM) durante 24 horas para permitir la secreción de las cadenas L
solubles en el sobrenadante. Se podrían expresar las cadenas L en
el espacio periplásmico reduciendo el periodo de inducción con IPTG
de 24 a 3 horas.
Como se ha mencionado previamente, los
anticuerpos catalíticos se sintetizan como respuesta a la
inmunización con sustrato. Se ha clonado una librería de cadenas L
de anticuerpo a partir de un ratón inmunizado con VIP. Se determinó
la actividad proteolítica de los clones de cadena L seleccionadas
aleatoriamente o seleccionadas basándose en su actividad de unión
al antígeno. Se hizo la selección mediante cromatografía de fagos
sobre VIP inmovilizada. Se aislaron potentes catalizadores capaces
de hidrolizar VIP (Tir10-I^{125}) y sustratos de
proteasa genérica
(péptido-metil-courmarinamidas). Los
clones que se seleccionaron basándose en su actividad de unión a
VIP mostraron una catálisis aumentada en 1-2 órdenes
de magnitud. El aumento de la actividad catalítica se debió a un
aumento en la afinidad de unión a VIP. Los números renovados
utilizando VIP como sustrato oscilaron entre
0,1-2,2/min. Aproximadamente el 20% de las cadenas L
purificadas a partir de 156 clones seleccionados aleatoriamente
ensayadas en proteína 10 nM, mostraron actividad catalítica
utilizando un péptido sintético como sustrato. Se ha secuenciado la
región variable de doce cadenas L y ahora se buscan secuencias
consensuadas y motivos espaciales asociados a la actividad
catalítica. Estas observaciones muestran catálisis frecuentes por
parte de un repertorio de cadenas L naturales de anticuerpo y el
desarrollo de la actividad catalítica específica de antígeno por
parte de la inmunización con un polipéptido. Esto podría ocurrir por
el desarrollo de novo de actividad catalítica debido a la
diversificación de la secuencia de la región variable o su herencia
como una actividad de línea germinal y el mantenimiento de la alta
afinidad para el inmunogen durante la maduración.
La infección con VIH-1 induce
una respuesta inmune masiva. La clonación de una librería de cadenas
L a partir de linfocitos del paciente arriba descrito, utilizando
los procedimientos expuestos en el presente documento para la
clonación de cadena L de VIP, probaría también con éxito el
aislamiento de un suministro rellenable de
anti-gp120 que hidrolice cadenas L de
anticuerpo.
Se podrían administrar los anticuerpos de cadena
L catalíticos anti-gp120 a los pacientes en un
excipiente farmacéuticamente adecuado para reducir los niveles de
antígeno de gp120 soluble en el cuerpo.
Se ha revisado al detalle el uso clínico de
inmunoglobulina para su administración vía intravenosa (IVIG). Ver,
por ejemplo, Dietrich et al., Blood
79:2946-51 (1992); Rossi et al.,
Immunol. Rev. 110:135-149 (1989); Dwyer,
J.M., New Eng. J. Med. 326:107-16, (1992);
Schwartz, S.A., J. Clin. Immunol. 10:81 (1990).
Se administrarían por vía i.v. las cadenas L
purificadas de la presente invención que hidrolizan gp120 a los
pacientes para reducir los niveles de VIH-1 soluble
y de gp120 en el cuerpo. Se ajustarían las dosis de acuerdo con la
carga vírica del paciente, y podrían oscilar entre 1/100 veces la
carga vírica con los niveles estequiométricos (1:1). Se podrían
requerir dosis sustancialmente menores para la neutralización del
virus debido a que las cadenas L son catalíticas. Se sabe que las
dosis de inmunoglobulina que oscilan entre 0,25-1
g/kg de peso corporal son seguras. Se mediría la eficacia
analizando los niveles de gp120 soluble mediante ELISA antes y
después del tratamiento.
Alternativamente, se administrarían los
anticuerpos que hidrolizan gp120 directamente a los cerebros de los
pacientes con demencia asociada a SIDA. Se ha descrito en la
literatura la introducción de los agentes terapéuticos en el
cerebro. Ver, por ejemplo, Harbaugh, R.E., Biomed. Pharmacother,
43:483-485 (1989); Johnson et al., J.
Neurosurg. 70:240-248 (1989); Giannone, L.,
et al., J. Clin. Oncol. 4:68-73
(1986).
Se podrían introducir las cadenas ligeras que
hidrolizan gp120 directamente en el compartimiento intraventricular
mediante una cánula y, alternativamente, se podrían conjugar con una
molécula de transferrina e introducirlas por vía i.v. Se conoce muy
bien, en la materia, la construcción de proteínas de fusión. Se
unirían operativamente las secuencias genéticas que codifican la
cadena L catalítica de la invención con las secuencias genéticas
que codifican la transferrina. Se ha demostrado que la transferrina
es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y de este modo
podría introducir eficazmente la cadena L de la invención en el
cerebro. (Shin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
92:2820-2824 (1995).
Claims (9)
-
\global\parskip0.940000\baselineskip
1. Anticuerpo catalítico humano aislado que cataliza la escisión de un enlace peptídico en la glicoproteína 120 del Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH), siendo obtenible dicho anticuerpo a partir del suero de humanos infectados con el VIH o partir de pacientes con SLE. - 2. Anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo es una IgG.
- 3. Fv producida de manera recombinante utilizando ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.
- 4. Procedimiento para aislar un anticuerpo humano catalítico que cataliza la escisión de gp120, que comprende las etapas de:
- a)
- cribar muestras de suero humano para la presencia de dicho anticuerpo catalítico humano al ser analizadas por la generación productos de escisión de dicha gp120 inferiores a 120 kd; y
- b)
- purificar dicho anticuerpo;
donde dicho suero procede de un paciente infectado con el VIH-1 o procede de un paciente con SLE. - 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, comprendiendo dicho procedimiento además las etapas de:
- c)
- determinar la secuencia genética del anticuerpo catalítico humano;
- d)
- insertar dicha secuencia que codifica el anticuerpo catalítico humano en una célula;
- e)
- expresar dicho anticuerpo en dicha célula.
- 6. Procedimiento para producir un anticuerpo catalítico anti-gp120 a partir del suero de humanos infectados con VIH-1 o de pacientes con SLE que comprende:
- a)
- aislar el ARNm de linfocitos de sangre periférica de dicho humano;
- b)
- generar un ADNc a partir de dicho ARNm utilizando la transcriptasa inversa-PCR;
- c)
- insertar dicho ADNc en un vector utilizando sitios adecuados de restricción; y
- d)
- incorporar dicho vector en un fago, de manera que se expresan las secuencias de ADNc y las proteínas recombinantes se exhiben en la superficie de dicho fago;
- e)
- aislar las partículas de fago que expresan dicha actividad catalítica anti-gp120 mediante cromatografía en columna;
- f)
- transformar E. coli con dicho fago que expresa dicha actividad catalítica de gp120; y
- g)
- purificar dichos anticuerpos catalíticos anti-gp120 de dichas células de E. coli transformadas.
- 7. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde el anticuerpo es una IgG.
- 8. Uso de un anticuerpo catalítico humano de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o de una Fv de acuerdo con la reivindicación 3, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un paciente VIH-1positivo, donde la preparación de un medicamento que comprende una Fv de acuerdo con la reivindicación 3 comprende:
- a)
- unir operativamente una secuencia genética que codifica dicha Fv con una secuencia que codifica transferrina;
- b)
- transformar una célula con dichas secuencias genéticas unidas operativamente de manera que se sintetiza una proteína de fusión;
- c)
- purificar dicha proteína de fusión, y
- d)
- preparar un medicamento que comprende dicha proteína de fusión para administrar a un paciente con un portador farmacéutico apropiado.
- 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 de un anticuerpo catalítico humano de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicho anticuerpo, se administra vía i.v. a una dosis que oscila entre 0,1-1 g/kg de peso corporal.
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