JPH03254693A - 抗イデオタイプ抗体作製用抗原、抗イデオタイプ抗体、及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） ）ＩＩＶ　（Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）は、ヒト後天性免疫不全症候群（
ＡＩＤＳ）の原因ウィルスである。

本発明は、抗ＨＩＶ作用を有する、ヒトＣＤ４タンパク
質の断片ペプチド（７０−１３２）　（ＣＤ４分子のＮ
末端から数えて、　７０−１３２番目のアミノ酸鎖より
成るペプチド）に含まれるペプチドを免疫原として作製
したヒトＣＤ４（７０−１３２）ペプチドと反応する抗
体（以下抗ヒトＣＤ４（７０−１３２）ペプチド抗体）
よりなる抗イデオタイプ抗体作製用抗原、該抗体を免疫
原として作製した抗イデオタイプ抗体、及びその製法に
関するものである。

抗ＨＩＶ作用を有するヒトＣＤ４（７０−１３２）ペプ
チドに含まれるペプチド（Ｈａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ
、、Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、。

１０５、１２９−１３５（１９８９））を出発抗原とし
た、抗ヒトＣＤ４（７０−１３２）ペプチド抗体及び抗
イデオタイプ抗体は１期待された通り抗ＨＩＶ作用を示
した。特に抗イデオタイプ抗体は、顕著な抗ＨＩＶ作用
を有していた。すなわち１本杭体は、　ＨＩＶを不活化
し、Ｔリンパ球への感染を阻害するのと同時に、ＨＩＶ
の感染したＴリンパ球を不活化し、非感染Ｔリンパ球へ
の細胞間感染を防止する能力を有するものであった。

従って、本発明は、　ＡＩＤＳの予防、治療薬として利
用することにより画期的な効果が期待されるものである
。

本発明中の抗体は、直接使用してもよいが、該抗体を応
用した抗ＨＩＶ薬１例えば、該抗体をターゲティング因
子として細胞毒素や、毒素含有リポソームに結合したＨ
ＩＶ感染細胞の選択的殺傷剤の開発等を通じて、有効な
治療薬を持たないＡＩＤＳ臨床医療分野に、大きく貢献
するものである。また。

ＨＩＶ感染機構の解析、Ｔリンパ細胞の動態を解析する
手段として本発明を利用することにより、基礎医療分野
に大きく貢献するものである。

（従来の技＄１！ｒ） ヒトＣＤ４タンパク質は、Ｔリンパ球の細胞膜を貫通す
る膜タンパク質である。ＨＩＶのＴリンパ球への感染は
、ＨＩＶ外被タンパク質と、ＣＤ４タンパク質との結合
を第１の端緒として開始される。すなわち、ＣＤ４タン
パク質は、ＨＩＶ感染における細胞側のレセプタータン
パク質となることが報告されている（Ｄａｌｇｌｅｉｓ
ｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２．７６３
−７６７（１９８４）、　　Ｋｌａｔｚｍａｎｎ　ｅｔ
　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ＋　　３１２．　７６７７
６８　　（１９８４）、　　Ｍｃ、　Ｄｏｕｇａｌ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　５ｃｉｏｎａ、　　２３１゜３８２−３
８５　　（１９８６）、　５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　３２２゜４７０−４７４
　　（１９８６）、　Ｌａ５ｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ
ｅ１１．　５０．９７５−９８５（１９８７））、この
ため、ＣＤ４タンパク質には、ＨＩＶ外被タンパク質と
結合する、特定の領域が存在するものと考えられる。

従って、この両者の結合を選択的にブロックすることに
より、　ＨＩＶの感染防止、ひいては、抗ＨＩＶ剤の開
発が可能となる。

従来の技術において、上記の原理に基いた。抗ＨＩＶ作
用を有する物質の報告例は、いくつか存在する。第１に
は、可溶性ＣＤ４タンパク質（ＣＤ４分子中の膜外部分
のみを、遺伝子工学的に発現させた可溶性タンパク質）
を用いる方法である。可溶性ＣＤ４タンパク質は、ＨＩ
Ｖ外被タンパク質と選択的に結合し、これをマスクする
ことにより、細胞上のＣＤ４タンパク質と、これとの結
合をブロックすることが可能である。

第２には、抗ＣＤ４抗体を用いる方法である。抗ＣＤ４
抗体は、Ｔリンパ細胞上のＣＤ４タンパク質と選択的に
結合し、これをマスクすることにより、ＨＩＶ外被タン
パク質とこれとの結合をブロックすることが可能である
。ヒトＣＤ４タンパク質を免疫原として作製されたマウ
スモノクローナル抗体としては、０ＫＴ４．０ＫＴ４Ａ
（Ｂ、　Ｃ，Ｄ、　Ｅ、　Ｆ）、　Ｌｅｕ　３ａ９ＭＴ
１５１などが、一般に知られている（Ｓａｔｔｅｎｔａ
ｕ　ｅｔａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３４．１１２
０−１１２３　（１９８６））。その中でも、抗ＨＩＶ
作用の強い、０ＫＴ４Ａ、　Ｌａｕ３ａに関する研究が
進められている（Ｊａｍｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５
ｃｉｅｎｃｅ。

２４０、１３３５−１３３９（１９８ｇ））。第３には
、　ＣＤ４タンパク質の断片ペプチドを用いる方法であ
る。　　ＣＤ４タンパク質の断片ペプチドのうち、　　
ＨＩＶ外被タンパク質との結合部位に相当するものは、
ＨＩＶ外被タンパク質と選択的に結合し、これをマスク
することにより、Ｔリンパ細胞上のＣＤ４タンパク質と
の結合をブロックすることが可能である。今までにＣＤ
４　（７６−９４）、Ｃｙｓ”−Ｂｚｎペプチド（Ｌｉ
ｆｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１．７１２−７１６（１９８８
））、及びＣＤ４（７０−１３２）、Ｃｙ８　ｍ　Ｇ、
Ｃｙｓ１３２−ｄｉＡｃ＋ａペプチド（Ｈａｙａｓｈｉ
　ａｔ　ａｌ、）などが、抗ＨＩＶ作用を有するＣＤ４
ペプチドとして報告されている。

（発明が解決しようとする課題） 従来の技術に説明した原理に基き、それぞれの方法を実
用化していく上で、いくつかの点が解決すべき課題とし
て明らかとなった。すなわち、第１法においては、まず
、可溶性ＣＤ４タンパク質を生体内に投与した場合、血
中半減期が短いことが挙げられる。従って、短い投与間
隔で多量に投与しなければならず生体の健康面及びコス
ト面において、実用的ではない。更に、血中のＣＤ４濃
度が上昇すると、ＣＤ４本来の機能（抗原認識機構〉を
妨げることになり、生体の免疫機能を低下させる恐れが
ある。第２法においては、まず、０ＫＴ４Ａ、Ｌｅｕ３
ａのエピトープペプチドとされる、ヒトＣＤ４ペプチド
（１１−４０）　、　（１８−５１）、　（１８−６９
）　、　（２６−４７）には、抗ＨＩＶ作用が認められ
ないことが問題となる。このことから、これらの抗ＣＤ
４抗体が、ＣＤ４タンパク質上のＨＩＶ外被タンパク質
との特異的結合部位と結合していないことが予想される
。抗体分子（ＩｇＧ、分子量約１５０ｋＤ）は、ＣＤ４
タンパク質（分子量約５５ｋＤ）に比べ、かなり大きい
ので、結合時には、　ＣＤ４タンパク質を空間的に大き
く覆ってしまう。このため、抗ＨＩＶ作用は、ＣＤ４タ
ンパク質上のＨＩＶ外被外被タンパ上質特異的結合部位
をマスクしなくても示されることになる。しかしながら
、この場合、本発明中に示されるような、抗イデオタイ
プ抗体の作製時には、ＨＩＶ外被外被タンパ上質合しな
い、すなわち、意味をなさない抗イデオタイプ抗体以外
作製し得ない。加えて、生体内に投与した場合。

Ｔリンパ細胞上のＣＤ４タンパク質をマスクしてしまう
ため、可溶性ＣＤ４タンパク質の場合と同様。

ＣＤ４本来の機能を妨げることが予想される。第３法に
おいては、ペプチドの分子量が小さいため生体内に投与
した場合抗原性が少なく、また、ＣＤ４本来の機能の阻
害も僅少に抑えられる反面、血中半減期が短いため高濃
度かつ多量の投与が必要となる。

以上のことから、１）生体内での有効期間が長い（血中
半減期の長い）、２）ＣＤ４本来の機能を妨げない、と
いった課題を克服した物質の開発が急務と考えられる。

（課題を解決するための手段） 本研究者等は、このような課題を解決すべく、鋭意研究
を重ねた結果、ｌ）血中半減期を伸ばすためには、生体
内で実際に多大な役割を果している抗体分子（免疫グロ
ブリン）を応用したものであること、２）ＣＤ４本来の
機能を保存するためにはＣＤ４タンパク質上のＨＩＶ外
被外被タンパ上質応する領域のみを利用し、他の領域の
使用を極力避けること、という認識に到達した。この２
点の認識を満足する物質として、本研究者等は、抗ＨＩ
Ｖ作用を持つＣＤ４タンパク質断片ペプチドの抗イデオ
タイプ抗体の作製を発意したのである。該ペプチドＣＤ
４（７０−１３２）は、分子量的にＣＤ４タンパク質の
１７７であるのでＣＤ４本来の機能が保存可能と考えら
れるうえ、強い抗ＨＩＶ作用を有しているので、ＨＩＶ
外被外被タンパ上質特異的結合部位であるとされている
。従って該ペプチドに対する抗体のイデオトープに対す
る抗体、すなわち、本研究者らの目指す抗イデオタイプ
抗体は、ＣＤ４タンパク質本来の機能を、そこなわず、
　　ＨＩＶ外被外被タンパ上質異的に結合し、Ｔリンパ
球上のＣＤ４タンパク質との結合をブロックし、抗ＨＩ
Ｖ作用を示すものである。加えて、該抗イデオタイプ抗
体の本体は免疫グロブリン（ＩｇＧ）であるので、血中
半減期は、大きく向上するものである。更に、ＨＩＶ感
染細胞に該抗イデオタイプ抗体を用いた場合、細胞表面
に発現したＨＩＶ外被外被タンパ上質異的に結合するこ
とにより、補体系や、細胞性免疫を誘導し、これを殺傷
することも可能である。

また更にＨＩＶ外被外被タンパ上質Ｄ４タンパク質との
結合領域の遺伝子構造は、さまざまなＨＩＶ分離株にお
いて強く保存されており、すべてのＨＩＶに共通すると
考えられているので、ここに示される抗イデオタイプ抗
体は、すべてのＨＩＶ株について抗ＨＩＶ作用を期待で
きるものである。

本来、ＨＩＶは遺伝子突然変異を多発し、とりわけ、外
被糖タンパク質ｇＰ１２０、ｇｐ’ｌ　１に頻発するた
め、これらの示す抗原性は、容易に変化してしまう。こ
のため従来技術によっては、すべてのＨＩＶ株に有効な
ワクチンの開発が困難であった。

本発明に示される物質及び手法は、ＨＩＶの感染にかか
わる。すべてのＨＩＶ株に共通かつ抗原性の不変な領域
に着目するものである。従って１本発明を応用したワク
チンは、従来技術を克服し、すべてのＨＩＶ株に有効と
思われる。

以上の観点に基き１本研究者等は、研究を続け。

まず、ＣＤ４（７０−１３２）ペプチドに対する抗体を
作製した。この抗ＣＤ４（７０−１３２）ペプチド抗体
は、予想された通り、抗ＨＩＶ作用を有していた。更に
該抗体を免疫原として抗イデオタイプ抗体を調製し、多
数の試験例を重ねた結果、抗ＨＩＶ作用を有する抗イデ
オタイプ抗体を確認し１本発明を完成させたのである。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明を実施するには、まず第１段階として抗ｃｏ４（
７０−１３２）ペプチド抗体の抗原となるヒトＣＤ４ペ
プチドを用意する０本発明に使用するペプチドの配列は
、後述しであるアミノ酸配列を有する（７０−１３２）
ペプチドの範囲内のエピトープを有する抗体が得られる
様に決定する。短かいものとしてたとえば（８６−１３
２）　、　（６８−９４）等が用いられるが、より長い
（７０−１３２）が好ましい。既に報告されているヒト
ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列に従って、更にアミノ
末端やカルボキシル末端を延長することも可能だが、そ
れだけ合成が困難となり、以後の操作における効率が低
下する。以下（７０−１３２）ペプチドを用いて説明す
る１本発明においては、このペプチドを化学合成法によ
り作製した。

本発明者らは、Ｆ■ｏｃアミノ酸を使用した固相合成法
（Ｓｈｅｐｐａｒｄ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｈｅｗ
、　Ｓａｃ、、　Ｃｈｅｗ。

Ｃｏｗａｍ、、　１６５−１６６（１９８５））を採用
し、当ペプチドを高純度で合成した。アミノ酸配列は、
Ｍａｄｄｏｎらの報告（Ｍａｄｄｏｎ、　ａｔ　ａｌ、
、　Ｃｅ１ｌ、　４７．３３３−３４８（１９８６））
に基いて決定した。

まずそれぞれの部分ペプチドのＣ−末端に相当するＦｍ
ｏｃアミノ酸ペンタフルオロフェニルステルをジメチル
ホルムアミド中で４−ジメチルアミノピリジン存在下、
Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂に結合させ、次
いで結合すべき別のＦｍｏｃアミノ酸Ｐｆρエステルと
縮合反応により結合させた。

また、スレオニンとセリンについては１−オキソ−２−
ヒドロキシ−ジヒドロ−ベンゾトリアジン（ＤＥＢ丁）
エステルを用いて導入した。各アミノ酸のカップリング
反応終了後、ペプチドの結合した樹脂を２０％ピペリジ
ン・ジメチルホルムアミド混液で処理してＮ末端Ｆｍｏ
ｃ基を除去し、次いでｍ−クレゾール存在下、室温にて
ＴＦＡ−チオアニソールを作用させて脱保護基をすると
同時に，目的とする部分ペプチドを樹脂より回収した。

また、アルギニン残基を含むペプチドはトリメチルシリ
ルプロミド（ＴＭＳＢｒ）−チオアニソール／　ＴＦＡ
で処理を行った。

本発明者らは上述の方法によりＣＤ４タンパク質の部分
ペプチドを合成したが、その方法はこれに限られるわけ
ではなく他の化学合成法、例えば、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸
を用いる方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，　Ｊ．　Ａ＋ｏ
。

Ｃｈｅ＋＊．　Ｓａｃ．、　８５，　２１４９（１９６
３））や、当該部分ペプチドに対応するＤＮＡを得て、
これを適当なベクターに挿入し、動物細胞や微生物で発
現させて目的とする部分ペプチドを得ても良いのである
。

次に、第２段階として、上記によって得られたペプチド
、もしくは、これを適当なキャリアータンパク質、例え
ば、牛血清アルブミン、ヘモシアニンなどに結合させた
ものを抗原として，＠乳動物に免疫し、抗ＣＤ４（７０
−１３２）ペプチド抗体を作成する。

免疫法は、常法に従えば良い．例えば、マウスを用いた
場合、好ましくは、５〜１０週令のマウス１匹あたり１
回につき．　０．０１〜０．５ｍｇを投与する。

必要に応じて、アジュバント、例えば、フロイント完全
アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウ
バンアジュバントなどを使用することが好ましい．投与
は皮下注射、静脈注射、腹腔的注射等により行われる。

その後，１〜３週ごとに１〜５回投与し，充分免疫する
．免疫においては，動物の免疫担当臓器、例えば、肺臓
に対する直接投与、或いは、免疫担当細胞、例えば、抗
原提示細胞，マクロファージ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球
に対する直接投与も可能である。

抗ＣＤ４（７０　−　１３２）ペプチド抗体としては、
上記の動物血清中、細胞培養上清中に得られるポリクロ
ーナル抗体を使用することができるが，更に、モノクロ
ーナル抗体を作製することにより、ＣＤ４　（７０−１
３２）ペプチド上の均一なエピトープを認識する抗体を
調製することができる。

モノクローナル抗体を作製するためには、このようにし
て免疫された動物から、最終免疫の２〜４日後に、リン
パ球を採取する。リンパ球調製には肺臓、リンパ節、末
梢血等が用いられる。このリンパ球を骨髄腫細胞（ミエ
ローマ）と融合させる。

骨髄腫細胞としては、特定酵素の欠損した細胞、例えば
マウスミｘ　Ｏ　−　？　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−１１
　（Ｐ３−０１）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３　（
Ｘ６３−６５３）、Ｐ３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（Ｎ
Ｓ−１）、ラットミエローマ２１０−ＲＣＹ３−Ａｇ１
２３等が好ましい。

細胞融合はケラ−とミルシュタインの方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ，　２５６，　４９５−４９７，（１９７５））によ
り行うことができる。

細胞融合の終了後、選択培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン）培地によりハイブ
リドーマを選択する。

ヒトＣＤ４ペプチドに対する抗体を産生じているハイブ
リドーマを、実施例１の酵素免疫測定法−１により選出
し、その後限界希釈法によるクローニングを２〜３回く
り返すと、モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マ細胞が得られる。

（本研究者等は、代表的なハイブリドーマクローン株３
株を既に寄託した。すなわち、ハイブリドーマＣＰ−１
，ＣＤ−２、ＣＰ−９を名称として、ＦＥＲＮＰ−１０
８６２、ＦＥＲＮ　Ｐ−１０８６３、ＦＥＢＭ　Ｐ−１
０８６４の番号で寄託されている） こうして得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ細胞株を同系の動物の腹腔内に接種し。

増殖させたのち腹水を採取することにより、あるいは培
養器で培養することにより、目的のモノクローナル抗体
を得ることができる。

こうして得られたポリクローナル及びモノクローナル抗
体は必要に応じ精製して使用することができる。すなわ
ち硫安分画、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどの、通常タンパク質に適用される
方法を用いて精製することができる。

さて、抗ｃｏ４（７０−１３２）ペプチド抗体を作製す
る別法としてｉｎ　ｖｉｔｒｏ感作法を用いることもで
きる。

まず正常動物末梢血より、ｐｅｒｃｏｌｌ　（ファルマ
シア社製）などによる比重遠心法、塩化アンモニウムに
よる赤血球除去法、フローサイトメトリー法などにより
、リンパ球細胞画分を調製する。この細胞画分を培養す
ると共に、培養液中にＣＤ４（７０−１３２）ペプチド
をｏ、ｏｏｔ〜１ｍｇ／ｍＱの濃度で添加し１画分中の
マクロファージに貧食、抗原提示させる。提示された抗
原により共存するヘルパーＴ細胞が活性化され、抗原の
情報をＢ細胞にうけわたし、抗原に感作したＢ細胞すな
わち、抗ＣＤ４（７０−１３２）ペプチド抗体を産生ず
るＢ細胞が生成される。このＢ細胞をＥＢ（エプスタイ
ン−バー）ウィルスにて、或いは、ミエローマとの細胞
融合などにより、株化することにより、持続的に産生さ
れるポリクローナル抗体を得ることができる。更に、こ
の株化されたＢ細胞を限界希釈法により、２〜３回クロ
りングすれば、モノクローナル抗体を得ることができる
。

得られたモノクローナル抗体の、ＭＯＬＴ−４、阿Ｔ−
４などＣＤ４（＋）細胞の膜に存在するＣＤ４タンパク
質との直接的な反応性は、ウェスタンプロット法を用い
て調べることにより確認できる。上記の細胞を２Ｘ１０
７個程度集め、フェニルメチルスルホニルフルオリド（
ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤を含む低張リン酸
バッファー処理やホモジナイズなどにより破壊し、１．
ＯＯＯｒｐｍ、　５分の遠心で粗膜画分を沈殿させた上
清を、６．５０Ｏｒｐｍ、　２０分遠心し、沈殿として
粗膜画分を得ることができる６次に、この粗膜画分をＬ
ａａｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０
（１９７０））に従う５Ｏ５−１０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、更にＴｏｖｂｉｎ等の方
法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ、　７６、４３５０−４３５４（１９７９））に
従ってウェスタンブロッティングを行う。−次抗体とし
て、前述の抗ｃｏ４（７０−１３２）ペプチド抗体を用
いペルオキシダーゼを結合した、２次抗体により発色さ
せると、ＣＤ４分子の分子量５５　、０００に対応する
部分に特異的に発色するバンドが見られ、またこのバン
ドは、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、０ＫＴ４を用いて
も検出される。これらのことにより、ｃｏ４（７０−１
３２）ペプチドを免疫原として作製された抗体が、細胞
由来のＣＤ４タンパク質とも反応することが確認できる
。

さて、上記抗ＣＤ４（７０−１３２）ペプチド抗体は、
細胞由来のＣＤ４分子と結合性を示し、かつ、ＨＩＶ外
被タンパク質との特異的結合領域を認識しているので、
ＨＩＶ感受性細胞とＨＩＶとの感染モデル系に応用すれ
ば、抗ＨＩＶ作用を示すはずである０例えば訂−４細胞
Ｉ　Ｘ　ｔｏ’個と該抗体とを終濃度ｌμｇ／−となる
よう混合し、３０分間反応させる。その後、段階希釈し
たＨＩＶ液、すなわち、１（ＴＬＶ−ＩＩＩ　Ｂ株やＬ
ＡＶ−１株の感染したＭＯＬＴ−４細胞培養液中に産生
される高い感染価を持つものを加えると、抗体の存在し
ないコントロールでは、非常に低濃度のＨＩＶ液を用い
ても感染が成立するのに対し、抗体を添加した実験区の
すべてが、より高濃度のＨＩＶ液を使用した場合のみに
しか感染が認められない、従ってＨＩＶの感染が成立す
る希釈倍率の上限（ＨＩＶタイター）を比較することに
より抗ＨＩＶ作用を判定することができる（ＨＩＶタイ
ターが小さい方が、抗体の抗ＨＩＶ作用が強い）。

このような方法を用いて、これらの抗ＣＤ４（７０−１
３２）抗体がＨＩＶの感染力を低下せしめていること。

すなわち、抗ＨＩＶ作用を有していることが証明できる
。

第３段階として、第２段階に得た抗ＣＤ４（７０−１３
２）ペプチド抗体を免疫原としてＣＤ４（７０−１３２
）ペプチドに対するイデオタイプ抗体を作製し、抗）Ｉ
ＩＶ作用を有するものを分離する。

抗体としてポリクローナル抗体を使用することもできる
が、モノクローナル抗体を用いるのが好ましい。

免疫法は、第２段階と同様に行えばよい、抗ＣＤ４（７
０−１３２）ペプチド抗体、好ましくはモノクローナル
抗体を、単独あるいはＢＳＡなどのキャリアタンパク質
と結合させ抗原とし、これを抗体作製動物と同種同系の
ものに免疫する。同系動物に抗体分子を投与すると、抗
体のイデオタイプ部位のみが抗原性を示し、少数ながら
もイデオタイプに対する抗体を産生ずる細胞が発生する
。以後の抗体調製法は、第２段階と重複するので割愛す
るが、例えば、マウスを用いた場合、マウス−匹あたり
、０．１”１ｍｇの抗原を、１〜２週問おきに４〜５回
免疫するのが好ましい。

抗イデオタイプ抗体の存否は、例えば、実施例３−　（
４）の酵素免疫測定法−２により判定できる。

抗イデオタイプ抗体は、ポリクローナル抗体として利用
してもよいが、前述と同様の方法にて、エピトープが均
一のモノクローナル抗体を作製することができる。得ら
れた抗イデオタイプ抗体は、前述のＨＩＶ感受性細胞を
用いた、ＨＩＶ感染モデル系により、抗ＨＩＶ作用を判
定することができる。

さて、これ以外の方法として、抗イデオタイプ抗体は、
第２段階に得られた抗ＣＤ４（７０−１３２）ペプチド
抗体を単独、あるいはＢＳＡなどのキャリアタンパク質
と結合させ、これを抗原として第２段階に示されるｉｎ
　ｖｉｔｒｏ感作法にて作製することができる。

抗原は０．００１〜ｌｙａｇ／ｖａＱとなるよう添加す
ればよい、　ＥＶウィルスの感染、ミエローマとの細胞
融合などにより株化し、ポリクローナル抗体を得ること
ができるが、更にクローニングによって、モノクローナ
ル抗体を得ることができる。一方、このような方法とは
、まったく別に、ＡＩＤＳ感染動物の末梢血Ｂリンパ球
を用いてＣＤ４（７０−１３２）ペプチドに対する抗イ
デオタイプ抗体を調製することができる。　ＡＩＤＳ感
染動物の免疫系においてＨＩＶ外被タンパク質の大部分
の領域は、抗原決定基として既に認識されている。　Ｃ
Ｄ４（７０−１３２）ペプチドに対する抗イデオタイプ
抗体は、この抗ＨＩＶ外被タンパク質抗体の特殊形、す
なわち、ＨＩｖ外被タンパク質上の、ＣＤ４タンパク質
との特異的結合領域と反応する抗ＨＩＶ外被タンパク質
抗体と同様の挙動をすると考えられる。従ってＡＩＤＳ
感染動物末梢血よりＢリンパ球を調製し、ＥＢウィルス
等を用いて株化させ、これに、適当な二次抗原、例えば
、抗ＣＤ４（７０−１３２）ペプチド抗体を用いて刺激
し抗原感作させると、抗イデオタイプ抗体に対応する抗
体を産生ずる細胞のみが、抗原刺激を受けて増殖する。

この増殖した細胞を培養することにより抗イデオタイプ
抗体を作製することができ、更に、この細胞をクローニ
ングすることにより、モノクローナル抗体を得ることが
できる。

本研究者等は、第２段階に示したマウス抗ＣＤ４（７０
−１３２）ペプチド抗体を免疫原として１種々の抗イデ
オタイプ抗体を調製した。酵素抗体法による１次スクリ
ーニング及び抗ＨＩＶ作用の測定による２次スクリーニ
ングを満たす抗イデオタイプモノクローナル抗体産生細
胞５株を分離し、ＩＩＤ−５５（ＦＥＲＰ−１１１５７
）、ＩＩＤ−６２（ＦＥＲＰ−１１１５８）を代表例と
して寄託した。

このようにして本研究者等は、本発明を完成させたので
ある。

実施例１ マウス抗ＣＤ４（７０−１３２）ペプチドモノクローナ
ル抗体の作製 （１）免疫マウス牌細胞の調製 ５週令のＢＡＬＢ／　Ｃ雌マウス（日本チャールズリハ
ー社、、ｋ　ｊｊ入手）　Ｌ：、　ｔ：　トｃＤ４ヘフ
チト（７０−１３２）２００μｇをフロイントの完全ア
ジュバントと共に腹腔内投与して免疫した。更に２週間
後に同ペプチド２００μｇをＰＢＳに溶解して腹腔内投
与して、追加免疫した。同様な免疫を更に２＠行った後
、同ペプチド５００μｇを免疫した。３日後に肺臓を摘
出しＤＭＥＭ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕ朧）培
地中でほぐし懸濁、洗浄し、融合用の牌細胞を調製した
。

（２）マウス骨髄腫細胞（ミエローマ）の調製マウスミ
エローマＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌｔｒ、　１０％Ｆ
Ｃ５ｔ有ＤＭＥＭ培地で＠養し、対数増殖期にある細胞
を集め、融合用の親株とした。

（３）細胞融合 （１）と（２）で得られた牌細胞（２Ｘ　１０”釦と、
マウス骨髄腫細胞（４Ｘ　１０’個）とを混合し、遠心
分離して上清を捨ててペレットでよくほぐし、５０％ポ
リエチレングリコール１５００　（ベーリンガーマンハ
イム社製）０．５−を１〜２分間で徐々に加え細胞融合
を行った。更に約１０分間かけて、　ＤＭＥＭ培地１０
−ｋを攪拌しながら滴下し融合を完成させた。これにＦ
ｅ２　ｌ−を加え融合反応を停止した。遠心分離により
上清のポリエチレングリコール溶液を除き、ペレットを
１０％ＦＣ５を含むＤＭＥＭ培地で洗い遠心分離によっ
て上溝を除いた。ペレットをＨＡ丁培地（１００μ阿ヒ
ポキサンチン、０．４μ阿アミノプテリン。

１６μ阿チミジン、０．０３％Ｌ−グルタミン、１５％
ＦＣ５を含むＤＭＥＭ培地）により懸濁し、５Ｘ１０’
細胞／穴となるように９６穴培養プレートに０．２■Ｑ
／穴づつ分注した。炭酸ガス培養器中、３７℃の条件下
で培養し、１日おきにＨＡＴ培地を０．１ｍｆｌ／穴づ
つ新鮮なものと交換した。７〜１０日間培養、育成し、
ハイブリドーマコロニーを得た。

（４）酵素免疫測定法−１ ＥＬＩＳＡ用９６穴アミノプレート（住友ベークライト
社製）に、ＰＢＳで溶解したヒトＣＤ４ペプチド（０，
ｌ〜ｌμｇ／ｍＱ）を５０μＱ／穴づつ分注し、室温で
１〜４時間放置してプレート穴底面に吸着させた。　０
．１５Ｈの塩化ナトリウムを含むリン酸バッファー（Ｐ
ＢＳ　。

ＰＦｆ７．４）で３回洗浄した後、３％カゼインナトリ
ウムを含むＰＢＳを各式に満たし室温で１時間静置し、
プレート穴全体をカゼインでコーティングした。

各式の液を捨てた後、ＰＢＳで洗浄し、ハイブリドーマ
培養上清液を５０μＱ／穴加え、室温で１〜４時間放置
した。　０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回
洗浄、ＰＢＳで２回洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗マ
ウスＩｇＧ抗体（バイオランド社製）の４０００倍ＰＢ
Ｓ希釈液を５０μＱ／六分注し、室温で１〜２時間放置
した。　Ｏ，ＯＳ％Ｔｗａｓｎ２０−ＰＢＳで５回洗浄
、ＰＢＳで２回洗浄後１０−にオルトフェニレンジアミ
ン−０，０２５％ＢＳＡを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム
バッファ　−（ｐＨ５，０）と０．１％過酸化水素水と
を３＝１に混合した発色液を５０μＱ／穴加え室温で１
５〜３０分放電して反応させ、これに、０．１％亜硫酸
ナトリウム（Ｎａｇ　５０３　）を含む、　ＩＮ硫酸を
１５０μＱ／穴加え反応を停止し。

４９２ｎｍで吸光度を測定した。求めるハイブリドーマ
の検索に際しては、高い測定値を示した上清液の株を選
択すれば良い。

（５）ハイブリドーマのスクリーニングとクローニング 各式の培養上清液を抗体液とし、上述の酵素免疫測定法
−１に供した。抗原には、ヒトＣＤ４（７０−１３２）
ペプチドを用いた。

抗体産生を示した穴のハイブリドーマを限界希釈法によ
り単個細胞化（クローニング）した。すなわちアミノプ
テリンを含有しないＨＡＴ培地（ＨＴ培地）にこのハイ
ブリドーマを懸濁させ、ｌ細胞１０．１ｔＱとなるよう
調整した。正常マウスより調製した牌細胞を同じ＜ＨＴ
培地で５ｘｉｏｓ細胞１０．１ｍ１２となるよう懸濁し
、９６穴プレートに０．１■Ｑ／穴づつ分注した上に、
上記ハイブリドーマ懸濁液を０．１■Ｑ／穴づつ添加し
た。この、ハイブリドーマ１細胞／穴としたプレートを
、炭酸ガス培養器中で３７℃、１〜２週間培養した。

更に、ハイブリドーマコロニーの発生数が１個だけであ
る穴の培養上清液を抗体液として、酵素免疫測定法を行
い、抗体陽性を示したハイブリド−マを、上記と同様に
限界希釈法にてもう１度クローニングした。得られた抗
ＣＤ４（７０−１３２）ペプチド抗体産生細胞をクロー
ン株とした。計１１株の独立したハイブリドーマクロー
ン株（ＣＰＩ−ＣＰＩＩ）を得、１０％ＦＣ３−ＤＭＥ
Ｍ培地にて大量培養した。

（６）モノクローナル抗体の精製 上記（５）で得たハイブリドーマ１１株を無血清培地Ａ
ＳＦ１０３（味の素社製）で各々５０−ずつ培養し、細
胞濃度Ｉ　Ｘ　１０’個／ｍＱとなった培養物を遠心分
離し。

その上清液をプロティンＡ−アガロース（バイオランド
社製〉又はレンチルレクチン−セファロース（ファルマ
シア社製）にかけ、前者ではＰＨ４，０のクエン酸緩衝
液、後者では１０％メチル−α−〇−マンノピラノシド
含有ＰＢＳで溶出したのち、　ＰＢＳに透析して各精製
モノクローナル抗体を得た。

また、別法として、ハイブリドーマをマウス腹水中で培
養し、腹水抗体を調製及び精製した。

抗ＣＤ４（７０−１３２）モノクローナル産生細胞株Ｃ
ＰＩ〜１１の、それぞれＩ　Ｘ　１０’個の細胞をブリ
スタン（和光純薬製）０．５−腹腔投与後２週間のＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに腹腔注入した。注入後５〜１０日後に
、腹部の肥大したマウスの腹部を切開し、充満した腹腔
液を採集した。２０００ｒｐｍ、　５分の遠心後、上清
液に等容量のＰＢＳを加え混合し、更に１００％飽和硫
酸アンモニウム（硫安）溶液を混合液と等容量別え、５
０％飽和硫安液とした。４℃、１時間放置後、８，００
０ｒｐｍ、　４℃、１５分遠心し、ＩｇＧを主とする沈
澱を集めた。沈澱に６−のＰＢＳを加えて溶解し、４−
の１００％飽和硫安溶液を加え、４０％飽和硫安液とし
、４℃、１時間放置後、　８，０００ｒｐａ＋、４℃、
１５分遠心し、沈澱を集めた。沈澱をＰＢＳに溶解し、
ＰＢＳで平衡化したプロティンＧセファロース（ファル
マシア製）カラムに添加した。

カラムの１０倍容量のＰＢＳで洗浄後、　０．１Ｍグリ
シン−塩酸（Ｐ）ｌ　２，７）にて溶出し、ただちにＩ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ＰＨ７，５）緩衝液に溶出液
を受は抗体画分を回収した。得られた抗体画分を４Ｑの
ＰＢＳに対して４回透析し、各精製モノクローナル抗体
を得た。

（７）モノクローナル抗体のＣＤ４タンパク質との反応
性 上記（６）で得たモノクローナル抗体のＣＤ４タンパク
質との反応性を、ウェスタンプロット法を用いて確認し
た。

ＭＯＬＴ−４細胞（ＣＤ−４＋）　２Ｘ１０’個をＰａ
５ｓ、：よる遠心で２回洗った後、１ｍＭＰＭＳＦを含
むＩ　０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ρ）１７．
５）２■ａを加え懸濁し。

水冷下で５分低張処理した。これに１ｍＭＰＭＳＦを含
むＰＢＳを４ｍ＋１２加え、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイ
ザーで水冷下４０〜５０ストロークホモジナイズし、破
砕液を１．００Ｏｒｐｍ、　５分遠心した。遠心上清を
再びｌ　、　０００ｒｐｉ＋、５分遠心し、得られた上
溝を更に６，５００ｒｐｍ。

２０分遠心し、沈澱を粗膜画分として電気泳動の試料と
した。０．１％ＳＯ５を含む１０％ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動、分離させた後、２０％メタノールを含
有する２５１ＩＭトリスヒドロキシアミノメタン−１９
２ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ８，３）内でタンパク質を
ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースペーパー
に電気的に転写した。ニトロセルロースペーパーを３％
カゼイン−ＰＢｓに室温、１時間浸してコートした。次
に各モノクローナル抗体と各々４℃で一晩反応させ、洗
浄し、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体（カッペル社製）の１０００倍希釈液を室温で
約２時間反応させた。洗浄後、４−クロロ−１−ナフト
ール（生化学工業社製）０．５ｖｓｇ／ｍＱ、過酸化水
素水０．０２％を含むペルオキシダーゼ基質液を室温で
３０分反応させ、発色するタンパク質のバンドを調べた
。

上記（６）で得た１１種のモノクローナル抗体は、いず
れもヒトＣＤ４分子の分子量５５０００と一致するタン
パク質のみに、特異的に反応した。

実施例２ 抗ｃｏ４（７０−１３２）ペプチドモノクローナル抗体
の抗旧Ｖ効果 ９６穴マイクロプレート中でＨＩＶ感受性であるＭＴ−
４細胞（ＣＤ４＋）　ｌＸｌ０’細胞／ｖｒ０５０μｍ
と、２ｐｇ／ｌａＱのモノクローナル抗体（ＣＰＩ−１
１）５０μＱとを混合し、室温で３０分放置した。これ
に、１０１−１０’倍に段階希釈したＨＩＶ液（ＨＩＶ
−１が既に持続感染しているＭＯＬＴ−４細胞の培養上
清）１００μ立を加えて混合し。

１０％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ−１６４０培地、炭酸ガス
培養器中、３７℃で４日間培養した。

感染の判定は、上記の細胞をスライドグラスに塗抹し、
−２０℃アセトンで固定した標本中に発現したＨＩＶの
１嗅タンパク質ｐ１ｇの有無により下した。

ｐ１８は、抗ｐ１８モノクローナル抗体を用いた免疫蛍
光抗体法により検出した。

免疫蛍光抗体法は、抗ｐ１８抗体液をスライドグラス上
の固定細胞上に滴下し、室温で１５分間反応させ、ＰＢ
Ｓで洗浄後、フルオレセインを結合した抗マウスＩｇＧ
抗体液（カッペル社製）をＰＢＳで４０倍希釈して滴下
し、室温で１５分間反応させ、　ＰＢＳで洗浄し、９０
％グリセロールを用いて封入した後、蛍光顕微鏡にて緑
黄色の特異的蛍光発色の有無を観察して行われた。

抗ＨＩＶ効果の判定は、ＨＩＶの感染が成立するＨＩＶ
液希釈倍率の上限（ＨＩＶタイター）の比較により行っ
た。すなわち、ＦＩＩＶタイターがコントロールより低
いものほど抗ＨＩＶ効果が強い。

すべての抗ＣＤ４（７０−１３２）モノクローナル抗体
においてＨＩＶタイターをコントロールと比較して１０
１〜１０’低下させる抗ＨＩＶ効果を確認した。

特ニＣＰ−１、ＣＰ−２，ＣＰ−９ニおイテ強い抗ＨＩ
Ｖ効果がみられた。

実施例３ ｃｏ４（７０−１３２）ペプチドに対する抗イデオタイ
プモノクローナル抗体の作製 （１）抗原の調製 実施例１−（６）に示す方法に従い、抗ＣＤ４（７０−
１３２）モノクローナル抗体を調製し、精製して免疫原
とした。

（２）免疫法、牌細胞 精製抗ＣＤ４（７０−１３２）ペプチドモノクローナル
抗体ｌｌＩｇの０．５＠ｆｌＰＢＳ溶液を、０．５ｍＭ
のフロイント完全アジュバントとよく混合し、　ＢＡＬ
Ｂ／　Ｃマウスの腹腔に投与した。以後、１週間間隔で
３回、アジュバントを含まない同溶液を腹腔投与し、最
終免疫の３日後、肺臓を摘出した。これ以後、牌細胞の
調製法、ミエローマの調製法、細胞融合法については、
実施例１のモノクローナル抗体作製法と同様に行った。

（３）酵素免疫測定法−２ ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（コースタ−社製）に、Ｐ
ＢＳで１μｇ／＠Ｑに希釈した抗マウスＩｇＧ（）ｌ＋
Ｌ）抗体（カッペル社製）を５０μＱ／穴づつ分注し、
室温で１〜４時間放置してプレート穴底面に吸着させた
。

ＰＢＳで３回洗浄した後、３％カゼインナトリウムを含
むＰＢＳを番犬に満たし、室温で１時間静置し、プレー
ト穴全体をカゼインでコーティングした。

番犬の液を捨てた後、ＰＢＳで洗浄し、ハイブリドーマ
培養上清液を５０μＱ／穴加え、室温でｌ〜４時間放置
し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄
後、抗原として用いた抗ＣＤ４（７０−１３２）ペプチ
ドモノクローナル抗体に、ピアス社製のビオチン化試薬
を用いてビオチン化した抗体のＰＢＳ溶液ｌμｇ／ａｎ
を５０μＱ／穴加え、室温でｌ〜２時間放置した。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄し、
ワサビペルオキシダーゼを結合したアビジン（ベクター
社製）のＰＢＳによる２０００倍釈液を５０μＱ／穴加
え、室温でｌ〜２時間放置した。０．０５％Ｔｗｓｅｎ
２０を含むＰＢＳで５回洗浄後、実施例１−（４）とま
ったく同様に、オルトフェニレンジアミンを用い発色、
測定を行った。求めるハイブリドーマの検索に際しては
、高い測定値を示した培養土清液の株を選択すればよい
。

（４）ハイブリドーマのスクリーニングとクローニング 実施例１−（５）と同様に行う。上記に得られた抗イデ
オタイプ抗体産生ハイブリドーマを、限界希釈法を２回
くり返すことにより、クローニングした。クローン化さ
れたハイブリドーマは、上記酵素免疫測定法−２により
選択し、陽性抗体を産生ずるクローン２４株を得、　１
０％ＦＣ５−ＤＭＥＮ培地にて大量培養した。

実施例４ ＣＤ４（７０−１３２）ペプチドに対する抗イデオタイ
プ抗体の抗ＨＩＶ効果 実施例２と同様に行う、実施例３により得られた抗体を
、実施例１−（６）に示す方法にて精製し。

ＲＰＮＩ−１６４０培地により３μｇ／ａＱニ希釈シ、
コれノ５０μ氾と、１０１〜１０’に段階希釈したＨＩ
Ｖ液１００μＱとを９６六マイクロプレート中で混合し
、室温で３０分放置した。これに阿Ｔ−４細胞２　Ｘ　
１０’細胞／ｍｆ１５０μｋを加えて混合し、１０％Ｆ
Ｃ５を含むＲＰＭＩ−１６４０培地、炭酸ガス培養器中
、３７℃で４日間培養した。

実施例２と同様に感染の判定は、免疫蛍光抗体法に従い
、抗ＨＩＶ効果の判定は、　ＨＩＶタイターの比較によ
り行った。

表−１に示すように、ＩＤ−３８，ＩＤ−５１，ＩＤ−
５５゜ＩＤ−６２は、ＨＩＶタイターを１０３減少させ
１強い抗ＨＩＶ作用を示した。

表−Ｉ　　ＣＤ４（７０−１３２）ペプチドに対するイ
デオタイプモノクローナル抗体の抗ＨＩＶ効果コントロ
ール（−） ＩＤ−３８ ＩＤ−５０ ＩＤ−５１ ＩＤ−５５ ＩＤ−６２ １０４・５ １０”・５ １０２・５ １０１・５ １０１・５ １０１・５ 尚、本発明におけるヒトＣＤ４ペプチドのアミノ酸−次
構造配列は以下の式の通りである。

ペプチド（７０−１３２） Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−１１ｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ａ　
ｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｃｙ　５−Ｇｌｕ−Ｖ
ａ　１−Ｇｌｕ−Ａ　５ｐ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｙ　５−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ
　ｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａ　１ａ−Ａ
ｓｎ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｇ　１ｙ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−５ｅｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ
−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ（発明の効果） 本発明の抗イデオタイプ抗体は、抗ＨＩＶ活性を示すも
のであり、有効な治療薬を持たないＡＩＤＳ臨床分野で
ＡＩＤＳの予防、治療薬として利用されるものである。

また本発明の抗イデオタイプ抗体作製用抗原は、抗ＨＩ
Ｖ活性を示す抗イデオタイプ抗体を作製するに有用な抗
原となるものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＣＤ４（７０−１３２）ペプチドと反応する
   抗体よりなる、抗ＨＩＶ作用を有する抗イデオタイプ抗
   体作製用抗原。
2. （２）ヒトＣＤ４（７０−１３２）ペプチドと反応する
   抗体を抗原として作製された、抗ＨＩＶ作用を有する抗
   イデオタイプ抗体。
3. （３）ヒトＣＤ４（７０−１３２）ペプチドと反応する
   抗体を免疫原として抗体を生成せしめることを特徴とす
   る、抗ＨＩＶ作用を有する抗イデオタイプ抗体の製造方
   法。