ES2279598T3 - Polipeptidos de proteinas y sus usos. - Google Patents
Polipeptidos de proteinas y sus usos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2279598T3 ES2279598T3 ES99202141T ES99202141T ES2279598T3 ES 2279598 T3 ES2279598 T3 ES 2279598T3 ES 99202141 T ES99202141 T ES 99202141T ES 99202141 T ES99202141 T ES 99202141T ES 2279598 T3 ES2279598 T3 ES 2279598T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- antibody
- polypeptide
- immunoreaction
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
Abstract
La invención se refiere a polipétidos de la proteína S y a anticuerpo anti-P capaces de inhibir el enlace de las proteínas con C4BP. Los péptidos y los anticuerpos son útiles en procedimientos de diagnóstico y sistemas para purificar o detectar Proteínas S libres. Además, los polipéptidos son útiles en procedimientos terapéuticos como anticoagulantes.
Description
Polipéptidos de proteínas y sus usos.
La presente invención se refiere a polipéptidos
y anticuerpos anti-péptidos útiles para
procedimientos y composiciones terapéuticas para inhibir la unión
de la proteína S a la proteína de unión C4b. Además, los
polipéptidos y anticuerpos son útiles en procedimientos
diagnósticos para detectar proteína S libre en muestras de
fluidos.
La proteína S dependiente de vitamina K (PS) es
una glicoproteína monocatenaria de 75.000 dalton de masa molecular.
Sirve como cofactor de la proteína C activada en la inactivación de
los factores Va y VIIIa. La concentración de PS en plasma humano es
de aproximadamente 25 mg/l. La proteína S se encuentra en plasma
citrado en al menos dos formar, PS libre (PS_{F}), que comprende
aproximadamente un 40% de la PS total, y unida a la proteína de
unión C4b (C4BP), que comprende aproximadamente un 60% de la PS
total. LA C4BP es una proteína reguladora de la vía clásica del
sistema del complemento. Sólo la forma libre de la PS soporta la
actividad del cofactor para la proteína C activada. La proteína S
forma complejos con C4BP en presencia de Ca^{++} y EDTA, y la
constante de disociación (Kd) para la interacción es muy inferior en
presencia de Ca^{++} (6x10^{-10}M) que en presencia de EDTA
(10^{-9}M). Esta baja constante de disociación sugiere que o la
proteína S circulante en sangre está completamente unida a C4BP o
podría estar implicado otro componente que cambia el equilibrio
entre la proteína S y C4BP. Este tercer componente denominado
proteína de unión a la proteína S (PSBP) se describió en plasma bovino pero no se encuentra en plasma humano.
proteína de unión a la proteína S (PSBP) se describió en plasma bovino pero no se encuentra en plasma humano.
La relevancia fisiológica de la proteína S se de
muestra mediante el mayor riesgo observado de tromboembolia venosa
entre los individuos con deficiencia congénita de proteína S.
Además, el 30% de los pacientes que exhiben tromboembolia arterial
exhiben disminuciones de los niveles de PS en plasma. Por tanto, los
ensayos para medir los niveles en plasma de PS, y en particular los
niveles de PS libre, son una herramienta importante para el
clínico. La formación de complejos de PS con C4BP elimina la forma
activa de anticoagulación de PS (PS_{F}) de la circulación.
Los ensayos previos para medir los niveles en
plasma de PS incluyeron el uso de un concentrado de plasma normal
como estándar de referencia que contenía PS total constituida por PS
libre (PSF) y en forma de complejo (PS:C4BP). Por tanto, el ensayo
debe separar la PS libre de la PS en complejo con el fin de
identificar la cantidad de PS_{F} disponible en la sangre. Edson
y col., Am. J. Clin. Path., 94: 176-186
(1990), revisiones de métodos diagnósticos de laboratorio para
detectar la proteína S libre, incluido el procedimiento de
electroforesis estándar bidimensional cruzada Rocket (CIEP) de
Laurell y col., Anal. Biochem., 10: 358-361
(1985) y el procedimiento de precipitación en dos etapas de Comp y
col., Blood, 67: 504-508 (1986), usando
polietilenglicol para eliminar de forma selectiva el complejo
PS:C4BP de la PS libre antes de la medición de la PS.
No se han descrito anticuerpos inmunoespecíficos
para la PS libre. Asimismo, los intentos para desarrollar
anticuerpo que se unan a la región de PS implicada en la unión a
C4BP y que, por tanto, inhibirían la unión de PS a C4BP, tampoco
han tenido éxito. Dahlback y col., J. Biol. Chem., 265:
8127-8135 (1990). Por tanto, en la actualidad no
hay un medio directo para distinguir inmunológicamente la PS libre
del complejo PS:C4BP. Dado que en la actualidad no se dispone de un
ensayo directo de PS libre, los ensayos para la detección de PS
libre requieren una etapa de separación para distinguir especies
inmunológicamente indistinguibles de PS libre del complejo
PS:C4BP.
Malm y col., describen un anticuerpo monoclonal
que reacciona inmunológicamente con la proteína S (Eur. J.
Biochem., 165: 39-45, 1987). El anticuerpo
descrito se une a la proteína S libre y se une a la proteína S en
forma de complejo con la proteína de unión C4b (C4BP), pero no se
une a la proteína S escindida-trombina y, por
tanto, se ha propuesto que se une a un epítopo localizado cerca del
dominio gla de la proteína S.
Walker (J. Biol. Chem 1989, 264(30):
17645-17648) describen la caracterización de un
péptido sintético que es capaz de inhibir la interacción entre la
proteína S y la proteína de unión C4b. Este péptido se ha usado
para potenciar la actividad de cofactor anticoagulante de la
proteína S de conejo in vivo mediante la modulación de la
actividad de la proteína S (Weinstein y Walker. J. Clin.
Invest. 1990, 86(6): 1928-1935).
El documento EP0271810 describe un método de
determinar inmunológicamente la presencia de proteína S humana
libre o del complejo proteína de unión C4-proteína S
en una muestra de ensayo, mientras que el documento EP0315447
descrien un procedimiento para analizar inmunológicamente la
presencia de proteína S humana usando un anticuerpo monoclonal que
puede detectar la proteína S libre, pero no unida.
Tombesi y col. (Curr. Studies in Hematology and
Blood Transfusión, 1991, 58: 205-210) describen la
evaluación de un procedimiento para la detección de proteína S
usando anticuerpos monoclonales.
Suzuki y col. (Chemical Abstracts, 1990,
112(17), 15657g, p 574, columna 1) describen la preparación
de anticuerpos monoclonales frente a la proteína S y su uso para
purificar la proteína S y preparar suero sin proteína S.
Recientemente, se describió el péptido sintético
GVQLDLDEAI (SEC ID Nº 6: 3-17) que deriva de la
región carboxi terminal de la proteína S (residuos 605 a 614 de la
PS madura) y que inhibe la interacción de la proteína S con C4BP
in vitro. Walter., J. Biol. Chem., 264:
17645-17648 (1989); y Weinstein y col., J. Clin.
Invest., 86: 1928-1935 (1990). Estos informes
sugieren que esta región de la proteína S es importante para la
unión a C4BP. Se ha mostrado que otros polipéptidos de proteína S
correspondientes a los residuos 608-616 y
616-624 poseen un efecto mensurable sobre la unión
de PS a C4BP.
En la literatura se han descrito fragmentos
adicionales de proteína S producidos mediante escisión proteolítica.
Dahlback y col., J. Biol. Chem., 261:
5111-5115 (1986) y Stenflo y col., Natl. Acad,
Sci. USA, 84: 368-372 (1987). No obstante, no
se ha identificado que ninguno de estos fragmentos posea la
capacidad para inhibir la unión de la proteína S a C4BP.
En la actualidad se han descubierto regiones de
la proteína S que definen el sitio de unión entra la proteína S
(PS) y la proteína de unión C4b (C4BP) y son útiles para producir
polipéptidos de PS y anticuerpos anti-péptidos que
inhiben la interacción de unión entre PS y C4BP. Además, los
polipéptidos de PS y los anticuerpos proporcionan útiles reactivos
diagnósticos para medir la PS libre en muestras del cuerpo.
Por tanto, la presente invención describe un
polipéptido de PS que posee una secuencia de residuos aminoacídicos
que corresponde a la secuencia de una porción de la secuencia de
residuos aminoacídicos de la proteína S madura y que inhibe la unió
de la proteína S a C4BP.
También se contemplan las moléculas de
anticuerpos y anticuerpos monoclonales que reaccionan
inmunológicamente con un polipéptido de PS de la presente invención
y con la proteína PS nativa. Los anticuerpos preferidos inhiben la
unión de proteína S a C4BP.
La invención también describe sistemas y
procedimientos diagnósticos en una variedad de formatos de
inmunoensayo directos o competitivos para la detección de la
presencia de proteína S libre en un fluido vascular mediante el uso
de los polipéptidos de PS y moléculas de anticuerpos de esta
invención. Los ensayos se basan en la interacción de unión
específica descrita en la presente memoria descriptiva entre un polipéptido de PS o un anticuerpo con proteína S libre.
específica descrita en la presente memoria descriptiva entre un polipéptido de PS o un anticuerpo con proteína S libre.
Además se contemplan composiciones terapéuticas
y procedimientos para inhibir la unión de proteína S a C4BP usando
los polipéptidos de PS y anticuerpos de la invención.
Otra forma de realización describe el uso de los
anticuerpos para purificar la proteína S libre de muestras de
fluido, en particular el uso de moléculas de anticuerpo
inmovilizadas.
Otras formas de realización serán evidentes para
un experto en la técnica.
La figura 1 ilustra los resultados del Ensayo de
Inhibición Peptídica descrito en el ejemplo 5Aii. Concentraciones
variables de los péptidos enumerados se incubaron con la proteína
C4BP que revestía los pocillos de microtitulación de una placa de
96 pocillos. Posteriormente se añadió a los pocillos proteína S
biotinilada (b-PS) y la cantidad de
b-PS que se había unido a C4BP se detectó como se ha
descrito en el ejemplo 2C. Otros péptidos mostrados en las Figuras
1-3, pero no enumerados en la Tabla 1 incluyen:
PSP-287
(1:287-301); PSP-314
(1:314-328); PSP-393
(1:393-407); PSP-48
(1:48-62); PSP-57
(1:57-71); PSP-172
(1:172-186); PSP-19
(1:621-635); y
(PSP-425ª(1:425-433). El Nº de la
SEC ID y las posiciones de los residuos de aminoácidos
correspondientes se indican en los paréntesis.
Las figuras 2, 3 y 4 también ilustran los
resultados del Ensayo de Inhibición Peptídica descrito en el Ejemplo
5Aii y en la leyenda de la Figura 1.
La figura 5 ilustra los resultados del Ensayo de
Inhibición Peptídica descrito en el ejemplo 5Aii. Concentraciones
variables de anticuerpos anti-PSP-12
(también denominado anti-PS
(420-430)) y
anti-PSP-13 (también denominado
anti-PS (603-616)) enumerados se
incubaron con la proteína C4BP que previamente revestía los pocillos
de microtitulación. Posteriormente se añadió a los pocillos
proteína S biotinilada (b-PS) y la cantidad de
b-PS que se había unido a C4BP se detectó como se
ha descrito en el ejemplo 2C.
La Figura 6, en dos figuras A y B, ilustra los
resultados de la electroforesis 2D descrita en el ensayo para la
proteína S libre mediante adsorción usando AcMo 56 como se ha
descrito en el Ejemplo 6B. La figura 6ª muestra los resultados de
la muestra de plasma normal control, donde la de Laurell Rocket
grande representa el complejo C4BP:PS y la Laurell Rocket pequeña
representa la proteína S libre. La figura 6B muestra los resultados
de una muestra de plasma adsorbida con AcMo 56, donde la única
Laurell Rocket Sencilla representa el complejo C4BP:PS.
La Figura 7 ilustra los resultados en el
SDS-PAGE descrito en el ensayo para la proteína S
libre mediante adsorción usando anticuerpos policlonales
anti-PS (420-434) como se describe
en el Ejemplo 6B. El carril 1 corresponde al material de partida
que contiene PS libre y el complejo PS:C4BP. El carril 2 corresponde
al rendimiento del material de partida tras el paso a través de una
columna que contiene anticuerpo policlonal
anti-PS(420-434) en fase
sólida. El carril 3 corresponde a la fracción del material de
partida eluido de la columna con tiocianato 3M. La flecha indica la
localización de la banda correspondiente a la proteína S libre.
Residuo de aminoácido: Un aminoácido
formado tras la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en
sus enlaces peptídicos. Los residuos de aminoácidos identificados
en la presente memora descriptiva se encuentran, preferentemente,
en la forma isomérica natural "L". No obstante, los residuos en
la forma isomérica "D" se pueden sustituir por cualquier
residuo de aminoácido L, siempre que el polipéptido conserve la
propiedad funcional deseada. NH2 se refiere al grupo amino libre
presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al
grupo carboxi libre presente en el extremo carboxi de un
polipéptido. Siguiendo la nomenclatura estándar para polipéptidos,
J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969) y se
adoptó en 37 CFR § 1.822(b)(2), las abreviaturas de los
residuos de aminoácidos se muestran en la siguiente tabla de
correspondencias:
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla de
correspondencias
Debe observarse que todas las secuencias de los
residuos de aminoácidos están representadas en la presente memoria
descriptiva mediante fórmulas cuya orientación izquierda y derecha
está en la dirección convencional del extremo amino al extremo
carboxi. Además, la frase "residuo de aminoácido" se define
ampliamente de modo que incluya aminoácidos modificados e
inusuales, tales como los enumerados en 37 CFR § 1.822(b)(4).
Además, debe observarse que un guión al principio o al final de una
secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptídico a
otra secuencia de uno o más residuos de aminoácidos o un enlace
covalente a un grupo del extremo carboxilo o
hidroxilo.
hidroxilo.
Proteína C activada: la proteína C
activada se refiere a proteína C escindida proteolíticamente
mediante trombina para obtener proteína C actividad (APC), que
inactiva los factores de coagulación Va y VIIIa, inhibiendo de este
modo la coagulación.
Anticuerpo: El término anticuerpo en sus
varias formas gramaticales se usa en la presente memoria descriptiva
para referirse a moléculas de inmunoglobulina y porciones
inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir
moléculas que contienen un anticuerpo que combina sitio o paratope.
Ejemplos de moléculas de anticuerpo son moléculas de
inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina
sustancialmente intactas y porciones de una molécula de
inmunoglobulina, incluidas las porciones conocidas en la técnica
como Fab, Fab', F(ab')_{2} y F(v).
Sitio de combinación del anticuerpo: Un
sitio de combinación del anticuerpo es la porción estructural de una
molécula de anticuerpo compuesta por regiones variables e
hipervariables de una cadena pesada y ligera, que se unen
específicamente (reacciona inmunológicamente) a un antígeno.
El término reacciona inmunológicamente en sus
varias formas significa unión específica entre una molécula que
contiene un determinante antigénico y una molécula que contiene un
sitio de combinación de anticuerpo tal como una molécula de
anticuerpo entera o una porción de la misma.
Factor V: El factor V es una proteína de
alto peso molecular que, cuando es activado por la trombina, puede
acelerar la conversión de protrombina a trombina mediante el Factor
Xa que estimula la coagulación. El factor Va activado se inactiva
por la acción de la proteína C activada para inhibir el proceso de
coagulación.
Factor VIII: El factor VIII, denominado
el factor antihemofilia en la coagulación sanguínea, es una proteína
de alto peso molecular implicada en la activación del factor X
junto con el Factor Xa. El factor VIIIa activado se inactiva por
acción de la proteína C activada para inhibir el proceso de
coagulación.
Factor X: El factor X es un cimógeno de
una serín proteasa que posee un peso molecular de 55.000. Cuando se
activa, el factor Xa junto con el factor Va causa la conversión de
la protrombina en trombina que estimula la coagulación.
Anticuerpo monoclonal: La frase
anticuerpo monoclonal en sus varias formas gramaticales se refiere a
una población de moléculas de anticuerpos que contiene únicamente
una especie de sitio de combinación de anticuerpo capaz de
reaccionar inmunológicamente con un antígeno concreto. Por tanto, un
anticuerpo monoclonal exhibe típicamente una única afinidad de
unión por cualquier antígeno con el que inmunorreaccione. Por
consiguiente, un anticuerpo monoclonal puede contener una molécula
de anticuerpo que posee una pluralidad de sitios de combinación de
anticuerpos, cada uno inmunoespecífico para un antígeno diferente,
por ejemplo un anticuerpo monoclonal biespecífico.
Polipéptido y Péptido: Polipéptido y
péptido son términos usados de forma intercambiable en la presente
memoria descriptiva para designar una serie lineal de residuos de
aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos entre los
grupos alfa-amino y carboxi de residuos
adyacentes.
Proteína C: La proteína C (PC) es un
cimógeno de serín proteasa dependiente de vitamina K y comparte
homología de secuencia con otras serín proteasas conocidas
dependientes de vitamina K. en presencia de trombomodulina y
trombina en las células endoteliales, la proteína C se activa en una
serín proteasa, APC, y se convierte en un potente inhibidor de la
coagulación de la sangre mediante la inactivación del Factor Va y el
Factor VIIIa.
Proteína S: La proteína S (PS) es una
proteína plasmática dependiente de vitamina K que sirve como
cofactor de la proteína C activada en la inactivación de los
factores Va y VIIIa.
Serín proteasas: Las serín proteasas son
una familia de enzimas que fragmentan proteínas (proteolíticas) de
las que la proteína C activada es un miembro.
Péptido sintético: El péptido sintético
se refiere a una cadena de residuos de aminoácidos químicamente
producida unidos mediante enlaces peptídicos que no posee proteínas
naturales y fragmentos de las mismas.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
la frase "polipéptido de PS" se refiere a un polipéptido que
posee una secuencia de residuos de aminoácidos que comprende una
secuencia de residuos de aminoácidos que corresponde, y
preferentemente es idéntica, a una porción de la molécula de
proteína S. La secuencia de residuos de aminoácidos de la proteína
S madura se enumera como SEC ID Nº 1 en la lista de secuencias. Un
polipéptido PS de la presente invención posee la capacidad de
inhibir la unión de la proteína S (PS) a la proteína de unión C4b
(C4BP).
Por tanto, la invención proporciona un
polipéptido de proteína S que posee una longitud de no más de 100
residuos de aminoácidos y que incluye una secuencia de residuo de
aminoácidos, el Nº de la SEC ID y los residuos correspondientes de
los cuales se muestran entre paréntesis, que se representa mediante
una fórmula seleccionada de:
| -QEKQNKH- \; y | (1:427-433) |
| -SGIKKIIQEK-, | (12:1-10) |
y en la que dicho polipéptido
inhibe la unión de la proteína S a la proteína de unión
C4b.
El Nº de SEC ID y los residuos correspondientes
de una secuencia de residuos de aminoácidos descritos se describen
de forma conveniente en la presente memoria descriptiva entre
paréntesis, donde el primer número es el Nº de SEC ID y el
intervalo después del punto representa los números de residuos de
los residuos de aminoácidos indicados en la lista de secuencias.
Por ejemplo, "(1:423-427)" se refiere a la
secuencia KEIIQ mostrada en la SEC ID Nº 1 desde el residuo 423 al
residuo 427.
En una forma de realización relacionada, la
invención proporciona un polipéptido de PS que posee una longitud
no mayor a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, que incluye
una secuencia de residuo de aminoácidos representada por la
fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-SGIKKIIQEKQNKC- \+
(12:1-14)\cr}
En esta forma de realización, un polipéptido
preferido y de ejemplo posee una secuencia de residuos de
aminoácidos representada por la fórmula SGIKKIIQEKQNKC
(12:1-14). Este péptido de PS se sintetizó sin el
residuo de histidina (H) normalmente presente en la proteína PS
nativa en la posición del residuo de aminoácido 433, que
corresponde a la posición del residuo de aminoácidos entre 13 y 14
en la SEC ID Nº 12.
En otra forma de realización, la invención
proporciona un polipéptido de PS que posee una longitud de no más
de aproximadamente 100 residuos de aminoácidos que incluye una
secuencia de residuos de aminoácidos representada por la fórmula:
-QEKQNKHX- (1:427-434), donde X es C o S. En esta
forma de realización, un polipéptido preferido y de ejemplo posee
la secuencia de residuos de aminoácidos representada por la fórmula
QEKQNKHS (2:8-15).
Para fines informativos, en la Tabla 1 se
muestran otros polipéptidos de PS, sus designaciones y sus
posiciones de los residuos de aminoácidos de la PS.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{1} \begin{minipage}[t]{145mm}Un residuo de aminoácido
subrayado y el asterisco al lado de la designación del polipéptido
indican una sustitución relativa a la secuencia de los residuos de
aminoácidos de la PS nativa. Se muestra la secuencia de los
residuos de aminoácidos del polipéptido, junto con el paréntesis que
indica la SEC ID Nº y la designación del número de residuos de
aminoácidos. Para las secuencias de aminoácidos marcadas como SEC ID
Nº 1. La columna del número de residuos indica los números de
posición de la secuencia peptídica. Para los péptidos con las SEC
ID Nº 2-8, 11-13, el primer
intervalo detrás del punto indica la designación del número de
residuos de aminoácidos como aparece en la lista de secuencias. El
segundo intervalo después de la barra oblicua indica la posición
del residuo amino correspondiente a las posiciones relativas en la
secuencia de la PS nativa en la SEC ID Nº
1.\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a la estructura tridimensional de una
molécula de proteína S nativa plegada, en la presente invención se
ha determinado que múltiples regiones de proteína S están implicadas
en el contacto con C4BP cuando se forma un complejo PS:C4BP, cuyas
múltiples y variadas regiones se definen mediante los varios
polipéptidos de PS descritos anteriormente. La capacidad de los
polipéptidos de PS descritos anteriormente para inhibir la unión de
PS a C4BP se muestra en los Ejemplos en la presente memoria
descriptiva.
Por tanto, en otra forma de realización, la
invención contempla las composiciones de polipéptidos de PS que
comprenden uno o más de los diferentes polipéptidos de PS descritos
anteriormente, mezclados en combinaciones para proporcionar
inhibición simultánea de múltiples sitios de contacto formados en un
complejo PS:C4BP.
Preferentemente, un polipéptido de PS de esta
invención se caracteriza después por su capacidad para simular
inmunológicamente un epítopo (determinante antigénico) expresado por
la PS. Tal polipéptido es útil en la presente memoria descriptiva
en forma de un componente en un inóculo para producir anticuerpos
que inmunorreaccionan con la proteína PS nativa y preferentemente
inmunorreaccionan con la PS libre.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
la frase "imita inmunológicamente" en sus varias formas
gramaticales se refiere a la capacidad de un polipéptido de PS de
esta invención para inmunorreaccionar con un anticuerpo de la
presente invención que reconoce un epítopo nativo conservado de PS
como se define en la presente memoria descriptiva.
Debe entenderse que un polipéptido sujeto no
necesita ser idéntico a la secuencia de residuos de aminoácidos de
la PS, siempre que incluya la secuencia requerida y que sea capaz de
inhibir la unión de PS a C4BP, como se describe en la memoria
descriptiva.
Un polipéptido sujeto incluye cualquier análogo,
fragmento o derivado químico de un polipéptido cuya secuencia de
residuos de aminoácidos se muestra en la presente memoria
descriptiva siempre que el polipéptido sea capaz de inhibir la
unión de la proteína S a C4BP. Por tanto, uno de estos polipéptidos
se puede someter a varios cambios, sustituciones, inserciones y
deleciones, en el que tales cambios proporcionan ciertas ventajas en
su uso. A este respecto, un polipéptido de PS de esta invención
corresponde, en lugar de ser idéntico, a la secuencia de la
proteína S en la que se realizan uno o más cambios y conserva la
capacidad para inhibir la unión de la proteína S a C4BP en uno o
más de los ensayos como se ha definido en la presente memoria
descriptiva para determinar la inhibición de la formación del
complejo PS:C4BP.
El término "análogo" incluye cualquier
polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos
sustancialmente idéntica a una secuencia que se muestra
específicamente en la presente memoria descriptiva, en la que uno o
más residuos se han sustituido de forma conservadora con un residuo
funcionalmente similar y que exhibe la capacidad para la formación
de complejo PS:C4BP como se ha descrito en la memora descriptiva.
Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de
un residuo apolar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina
o metionina, por otro, la sustitución de un residuo polar
(hidrófilo) por otro tal como entre arginina y lisina, entre
glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un
residuo básico tal como lisina, arginina o histidina, por otro, o
la sustitución de un residuo ácido, como ácido aspártico o ácido
glutámico, por otro. Se pueden ver ejemplos de sustituciones en
varios de los polipéptidos de PS inhibidores descritos en la
presente memoria descriptiva con secuencias que no son idénticas a
la secuencia de la PS nativa.
La frase "sustitución conservadora" también
incluye el uso de un residuo derivado químicamente en lugar de un
residuo no derivado, siempre que tal polipéptido exhiba la actividad
de unión requerida.
"Derivado químico" se refiere a un
polipéptido sujeto que posee uno o más residuos derivados
químicamente mediante reacción de un grupo lateral funcional. Tales
moléculas derivadas incluyen, por ejemplo, las moléculas en las que
grupos amino libres han sido derivados para formar clorhidratos de
amina, grupos sulfonilo de p-tolueno, grupos
carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos de
cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libre pueden
derivar para formar sales, ésteres de metilo y etilo u otros tipos
de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivar
para formar derivados de O-acilo u
O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de la histidina
puede derivar para formar
N-im-bencilhistidina. También
incluidos como derivados químicos se encuentran los péptidos que
contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de los veinte
aminoácidos convencionales. Por ejemplo: la
4-hidroxiprolina puede ser sustituida por prolina;
la 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; la
3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la
homoserina puede sustituirse por serina; y la ornitina puede
sustituirse por lisina. Los polipéptidos de la presente invención
también incluyen cualquier polipéptido que posea una o más
adiciones y/o deleciones o residuos en relación con la secuencia de
un polipéptido cuya secuencia se muestra en la presente memoria
descriptiva, siempre que se mantenga la actividad requerida.
El término "fragmento" se refiere a
cualquier polipéptido sujeto que posea una secuencia de residuos de
aminoácidos más corta que la de un polipéptido cuya secuencia de
residuo de aminoácidos se muestra en la presente memoria
descriptiva.
Cuando un polipéptido de la presente invención
posee una secuencia que no es idéntica a la secuencia de la PS,
normalmente es porque se han realizado una o más sustituciones
conservadoras o no conservadoras, por lo general no más de
aproximadamente un 30 por ciento, más normalmente no más de un 20
por ciento y preferentemente no más de un 10 por ciento de los
residuos de aminoácidos son sustituidos. También se pueden añadir
residuos adicionales en cualquier extremo con el fin de
proporcionar un "ligador" a través del cual los polipéptidos
de esta invención se puedan fijar de un modo conveniente a un
indicador o a una matriz sólida, o portador. Preferentemente, los
residuos del ligador no forman epítopos de PS, es decir, no poseen
una estructura similar a la PS.
Los indicadores, las matrices sólidas y los
transportadores que se pueden usar con los polipéptidos de esta
invención se describen más adelante en la presente memoria
descriptiva.
Normalmente, los ligadores de residuos de
aminoácidos son al menos un residuo y pueden ser 40 o más residuos,
Más a menudo de 1 a 10 residuos, pero no forman epítopos de PS. Los
residuos de aminoácidos típicos usados para la unión son tirosina,
cisteína, lisina, ácido glutámico y ácido aspártico, o similares.
Además, un polipéptido sujeto puede diferir, a menos que se
especifique lo contrario, de la secuencia natural de PS a través de
la modificación de la secuencia mediante acilación del NH2
terminal, por ejemplo acetilación, o amidación con ácido
tioglicólico, mediante carboxilamidación terminal, por ejemplo con
amoniaco, metilamina y similares.
Cuando se acopla a un transportador para formar
lo que en la técnica se conoce como conjugado
transportador-hapteno, un polipéptido de PS de la
presente invención es capaz de inducir anticuerpos que
inmunorreaccionen con la PS. A la luz del principio bien
establecido de la reactividad cruzada inmunológica, la presente
invención contempla de este modo variantes antigénicamente
relacionadas de los polipéptidos que se muestran en la Tabla 1. Una
"variante antigénicamente relacionada" es un polipéptido sujeto
que es capaz de inducir moléculas de anticuerpos que
inmunorreaccionan con un polipéptido de la Tabla 1 y con la PS.
Cualquier péptido de la presente invención puede
usarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Entre los
ácidos adecuados que pueden formar sales con los péptidos de la
presente invención incluyen ácidos inorgánicos, tales como ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico,
ácido tiociánico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico acético, ácido
propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido
oxálico, ácido masónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido
fumárico, ácido antranílico, ácido cinnámico, ácido naftaleno
sulfónico, ácido sulfanílico o similares.
Entre las bases adecuadas capaces de formar
sales con los péptidos de la presente invención se incluyen bases
inorgánicas tales como hidróxido sódico, hidróxido de amonio,
hidróxido potásico, y similares; y bases orgánicas tales como
mono-, di- y tri-alquil y aril aminas (p. ej.,
trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimetilamina y
similares) y etanolaminas opcionalmente sustituidas (p. ej.,
etanolamina, dietanolamina y similares).
Un polipéptido de PS de la presente invención,
también conocido en la presente memoria descriptiva como polipéptido
sujeto, se puede sintetizar mediante cualquiera de las técnicas
conocidas para los expertos en la técnica polipeptídica, incluyendo
técnicas de ADN recombinante. Las técnicas de química sintética,
tales como síntesis de tipo Merrifield de fase sólida, se prefieren
por motivos de pureza, especificidad antigénica, libertad de
productos laterales indeseados, facilidad de producción y similares.
Un resumen excelente de las muchas técnicas disponibles se puede
encontrar en J.M. Steward y J. D. Young, "Solid Phase Peptide
Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M.
Bodanszky, y col., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons,
Segunda Edición, 1976 y J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and
Peptides", Vol. 2, pág. 46, Academia Press (Nueva York), 1983
para la síntesis de péptidos de fase sólida, y E. Schroder y K.
Kubke, "The Peptides", vol. 1, Academic Press (Nueva York)
1965 para la síntesis de solución clásica. En los textos anteriores
y en J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic
Chemistry", Plenum Press, Nueva York, 1973, se describen grupos
protectores adecuados útiles en tales síntesis.
En general, los procedimientos de síntesis de
fase sólida contemplados comprenden la adición secuencial a una
cadena peptídica en crecimiento de uno o más residuos de aminoácidos
o residuos de aminoácidos adecuadamente protegidos. Normalmente,
bien el grupo amino o bien el grupo carboxilo del primer residuo de
aminoácido está protegido mediante un grupo protector adecuado
extraíble de forma selectiva. Para los aminoácidos que contienen un
grupo lateral reactivo como lisina se utiliza un grupo protector
diferente extraíble de forma selectiva.
Usando una síntesis de fase sólida como ejemplo,
el aminoácido protegido o derivado se fija a un soporte sólido
inerte a través de su grupo amino o carboxilo sin proteger. El grupo
protector del grupo amino o carboxilo se elimina de forma selectiva
y el siguiente aminoácido de la secuencia que posee el grupo
complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido se
mezcla y hace reaccionar en condiciones adecuadas para formar el
enlace amida con el residuo ya fijado al soporte sólido. El grupo
protector del grupo amino o carboxilo se elimina de sus ácidos
recién añadidos y, a continuación, se añade el siguiente aminoácido
(adecuadamente protegido), y así sucesivamente. Una vez que los
aminoácidos deseados se han unido en la secuencia adecuada, todos
los grupos terminales restantes y protectores de grupo (y el
soporte sólido) se eliminan de forma secuencia o simultánea, para
dar el polipéptido
final.
final.
Un Polipéptido de PS se puede usar, entre otros,
en los procedimientos y sistemas diagnósticos de la presente
invención, para detectar la PS presente en una muestra corporal, o
se puede usar para preparar un inóculo como se ha descrito en la
presente memoria descriptiva para la preparación de anticuerpos que
inmunorreaccionan con los epítopos conservados en la PS.
Además, un polipéptido de PS de esta invención
se puede usar en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de la trombosis.
El término "anticuerpo" en sus varias
formas gramaticales se usa en la presente memoria descriptiva como
nombre colectivo que se refiere a una población de moléculas de
inmunoglobulina y/o porciones inmunológicamente activas de
moléculas de inmunoglobulina, es decir moléculas que contienen un
sitio de combinación de anticuerpo o paratope.
Un "sitio de combinación de anticuerpo" es
la porción estructural de una molécula de anticuerpo compuesta por
regiones variables e hipervariables de una cadena pesada y ligera
que se une específicamente al antígeno.
\newpage
La frase "molécula de anticuerpo" en sus
varias formas gramaticales como se usa en la presente memoria
descriptiva contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta
como una porción inmunológicamente activa de una molécula de
inmunoglobulina.
Ejemplos de moléculas de anticuerpo para usar en
los procedimientos y sistemas de diagnóstico de la presente
invención son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de
inmunoglobulina sustancialmente intactas y las porciones de una
molécula de inmunoglobulina que contienen el paratope, incluidas las
porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F(v).
Las porciones Fab y F(ab')_{2} de
anticuerpos se preparan mediante la reacción proteolítica de papaína
y pepsina, respectivamente, en anticuerpos sustancialmente intactos
mediante procedimientos bien conocidos. Véase por ejemplo, la
patente de EE.UU. nº 4.342.566 concedida a Theofilopoulos y Dixon.
Las porciones Fa' de los anticuerpos también con bien conocidos y
se producen a partir de las porciones F(ab')_{2} seguido
de la reducción de los puentes disulfuro que unen las dos porciones
de la cadena pesada como con mercaptoetanol, y seguido por la
alquilación de la proteína mercaptano resultante con un reactivo tal
como yodoacetamida. Se prefiere un anticuerpo que contiene
moléculas intactas de anticuerpo, y se utilizan a modo de
ilustración en la presente memoria descriptiva. Por tanto, la
invención proporciona un anticuerpo que inhibe la unión de la
proteína S a la proteína de unión C4b y que inmunorreacciona
con:
- (a)
- la proteína S, y
- (b)
- un polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos, la SEC ID Nº y los residuos correspondientes de los cuales se muestran entre paréntesis, representada por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SGIKKIIQEKQNKC \+
(12:1-14)\cr}
Pero que no inmunorreacciona con el polipéptido
que posee una secuencia de residuos de aminoácidos representada por
la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
CTCCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS \+
(1:103-131).\cr}
Por "sustancialmente libre" se quiere decir
que las moléculas de anticuerpo no inmunorreaccionan con el antígeno
indicado a niveles dentro de un orden de magnitud, y
preferentemente dentro de dos órdenes de magnitud, del nivel de
inmunorreacción con una especie de antígeno del que se ha citado que
inmunorreacciona con la molécula de anticuerpo, donde la
inmunorreacción se expresa como una constante de equilibrio entre el
antígeno unido (que ha inmunorreaccionado) y no unido.
Según las enseñanzas de la presente memoria
descriptiva, se ha descubierto que las moléculas de anticuerpo que
inmunorreaccionan con un polipéptido de PS de la presente invención
poseen la capacidad de inmunorreaccionar con un sitio en la PS que
no es accesible a la inmunorreacción cuando la PS se encuentra en
forma de complejo con C4BP. Por tanto, las moléculas de anticuerpo
de esta invención no inmunorreaccionan con el complejo PS:C4BP pero
sí se unen a la PS_{F.}
A un anticuerpo anti-PS que
inmunorreacciona con PS pero que no inmunorreacciona con PS en un
complejo PS:C4BP se hace referencia en la presente memoria
descriptiva como que inmunorreacciona con la "PS libre",
también denominada en la presente memoria descriptiva PS_{F}. Tal
anticuerpo también se denomina en la presente memoria descriptiva
anticuerpo anti-PS_{F}, un anticuerpo que
inmunorreacciona con PS_{F} y un anticuerpo que es
inmunoespecífico para PS_{F}, es decir que no se une al complejo
PS:C4BP. Tal anticuerpo es particularmente útil, como se describe
más adelante en la presente memoria descriptiva, para usar en
ensayos diagnósticos para medir la PS_{F} en una muestra de
fluido.
Además, un anticuerpo anti-PS
inmunoespecífico para PS_{F} posee la capacidad para inhibir la
unión de la proteína S a la proteína de unión D4B.
La inmunorreactividad del anticuerpo con los
antígenos que contienen PS se puede medir mediante una variedad de
ensayos inmunológicos conocidos en la técnica. La inmunorreacción
ejemplo de un anticuerpo anti-PS con un polipéptido
de PS se describe en el Ejemplo 2. La unión directa con PS aislada
(preparada como se describe en el ejemplo 2c) y con polipéptidos de
PS se puede analizar al menos mediante los procedimientos descritos
en el Ejemplo 2.
Un anticuerpo de la presente invención se
produce típicamente mediante la inmunización de un mamífero con un
inóculo que contiene un polipéptido de PS de esta invención y, de
este modo, induce en el mamífero moléculas de anticuerpo que
poseen inmunoespecificidad para el polipéptido de PS inmunizado. A
continuación, las moléculas de anticuerpo se obtienen del mamífero
y se aíslan en el grado deseado mediante técnicas bien conocidas
como, por ejemplo, usando DEAE Sephadex para obtener la fracción
IgG. Ejemplos de procedimientos de preparación de anticuerpos
usando polipéptidos de PS en el inmunógeno se describen en la
presente memoria descriptiva en el Ejemplo 2.
\newpage
La preparación de anticuerpos contra el
polipéptido es bien conocida en la técnica. [Véase Staudt y col.,
J. Exp. Med., 157: 687-704 (1983)]. Brevemente, para
producir una composición de anticuerpo frente al péptido de esta
invención, se inocula en un mamífero de laboratorio una cantidad
inmunológicamente eficaz de un polipéptido de PS, normalmente como
se encuentra presente en una vacuna de la presente invención. Las
moléculas de anticuerpos anti-polipéptido de PS
inducidas de este modo se recogen del mamífero y las
inmunoespecíficas para el polipéptido de PS y la PS aislada se
aíslan hasta el grado deseado mediante técnicas bien conocidas tales
como, por ejemplo, mediante cromatografía de inmunoafinidad.
Para potenciar la especificidad del anticuerpo,
los anticuerpos preferentemente se purifican mediante cromatografía
de inmunoafinidad usando polipéptidos inmunizantes fijados a fase
sólida. El anticuerpo se pone en contacto con el polipéptido
inmunizante fijados a fase sólida durante un periodo de tiempo
suficiente para que el polipéptido inmunorreaccione con las
moléculas de anticuerpo para formar un inmunocomplejo fijado a la
fase sólida. Los anticuerpos unidos se separan del complejo
mediante técnicas estándar. Ejemplos de procedimientos de
purificación mediante inmunoafinidad para producir un anticuerpo
anti-PS purificado por inmunoafinidad de esta
invención se describen en el Ejemplo 3.
La palabra "inóculo" en sus varias formas
gramaticales se usa en la presente memoria descriptiva para
describir una composición que contiene un polipéptido de PS de esta
invención en forma de un ingrediente activo usado para la
preparación de anticuerpos contra un polipéptido de PS. Cuando un
polipéptido se usa en un inóculo para inducir anticuerpos debe
entenderse que el polipéptido se puede usar en varias formas de
realización, por ejemplo solo o unida a un transportador en forma
de conjugado, o como un polímero polipeptídico. Sin embargo, para
la facilidad de expresión y en el contexto de un inóculo de
polipéptido, las varias formas de realización de los polipéptidos
de esta invención se denominan colectivamente con el término
"polipéptido" y sus varias formas gramaticales.
Para un polipéptido que contiene menos de
aproximadamente 35 residuos de aminoácidos, es preferible usar el
péptido unido a un transportador con el fin de inducir la producción
de anticuerpos.
Se pueden añadir uno o más residuos de
aminoácidos adicionales al extremo amino o carboxi del polipéptido
para ayudar a unir el polipéptido aun transportador. Se ha
encontrado que los residuos de cisteína añadidos a los extremos
amino o carboxi del polipéptido son particularmente útiles para
formar conjugados a través de puentes disulfuro. No obstante,
también se pueden usar otros procedimientos bien conocidos en la
técnica para preparar conjugados.
Las técnicas de conjugación o acoplamiento de
polipéptidos a través de grupos funcionales activados actualmente
conocidos en la técnica son particularmente aplicables. Véase, por
ejemplo, Aurameas y col., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl.
7:7-23 (1978) y las patentes de EE.UU. nº 4.493.795,
nº 3.791.932 y nº 3.839.153. Además, se puede llevar a cabo una
reacción de acoplamiento dirigida a sitio, de forma que se pueda
minimizar cualquier pérdida de actividad causada por la orientación
del polipéptido después del acoplamiento. Véase, por ejemplo,
Rodwell y col., Biotech., 3:889-894 (1985) y la
patente de EE.UU. nº 4-671-958.
Ejemplos de procedimientos de unión adicionales
incluyen el uso de productos de la reacción de adición de Michael,
dialdehídos tales como glutaraldehído, Klipstein y col., J.
Infect. Dis., 147: 318-326 (1983) y similares,
o el uso de tecnología con carbodiimidas como en el uso de una
carbodiimida hidrosoluble para formar enlaces amida con el
transportador. Como alternativa, se puede usar el reticulador
heterobifuncional SPDP
(N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato))
para conjugar péptidos, en los que se han introducido una cisteína
en el extremo carboxi.
Transportadores útiles son bien conocidos en la
técnica y, en general, son ellos mismos proteínas. Ejemplos de
tales transportadores son hemocianina de lamprea de California
(KLH), edestina, tiroglobulina, albúminas tales como seroalbúmina
bovina (BSA) o seroalbúmina humana (HSA), eritrocitos tales como
eritrocitos de oveja (SRBC), toxoide del tétanos, toxoide del
cólera así como ácidos de poliamino tales como poli
D-lisina: ácido D-glutámico, y
similares.
La elección de transportador depende más del
último uso del inóculo y se basa en los criterios no particularmente
implicados en la presente invención. Por ejemplo, se debe
seleccionar un transportador que no genera una reacción
desfavorable en el animal concreto para su inoculación.
El presente inóculo contiene una cantidad
inmunogénica eficaz de un polipéptido de esta invención, normalmente
en forma de un conjugado unido a un transportador. La cantidad
eficaz de polipéptido por unidad de dosis suficiente para inducir
una respuesta inmunitaria al polipéptido inmunizante depende, entre
otras cosas, de la especie de animal inoculado, el peso corporal
del animal y el régimen de inoculación escogido es bien conocido en
la técnica. Los inóculos normalmente contienen concentraciones de
polipéptido de aproximadamente 10 microgramos (\mug) a
aproximadamente 500 miligramos (mg= por inoculación (dosis),
preferentemente aproximadamente 50 microgramos a aproximadamente 50
miligramos por dosis.
El término "unidad de dosis" en lo
referente a los inóculos, se refiere a unidades físicamente
pequeñas, adecuadas como dosis unitarias para animales, en la que
cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo
calculada para producir el efecto inmunogénico deseado en asociación
con el diluyente requerido, es decir el transportador, o vehículo.
Las especificaciones para la nueva unidad de dosis de un inóculo de
esta invención vienen dictadas por, y dependen directamente de, (a)
las características únicas del material activo y por el concreto
efecto inmunológico que se quiere conseguir, y (b) las limitaciones
inherentes en la técnica de mezclar tal material activo para el uso
inmunológico en animales, tal como se describe con detalle en la
presente memoria descriptiva, siendo éstas características de la
presente invención.
Normalmente los inóculos se preparar a partir
del conjugado-polipéptido sólido seco mediante
dispersión del conjugado-polipéptido en un diluyen
fisiológicamente tolerable (Aceptable) tal como agua, solución
salina o solución salina tamponada con fosfato para formar una
composición acuosa.
Los inóculos también pueden incluir un adyuvante
como parte del diluyente. Los adyuvantes tales como adyuvante
completo de Freund (CFA), adyuvante incompleto de Freund (IFA) y
alumbre son materiales bien conocidos en la técnica y están
disponibles comercialmente en diversas fuentes.
El anticuerpo producido de este modo se puede
usar, entre otras cosas, en los procedimientos y sistemas de
diagnóstico de la presente invención para detectar PS libre (PS no
unida a C4BP) presente en una muestra tal como una muestra de
fluido corporal. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos
al menos en el Ejemplo 6. Los anticuerpos anti-PS
que inhiben la unión de la proteína S a C4BP también se pueden usar
in vivo en procedimientos terapéuticos como anticoagulantes
y antitrombóticos. Los ensayos para medir la capacidad para inhibir
la unión de PS a C4BP se describen en el Ejemplo 5.
Un anticuerpo anti-PS preferido
es un anticuerpo monoclonal y en la presente memoria descriptiva se
usa como ejemplo de un anticuerpo anti-PS.
La frase "anticuerpo monoclonal" en sus
varias formas monoclonales se refiere a una población de moléculas
de anticuerpos que contienen sólo una especie de sitio de
combinación de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un epítopo
concreto. Por tanto, un anticuerpo monoclonal típicamente exhibe una
única afinidad de unión para cualquier epítopo con el que
inmunorreacciona. Por tanto, un anticuerpo monoclonal puede contener
una molécula de anticuerpo que posea una pluralidad de sitios de
combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un
epítopo diferente, por ejemplo un anticuerpo monoclonal
biespecífico.
Un anticuerpo monoclonal de esta invención
comprende moléculas de anticuerpo que inhiben la unión de la
proteína S a la proteína de unión C4b como se describe en la
presente memoria descriptiva. Un anticuerpo monoclonal de esta
invención además se caracteriza por ser capaz de inmunorreaccionar
con 1) proteína S aislada y 2) un polipéptido de PS de la presente
invención como se ha descrito para los anticuerpos
anti-PS de esta invención.
Un anticuerpo monoclonal está formado
típicamente por anticuerpos producidos por clones de una única
célula denominada hibridoma, que secreta (produce) sólo un tipo de
molécula de anticuerpo. La célula hibridoma se forma mediante la
fusión de una célula productora de anticuerpos y un mieloma u otra
línea celular que se autoperpetúa. La preparación de tales
anticuerpos fue descrita por primera vez por Kohler y Milstein,
Nature, 256: 495-497 (1975). Los
sobrenadantes del hibridoma preparados de este modo se pueden
someter a detección selectiva para detectar la presencia de
moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan con un polipéptido de
PS o la inhibición de la unión de PS a C4BP como se describe más
adelante en la presente memoria descriptiva.
Brevemente, para formar el hibridoma a partir
del que se produce la composición de anticuerpos monoclonales, un
mieloma u otra línea celular que se autoperpetúa se fusiona con
linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con un
antígeno de PS, tal como está presente en un polipéptido de PS de
esta invención. Niman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80: 4949-4953 (1983) han descrito la tecnología del
hibridoma inducido por el polipéptido.
Se prefiere que la línea de células de mieloma
usada para preparar un hibridoma proceda de la misma especie que los
linfocitos.
Normalmente, el mamífero preferido es un ratón
de la cepa 129 G1X+. Entre los mielomas de ratón adecuados para
usar en la presente invención se incluyen las líneas celulares
sensibles a
hipoxantina-aminopterina-timidina
(HAT) p3x63-Ag8.653 y Sp2/0-Ag14,
disponibles en la Colección de cultivos tipo americana, Rockville,
MD, bajo las designaciones CRL 1580 y CR 1581, respectivamente.
Normalmente, los esplenocitos se fusionan con
las células de mieloma usando polietilenglicol (PEG) 1500. Los
híbridos fusionados se seleccionan en función de su sensibilidad a
HAT. Los hibridomas productores de un anticuerpo monoclonal de esta
invención se identifican usando el ensayo de inmunoadsorción ligado
a enzimas (ELISA) descrito en el Ejemplo 4.
Un anticuerpo monoclonal de la presente
invención también se puede producir iniciando un cultivo de,
hibridoma monoclonal que comprenda un medio nutritivo que contenga
un hibridoma que produzca y secrete moléculas de anticuerpo de la
especificidad polipeptídica adecuada. El cultivo se mantiene en las
condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para que el
hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo al medio. A
continuación se recoge el medio que contiene el anticuerpo.
Posteriormente las moléculas de anticuerpo de pueden aislar mediante
técnicas bien conocidas.
Los medios útiles para la preparación de estas
composiciones son bien conocidos en la técnica y están disponibles
comercialmente, e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones
endogámicos y similares. Un ejemplo de medio sintético es el Medio
Mínimo Esencial de Dulbecco (DMEM; Dulbecco y col., Virol. 8:
396 (1959)) suplementado con 4,5 mg/l de glucosa, glutamina 20 mm y
20% de suero bovino fetal. Un ejemplo de cepa de ratón endogámico es
el Balbc.
Otros procedimientos para producir un anticuerpo
monoclonal, una célula de hibridoma o un cultivo de células de
hibridoma también son bien conocidos. Véase, por ejemplo, el
procedimiento para aislar anticuerpos monoclonales a partir de un
repertorio inmunológico como han descrito Sastry y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5728-5732 (1989); y
Huse y col. Science, 246: 1275-1281 (1989).
Los anticuerpos monoclonales de esta invención
se pueden usar del m mismo modo que el descrito en la presente
memoria descriptiva para los anticuerpos de la presente
invención.
Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal se puede
usar en los usos médicos, procedimientos diagnósticos o in
vitro descritos en la presente memoria descriptiva en los que se
desea la inhibición de la unión de la proteína S a la proteína de
unión C4b.
En esta invención también se contempla la célula
hibridoma y cultivos que contengan una célula de hibridoma que
produzca un anticuerpo monoclonal de esta invención.
Uno de estos anticuerpos monoclonales es el
anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma LJS 56 (AcMo 56)
que inmunorreacciona con PS_{F} y el polipéptido de PS
PSP-12 que posee la secuencia de residuos de
aminoácidos SGIKEIIQEKQNKHC (1:420-434). El
hibridoma también inmunorreacciona con el polipéptido de PS
denominado PSP-loop que posee la secuencia de
residuos de aminoácidos CIRSWNLMKQGASIKEIIQEKQNKHC
(11:1-26). El AcMo 56 se produjo como se describe en
el Ejemplo 4 usando el polipéptido de PS PSP-12 como
inmunógeno. Un secundo anticuerpo monoclonal, funcionalmente
equivalente al AcMo 56, se aisló mediante los mismos procedimientos
y se designa como AcMo 418.
El hibridoma LJS 56 se depositó según los
requerimientos del Tratado de Budapest con la Colección Americana de
Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD, el 26 de junio de 1991, y se le
asignó un número de registro HB 10818.
Otro anticuerpo monoclonal producido por el
hibridoma LJS S-7 (AcMo S-7)
inmunorreacciona con la PS cuando está presente en complejo
PS-C4BP y en la presente memoria descriptiva se usa
como anticuerpo de captura que inmunorreacciona con la "PS
total", también denominada PS_{T}. El AcMo S-7
se produjo como se describe en el Ejemplo 6 usando PS aislada como
inmunógeno.
El hibridoma LJS S-7 se depositó
según los requerimientos del Tratado de Budapest con la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD, el 26 de junio de
1991, y se le asignó un número de registro HB 10819.
Los hibridomas LJS 56 y LJS S-7
se han depositado en un depósito que asegura la permanencia del
depósito y la fácil accesibilidad al mismo por el público tras la
expedición de una patente, en las condiciones que garantizan que el
acceso a los hibridomas estará disponible durante la tramitación de
la solicitud de patente para los que el Comisionado estime que
tienen derecho a tal acceso, y que todas las restricciones de
disponibilidad de los hibridomas depositados para el público se
eliminarán de forma irrevocable tras la concesión de la patente.
Los hibridomas depositados se mantendrán en la ATCC durante el
periodo de la patente o durante 30 años desde la fecha del
depósito, lo que sea más prolongado, y en todos los casos durante al
menos cinco años después de la fecha de la última petición de
acceso.
acceso.
La presente invención también describe un
sistema de diagnóstico, preferentemente en forma de kit, para
analizar la presencia de proteína S libre (PS_{F}) en una muestra
de fluido, tal como sangre, plasma o suero, donde es deseable
detectar la presencia, y preferentemente la cantidad, de PS_{F} en
una muestra de acuerdo con los procedimientos diagnósticos
descritos en la presente memoria descriptiva. El sistema de
diagnóstico incluye, en una cantidad suficiente para realizar al
menos un ensayo, un polipéptido de PS sujeto y/o un anticuerpo
sujeto o anticuerpo monoclonal de la presente invención, en forma de
un reactivo envasado por separado. Ejemplos de sistemas de
diagnóstico para detectar PS_{F} en una muestra corporal y
utilizando un polipéptido de PS o un anticuerpo de esta invención
se describen en el Ejemplo 6.
En otra forma de realización, se contempla un
sistema de diagnóstico, preferentemente en forma de kit, para
analizar la presencia de un polipéptido de PS o un anticuerpo
anti-PS en una muestra de fluido corporal, tal como
para monitorizar el destino del polipéptido de PS o del anticuerpo
anti-PS administrado terapéuticamente. El sistema
incluye, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo, un
polipéptido PC sujeto y/o un anticuerpo sujeto en forma de un
reactivo inmunoquímico envasado por separado.
En otra forma de realización, se contempla un
sistema de diagnóstico, preferentemente en forma de kit, para
analizar de acuerdo con los procedimientos de la presente memoria
descriptiva la presencia de proteína de unión C4b (C4BP) que es
capaz de unirse (competente para la unión) a la PS en una muestra de
fluido corporal, como sangre, plasma o suero. En la presente
memoria descriptiva, tal especie de C4BP se denomina C4BP
competente. En vista de la presencia de varias formas de C4BP en
los fluidos vasculares, algunas de las cuales no pueden unirse a
PSF porque ya están formando complejos con PS o porque representan
especies de C4BP incapaces de unirse a PS, es deseable detectar la
presencia, y preferentemente la cantidad, de C4BP competente en un
fluido vascular. El sistema incluye, en una cantidad suficiente
para al menos un ensayo, un polipéptido PC sujeto y/o un anticuerpo
sujeto en forma de un reactivo inmunoquímico envasado por separado.
Ejemplos de sistemas se describen en el Ejemplo 7.
Normalmente también se incluyen instrucciones de
uso del(los) reactivo(s) envasados.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "envase" se refiere a una matriz sólida o un
material tal como vidrio, plástico (p. ej., polietileno,
polipropileno o policarbonato), papel, papel de aluminio y
similares, capaz de mantener dentro de unos límites fijados un
polipéptido, anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal de la
presente invención. Por tanto, por ejemplo, un envase puede ser un
vial de vidrio usado para contener cantidades en miligramo de un
polipéptido o anticuerpo contemplado o puede ser un pocillo de una
placa de microtitulación al que se han fijado de forma operativa
cantidades en microgramos de un polipéptido o anticuerpo
contemplado, es decir ligado de forma que pueda unirse
inmunológicamente a un anticuerpo o antígeno, respectivamente.
Las "Instrucciones de uso" típicamente
incluyen una expresión tangible que describe la concentración del
reactivo o al menos un parámetro del procedimiento de ensayo, tal
como las cantidades relativas del reactivo y la muestra que se van
a mezclar, los periodos de tiempo de mantenimiento para las mezclas
reactivo/muestra, la temperatura, las condiciones del tampón y
similares.
Un sistema de diagnóstico de la presente
invención también incluye, preferentemente, una etiqueta o medio
indicador que señale la formación de un inmunocomplejo que contiene
un polipéptido o molécula de anticuerpo de la presente
invención.
La palabra "complejo", como se usa en la
presente memoria descriptiva, se refiere al producto de una reacción
de unión específica tal como una reacción
anticuerpo-antígeno o
receptor-ligando. Ejemplos de complejos son los
productos de la inmunorreacción.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "etiqueta" y "medio indicador" en sus
diversas formas gramaticales se refieren a átomos y moléculas
sencillas que están directa o indirectamente implicados en la
producción de una señal detectable para indicar la presencia de un
complejo. Cualquier etiqueta o medio indicador puede estar unido a
o incorporado en una proteína de expresión, polipéptido o molécula
de anticuerpo que es parte de un anticuerpo o composición de
anticuerpo monoclonal de la presente invención, o usarse por
separado, y dichos átomos o moléculas se pueden usar solos o junto
con reactivos adicionales. Tales etiquetas son por si mismas bien
conocidas en la química de diagnóstico clínico y constituyen una
parte de esta invención únicamente en la medida en que se utilizan
con otras proteínas procedimientos y/o sistemas.
El medio indicador puede ser un agente indicador
fluorescente que se une químicamente a anticuerpos o antígenos sin
desnaturalizarlos, para formar un fluorocromo (colorante) que es un
marcador inmunofluorescente útil. Los agentes indicadores
fluorescentes adecuados son fluorocromos tales como isocianato de
fluoresceína (FIC), isotiocianato de fluoresceína (FITC), cloruro
de
5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo
(DANSC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), lisamina,
cloruro de sulfonilo rodamina 8200 (RB 200 SC) y similares. Una
descripción de las técnicas de análisis de la inmunofluorescencia
se encuentra en Deluca "Immunofluorescence Analysis" en
Antibody As a Tool, Marchalonis y col., eds., John Wiley
& Sons, ETD., pág. 189-231 (1982).
En formas de realización preferidas, el grupo
indicador es una enzima, tal como peroxidasa de rábano (HRP),
glucosa oxidasa, o similares. En tales casos, en los que el
principal grupo indicador es una enzima tal como HRP o glucosa
oxidasa, se requieren reactivos adicionales para visualizar le hecho
de que se ha formado un complejo receptor-ligando
(inmunorreactante). Tales reactivos adicionales para HRP incluyen
peróxido de hidrógeno y un precursor del colorante de oxidación tal
como diaminobencidina. Un reactivo adicional útil con la glucosa
oxidasa es ácido
2,2'-amino-di-(3-etil-benztiazolina-G-sulfónico)
(ABTS).
Los elementos radioactivos también son útiles
agentes indicadores y se usan a modo de ilustración en la presente
memoria descriptiva. Un ejemplo de agente radiomarcador es un
elemento radioactivo que produce emisiones de rayos gamma. Los
elementos que por sí mismos emiten rayos gamma, tales como
^{124}I, ^{125}I, ^{128}I y ^{51}Cr representan una clase
de grupos indicadores de elemento radioactivo productor de emisiones
de rayos gamma. Particularmente preferidos es el ^{125}I. Otro
grupo de medios indicadores útiles son elementos tales como
^{11}C, ^{18}F, ^{15}O y ^{13}N, que ellos mismos emiten
positrones. Los positrones emitidos de este modo producen rayos
gamma tras su encuentro con los electrones presentes en el cuerpo
del animal. También es útil un emisor beta, tal como ^{111}indio
o ^{3}H.
La unión de los indicadores, es decir
indicadores de polipéptidos y proteínas, es bien conocida en la
técnica. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpos producidas por
un hibridota se pueden marcar mediante incorporación metabólica de
aminoácidos que contengan radioisótopos proporcionados como
componente del medio de cultivo. Véase, por ejemplo, Galfre y col.,
Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Las técnicas
de conjugación o acoplamiento de proteínas a través de grupos
funcionales activados son particularmente aplicables. Véase, por
ejemplo, Aurameas y col., Scand. J. Immunol., Vol. 8 Suppl.
7:7-23 (1978), Rodwell y col., Biotech., 3:
889-894 (1984) y la patente de EE.UU. nº
4.493.795.
Los sistemas de diagnóstico también pueden
incluir, preferentemente como envase separado, un agente de unión
específico. Un "agente de unión específico" es una entidad
molecular capaz de unir selectivamente una especie de reactivo de
la presente invención o un complejo que contenga tal especie, pero
no es en sí mismo una composición de polipéptido o de molécula de
anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de agentes de unión
específicos son segundas moléculas de anticuerpos, proteínas del
complemento o fragmentos de las mismas, proteína A de S.
aureus y similares. Preferentemente, el agente de unión
específico se une a la especie reactivas cuando dicha especie está
presente como parte de un complejo.
En formas de realización preferidas, el agente
de unión específico está marcado. No obstante, cuando el sistema de
diagnóstico incluye un agente de unión específico que no está
marcado, el agente se usa típicamente como medio o reactivo de
amplificación. En estas formas de realización, el agente de unión
específico marcado es capaz de unirse específicamente al medio de
amplificación cuando el medio de amplificación está unido a un
complejo que contiene la especie reactivo.
Los kit diagnósticos de la presente invención se
pueden usar en un formato "ELISA" para detectar la cantidad de
PS_{F} o de C4BP competente en una muestra de fluido vascular, tal
como sangre, plasma o suero. "ELISA" se refiere a un ensayo de
inmunoadsorción ligado a enzimas que emplea un anticuerpo o antígeno
unido a una fase sólida y un conjugado
enzima-antígeno o enzima-anticuerpo
para detectar y cuantificar la cantidad de antígeno presente en una
muestra. Una descripción de la técnica de ELISA se encuentra en el
Capítulo 22 de la 4ª Edición de Basic and Clinical Immunology de D.
P. sites y col., publicado por Lange Medical Publications of Los
Altos, CA en 1982 y en las patentes de EE.UU. nº 3.654.090; Nº
3.850.752 y Nº 4.016.043.
Por tanto, en algunas formas de realización, un
polipéptido de PS, un anticuerpo o un anticuerpo monoclonal de la
presente invención se pueden fijar a una matriz sólida para formar
un soporte sólido que comprende un envase en los sistemas de
diagnóstico sujeto.
Normalmente, un reactivo se fija a una matriz
sólida mediante adsorción desde un medio acuoso, aunque se pueden
usar otros modos de fijación aplicables a proteínas y polipéptidos
que son bien conocidos para los expertos en la técnica. Ejemplos de
procedimientos de adsorción se describen en la presente memoria
descriptiva.
En la técnica también se conocen bien matrices
sólidas útiles. Tales materiales son insolubles en agua e incluye
el dextrano reticulado disponible como la marca SEPHADEX de
Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); azarosa; esferas de
poliestireno de un diámetro de aproximadamente 1 micrómetro (\mu)
a aproximadamente 5 mm disponibles en Abbott Laboratories de North
Chicago, IL; cloruro de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida
reticulada, redes con base de nitrocelulosa o nylon, como láminas,
tiras o palas; o tubos, placas o los pocillos de una placa de
microtitulación tales como los hechos de poliestireno o de
polivinilcloruro.
Las especies reactivo, agente de unión
específico marcado o reactivo de amplificación de cualquier sistema
de diagnóstico descrito en la presente memoria descriptiva se pueden
proporcionar en solución, como dispersión líquida o en forma de un
polvo sustancialmente seco, por ejemplo en forma liofilizada. Cuando
en medio indicador es una enzima, el sustrato de la enzima también
se puede suministrar en un envase aparte de un sistema. En este
sistema de ensayo diagnóstico también se puede incluir como
elementos envasados aparte un soporte sólido tal como la placa de
microtitulación descrita anteriormente y uno o más tampones.
Los materiales de envase tratados en la presente
memoria descriptiva en relación con los sistemas de diagnóstico son
los utilizados habitualmente en los sistemas de diagnóstico.
La presente invención contempla varios
procedimientos de ensayo para determinar la presencia, y
preferentemente la cantidad, de proteína S libre (PFS) en una
composición acuosa tal como una muestra de fluido biológico usando
un polipéptido, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal
de esta invención como reactivo inmunoquímico para formar un
producto de inmunorreacción cuya cantidad está relacionada, directa
o indirectamente, con la cantidad de PSF en la muestra.
Los expertos en la técnica entenderán que hay
numerosos procedimientos químicos de diagnóstico clínico bien
conocidos en los que se puede usar un reactivo inmunoquímico de esta
invención para formar un producto de inmunorreacción cuya cantidad
esté relacionada con la cantidad de PSF presente en una muestra
corporal. Por tanto, aunque en la presente memoria descriptiva se
describen procedimientos de ensayo de ejemplo, la invención no se
limita a ellos.
Al realizar un procedimiento de ensayo de esta
invención se pueden emplear diversos protocolos heterogéneos y
homogéneos, competitivos o no competitivos.
Por ejemplo, una forma de realización contempla
un procedimiento para analizar la cantidad de PS_{F} en una
muestra de fluido corporal que utiliza un primer anticuerpo de
captura para capturar e inmovilizar la PS en la fase sólida y un
segundo anticuerpo indicador para indicar la presencia del antígeno
de PS capturado. En esta forma de realización, un anticuerpo
inmunorreacciona con la PS_{F} para formar un complejo de
inmunorreacción PS_{F}-anticuerpo, y el otro
anticuerpo puede inmunorreaccionar con la PS mientras la PS está
presente en el complejo de inmunorreacción
PS_{F}-anticuerpo. Esta forma de realización se
puede practicar en dos formatos, siendo el anticuerpo de captura
inmovilizado uno de los dos anticuerpos identificados anteriormente
y el anticuerpo indicador el otro de los dos anticuerpos.
Un procedimiento de inmunoensayo de captura
usando una molécula de anticuerpo anti-PS_{F}
inmovilizado para analizar la cantidad de PS libre en una muestra
de fluido vascular comprende las etapas de:
(a) Formar una mezcla de inmunorreacción
mediante la mezcla de una muestra de fluido con un anticuerpo
anti-PS de la presente invención, preferentemente un
anticuerpo monoclonal. El anticuerpo está presente como parte de un
soporte sólido, es decir unido operativamente a una matriz sólida de
forma que la mezcla de inmunorreacción posee una fase líquida y una
fase sólida, y el anticuerpo funciona como reactivo de captura.
Preferentemente, la muestra de fluido es una
muestra de fluido vascular tal como sangre, o un producto derivado
de sangre tal como suero o plasma.
(b) La mezcla de inmunorreacción se mantiene en
condiciones biológicas de ensayo durante un periodo de tiempo
predeterminado tal como aproximadamente 10 minutos a aproximadamente
16-20 horas a una temperatura de aproximadamente
4ºC a aproximadamente 45ºC, en el que dicho tiempo es suficiente
para que la PS presente en la muestra inmunorreaccione con (se una
inmunológicamente) el anticuerpo en la fase sólida para formar un
producto de inmunorreacción que contenga PSF (inmunocomplejo).
Las condiciones biológicas del ensayo son
aquéllas que mantienen la actividad biológica de los reactivos
inmunoquímicos de esta invención y la PS que se busca analizar.
Entre dichas condiciones se incluyen un intervalo de temperatura de
aproximadamente 4ºC a aproximadamente 45ºC, un valor de pH de
aproximadamente 5 a aproximadamente 9 y una fuerza iónica variable
de la del agua destilada a la del cloruro sódico de aproximadamente
uno molar. Los procedimientos para optimizar tales condiciones son
bien conocidos en la técnica.
(c) Se determina la cantidad de producto de
inmunorreacción que contiene PSF formado en la etapa (b), de modo
que se determina la cantidad de PS presente en la muestra.
La determinación de la cantidad del producto de
inmunorreacción, bien directa o bien indirectamente, se puede
realizar mediante técnicas de ensayo bien conocidas en la técnica y
normalmente dependen del tipo de medio indicador usado.
Preferentemente, la determinación de la etapa
(c) comprende las etapas de:
(i) Mezclar el producto de inmunorreacción que
contiene la proteína S en la fase sólida con un segundo anticuerpo
para formar una segunda mezcla de inmunorreación que posee una fase
líquida y una fase sólida, en la que dicha segunda molécula de
anticuerpo posee la capacidad de inmunorreaccionar con el producto
de inmunorreación que contiene PS_{F}.
Los anticuerpos útiles como el segundo
anticuerpo incluyen preparaciones de anticuerpos policlonales
producidos contra PS purificada que inmunorreaccionan con una
variedad de epítopos en la molécula de PS, o anticuerpos
monoclonales seleccionados en función de su capacidad para unirse a
la PS tras la inmunorreacción con un anticuerpo que es específico
para PS_{F}, como se describe en la presente memoria descriptiva.
Tal anticuerpo inmunorreacciona con PS ya sea libre o en forma de
complejo con C4BP y, por tanto, es inmunoespecífico para la PS total
(PS_{T}). Las moléculas de anticuerpo anti PS_{T} no inhiben la
unión de la proteína S a C4BP. Un ejemplo de un anticuerpo
monoclonal preferido que inmunorreacciona con moléculas de OS cuando
están en forma de inmunocomplejo con un anticuerpo
específico-PS_{F} es el anticuerpo monoclonal
producido por el hibridoma LJS S-7 (AcMo
S-7).
(ii) Mantener dicha segunda mezcla de
inmunorreacción durante un periodo de tiempo suficiente para que
dicho segundo anticuerpo forme un complejo con el producto de
inmunorreacción y forme un segundo producto de inmunorreacción en
la fase sólida, y
(iii) Determinar la cantidad de un segundo
anticuerpo presente en el segundo producto de inmunorreacción y, de
este modo, la cantidad del producto de inmunorreacción formado en la
etapa (c).
En una forma de realización, el segundo
anticuerpo es un anticuerpo macado de forma que el marcaje
proporcione un medio indicador para detectar la presencia del
segundo producto de inmunorreacción formado. El marcaje se mide en
el segundo producto de inmunorreacción, lo que indica la presencia,
y preferentemente la cantidad, de segundo anticuerpo en la fase
sólida.
Como alternativa, la cantidad del segundo
anticuerpo se puede determinar mediante la preparación de una mezcla
de reacción adicional que posee un medio indicador que reacciona de
forma específica con (se une a) el segundo anticuerpo, como es bien
conocido. Son ejemplos terceras mezclas de inmunorreacción con una
molécula de anticuerpo anti-inmunoglobulina marcado
específico para el segundo anticuerpo. Tras la tercera
inmunorreacción, el tercer producto de inmunorreacción formado se
detecta mediante la presencia del marcaje.
También se contempla un procedimiento de
inmunoensayo de captura usando moléculas de anticuerpo
anti-PS_{T} inmovilizado relacionado con el
ensayo de captura descrito anteriormente. El ensayo para detectar
PS_{F} libre comprende las etapas de:
(a) Formar una primera mezcla de inmunorreacción
mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular con un primer
anticuerpo anti-proteína S que contenga moléculas de
anticuerpo que inmunorreacciona con la PS_{T}. El anticuerpo
anti-PST está unido operativamente a una matriz
sólida de forma que la primera mezcla de inmunorreacción posee una
fase líquida y una fase sólida. Un primer anticuerpo preferido es el
anticuerpo monoclonal (AcMo S-7) producido por el
hibridoma LJS S-7.
(b) La mezcla de inmunorreacción se mantiene
durante un periodo de tiempo suficiente para formar un producto de
inmunorreacción que contenga proteína S en la fase sólida en las
condiciones previamente descritas.
(c) A continuación se forma una mezcla
mezclando el producto de inmunorreacción que contiene PS en la fase
sólida de la etapa (b) con un segundo anticuerpo
anti-proteína S que contiene moléculas de anticuerpo
inmunoespecíficas para PS_{F}, es decir los anticuerpos de la
presente invención. Un ejemplo de este segundo anticuerpo es el
anticuerpo monoclonal (AcMo 56) producido por el hibridoma LJS
56.
(d) La segunda mezcla de inmunorreacción se
mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que las
moléculas de anticuerpo específicas para PS_{F} inmunorreaccionen
con la proteína S en la fase sólida y se forme un segundo producto
de inmunorreacción que contiene proteína S en la fase sólida.
(e) Se determina la presencia, y preferentemente
la cantidad, de producto formado en la etapa (d), de modo que se
determina la cantidad de proteína S libre en la muestra de fluido
vascular.
La determinación de la presencia del segundo
producto de inmunorreacción puede realizarse de acuerdo con los
procedimientos descritos anteriormente para el inmunoensayo de
captura anterior.
Ejemplos de inmunoensayos de captura para
detectar PS_{F} se describen en el Ejemplo 6.
Otra forma de realización para analizar la
cantidad de PS_{F} en una muestra de fluido corporal utiliza una
reacción de competencia en la que un polipéptido de PS o una
molécula de anticuerpo anti-PS_{F} de esta
invención está presente en la fase sólida en forma de un reactivo
inmunoquímico inmovilizado, y el otro de los dos reactivos está
presente en solución en la fase líquida, en forma de un reactivo
marcado. Una muestra de fluido se mezcla para forma una mezcla de
inmunorreacción de competencia y la cantidad resultante del marcaje
en la fase sólida es proporcional, directa o indirectamente, a la
cantidad de PS_{F} en la muestra de fluido.
Por tanto, una versión de esta forma de
realización comprende las etapas de:
(a) Formar una mezcla de inmunorreacción de
competencia mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular
con:
(1) un anticuerpo anti-proteína
S de acuerdo con esta invención que contiene moléculas de anticuerpo
que inmunorreaccionan con la PS_{F}, estando dicho anticuerpo
unido operativamente a una matriz sólida de forma que la mezcla de
inmunorreacción de competencia posee una fase líquida y una fase
sólida, y
(2) un polipéptido de la presente invención que
es inmunorreactivo con el anticuerpo añadido. El polipéptido
mezclado está unido operativamente a un medio indicador como se ha
descrito en la presente memoria descriptiva.
(b) A continuación, la mezcla de
inmunorreacción de competencia se mantiene durante un periodo de
tiempo suficiente para que el polipéptido y la PSF presente en la
fase líquida compita por la inmunorreacción con en anticuerpo de la
fase sólida. Dichas condiciones de inmunorreacción se han descrito
previamente, y tiene como resultado la formación de un producto de
inmunorreacción que contiene un medio indicador que comprende el
polipéptido marcado en la fase sólida.
\newpage
(c) Después se determina la cantidad del medio
indicador presente en el producto formado en la etapa (b), de modo
que se determina la presencia, y preferentemente la cantidad, de la
proteína S libre en la muestra de fluido vascular.
A continuación se lleva a cabo la determinación
del medio indicador en la fase sólida mediante los procedimientos
estándar descritos en la presente memoria descriptiva.
Ejemplos de moléculas de anticuerpos
anti-PSF para usar en la reacción de competencia son
las moléculas de anticuerpo AcMo 56. Un ejemplo también preferido
es el uso de polipéptidos biotinilados como se describe más
adelante en la presente memoria descriptiva.
Otra versión de esta forma de realización
comprende las etapas de:
(a) Formar una mezcla de inmunorreacción de
competencia mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular
con:
(1) un anticuerpo anti-proteína
S de acuerdo con la presente invención que contiene moléculas de
anticuerpo que inmunorreaccionan con la PS_{F}; y
(2) un polipéptido de la presente invención que
es inmunorreactivo con el anticuerpo y está operativamente unido a
una matriz sólida de forma que la mezcla de la inmunorreacción de
competencia posee una fase líquida y una fase sólida. Un ejemplo de
anticuerpo es el anticuerpo monoclonal AcMo 56.
(b) A continuación, la mezcla de inmunorreacción
de competencia se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente
para que cualquier PS libre en el fluido vascular compita con las
moléculas de anticuerpo para la inmunorreacción con los
polipéptidos de la fase sólida y formar un producto de
inmunorreacción que contiene anticuerpo en la fase sólida.
(c) Después se determina la cantidad de
anticuerpo presente en el producto formado en la etapa (b), de modo
que se determina la presencia y/o cantidad de proteína S libre en la
muestra de fluido vascular.
En formas de realización preferidas, el
anticuerpo está operativamente unido a un medio indicador de forma
que la determinación de la etapa (c) comprende determinar la
cantidad de medio indicador presente en el producto formado en la
etapa (b). Un medio indicador preferido quiere decir es la
biotinilización como se ha descrito en la presente memoria
descriptiva.
Preferentemente, la muestra de fluido vascular
se proporciona a una mezcla de inmunorreacción de competencia como
cantidad conocida de sangre, o un producto derivado de sangre tal
como suero o plasma. Más preferidas son las formas de realización
en las que la cantidad de reactivo inmunoquímico en la fase líquida
de la mezcla de inmunorreacción es un exceso de cantidad en
relación con la cantidad de reactivo en la fase sólida. Normalmente,
se establece un conjunto paralelo de inmunorreacción de competencia
usando una cantidad conocida de PS purificada en una serie de
dilución de forma que se pueda desarrollar una curva estándar, como
es bien conocido. Por tanto, la cantidad de producto formado en la
etapa (c) al usar una muestra de fluido vascular se compara con la
curva estándar y se determina la cantidad de PS_{F} presente en el
fluido vascular.
En otra forma de realización, la presente
invención contempla un ensayo de reacción de competencia que utiliza
la interacción de la unión entre C4BP y un polipéptido de PS de la
presente invención como la base para un ensayo diagnóstico de PSF
en una muestra de fluido vascular. Esta forma de realización
comprende las etapas de:
(a) Formar una mezcla de reacción de competencia
mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular con:
(1) Un soporte sólido al que se ha fijado C4BP
purificada de forma que la mezcla de reacción de competencia posee
tanto una fase líquida como una fase sólida, y
(2) un polipéptido de PS de la presente
invención que posee la capacidad de unirse a C4BP e inhibir la unión
de la proteína S a C4BP. El polipéptido mezclado está unido
operativamente a un medio indicador como se ha descrito en la
presente memoria descriptiva. Un medio indicador preferido es
polipéptido biotinilado. Polipéptidos particularmente preferidos
para usar en la presente memoria descriptivo con los polipéptidos
PSP-12 y PSP-loop debido a su unión
demostrada a C4BP, como se muestra en los ejemplos. La C4BP se puede
purificar como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, y
después se fija a una matriz sólida mediante adsorción desde una
solución como se ha descrito en la presente memoria descriptiva.
(b) A continuación, la mezcla de reacción de
competencia se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente
para que el polipéptido y la PS_{F} presente en la fase líquida
compita por la unión con la C4BP de la fase sólida. Las condiciones
de dicha reacción compatibles con la unión de la proteína S a C4BP
en la fase sólida se describen en otra parte de la presente memoria
descriptiva, y tiene como resultado la formación de un producto de
reacción que contiene medio indicador que comprende el polipéptido
marcado en complejo con C4BP en la fase sólida.
\newpage
(c) Después se determina la cantidad del medio
indicador presente en el producto formado en la etapa (b) como se
ha descrito previamente, de modo que se determina la presencia, y
preferentemente la cantidad, de la proteína S libre en la muestra
de fluido vascular.
Las reacciones de competencia se llevan a cabo,
preferentemente, con curvas estándar como se ha descrito antes, con
el fin de determinar con mayor exactitud la cantidad de PS_{F} en
la muestra de fluido vascular.
En una forma de realización relacionada, la
reacción de competencia anterior para detectar la PS_{F} que
utiliza C4BP inmovilizada se puede practicar con un anticuerpo
anti-PS_{F} de la presente invención en lugar de
un polipéptido de PS en la fase líquida porque tanto el polipéptido
de PS ya citado como el anticuerpo anti-PS_{F} se
unen a C4BP y, por tanto, pueden competir con la PS_{F} en la
muestra de fluido vascular por la unión a la C4BP inmovilizada. En
esta forma de realización, preferentemente el anticuerpo está
operativamente unido a un medio indicador como se ha descrito antes
para facilitar la detección del producto de reacción de
competencia.
La presente invención también contempla
inmunorreacciones de competencia similares a las previamente
descritas que están adaptadas para la determinación de la
presencia, y preferentemente la cantidad, de proteína de unión C4b
competente (C4BP) en una muestra de fluido.
"C4BP competente" es C4BP en una forma que
posee la capacidad para unirse a la proteína S libre (PSF) en
solución. Las formas de C4BP que no pueden unirse a la PSF incluyen
C4BP ya en forma de complejo con PSF, C4BP defectuosa debido a un
ensamblaje inadecuado de sus subunidades o la presencia de
subunidades proteicas genéticamente deficientes, y similares. Los
niveles de C4BP competente en sangre son importantes porque es la
forma de C4BP que contribuye a la inactivación de PSF mediante la
formación de complejos y, por tanto, la determinación de los
niveles en plasma de C4BP competente proporciona información
clínicamente relevante.
El ensayo de competencia se basa en la
interacción de unión descrita en la presente memoria descriptiva
entre un polipéptido de PS de la presente invención y la C4BP.
Por tanto, en una forma de realización de la
presente invención se contempla un procedimiento para determinar la
cantidad de C4BP en una muestra de fluido, preferentemente una
muestra de fluido vascular tal como plasma, que comprende las etapas
de:
(a) formar una mezcla de reacción de unión
mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular con un
polipéptido de proteína S de esta invención, en la que dicho
polipéptido esta operativamente unido a una matriz sólida de forma
que la mezcla de reacción de unión posee tanto una fase líquida como
una fase sólida;
(b) mantener dicha mezcla de reacción de unión
durante un periodo de tiempo suficiente para que cualquier proteína
de unión C4 competente presente en la muestra de fluido vascular se
una al polipéptido y forme un producto de reacción que contiene
proteína de unión C4b en la fase sólida; y
(c) determinar la cantidad de un proteína de
unión C4b presente en el producto de reacción de la fase sólida. En
los ejemplos se describen las condiciones típicas de la reacción de
unión adecuadas para usar.
En formas de realización preferidas, la etapa
determinante para detectar C4BP en la fase sólida que comprende las
etapas de:
(i) mezclar el producto de reacción formado en
la etapa (b) con un anticuerpo anti-proteína de
unión C4b que contiene moléculas de anticuerpo que
inmunorreaccionan con la proteína de unión C4b para formar una
mezcla de inmunorreacción;
(ii) mantener dicha mezcla de inmunorreacción
durante un periodo de tiempo suficiente para que el anticuerpo
inmunorreaccione con cualquier proteína de unión C4b presente en la
fase sólida y forme un producto de inmunorreacción de fase sólida;
y
(iii) Determinar la cantidad de anticuerpo
presente en el producto de inmunorreacción de la fase sólida formado
en la etapa (ii) y, de este modo, la cantidad de proteína de unión
C4b competente en la muestra de fluido vascular. Las etapas de
mezcla, mantenimiento y determinación se pueden llevar a cabo
esencialmente como se ha descrito en otra parte de la presente
memoria descriptiva.
Un anticuerpo anti-proteína de
unión C4BP adecuado para usar en la etapa (i) puede ser cualquier
anticuerpo que inmunorreaccione con C4BP cuando forma complejo con
PS. Un anticuerpo anti-C4BP preferido es un
antisuero policlonal preparado mediante inmunización de conejos con
una preparación de C4BP purificada. Particularmente preferidos son
los anticuerpos que contienen moléculas de anticuerpo que
inmunorreaccionan con la subunidad alfa de C4BP, que se pueden
preparar mediante inmunización con la subunidad alfa purificada como
es bien conocido, o se pueden obtener de una variedad de fuentes
comerciales. Entre los procedimientos para seleccionar una molécula
de anticuerpo anti-C4BP que se une a C4BP cuando
está presente en un complejo PS:C4BP se incluyen los ensayos de
unión descritos en la presente memoria descriptiva siguiendo la
preparación de rutina de un anticuerpo monoclonal usando C4BP como
inmunógeno.
En formas de realización preferidas, el
anticuerpo en la fase sólida se detecta mediante la presencia de un
medio indicador en el producto de inmunorreacción, de forma que el
anticuerpo es un anticuerpo marcado.
En otra forma de realización, la presente
invención contempla un procedimiento para determinar la cantidad de
C4BP en una muestra de fluidos, preferentemente una muestra de
fluido vascular tal como plasma, que comprende las etapas de:
(a) formar una mezcla de reacción de unión
mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular con:
- (i)
- un polipéptido de proteína S de la presente invención, y
- (ii)
- un anticuerpo anti-proteína de unión C4b que contiene moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan con la proteína de unión C4b, donde dicho polipéptido esta operativamente unido a una matriz sólida de forma que la mezcla de inmunorreacción posee tanto una fase líquida como una fase sólida.
(b) mantener dicha mezcla de inmunorreacción
durante un periodo de tiempo suficiente para que cualquier proteína
de unión C4b competente presente en la muestra de fluido vascular se
una al anticuerpo y forme un producto de inmunorreacción en la fase
sólida, y para que el polipéptido se una a dicho producto de
inmunorreacción; y
(c) determinar la cantidad de polipéptido
presente en el producto de reacción de la fase sólida y, por tanto,
la cantidad de proteína de unión C4b competente.
Preferentemente, el anticuerpo contiene
moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan con la subunidad alfa
de la proteína de unión C4b como se ha descrito anteriormente.
Un medio preferido para determinar la cantidad
de producto de reacción de la fase sólida es mediante el uso de un
polipéptido de PS marcado, seguido por el medio de detección
descrito en la presente memoria descriptiva para otros productos
marcados en la fase sólida. Particularmente preferido es el uso de
polipéptidos de PS biotinilados.
Ejemplos de procedimientos de ensayo adaptables
a los presentes procedimientos para detectar C4BP competente se
describen al menos en los Ejemplos de la presente memoria
descriptiva.
También se contemplan ensayos inmunológicos
capaces de detectar la presencia de formación de producto de
inmunorreacción sin el uso de un marcaje. Tales procedimientos
emplean un "medio de detección", en el que dichos medios son
ellos mismos bien conocidos en la química de diagnóstico clínico y
constituyen una parte de esta invención únicamente en el grado en
el que se utilizan con polipéptidos, procedimientos y sistemas por
lo demás nuevos. Ejemplos de medios de detección incluyen
procedimientos conocidos como biosensores e incluyen procedimientos
de biosensibilidad basados en los cambios en la reflectividad de una
superficie, los cambios en la absorción de una onda evanescente
mediante fibras ópticas o los cambios en la propagación de ondas
acústicas superficiales.
La presente invención contempla composiciones
terapéuticas útiles para practicar los procedimientos terapéuticos
descritos en la presente memoria descriptiva. Las composiciones
terapéuticas de la presente invención contienen un transportador
fisiológicamente tolerable junto con un reactivo terapéutico de esta
invención, a saber un polipéptido de PS, un anticuerpo
anti-PS o anticuerpo monoclonal como se ha descrito
en la presente memoria descriptiva, disuelto o dispersado en ella
en forma de un ingrediente activo. En una forma de realización
preferida, la composición terapéutica no es inmunogénica cuando se
administra a un mamífero o paciente humano con fines
terapéuticos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente
tolerable" y variaciones gramaticales de las mismas, cuando se
refieren a composiciones, transportadores, diluyentes y reactivos,
se unan de forma intercambiable y representan que los materiales se
pueden administrar a un mamífero sin que se produzcan efectos
fisiológicos deseables, tales como náuseas, mareos, molestias
gástricas y similares.
La preparación de una composición farmacológica
que contiene ingredientes activos disueltos o dispersos en la misma
se comprende bien en la técnica. Típicamente, tales composiciones se
preparan como inyectables bien en forma de soluciones líquidas o
suspensiones, sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas
adecuadas para solución, o suspensiones, en líquido antes de usar.
La preparación también puede estar emulsionada.
El ingrediente activo se puede mezclar con
excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con
el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para usar en los
procedimientos terapéuticos descritos en la presente memoria
descriptiva. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución
salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de
los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener
pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes
humectantes o emulsionantes, agentes de tampón de pH y similares
que potencia la eficacia del ingrediente activo.
La composición terapéutica de la presente
invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los
componentes de la misma. Entre las sales farmacéuticamente
aceptables se incluyen las sales de adición de ácido (formadas con
los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos
inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o
fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico,
mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo
libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como,
por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico,
y de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina,
2-etilamino etanol, histidina, procaína y
similares.
Los transportadores fisiológicamente tolerables
son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de transportadores
líquidos son soluciones acuosas estériles que no contienen
materiales además de los ingredientes activos y agua, o contienen
un tampón tal como fosfato sódico a un valor de pH fisiológico,
solución salina fisiológica o ambos, tales como solución salina
tamponada con fosfato. Todavía más, los transportadores acuosos
pueden contener más de una sal tampón, así como sales como cloruros
de sodio y de potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros
solutos.
Las composiciones líquidas también pueden
contener fases líquidas además de y con la exclusión de agua.
Ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites
vegetales tales como aceite de semilla de algodón y emulsiones de
agua-aceite.
Una composición terapéutica contiene una
cantidad de un polipéptido de PS o molécula de anticuerpo
anti-PSF de la presente invención suficiente para
inhibir la unión de la proteína S a C4BP. Típicamente, esta es una
cantidad de al menos 0,1 por ciento en peso, y más preferentemente
es de al menos 1 por ciento en peso, de péptido o anticuerpo por
peso de la composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es
una proporción por peso entre el péptido o el anticuerpo y la
composición total. Por tanto, por ejemplo, 0,1 por ciento en peso
es 0,1 gramos de polipéptido de PS por 100 gramos de composición
total.
Se ha descubierto que los polipéptidos de PS,
anticuerpos y anticuerpos monoclonales de la presente invención (es
decir, inhibidores de la formación del complejo PS:C4BP) poseen la
capacidad para inhibir la unión de PS a C4BP. En vista del papel
fisiológico de la C4BP en la formación de complejo con PS y, por
tanto, en la inactivación de sus efectos anticoagulantes, los
presentes inhibidores de la formación del complejo PS:C4BP son
útiles para inhibir la unión de la proteína S a C4BP in
vivo.
Por tanto, en una forma de realización, la
presente invención proporciona el uso de un polipéptido de un
anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento de la trombosis.
El polipéptido o anticuerpo estará presente en
el medicamento en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
polipéptido de PS es una cantidad predeterminada calculada para
conseguir el efecto deseado, es decir para inhibir la unión de la
proteína S a C4BP in vivo en un paciente y, de este modo,
incrementar la concentración vascular eficaz de PS_{F} en el
paciente.
La inhibición in vivo de la unión de PS a
C4BP usando un medicamento de esta invención es una forma de
realización particularmente preferida y es deseable en una variedad
de contextos clínicos, tales como cuando el paciente exhibe
síntomas de coagulación o se encuentra en riesgo de trombosis.
Típicamente, estará indicado un tratamiento para inhibir la unión
de la proteína S a C4BP usando polipéptidos de PS cuando un paciente
exhiba niveles de C4BP elevados en plasma, coagulación
intravascular diseminada (CID), shock séptico, trombosis venosa o
arterial y las afecciones similares que requieren intervención con
anticoagulantes.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
polipéptido de PS de esta invención es, normalmente, una cantidad
del polipéptido de PS tal que cuando se administre en una
composición fisiológicamente tolerable es suficiente para obtener
una concentración en plasma de aproximadamente 0,1 micromolar
(\muM) a aproximadamente 100 \muM, y preferentemente de
aproximadamente 0,5 \muM a aproximadamente 10 \muM.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
anticuerpo de esta invención es, normalmente, una cantidad de
anticuerpo tal que cuando se administre en una composición
fisiológicamente tolerable es suficiente para obtener una
concentración en plasma de aproximadamente 0,1 microgramos (\mug)
por mililitro (ml) a aproximadamente 100 \mug/ml, preferentemente
de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 5 \mug/ml, y
normalmente de aproximadamente 5 \mug/ml.
El nivel de inhibición de la unión de la
proteína S a la C4BP presente en un paciente indicativo de la
eficacia del presente tratamiento se puede determinar fácilmente
mediante análisis clínicos de rutina que detecten los niveles en
plasma de la proteína S libre. Ejemplos de ensayos para controlar el
nivel de PS_{F} se describen en la presente memora descriptiva.
Como alternativa, la eficacia del tratamiento se puede determinar
mediante la observación de los efectos de anticoagulación del
tratamiento.
Convencionalmente, las composiciones
terapéuticas que contienen polipéptido de PS o anticuerpos de esta
invención se administran por vía intravenosa, como, por ejemplo,
mediante inyección de una monodosis. El término "monodosis",
cuando se usa en referencia a una composición terapéutica de la
presente invención se refiere a unidades físicamente pequeñas
adecuadas como dosis unitarias para el sujeto, donde cada unidad
contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada
para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el
diluyente requerido; es decir, un transportador o vehículo.
Las composiciones se administran de un modo
compatible con la formulación de la dosis y en una cantidad
terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar depende del
sujeto que se va a tratar, la capacidad del sistema del sujeto para
utilizar el ingrediente activo y el grado de efecto terapéutico
deseado, Las cantidades precisas de ingrediente activo que se
requiere administrar dependen del juicio del facultativo y son
concretas para cada individuo. No obstante, en la presente memoria
descriptiva se describen intervalos de dosificación adecuados para
la aplicación sistémica y dependen de la vía de administración, Los
regímenes adecuados para su administración inicial y los refuerzos
también son variables, pero se tipifican mediante una administración
inicial seguida por dosis repetidas a intervalos de una o más horas
mediante una inyección posterior u otra administración. Como
alternativa, se contempla la infusión intravenosa continua
suficiente para mantener las concentraciones en sangre dentro de
los límites especificados para los tratamientos in vivo.
Como ayuda en la administración de cantidades
terapéuticas eficaces de un polipéptido de PS, anticuerpo o
anticuerpo monoclonal, un procedimiento de diagnóstico de esta
invención para detectar un polipéptido de PS, anticuerpo o
anticuerpo monoclonal, respectivamente, en la sangre del sujeto es
útil para caracterizar el destino de la composición terapéutica
administrada.
La especificidad de un anticuerpo
anti-PS_{F} de la presente invención para
inmunorreacción con PS libre y no con el complejo PS:C4BP
proporciona un reactivo útil para purificar la PS libre de una
solución acuosa, tal como un fluido biológico complejo, incluyendo
sangre, plasma, fluidos derivados de plasma y fuentes similares de
PS libre. Entre las fuentes adicionales de PS libre de las cuales
purificar la PS libre mediante los procedimientos presentes se
incluyen tejidos homogeneizados, cultivos celulares y sistemas de
expresión para producir PS usando procedimientos de ADN
recombinante para expresar genes clonados que codifican PS.
Se puede preparar PSF extremadamente pura
usando los procedimientos de la presente memoria descriptiva, y tal
preparación es útil para su administración terapéutica de PS
"anticoagulante activa", es decir PSF, en los casos de
deficiencia de proteína S y como anticoagulante y antitrombótico. En
la medida en la que los reactivos descritos en la presente memoria
descriptiva no se unen a PS:C4BP, los presentes procedimientos
permiten la preparación de PSF que no está contaminada con
C4BP de ninguna manera, que podría contrarrestar los efectos
anticoagulantes beneficiosos de la PS_{F} a través de su unión e
inactivación de la PS_{F}.
Por tanto, la presente invención también
contempla un procedimiento para purificar la proteína S libre
(PS_{F}) a partir de una solución acuosa, que comprende las
etapas de:
(a) mezclar una solución acuosa que contiene
PS_{F} con un anticuerpo de la presente invención que contiene
moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan con la PS_{F} parta
formar una mezcla de inmunorreacción;
(b) mantener la mezcla de inmunorreacción en las
condiciones de inmunorreacción durante un periodo de tiempo
suficiente para que la PS_{F} en solución inmunorreaccione con el
anticuerpo y forme un producto de inmunorreacción; y
(c) aislar el producto de inmunorreacción del
resto de la mezcla de inmunorreacción, de modo que se recupera la
PSF que ha inmunorreaccionado de los contaminantes presentes en la
solución acuosa inicial y se forma así PS_{F} purificada.
En formas de realización preferidas, las
moléculas de anticuerpo mezcladas en la etapa (a) son moléculas de
anticuerpo inmovilizadas, es decir están operativamente unidas a un
soporte sólido como se describe más adelante en la presente memoria
descriptiva. Cuando se usa un anticuerpo inmovilizado, la mezcla de
inmunorreacción posee una fase sólida y una fase líquida, y el
producto de inmunorreacción resultante se forma en la fase sólida.
Esto proporciona una ventaja particularmente preferida en la
purificación, porque el soporte sólido puede lavarse o enjuagarse
de forma conveniente con tampones formulados para eluir/eliminar
específicamente macromoléculas en la matriz del soporte sólido y
alrededor del soporte que no han inmunorreaccionado específicamente
con (unido a) las moléculas de anticuerpo inmovilizadas. Tras el
lavado para eluir las macromoléculas inmunorreaccionadas
inespecíficamente, las moléculas de anticuerpo inmovilizadas se
ponen en contacto con un tampón formulado para eliminar (eluir) de
forma específica la PS_{F} que ha inmunorreaccionado, cuyas
moléculas de PS libre eluidas se recogen (recuperan) en una forma
sustancialmente purificada.
En una forma de realización, el tampón de
elución puede contener un polipéptido en la fase líquida que
inmunorreacciona con el anticuerpo en la fase sólida y actúa como
competidor para la inmunorreacción con la PS_{F}. En otra forma
de realización, el tampón de liberación puede contener sales
incompatibles con la formación de un complejo de inmunorreacción
PS_{F}-anticuerpo. Las condiciones de la reacción
compatibles con la formación del producto de inmunorreacción, con
tampón de lavado o con el tampón de elución, pueden ser
desarrolladas con facilidad por un experto en la técnica usando los
ensayos y reactivos descritos en la presente memoria
descriptiva.
Expresado de forma diferente, el presente
procedimiento para producir PSF purificada implica dos etapas.
La primera etapa implica inmunoadsorción
(adsorción) de PS_{F} de una solución acuosa. El adsorbente
comprende una composición de anticuerpos inmovilizados, es decir un
anticuerpo de esta invención unido a un sustrato adecuado tal como
esferas de azarosa o un soporte sólido similar. Después de que la
PS_{F} se adsorbe hacia los anticuerpos inmovilizados mediante
inmunorreacción específica, el material adsorbido se lava
extensamente con un tampón para eliminar los materiales que no han
inmunorreaccionado, macromoléculas, proteínas y similares.
La segunda etapa implica una etapa de
tratamiento (elución) para eliminar (eluir) de forma específica el
material que ha inmunorreaccionado (adsorbido) con un tampón
formulado para perturbar el producto de inmunorreacción en la fase
sólida y efectuar la liberación del antígeno que ha
inmunorreaccionado a la fase líquida del tampón de elución. Los
tampones útiles para eluir las proteínas que han inmunorreaccionado
específicamente desde las columnas de anticuerpos inmovilizados
son, en general, bien conocidos. Ejemplos de tampones se describen
en el Ejemplo 6.
Los procedimientos para preparar una composición
de moléculas de anticuerpo inmovilizado para proteínas específicas
de inmunorreacción y para su elución de los mismos, para producir
proteínas purificadas son, en general, bien conocidos en la técnica
y también se describen más adelante en la presente memora
descriptiva. Por ejemplo, véanse las enseñanzas de Zimmerman y
col., en la patente de EE.UU. Nº 4.361-509, que
describe la purificación por inmunoafinidad del Factor VIII de
fuentes de plasma usando una molécula de anticuerpo monoclonal
inmovilizado. Ejemplos de moléculas de anticuerpo monoclonal
inmovilizado, su uso y su preparación se describen en el Ejemplo
6.
En una forma de realización relacionada, la
presente invención también contempla una composición para purificar
PS_{F} de soluciones acuosas de acuerdo con los procedimientos
descritos en la presente memoria descriptiva. La composición
comprende moléculas de anticuerpo de la presente invención
inmunoespecíficas para PS_{F} en forma de moléculas de anticuerpo
inmovilizado es decir operativamente unido a un soporte sólido.
Ejemplos de las composiciones se describen en el Ejemplo 6,
utilizando esferas de agarosa a las que se ha fijado (operativamente
unido) anticuerpos policlonales o monoclonales de la presente
invención. Entre los ejemplos se incluyen moléculas de anticuerpo
que inmunorreaccionan con los polipéptidos preferidos,
PSP-12 y PSP-loop, por ejemplo el
anticuerpo monoclonal AcMo 56.
La siguiente descripción proporciona detalles
sobre la manera en la que se pueden hacer y usar las formas de
realización concretas de la presente invención. Esta descripción,
aunque es un ejemplo de la presente invención, no debe
interpretarse como que limita específicamente la invención. Dentro
de esta descripción deben considerarse variaciones y equivalentes,
conocidas en la actualidad o que se desarrollen más adelante, que
entrarían en la comprensión y la competencia técnica de un experto
en esta técnica.
Los péptidos de la proteína S sintéticos
superpuestos enumerados en la Tabla 1 anteriormente se produjeron
mediante el procedimiento de síntesis simultánea de múltiples
péptidos usando la técnica de la fase sólida descrita por Houghten,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 5131-5135
(1985). En lo sucesivo, los péptidos se denominarán por sus
designaciones polipeptídicas como se indica en la Tabla 1. La
secuencia de residuos de aminoácidos y las correspondientes SEC ID
Nº para cada péptido también se enumeran en la Tabla 1. Todos los
péptidos se sintetizaron en forma de amida del extremo carboxi. Los
péptidos sintetizados se analizaron después mediante cromatografía
de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (HPLC) en una
columna Vydac C-18 (Alltech Associates, Inc., IL)
con un gradiente lineal de acetonitrilo de 0-60% en
0,1% de ácido trifluoroacético. A continuación, los péptidos se
purificaron hasta homogeneidad mediante HPLC preparativa usando las
condiciones óptimas sugeridas por la cromatografía analítica. Con
el fin de prevenir la formación de disulfuro entre péptidos, en
algunos péptidos la cisteína original se sustituyó por un residuo
de aminoácido de serina o glicina, como se indica en la Tabla 1.
Las composiciones de aminoácidos y las concentraciones de los
péptidos aislados se determinaron mediante hidrólisis de 24 horas
en HCl 6N en tubos evacuados a 110 grados centígrados (110ºC) y el
posterior análisis en un analizador Beckman modelo 6300 de alto
rendimiento. Los péptidos, PSP-loop,
PSP-424K y PSP-428K, no se
sometieron a purificación por HPLC y, por tanto, sólo tenían una
pureza del 30%.
Para verificar el correcto peso molecular, los
análisis con espectroscopia de masas de los péptidos
PSP-12 (1:420-434) y
PSP-605 (1:605-614) usando los
espectros de masa iónica positiva FIB obtenidos en un espectrómetro
de masas de doble foco VG-ZAB-VSE
equipado con un disparador de iones de celsio dieron un único pico y
el peso molecular exacto previsto de 1755 para la forma sencilla
protonada de PSP-12 y 1072 para la forma sencilla
protonada de PSP-605.
Los péptidos purificados se resuspendieron por
separado en agua destilada para formar una solución de péptidos
disueltos a una concentración final de 2,5 mM. Posteriormente, un
volumen de un décimo de tampón concentrado diez veces se denominó
TBS-Az que contiene Tris 0,05 M hidroximetil
aminometano-clorhidrato (Tris-HCl) a
ph 7,4, cloruro sódico 0,1M (NaCl), 0,02% de azida sódica
(NaN_{3}). Se comprobó el pH de la solución y, si era necesario,
se ajusto a pH 7,4 con cantidades tituladas de
Tris-base 1M. Para los péptidos que parecían no ser
completamente solubles a 2,5 mM en TBS-Az, las
suspensiones peptídicas parcialmente disueltas por separado se
centrifugaron a 13.000 x g para precipitar el material insoluble.
Las concentraciones molares en los sobrenadantes individuales
resultantes se estimaron a partir de la absorbancia a 280 nm y 257
nm respectivamente, para soluciones peptídicas que contienen
aminoácidos aromáticos usando un coeficiente de extinción molar de
5,600 M^{-1} cm^{-1} para triptófano y 1,400 M^{-1} cm^{-1}
para tirosina a 280 nm, usando un coeficiente de extinción molar de
200 M^{-1} cm^{-1} para fenilalanina a 257 nm.
Para la preparación de un inmunógeno peptídico,
se preparó el polipéptido sintético PSP-12 como se
describe en el Ejemplo 1. El péptido PSP-12
sintetizado se acopló a hemocianina de lamprea americana (KLH)
(Sigma, St. Louis, MO) usando el agente de reticulación
heterobifuncional, propionato de
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)
(SPDP) (Pierce Biochemicals, Rockford, IL). Para el procedimiento
de acoplamiento, 80 microlitros (\mul) de 10 miligramos/mililitro
(mg/ml) de SPDP disueltos en dimetilformamida se mezclaron gota a
gota a 400 \mul de KLH 15 mg/ml en fosfato 0,1M, NaCl 0,1M a pH
8,5 en condiciones de agitación continua durante 30 minutos a 22ºC
con el fin de formar SPDP-KLH activada. El
SPDP-KLH activada resultante se dializó extensamente
a 4ºC frente a una solución tamponada de fosfato 0,1M y NaCl 0,1M a
pH 7,4 con el fin de eliminar el SPDP no acoplado. Primero se
disolvieron seis mg del péptido PSP-12 preparado con
una cisteína en el extremo C en 2 ml de fosfato 0,1M y NaCl 0,1M a
pH 7,4 y después se mezcló con SPDP-KLH activada
preparado anteriormente en condiciones de agitación continua. El
grado de acoplamiento del PSP-12 con KLH se
monitorizó mediante la dilución de una alícuota de la mezcla 1:100
a tiempo cero, y cada hora después, y medir la liberación de
piridina-2-tiona a 343 nm en un
espectrofotómetro. Se determinó que el punto final del acoplamiento
era un incremento de 0,2 en la absorbancia, o tras la visualización
del precipitado en cuyo punto se formaron los conjugados peptídicos
con KLH, y se designó inmunógeno
PSP-12-KLH.
Para formar anticuerpos
anti-péptido, el inmunógeno
PSP-12-KLH preparado en el Ejemplo
2ª se emulsionó usando adyuvante completo de Freund (DIFCO
Laboratorios, Detroit, MI), para la primera inyección y adyuvante
incompleto de Freund (DIFCO) para todas las inyecciones posteriores
de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el inmunógeno
PSP-12-KLH se incorporó a la
emulsión a una concentración de mg/ml. Medio ml de una emulsión
preparada se inyectó por vía subcutánea en cada uno de los dos
conejos blancos New Zealand después de la obtención de muestra se
suero preinmunitarias. Se inyectó a los conejos tres veces a
intervalos semanales siguiendo el protocolo de la inyección como se
detalla. Dos semanas después de la última inyección, se obtuvieron
muestras de sangre para comprobar el título de anticuerpos frente
al péptido específico PSP-12 usado como inmunógeno
mediante el ensayo ELISA descrito más adelante en el Ejemplo 2C. Las
muestras de sangre obtenidas se almacenaron a 4ºC durante 12 horas,
tras las cuales las muestras se centrifugaron a 3000 x g durante 20
minutos. El sobrenadante resultante que contiene los anticuerpos
anti-péptidos se recogió, se designaron anticuerpos
policlonales anti-péptidos (antiPS) y se almacenó a
-20ºC.
Los péptidos: PSP-54,
PSP-561, PSP-418*,
PSP-13* y PSP-14* también se
prepararon por separado como inmunógenos mediante conjugación con
KLH como se describe en el Ejemplo 2A. La inmunización de conejos
distintos para la producción de antisuero frente a cada uno de los
péptidos enumerados anteriormente se realizó como se describe en la
presente memoria descriptiva. A continuación, los antisueros
resultantes se sometieron a detección selectiva con ELISA como se
ha descrito para los antisueros
anti-PSP-12 (también denominado
anti-PS (420-434)) en el Ejemplo
2C.
Los títulos de anticuerpos peptídicos y la
inmunoespecificada en sueros obtenidos de conejos en el Ejemplo 2B
se determinaron en un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas
(ELISA) como se describe más adelante. Los antígenos usados en el
ELISA incluyeron los péptidos inmunizantes PSP-12 y
la proteína S humana purificada (PS). La proteína S humana
purificada se preparó como se describe en Schwarz y col.,
Blood, 64: 1297-1300 (1984).
Para determinar la inmunoespecificidad de los
antisueros de conejo obtenidos en el Ejemplo 2B se realizaron
ensayos ELISA. Brevemente, 50 \mul de concentraciones 50 \muM de
péptidos PSP-12, PSP-loop,
PSP-424K y PSP-428K preparados en
el Ejemplo 1 y enumerados en la Tabla 1 o 10 \mug/ml de PS
preparada en el ejemplo 2C en un tampón compuesto por carbonato
sódico 0,05M (Na_{2}CO_{3}) y 0,02% de NaN_{3} a pH 9,0 se
mezclaron por separado en los pocillos de las placas de
microtitulación. Las placas se mantuvieron a 37ºC durante una hora
para permitir que los antígenos se fijen operativamente a las
paredes de los pocillos. Después de lavar con TBS las placas
revestidas con el antígeno, los pocillos se bloquearon con 250
\mul/pocillo de 10% de seroalbúmina bovina (BSA) (Sigma) en TBS
durante una hora a 22ºC. La solución de bloqueo se eliminó después
y, posteriormente, los pocillos se lavaron cinco veces con 250
\mul/pocillo de tampón de mantenimiento (Tris-HCl
0,05 M, NaCl 0,1M, NaN_{3} 0,02%, 1 mg/ml de BSA, CaCl_{2} 5 mM,
0,01% de Tween 20 a pH 7,4).
\newpage
A continuación en los pocillos lavados se
mezclaron cincuenta \mul de antisuero de conejo no inmune o
específico diluido en serie en tampón de mantenimiento para formar
una mezcla de inmunorreacción, que se mantuvo durante una hora a
37ºC para permitir la formación de productos de inmunorreacción de
fase sólida-líquida. Después, los pocillos se
lavaron tres veces con tampón de mantenimiento, seguido por la
mezcla en cada pocillo de 50 \mul de 1,\mug/ml de anticuerpo
secundario (igG policlonal biotinilada de cabra
anti-conejo) (Pierce Biochemicals) diluido en
tampón de mantenimiento para la detección de productos de
inmunorreacción. Las placas se mantuvieron durante 1 hora a 37ºC,
tiempo tras el cual se eliminó la solución de anticuerpo
secundario.
Después de lavar los pocillos como se ha
descrito anteriormente, a cada pocillo se mezclaron 50 \mul de
1,0 \mug/ml de estreptavidina-fosfatasa alcalina
(Pierce Biochemicals) en tampón de mantenimiento y se mantuvieron
durante 30 minutos a 37ºC. La detección de productos de
inmunorreacción específicos se realizó mediante la mezcla de 150
\mul/pocillo de 5 mg/ml de p-nitrofenilfosfato
(PNPP) (Pierce Biochemicals) en dietanolamina 0,1M y 0,02% de
NaN_{3} a pH 9,0, seguido por la medición del cambio en la
absorbancia a 405 nm con el tiempo usando el lector EL312
Microplate Bio-Kinetics y el programa de software
KinetiCalc (Biotek Instruments, Inc., VT). La unión no específica
se consideró como la absorbancia medida en pocillos bloqueados con
10% de BSA, que sirvieron como controles negativos sin el
revestimiento precedente de una proteína o péptido específico. En
las condiciones descritas, la unión no específica nunca superó más
del 5% de la unión específica. Los antisueros
anti-péptidos de conejo que exhibieron
inmunorreactividad que produjo un cambio en la densidad óptica a 405
nm superior a 20 delta por minuto usando el programa de cinética en
comparación con la inmunorreactividad del suero preinmunitario
hacia los péptidos PSP-12, PSP-loop,
PSP-424K y PSP-428K y que
inmunorreaccionó de forma similar con la PS, se seleccionaron para
usar como
anticuerpo anti-péptido y también se seleccionaron para su posterior purificación como se describe en el Ejemplo 3.
anticuerpo anti-péptido y también se seleccionaron para su posterior purificación como se describe en el Ejemplo 3.
Los antisueros de conejo obtenidos en el Ejemplo
2b contra los péptidos: PSP-54,
PSP-561, PSP-418*,
PSP-13* y PSP-14* se sometieron a
detección selectiva para determinar la inmunorreactividad a los
respectivos inmunógenos peptídicos y la PS como se ha descrito
anteriormente. Los antisueros de conejo que exhibieron una
inmunorreactividad significativa en comparación con los sueros
preinmunitarios hacia cada uno de los inmunógenos peptídicos y la
PS se purificaron después y analizaron como se describe en el
Ejemplo 3.
La purificación de la fracción IgG de antisuero
de conejo, que mostró una reactividad significativa frente al
péptido inmunizante PSP-12 y frente a los péptidos
PSP-loop, PSP-424K,
PSP-428K, así como PS purificada, se realizó
mediante precipitación en amonio-sulfato
(0-45%), seguida por purificación de IgG en una
columna de intercambio iónico Mono Q (Pharmacia LKB, Piscataway,
NJ) conectada a un sistema de cromatografía de líquidos rápida de
proteínas (FPLC) (Pharmacia). La purificación por inmunoafinidad de
la fracción de IgG inmunorreactiva concentrada se realizó pasando
aproximadamente 100 mg de la IgG en una columna de 5 ml que contiene
3 mg de proteína S preparada en el Ejemplo 2C acoplada a Sefarosa
4B (Pharmacia) como se describe en el Ejemplo 2A. Tras un
exhaustivo lavado de la columna con 5 volúmenes de la columna de
Tris-HCl 0,5M y NaCl 1M a pH 7.4 para eliminar los
anticuerpos no unidos, se eluyó la IgG unida con dos volúmenes de
columna de glicina-HCl 0,1M a pH 2,5. La proteína
eluida se monitorizó mediante absorbancia a 280 nm y se determinaron
las concentraciones de IgG a partir del coeficiente de extinción de
13,5. La IGG eluida se dializó inmediatamente contra
TBS-Az, se concentró frente a 50% de sacarosa
durante aproximadamente 3-4 horas y se dializó una
vez más extensamente contra TBS-Az hasta una
concentración final de 3-4 mg/ml. El análisis
mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecil sulfato sódico al
4-15% (SDS-PAGE) de las muestras
reducidas y no reducidas reveló una IgG de pureza superior al 95%.
Este anticuerpo anti-péptido purificado mediante
inmunoafinidad se denomina
anti-PS(420-434).
La afinidad del anticuerpo
antiPS(420-434) purificado mediante
inmunoafinidad frente a PS se determinó midiendo la unión directa
en ELISA de fase sólida de la PS biotinilada (b-PS)
al anticuerpo anti-PS (420-434)
inmovilizado. Para el ensayo ELISA, en los pocillos de una placa de
microtitulación se mezclaron 50 \mul de anticuerpo
anti-PS (420-434) diluido hasta una
concentración de 10 \mug/ml en Na_{2}CO_{3} 0,05 M y NaN_{3}
0,02% a pH 9,0 y se mantuvieron durante una hora a 37ºC para formar
pocillos recubiertos con anticuerpo. Tras la eliminación de la
solución de anticuerpo al final del periodo de mantenimiento, en
cada pocillo se mezclaron 250 \mul de BSA al 10% en
TBS-Az a pH 7,4 durante una hora a 22ºC para
bloquear los sitios no ocupados de los pocillos. Para los pocillos
usados como controles negativos, se omitió la etapa de recubrimiento
con anticuerpo antes de la etapa de bloqueo. A continuación, los
pocillos recubiertos con anticuerpo y bloqueados se lavaron tres
veces con tampón de mantenimiento preparado como se describe en el
Ejemplo 2C. En los pocillos lavados se mezclaron cincuenta \mul
de b-PS, preparados mediante la combinación de
biotina (Clontech, Palo Alto, CA) con PS purificada (Ejemplo 2C)
siguiendo las instrucciones del fabricante, diluidos en tampón de
mantenimiento hasta concentraciones variables de 0 a 10 \mug/ml,
para formar una mezcla de inmunorreacción que se mantuvo durante
una hora a 37ºC para formar un producto de inmunorreacción en la
fase sólida. Posteriormente los pocillos se lavaron cinco veces con
tampón de mantenimiento. La detección y medición de los productos de
inmunorreacción específicos se realizaron mediante la mezcla de
estreptavidina-fosfatasa alcalina seguida por PNPP,
como se ha descrito anteriormente para el ELISA en el Ejemplo
2C.
Los resultados del análisis ELISA indicaron que
los anticuerpos anti-PS (420-434) se
unían a la PS nativa con una constante de disociación (K_{d}) de
10 nanomoles (nM).
Un ensayo similar en el que anticuerpos
anti-PS(603-616) se adsorbió
a la fase sólida y se mezcló b-PS a concentraciones
variables de 0-40 \mug/ml de una clase única de
sitios de unión con una constante de disociación (K_{d}) de 31
nM.
Por tanto, los anticuerpos policlonales
producidos contra el péptido inhibidor más potente,
PSP-12 (1:420-434), como se
describe en el Ejemplo 5, purificados mediante inmunoafinidad en una
columna de PS-Sefarosa, inmunorreaccionaron con la
PS nativa. Por tanto, al menos partes de la región representadas por
este péptido en la PS se expusieron y quedaron disponibles para la
interacción con otras especies moleculares en la superficie
accesible por disolvente de la PS. Se ha mostrado que los
anticuerpos producidos contra pequeños péptidos sintéticos son
capaces de reconocer la proteína nativa.
El polipéptido designado PSP-12
(1:420-434) se preparó como inmunógeno de acuerdo
con el Ejemplo 2a. Ratones Balb/c ByJ (Scripps Clinic y Research
Foundation Vivarium, La Jolla, CA) fueron inmunizados por vía
intraperitoneal (ip) con 50 \mug de inmunógeno
PSP-12-KLH preparado en adyuvante
completo de Freund (CFA), seguido por una segunda y una tercera
inmunización usando el mismo inmunógeno
PSP-12-KLH, separadas entre sÍ por
aproximadamente tres semanas, en adyuvante incompleto de Freund
(IFA). Los ratones recibieron un refuerzo de 50 \mug del péptido
preparado por vía intravenosa (iv) en solución salina normal 4 días
antes de la fusión y una segunda perfusión similar de refuerzo un
día después.
Los animales tratados de este modo fueron
sacrificados y se extrajo el bazo de cada ratón. A continuación se
preparó una suspensión de células de bazo. Las células de bazo se
extrajeron después de la suspensión de células de bazo mediante
centrifugación durante aproximadamente 10 minutos a 1000 rpm, a
23ºC. Tras la eliminación del sobrenadante resultante, el
precipitado celular se resuspendió en 5 ml de tampón de lisis de
cloruro de amonio frío (NH_{4}Cl) y se mantuvo durante
aproximadamente 10 minutos.
Diez ml de Medio Eagle modificado de Dulbecco
(DMEM) (Gibco) y tampón HEPES [ácido
4-(2-hidroxietil)-1-piperidinaetanosulfónico]
se mezclaron con la suspensión de células lisadas para formar una
mezcla, y dicha mezcla se centrifugó durante aproximadamente 10
minutos a 1000 rpm a 23ºC.
Tras la decantación del sobrenadante resultante,
el precipitado se resuspendió en 15 ml de DMEM y HEPES y se
centrifugó durante aproximadamente 10 minutos a 1000 rpm a 23ºC. Se
repitió el procedimiento anterior.
A continuación, el precipitado se resuspendió en
5 ml de DMEM y HEPES. Después se extrajo una alícuota de la
suspensión de células de bazo para recuento. Las fusiones se
realizaron del siguiente modo usando la línea celular de mieloma no
secretor de ratón P3X63Ag 8.653.1, un subclon de la línea P3X63Ag
8.653 (ATCC 1580). Con una proporción entre las células de mieloma
y de bazo de aproximadamente 1 a 10 o de aproximadamente 1 a 5, se
centrifugó una cantidad suficiente de células de mieloma hasta
obtener un precipitado, se lavó dos veces en 15 ml de DMEM y HEPES
y después se centrifugó durante 10 minutos a 1000 rpm a 23ºC.
Las células de bazo y las células de mieloma se
combinaron en tubos de fondo redondo de 15 ml. LA mezcla celular se
centrifugó durante 10 minutos a 1000 rpm a 23ºC y el sobrenadante se
extrajo mediante aspiración. Después, 200 \mul de 50% (peso por
volumen) de polietilenglicol acuoso (PEG) de peso molecular 4000;
(ATCC Baltimore, MD) a aproximadamente 37ºC se mezclaron con el
precipitado usando una pipeta de 1 ml con agitación enérgica para
romper el precipitado. A continuación, las células se mezclaron
suavemente durante entre 15 y 30 segundos. La mezcla resultante se
centrifugó 4 minutos a 700 rpm.
Aproximadamente 8 minutos desde la adición de
PEG, 5 ml de DMEM más tampón HEPES se mezclaron lentamente hasta
obtener el precipitado, sin romper las células. Después de 1 minuto,
la mezcla resultante se rompió con una pipeta de 1 ml y se mantuvo
durante 4 minutos adicionales. Esta mezcla se centrifugó durante 7
minutos a 1000 rpm. El sobrenadante resultante se decantó,
lentamente se mezclaron con el precipitado 5 ml de medio HT
(hipoxantina/timidina) y la mezcla se mantuvo sin alterar durante 5
minutos. A continuación, el precipitado se rompió en trozos grandes
y la suspensión celular final se introdujo en matraces T75 (2,5 ml
por matraz) en los que se habían introducido previamente 7,5 ml de
medio HT. La suspensión celular resultante se mantuvo a 37ºC para
cultivar las células fusionadas. Tras 24 horas se añadieron a los
matraces 10 ml de medio HT, seguido 6 horas después mediante la
mezcla de 0,3 ml de aminopterina 0,04 mM. Cuarenta y ocho horas
después de la fusión a los matraces se añadieron 10 ml de medio HAT
(hipoxantina/aminopterina/timidina).
Tres días después de la fusión, se sembraron
células viables en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a
aproximadamente 2x 104 células viables por pocillo (768 pocillos en
total) en medio tampón HAT como describen Kennett y col., Curr.
Top. Microbiol. Immunol., 81: 77 (1978). Las células se
nutrieron siete días después de la fusión con medio HAT y a
intervalos de aproximadamente 4-5 días después,
según lo necesario, con medio HT. El crecimiento fue seguido
microscópicamente y los sobrenadantes del cultivo se recolectaron
aproximadamente dos semanas después. Los sobrenadantes del cultivo
procedentes de los cultivos resistentes a HAT se analizaron después
para determinar la presencia del anticuerpo específico
PSP-12 (1:420-434) mediante ELISA de
fase sólida como se describe en el Ejemplo 2C y se seleccionó como
hibridomas que producen un anticuerpo de esta invención. Los
cultivos de hibridoma productores de anticuerpos monoclonales
anti-PS (420-434) se identificaron
de este modo y un clon se designó LJS 56 (o AcMo 56).
El anticuerpo monoclonal 56 (AcMo 56) se sometió
a detección selectiva para la posterior inmunoespecificidad como en
el Ejemplo 2C, usando los péptidos PSP-12,
PSP-loop, PSP-424K y
PSP-428K en la fase sólida. Mediante dichos
procedimientos, se determinó que el AcMo 56 unido a todos los
péptidos saturados de un modo dependiente de la dosis. La unión del
AcMo 56 al péptido PSP-loop saturado a una
concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,6 \mug/ml. Esto
contrastaba con lo observado en los péptidos PSP-12,
PSP-424K y PSP-428K, donde 1,2
\mug/ml de AcMo 56 eran necesarios para saturar los sitios de
unión. El AcMo 56 no se unió a un péptido correspondiente al
PSP-12 sintetizado en el orden inverso. Además, el
AcMo 56 no se unió a los péptidos con una sustitución del
aminoácido ácido glutámico cargado negativamente por una lisina
normal cargada positivamente en cualquiera de las exposiciones de
los residuos de aminoácidos 423 y 432 de la secuencia de la proteína
S nativa. Por tanto, el AcMo 56 se unía a los péptidos de un modo
específico de residuo y de conformación. Además también se encontró
que el AcMo 56 inmunorreaccionaba con la proteína S de la fase
sólida en el ensayo descrito en el Ejemplo 2C.
La especificidad del AcMo 56 purificado hacia la
proteína S libre o la proteína S total se evaluó después como se
describe en el Ejemplo 6. De este modo, también se mostró que el
AcoMo 56, específico para el péptido PSP-12,
inmunorreaccionaba con la proteína S libre y no inmunorreaccionaba
con el complejo PS:C4BP.
En el Ejemplo 3 se describe un ensayo de unión
directa en el que el AcMo 56 recubre los pocillos de placas de
microtitulación y mezclado con la b-PS nativa se
confirmó que el AcMo 56 inmovilizado se une a la PS nativa.
Por tanto, dado que el AcMo 56 es específico del
péptido PSP-12 y sólo se une a la proteína S libre y
no en forma de complejo, para la presente invención se prefiere un
anticuerpo monoclonal. No obstante, se produjeron otros anticuerpos
monoclonales funcionalmente equivalentes al AcMo 56 usando el
conjugado PSP-12-KLH como
inmunógeno. Uno de tales AcMo es el LJS-418 (AcMo
418) y muestra una afinidad de unión por la proteína S similar a la
del AcMo 56. Usando otros polipéptidos de PS mencionados
anteriormente se puede producir de un modo similar otros anticuerpos
monoclonales.
Hibridomas secretores de anticuerpos
anti-PS (420-434) como se describe
en el Ejemplo 4a se inyectaron en ratones Balb/c de 10 semanas como
se describe más adelante para producir fluido ascítico.
Hasta ese punto, se sensibilizaron conjuntos
separados de ratones Balb/c de 10 semanas de edad con 0,3 ml de
aceite mineral y después se les inyectó por vía intraperitoneal
5x10^{6} células de hibridoma. El tiempo medio para el desarrollo
de ascitis fue 9 días. Tras la clarificación mediante centrifugación
a 15.000 x g durante 15 minutos a 23ºC, los fluidos ascíticos
producidos por los hibridomas se reunieron y almacenaron congelados
a -20ºC para formar composiciones de anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales producidos con la
ascitis se purificaron después mediante cromatografía de líquidos
rápida de proteínas (FPLC) usando una columna de intercambio
aniónico Pharmacia Mono Q HR5/5 (Pharmacia) usando un gradiente de
NaCl 0-0,5M en Tris-HCl 10 mM a pH
8,0 siguiendo las instrucciones suministradas con la columna. Los
AcMo tratados con FPLC se concentraron a continuación usando una
célula de ultrafiltración agitada Amicon (Amicon. Danvers, MA;
Membrana PM 30) hasta una concentración de 1 mg/ml, se dializaron en
TBS y se almacenaron a -70ºC para formar AcMo purificado.
La C4BP humana purificada se obtuvo de 5 litros
(l) de plasma citrado humano mediante precipitación con 80 mM de
cloruro de bario en presencia de inhibidores, clorhidrato de
benzamidina (10 mM), diisopropilfosforofluoridato (1 mM), fluoruro
de fenilmetanosulfonilo (1 mM) e inhibidor de soja tripsina (50
mg/l). Tras agitar la mezcla durante 1 hora, el precipitado de
citrato de bario se sedimentó mediante centrifugación a 5000 x g
durante 10 minutos a 4ºC. El precipitado se resuspendió en 700 ml
de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 0,2M a pH 7,4 y se dializó
extensamente contra TBS-Az con clorhidrato de
benzamidina 10 mM y se pasó a través de una columna (1,5 x 40 cm)
que contenía 3 mg de IgG/ml gel de anticuerpos policlonales de
conejo anti-C4BP inmunopurificados (CalBiochem, San
Diego, CA) acoplado a Sefarosa 4B activada con CNBr, con un caudal
de 35 ml/. Las esferas se lavaron con 100 ml de TBS con NaCl 1M,
seguido por 100 ml de EDTA 20 mM en TBS. El antígeno de C4BP se
eluyó con 100 ml de clorhidrato de guanidina 3M en TBS y se
recogieron fracciones de 2 ml. Las fracciones se analizaron para
determinar la presencia de C4BP mediante SDS-PAGE
como se describe más adelante, se acumularon (52 ml) y la proteína
se concentró usando ultrafiltros PM 30 Diaflo (Amicon). La reserva
concentrada (5 ml) se pasó por una columna de Sefarosa
CL-6B (3 x 100 cm) a un caudal de 10 ml/h, para la
separación de antígeno de PS de la C4BP en un tampón de carrera de
Tris-HCl 0,05M, guanidina 3M a pH 6,0. El pico de la
proteína C4BP (15 ml) se dializó frente a TBS y la concertación de
la proteína se determinó midiendo la densidad óptica a 280 nm como
se describe en el Ejemplo 1. Se juzgó que la C4BP tenía una pureza
> 95% sin que se detectara presencia de proteína S cuando se
analizó mediante SDS-PAGE. El material purificado
representa aproximadamente un 10% de la cantidad total de C4BP en
el material de partida.
Cada uno de los péptidos producidos como se
describe en el Ejemplo 1 y enumerados en la Tabla 1 se analizó para
determinar si capacidad para inhibir la unión de la proteína S
nativa en fase líquida a la C4BP en la fase sólida.
Pocillos de microtitulación de una placa de 96
pocillos se recubrieron con 50 \mul de C4BP purificada a 10
\mug/ml en tampón carbonato (Na_{2}CO_{3} 0,02M, a pH 9,0,
Na-Azida al 0,02%). Tras el bloqueo con 10% de BSA
en TBS, 50 \mul de diferentes concentraciones de péptidos diluidos
en tampón de lavado (TBS, 0,2% de BSA, CaCl 5 mM, 0,02% de Tween
20) se introdujeron por separado en los pocillos recubiertos con
C4BP. Tras 2 horas a temperatura ambiente, 50 \mul de una
solución de proteína S biotinilada se introdujeron en cada pocillo
para formar una segunda mezcla de unión con una concentración final
de 2 \mug/ml. La placa se agitó y las muestras se incubaron 1
hora a temperatura ambiente. Las muestras se desecharon y los
pocillos se lavaron 3 veces con tampón de lavado. A cada pocillo se
añadieron 50 \mul de estreptavidina-fosfatasa
alcalina (1 \mug/ml de tampón de lavado) y se dejaron incubar
durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la
estreptavidina-fosfatasa alcalina se eliminó y los
pocillos se lavaron 6 veces con tampón de lavado. Las densidades
ópticas resultantes de las soluciones de reacción se leyeron como se
ha descrito antes en el Ejemplo 2C.
Los resultados del ensayo se comunican en forma
de un porcentaje de inhibición de la unión de C4BP. El porcentaje
de inhibición de la unión de C4BP se define como:
I = 100%-100x
(delta_{T}/delta_{C})
donde I se expresa en forma de
porcentaje;
y
donde 100%= delta/min de la cantidad de
b-PS que se une específicamente a los pocillos
recubiertos con C4BP en ausencia de un péptido de PS competidor;
y
donde delta_{T}= el cambio en la absorbancia
(405 nm) en presencia de péptido de PS competidor; y
donde delta_{C}= el cambio en la absorbancia
(405 nm) en ausencia de péptido de PS competidor.
Los resultados de los ensayos de competencia se
muestran en la Tabla 2 y en las figuras 1, 2, 3 y 4. Las
designaciones de los péptidos correspondientes a la SEC ID Nº se
muestran en la Tabla 1. Los resultados de la Tabla 2 indican que el
péptido PSP-12 era el inhibidor más fuerte, que
inhibe la formación del complejo PS:C4BP en un 80% a una
concentración del péptido de 800 \muM. Cada uno de los péptidos
PSP-415*, PSP-417
(1:413-422), PSP-417P
(1:413-424) y
PSP-428*(2:4-15) inhibió la
formación del complejo PS:C4BP en aproximadamente un 60% a una
concentración del péptido de 800 \muM. El péptido
PSP-424 (1:421-427) inhibió la
formación del complejo PS:C4BP en un 40% a una concentración de 800
\muM.
Los péptidos PSP-347
(1:347-361), PSP-32
(1:32-46), PSP-7
(1:187-200), PSP-417A
(1:417-424), PSP-12
(1:420-434) y PSP-418*
(4:1-15) exhibieron una fuerte inhibición de la
formación del complejo PS:C4BP en relación con los péptidos de PS
de otras regiones de la proteína S. También se analizaron péptidos
de PS adicionales y se mostró que inhibían la unión de PS a C4BP.
En los siguientes experimentos, se mostró que el péptido
PSP-loop (11:1-26) inhibía
completamente la unión de PS a C4BP a una concentración del péptido
de aproximadamente 250 \muM, mientras que el péptido
PSP-12 no produjo una inhibición completa a la misma
concentración, Los péptidos PSP-424K y
PSP-428K exhibieron perfiles de inhibición similares
al del PSP-12.
Estos datos indican que los péptidos descritos
anteriormente poseen la capacidad de inhibir la unión de PS a C4BP
en el lugar o cerca del lugar de la región de unión para PS:C4BP.
Según estos resultados, se identificaron diversas regiones mínimas
de PS como sitios significativos para el contacto entre PS y C4BP y,
por tanto, definen un polipéptido de PS de esta invención.
Para comprobar la capacidad de los péptidos
PSP-loop, PSP-424K y
PSP-428K se usó un enfoque alternativo, en
comparación con el observado para el péptido PSP-12,
al inhibir la unión de C4BP a PS. Para este ensayo se recubrieron
los pocillos de microtitulación con PS purificada diluida hasta una
concentración de 10 \mug/ml en tampón de recubrimiento -carbonato
como se ha descrito anteriormente. Los pocillos se mantuvieron para
permitir que la PS se una a las paredes de los pocillos. Tras el
periodo de mantenimiento, los pocillos se bloquearon también como
se ha descrito anteriormente. Los péptidos PSP seleccionados se
mezclaron por separado a diversas concentraciones variables de
0-500 \muM con C4BP-biotinilada
(b-C4BP) a una concentración de 1 \mug/ml. Las
mezclas se mantuvieron en una placa de fase fluida durante 2 horas a
temperatura ambiente para formar complejos
péptido-C4BP.
Cincuenta \mul de las mezclas en complejo se
mezclaron por separado en los pocillos recubiertos con C4BP
preparados y se mantuvieron durante 1 hora a temperatura ambiente.
Después, la placa se lavó y se procesó para el desarrollo como se
ha descrito anteriormente.
En este ensayo, el péptido
PSP-loop inhibió la unión de los pocillos
recubiertos con C4BP con una concentración inhibitoria semimáxima
de aproximadamente 15 \muM (CI_{50}= 15 \muM) y una CI_{90}
de 50 \muM. Los otros péptidos, PSP-12,
PSP-424K y PSP-428K también fueron
inhibidores, pero con una CI50 de aproximadamente 50 \muM y una
CI_{90} de aproximadamente 250 \muM. Por tanto, el péptido
PSP-loop (11:1-26) fue más eficaz a
la hora de inhibir la unión de C4BP a PS que los otros tres péptidos
analizados.
Los anticuerpos preparados en el Ejemplo 2
inmunorreactivos con sus respectivos péptidos de inmunización y que
mostraron inmunorreactividad con la proteína S purificada se
analizaron para determinar la capacidad para inhibir la unión de la
proteína S a la C4BP inmovilizada usando el sistema ELISA descrito
en el Ejemplo 5ª con las siguientes excepciones. El anticuerpo
policlonal inmunopurificado antipéptido (concentración final de 0 a
200 \mug/ml (0 3,1 \muM) se preincubó con 50 \mul de proteína
S biotinilada (2 \mug/ml), producida como se ha descrito en el
Ejemplo 5Aii, durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la
adición a pocillos recubiertos con C4BP. Cincuenta \mul de C4BP
purificada (10 \mug/ml), producida como se ha descrito en el
Ejemplo 5Ai, recubrió y bloqueó los pocillos como se ha descrito en
el Ejemplo 5Aii. El resto del ensayo se realizó como se ha descrito
en el Ejemplo 5ª. Los resultados del ensayo se comunican en forma de
un porcentaje de inhibición de la unión a C4BP. El porcentaje de
inhibición de la unión a C4BP se define como:
I = 100%-100x
(delta_{T}/delta_{C})
donde I se expresa en forma de
porcentaje;
y
donde 100%= delta/min de la cantidad de
b-PS que se une específicamente a los pocillos
recubiertos con C4BP en ausencia de cualquier anticuerpo
competidor; y
donde delta_{T}= el cambio en la absorbancia
(405 nm) en presencia de un anticuerpo competidor; y
donde delta_{C}= el cambio en la absorbancia
(405 nm) en ausencia de anticuerpo competidor.
Los resultados de los ensayos de competencia de
anticuerpos se muestran en la Tabla 3 y en la figura 5. Los datos
de la Tabla 3 indican que el anticuerpo policlonal
anti-PS (420-434) era el único
anticuerpo que inhibió sustancialmente la formación del complejo
PS:C4BP. El anti-PS(420-434)
inhibió la unión de la proteína S nativa a C4BP en más de un 85%
cuando estaba presente a una concentración de 3,1 \muM. Cuando las
concentraciones de
anti-PS(420-434)
(anti-PSP-12) y
anti-PS(603-616)
(anti-PSP-13*) se variaban de
0-200 \mug/ml, la inhibición del
anti-PS(420-434) del complejo
PS:C4BP fue mejor que la inhibición producida por al
anti-PS(603-616) en
aproximadamente un 60%. El
anti-PS(420-434) inhibió la
formación del complejo PS:C4BP en un 70% a una concentración de 200
\mug/ml, donde la mitad de la inhibición total se produjo a una
concentración de 5 \mug/ml. Por tanto, el anticuerpo
anti-PS(420-434) se une a la
PS nativa e inhibe la unión de PS a C4BP.
Por tanto, un anticuerpo anti-PS
preferido de esta invención posee la capacidad para
inmunorreaccionar con un péptido de PS e inhibir la unión de PS a
C4BP. La detección selectiva de la inhibición de la unión de PS a
C4BP se realiza de un modo conveniente mediante el ensayo de
inhibición anterior.
Para comprobar la capacidad de los péptidos
PSP-loop, PSP-424K y
PSP-428K se usó un enfoque alternativo, en
comparación con el observado para el péptido PSP-12,
al inhibir la unión de PS a C4BP. Para este ensayo los péptidos de
C4BP, PS-biotinilada (b-PS) y PSP se
mezclaron juntos a las concentraciones respectivas de 3 \mug/ml,
0,6 \mug/ml y a un intervalo de 0-500 \muM
(V:V:V). Las mezclas se mantuvieron durante 2 horas a temperatura
ambiente en una placa de fase fluida para permitir la unión y/o la
inhibición de los mismos de PS a C4BP por los péptidos derivados de
PS. Tras el periodo de mantenimiento, 50 \mul de las mezclas se
mezclaron por separado en los pocillos previamente recubiertos con
10 \mug/ml del anticuerpo policlonal IGG
anti-C4BP. Las mezclas se mantuvieron durante 1
hora a temperatura ambiente para permitir la unión de C4BP a las
placas recubiertas con el anticuerpo antiC4BP. La unión de los
complejos biotinilados a las placas recubiertas con el anticuerpo
se detectó como se describe en el Ejemplo 5Aii.
El péptido PSP-loop inhibió la
unión de b-PS a C4BP (detectada mediante la unión o
la inhibición de su unión a las placas recubiertas con
anticuerpo-C4BP) con CI_{50} de aproximadamente 40
\muM y una CI_{90} de aproximadamente 400 \muM. Los péptidos
PSP-12 y PSP-424K también fueron
inhibidores pero con una eficacia menor. Por tanto, se mostró que
el péptido PSP-loop inhibía con eficacia la unión de
PS a C4BP en el ensayo de anticuerpos descritos anteriormente con
resultados comparables a los mostrados en el Ejemplo 5Aii en el
ensayo de inhibición peptídica.
Con el fin de identificar los epítopos del
anticuerpo anti-PS(420-434)
se realizó un ensayo ELISA usando los péptidos que se muestran en
la Tabla 4. Los péptidos recubrieron u bloquearon placas de
microtitulación y se incubaron con concentraciones de
anti-PS(420-434) variables de
IgG a 0-5 \mug/ml de acuerdo con los protocolos
de Elisa previamente descritos. El resto del ensayo y el registro de
los datos se realizó como se ha descrito en el Ejemplo 2C.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del ensayo se muestran en la
Tabla 4. Los datos indican que el
anti-PS(420-434) se unía con
la afinidad más elevada a los péptidos que contienen la secuencia
-KEIQ (1:423-427) y poseían una longitud de más de
7 residuos de aminoácidos, o la secuencia
-QEKQNKHS-(1:427-434).
Los anticuerpos monoclonales preparados en el
Ejemplo 4, inmunorreactivos con sus respectivos péptidos de
inmunización y que mostraron inmunorreactividad con la proteína S
purificada se analizaron para determinar la capacidad para inhibir
la unión de C4BP a la PS inmovilizada en el sistema ELISA descrito
en el Ejemplo 2C con las siguientes excepciones. El anticuerpo
monoclonal inmunopurificado
anti-PS(420-434), designado
AcMo 56, a intervalos variables de 0-150 \mug/ml
se preincubaron con la proteína S inmovilizada durante 2 horas a
temperatura ambiente. La C4BP biotinilada (b-C4BP),
producida mediante la combinación de biotina (Clontech) con C4BP y
siguiendo las instrucciones del fabricante, se mezcló en los
pocillos en una concentración final de 1 \mug/ml y se mantuvo
durante 1 hora a temperatura ambiente. El resto del ensayo y el
registro de los datos se realizó como se ha descrito en el Ejemplo
2C.
Los resultados muestran una disminución
sustancial en la formación del complejo PS:C4BP con concentraciones
crecientes de AcMo 56 en comparación con la IgG no inmunitaria
control. Por tanto, el AcMo 56 inhibe la unión de C4BP a PS.
Para comprobar la capacidad de los péptidos
PSP-loop, PSP-424K y
PSP-428K se usó un enfoque alternativo, en
comparación con el observado para el péptido PSP-12,
al inhibir la unión de PS a C4BP, cuyo resultado se detectó en
placas recubiertas con anticuerpos monoclonales. Para este ensayo
los péptidos de C4BP-biotinilada
(b-C4BP), PS y PSP se mezclaron juntos a las
concentraciones respectivas de 0,5 \mug/ml, 1,0 \mug/ml y a un
intervalo de 0-500 \muM (V:V:V). Las mezclas se
mantuvieron durante 2 horas a temperatura ambiente en una placa de
fase fluida para permitir la unión y/o la inhibición de los mismos
de PS a C4BP por los péptidos derivados de PS. Tras el periodo de
mantenimiento, 50 \mul de las mezclas se mezclaron por separado en
los pocillos previamente recubiertos con 10 \mug/ml del AcMo
D-7 (ATCC Nº HB 80819). Las mezclas se mantuvieron
durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir la unión de
C4BP a las placas recubiertas con el anticuerpo AcMo
S-7. La unión de los complejos biotinilados a las
placas recubiertas con anticuerpo se detectó como se ha descrito en
el Ejemplo 5Aii.
El péptido PSP-loop inhibió la
unión de b-PS a C4BP (detectada mediante la unión o
la inhibición de su unión a las placas recubiertas con anticuerpo
AcMo S-7) con un CI_{50} de aproximadamente 35
\muM y una CI_{90} de aproximadamente 100 \muM. Los péptidos
PSP-12 y PSP-424K también fueron
inhibidores pero con una eficacia menor con un CI_{50} de
aproximadamente 50 \muM y una CI_{90} de aproximadamente 250
\muM. Por tanto, se mostró que el péptido
PSP-loop inhibía con eficacia la unión de PS a C4BP
en el ensayo de anticuerpos descrito anteriormente con resultados
comparables a los mostrados en el Ejemplo 5Aiii con el ensayo usando
anticuerpos policlonales anti-C4BP y en el Ejemplo
5Aii en el ensayo de inhibición peptídica.
Para los ensayos que se describen a
continuación, PS_{T} se define como la proteína S "total" se
encuentre en fase sólida o líquida. La PS_{T} incluye la proteína
S en forma de complejos con cualquier otra proteína, incluida la
C4BP, o proteína S libre de cualquier otra proteína. PS_{F} se
define como la proteína S libre de complejos con C4BP y que es capaz
y está disponible para formar complejos con C4BP.
Se preparó un anticuerpo monoclonal como se ha
descrito en el Ejemplo 4 pero usando proteína S purificada como
inmunógeno. El AcMo se sometió a detección selectiva usando los
procedimientos del Ejemplo 4 para determinar su capacidad pata
unirse a la proteína S en forma de complejos con C4BP. El AcMo
resultante con las características deseadas se designó LJS
S-7 (o AcMo S-7) (ATCC Nº HB 10819).
El AcMo S-7 purificado recubre pocillos de placas
de microtitulación y bloqueó como se describe en el Ejemplo 3. A los
pocillos que contienen AcMo S-7 se añadieron 50
\mul/pocillo en diluciones seriadas (1:500 a 1:64.000) de proteína
S purificada para producir una curva de concentración estándar.
Además, en pocillos distintos recubiertos de forma similar se
añadieron diluciones seriadas 1:2.000 -1:4.000 de sangre donante en
tampón de lavado. Tras una incubación de 2 horas a temperatura
ambiente, se eliminan los patrones y las diluciones muestra. A
continuación, en cada pocillo se añade AcMo S-7
biotinilado, formado mediante los procedimientos descritos en 5A, y
el resto del ensayo se realiza como se describe en el Ejemplo 2C
para detectar productos que inmunorreaccionan que contienen PS
libre. Las concentraciones en plasma humano normal de C4BP y PST se
midieron a 155 \mug/ml (270 nM) y 26 \mug/ml (350 nM),
respectivamente.
Los resultados indican que el AcMo
S-7 inmovilizado captura la PS total y, después, se
detecta la PS_{F} en la población de PS capturada mediante el uso
del anticuerpo específico de PSF, AcMo 56. Por tanto, este enfoque
permite la detección de PS_{F} en muestras de fluido.
Para mostrar que el AcMo 56 reconoce únicamente
la proteína S libre y es útil para la captura selectiva de la
proteína S libre, se preparó AcMo 56 de fase sólida y la PS libre se
inmunoadsorbión a partir de plasma humano normal. En este punto, el
anticuerpo monoclonal AcMo 56 preparado en el Ejemplo 4, se acopló a
sefarosa 4B-actividad por CNBr (Pharmacia)
siguiendo las instrucciones del fabricante (3 mg de IgG/ml gel). A
continuación, 400 \mul de plasma humano normal (George King,
Inc., Overland KS) se mantuvo con 100 \mul de esferas húmedas que
contenían el anticuerpo monoclonal inmovilizado AcMo 56 en tampón
TBS durante 90 minutos a 8ºC en agitación continua. LA mezcla de
anticuerpo AcMo 56/plasma se centrifugó a 3000 rpm a 8ºC. A
continuación, el sobrenadante se alicuotó y congeló a -70ºC para el
posterior análisis. En el procedimiento de adsorción anterior se
usaron como controles otras dos muestras de plasma para analizar la
especificidad del tratamiento con AcMo 56. Para una muestra una
alícuota idéntica de 400 \mul de plasma normal se mantuvo en las
mismas condiciones sin sefarosa. Para otra muestra, 400 \mul de
plasma humano normal se incubó con 100 \mul de AcMo
S-7 anti-PST acoplado a esferas de
sefarosa en las mismas condiciones. El AcMo S-7
reconoce el complejo y la proteína S libre, y previamente se había
mostrado que adsorbe todo el antígeno de la proteína S del
plasma.
Para identificar visualmente la proteína S libre
y en forma de complejo en las diversas fracciones adsorbidas
producidas anteriormente, se realizó una inmunoelectroforesis
bidimensional cruzada o Rocket (CIEP) como describen Laurell y
col., Anal. Biochem., 10: 358-361 (1985).
Primero, 30 \mul de plasma tratado o de plasma control no
expuesto a sefarosa, se cargaron en un gel con 1% de azarosa, 0,3
mM/l de EDTA en tampón de Tris-glicina, a pH 8,7.
El gel se vertió en una película unida al gel parcialmente cubierta
con una pieza de dispositivo de metal para preservar un área para
la azarosa usada para la segunda electroforesis dimensional. La
electroforesis en la primera dimensión se realizó a 4ºC a 1 mA/cm
durante 45 minutos. Tras la realización de la electroforesis en la
primera dimensión, se aplicó el gel para la segunda dimensión que
contenía 5 mmol/l de EDTA, 3% de polietilenglicol y anticuerpo de
cabra anti-PS a una dilución 1/400. La
electroforesis en la segunda dimensión se realizó a 22ºC y 1,2
mA/cm durante 18 horas. Las placas se lavaron, secaron y marcaron
como describieron Laurell y col., ant.
Los resultados de la electroforesis
2-D se muestran en la Figura 6, revelaron la
ausencia de la banda de PS_{F} en la localización esperada para
el plasma adsorbido a AcMo 56 (en comparación con la localización de
la banda de PS_{F} para el plasma no tratado). Además, el
complejo C4VP:PS produjo una banda en la localización esperada para
el plasma adsorbido a AcMo 56. Por tanto, el AcMo 56 se une
específicamente a la especie de proteína S que no está en forma de
complejo con C4BP, es decir, es PS libre.
Como alternativa, para identificar los
anticuerpos policlonales de conejo
anti-PS(420-434) que sólo
reconocen la proteína S libre. 3 mg de anticuerpo
anti-PS(420-434) purificado
por inmunoafinidad, preparado en el Ejemplo 3, se acopló a 1 ml de
sefarosa 4B-CNBr (Pharmacia) resuspendido siguiendo
las instrucciones del fabricante. Después de bloquear las esferas
con etanolamina 0,1M a pH 9,0, las esferas se vertieron en una
columna de cromatografía (1 x 1 cm) equilibrada en tampón TBS a
temperatura ambiente.
A la columna que contiene
anti-PS(420-434), diferentes
mezclas de proteína S en complejo y libre, preparadas como se
describe en los Ejemplo 2A y 5A, se pasaron a su través a un flujo
de 1 ml/min. Tras lavar con 50 ml de tampón TBS, la columna se
eluyó con 10 ml de tiocianato 3M en tampón TBS. Las fracciones
eluidas se dializaron en tampón TBS y las muestras resultantes se
sometieron a SDS-PAGE usando geles a un gradiente de
4-15%. Los geles se marcaron con plata con el fin
de analizar las diferentes bandas de proteínas o se transfirieron a
papel de nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia con un
anticuerpo específico contra la proteína S o la C4BP. Como control
se usó otra columna de afinidad con diferentes anticuerpos
policlonales de cabra
anti-PS(420-434) acoplados a
sefarosa para adsorber toda la proteína S.
Los resultados, mostrados en la Figura 7,
muestran que de la columna sólo eluyó la proteína S libre. Esto
indica que los anticuerpos policlonales anti-PS
(420-434) sólo se unen a la proteína S libre y no se
unirán al complejo PS:C4BP.
Estos resultados también muestran que los
anticuerpos anti-PSF de esta invención son útiles
para purificar la PS libre de los fluidos biológicos complejos
tales como sangre, plasma y productos derivados de plasma.
Cincuenta \mul de péptido sintético
PSP-12 (20 \muM) o la proteína S nativa (10
\mug/ml) diluidos en tampón Na_{2}CO_{3} 0,02M a pH 9,0
recubrieron por separado pocillos de microtitulación durante 1 hora
a 37ºC. La muestra de incubación se desechó y los pocillos se
bloquearon con 200 \mul de 10% de BSA en Tris-HCl
0,05M, NaCl 0,1M a pH 7,4 (TBS) y se almacenaron a 4º hasta su uso.
A continuación los pocillos se lavaron 3 veces con 0,2% de BSA en
TBS, Ca++ 5 mM y 0,02% de Tween-20 (tampón de
lavado). Después del lavado se mezclaron en cada pocillo 50 \mul
en diluciones seriadas de C4BP biotinilada (b-C4BP)
a concentraciones variables de 0-20 \mug/ml. La
solución se mantuvo durante 2 horas a temperatura ambiente para
permitir que la C4BP forme complejos (se una) con PS o
PSP-12 en los pocillos. El resto del ensayo se
realizó como se describe en el Ejemplo 2C. Los resultados indicaron
que el péptido PSP-12 y la PS purificada se unen a
C4BP al mismo nivel.
Con el fin de detectar la C4BO competente
presente en una muestra de fluido vascular, pocillos de
microtitulación se recubren con el péptido PSP-12 y
se bloquearon como se ha descrito en la sección 7ª.
A los pocillos recubiertos con
PSP-12 se añadieron a cada uno de los pocillos 50
\mul/pocillo en diluciones seriadas de C4BP purificada (1:500 a
1:64.000) preparadas como en el Ejemplo 5A o NHP
(1:2.000-1:4.000 diluciones de muestras
desconocidas) en tampón de lavado. Tras una hora de incubación a
temperatura ambiente, se eliminan los patrones y las diluciones
muestra y los pocillos se lavan 3 veces con tampón de lavado. A
continuación, a cada pocillo se añaden anticuerpos policlonales de
conejo anti-C4BP purificados mediante inmunoafinidad
(10 \mug/ml). Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente,
se eliminan los anticuerpos policlonales se eliminan mediante
lavados con tampón de lavado. Esta etapa se sigue de otra hora de
incubación a temperatura ambiente con 50 \mul/pocillo de IgG de
cabra anti-conejo biotinilada (1 \mug/ml).
Después, en cada pocillo se mezclan 1 \mug/ml de estreptavidina
conjugada con fosfatasa alcalina (SAAP) (50 \mul/pocillo) y se
mantuvieron durante 30 minutos a temperatura ambiente. LA SAAP se
elimina y los pocillos se lavan 6 veces con tampón de lavado. A
continuación, en cada pocillo se mezclan cinco mg/ml de PNPP (100
\mul/pocillo) en tampón de dietilamina/HCl 0,1M a pH 9,0. El
cambio en la absorbancia a 405 nm se mide usando el lector EL312
Microplate (Biotek Instruments, Inc., Winooski VT) y los datos se
analizan usando un programa de software para cinética (KinetiaCalc,
Bio-tek). Los resultados muestran unión únicamente
en los pocillos control positivos y también en las diluciones
menores de NHP que indican captura de C4BP.
Anticuerpos monoclonales purificados frente a la
cadena alfa de C4BP (disponible en Biodesign Internacional
Kenneb-unkport, ME) (10 \mug/ml) en 50 \mul de
tampón de Na_{2}CO_{3} 0,02M a pH 9,0 recubren pocillos de
placas de microtitulación durante 1 hora a 37ºC. Los pocillos se
bloquean con 200 \mul de 10% de BSA en TBS y se almacenan a 4ºC
hasta su uso. Antes de usar, los pocillos se lavan tres veces con
0,2% de BSA en TBS, C++ 5 mM, 0,02% de azida sódica y 0,02% de
Tween-20 (tampón de lavado). Diluciones seriadas de
1:500 a 1:64.000 en 50 \mul/pocillo de C4BP purificada o NHP se
mezclan para producir una curva de concentración estándar. Además,
diluciones seriadas de
1:2.000-1:4-000 de muestras de
plasma humano normal desconocidas en tampón de lavado se mezclan en
los pocillos. Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se
eliminan los patrones y las diluciones de la muestra y los pocillos
se lavan 3 veces con tampón de lavado.
A continuación,
b-PSP-12 sintético se diluye a
concentraciones (0-200 \muM) en tampón de lavado y
se incuba en los pocillos que contienen la C4BP unida a anticuerpos
policlonales anti-C4BP durante 1 hora a temperatura
ambiente. El resto del ensayo se realiza como se describe en el
Ejemplo 2C. Los resultados muestran unión únicamente en los
pocillos positivos control y en las diluciones menores de NHP que
indica captura de b-PSP-12.
La memoria escrita anterior se considera
suficiente para permitir al experto en la técnica practicar la
invención. El alcance de la presente invención no debe estar
limitado por las líneas celulares depositadas, ya que la presente
forma de realización depositada está destinada a ser sólo una
ilustración sencilla de un aspecto de la invención y todas las
líneas celulares funcionalmente equivalentes se encuentran dentro
del alcance de esta invención. El depósito de materiales no
constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en
la presente memoria descriptiva es inadecuada para permitir la
práctica de cualquier aspecto de la invención, incluido el mejor
modo de la mismo, ni deben interpretarse los depósitos como
limitantes del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones
específicas que representan. De hecho, para los expertos en la
técnica a partir de la anterior descripción se pondrán de
manifiesto varias modificaciones de la invención además de las
mostradas y descritas en la presente memoria descriptiva.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Griffin, John H.
\hskip1cm Fernández, José A.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLIPÉPTIDOS DE LA PROTEÍNA S Y ANTICUERPOS ANTI-PÉPTIDO QUE INHIBEN LA UNIÓN DE LA PROTEÍNA A LA PROTEÍNA DE UNIÓN C4b, SISTEMAS DE DIAGNÓSTICO Y PROCEDIMIENTOS TERAPÉUTICOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: The Scripps Research Institute. Office of Patent Counsel
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 10666 North Torrey Pines Road, Mail Drop TPC8
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92037
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO LEGIBLE POR UN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1, versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 DE JULIO DE 1992
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/724.726
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 2 DE JULIO DE 1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Fitting, Thomas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.163
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: SCR1119P
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE COMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 619-554-2937
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 619-554-6312
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 635 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Ile Lys Glu Ile Ile Gln Glu Lys Gln
Asn Lys His Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Val Lys Glu Ile Ile Gln Glu Lys Gln
Asn Lys His Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ile Arg Ser Trp Asn Leu Met Lys Gln Gly
Ala Ser Gly Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Pro Glu Gly Tyr Arg Tyr Asn Leu Lys Ser
Lys Ser Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asn Gly Val Gln Leu Asp Leu Asp Glu Ala
Ile Ser Lys Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala His Ser Cys Pro Ser Val Trp Lys Lys
Thr Lys Asn Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asn Lys Thr Lys Lys Trp Val Ser Pro Ser
Ser His Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota- "donde X es Ile o Val, preferentemente Ile".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Xaa Lys Glu Ile Ile Gln Glu Lys Gln
Asn Lys His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota- "Donde X es Cys o Ser".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Glu Lys Gln Asn Lys His Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ile Arg Ser Trp Asn Leu Met Lys Gln Gly
Ala Ser Ile Lys Glu}
\sac{Ile Ile Gln Glu Lys Gln Asn Lys His
Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Ile Lys Lys Ile Ile Gln Glu Lys Gln
Asn Lys Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Ile Glu Ile Ile Gln Lys Lys Gln Asn
Lys Cys}
Claims (35)
1. Un polipéptido de la proteína S que posee una
longitud no mayor a 100 residuos de aminoácidos e incluye una
secuencia de residuo de aminoácido, cuya SEC ID Nº y los
correspondientes residuos se muestran entre paréntesis,
representado por una fórmula seleccionada de:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-QEKQNKH- \; y \+ (1:427 - 433)\cr \+\cr
-SGIKKIIQEK-, \+
(12:1 - 10)\cr}
y donde dicho polipéptido inhibe la
unión de la proteína S a la proteína de unión
C4b.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el
que dicho polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos, la SEC
ID Nº cuyos correspondientes residuos se muestran entre paréntesis,
representado por una fórmula seleccionada de:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-QEKQNKH-, \hskip0,2cm y \+ \hskip0,1cm
(1:427-434)\cr}
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-SGIKKIIQEKQNKC.- \+
(12:1-14)\cr}
donde X es C o
S.
3. El polipéptido de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, en el que dicho polipéptido comprende una
secuencia de residuos de aminoácidos correspondiente a una porción
de la secuencia de residuos de aminoácidos de la proteína S que se
muestra en la SEC ID Nº 1.
4. El polipéptido de la reivindicación 1, en el
que dicho polipéptido posee una secuencia de residuos de
aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos correspondientes residuos se
muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-QEKQNKHS \+
(1:427-434)\cr}
5. Un anticuerpo que inhibe la unión de la
proteína S a la proteína de unión C4b y que inmunorreacciona
con:
(a) la proteína S, y
(b) un polipéptido que posee una secuencia de
residuos de aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos correspondientes
residuos se muestran entre paréntesis, representado por la
fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SGIKKIIQEKQNKC \+
(12:1-14)\cr}
pero no inmunorreaciona con el
polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos
representado por la
fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
CTCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS \+
(1:103-131).\cr}
6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
7. El uso de un polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la fabricación de un
medicamento para tratar la trombosis en un paciente.
8. El uso de la reivindicación 7, en el que
dicho polipéptido es para la administración en una cantidad
suficiente para producir una concentración intravascular de
polipéptido de proteína S en la sangre de dicho paciente en el
intervalo de 0,1 a 100 micromolar.
9. El uso de un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 5 en la fabricación de un medicamento para tratar la
trombosis en un paciente.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que
dicho anticuerpo es para la administración en una cantidad
suficiente para producir una concentración intravascular de
anticuerpo en la sangre de dicho paciente en el intervalo de 0,1 a
100 \mug/ml.
\newpage
11. Una composición que comprende un excipiente
farmacéuticamente aceptable y un polipéptido de proteína S
seleccionado del grupo de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 en una cantidad suficiente para inhibir
la unión de la proteína S a la proteína de unión C4b.
12. La composición de la reivindicación 11, en
la que dicha cantidad es al menos 0,1 por ciento en peso del
polipéptido de la proteína S por peso de composición total.
13. Una composición que comprende un excipiente
farmacéuticamente aceptable y un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 5 en una cantidad suficiente para inhibir la unión de
la proteína S a la proteína de unión C4b.
14. La composición de la reivindicación 13, en
la que dicha cantidad inhibidora de APC es al menos 0,1 por ciento
en peso de anticuerpo por peso de composición total.
15. Un procedimiento in vitro para
inhibir la unión de la proteína S a la proteína de unión C4b en una
composición acuosa que comprende poner en contacto dicha composición
acuosa con una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido
de proteína S seleccionado del grupo de polipéptidos de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
16. Un procedimiento in vitro para
inhibir la unión de la proteína S a la proteína de unión C4b en una
composición acuosa que comprende poner en contacto dicha composición
acuosa con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de
acuerdo con la reivindicación 5.
17. Un procedimiento de análisis de la cantidad
de la proteína S libre en una muestra de fluido vascular que
comprende las etapas de:
(a) formar una mezcla de inmunorreacción
mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular con un
anticuerpo anti-proteína S que inmunorreaciona
con:
- (i)
- la proteína S, y
- (ii)
- un polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos correspondientes residuos se muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SGIKKIIQEKQNKC \+
(12:1-14)\cr}
pero no inmunorreacciona con el
polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos
representada por la fórmula: CTCCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS
(1:103-131), estando dicho anticuerpo operativamente
unido a una matriz sólida de forma que la mezcla de inmunorreacción
posee una fase líquida y una fase
sólida;
(b) mantener dicha mezcla de inmunorreacción
durante un periodo de tiempo suficiente para formar un producto de
inmunorreacción que contiene PS_{F} en la fase sólida, y
(c ) determinar la cantidad de producto formado
en la etapa (b).
18. El procedimiento de la reivindicación 17,
en el que dicha determinación en la etapa (c) comprende las etapas
de:
(i) mezclar el producto de inmunorreación que
contiene la PS_{F} en la fase sólida con un segundo anticuerpo
para formar una segunda mezcla de inmunorreación que posee una fase
líquida y una fase sólida, en la que dicho anticuerpo posee la
capacidad de inmunorreaccionar con el producto de inmunorreación que
contiene PS_{F;}
(ii) mantener dicha segunda mezcla de reacción
durante un periodo de tiempo suficiente para dicho segundo
anticuerpo inmunorreaccione con el producto de inmunorreacción y
forme un segundo producto de inmunorreacción en la fase sólida;
y
(iii) determinar la cantidad de un segundo
anticuerpo presente en el segundo producto de inmunorreacción y, de
este modo, la cantidad del producto de inmunorreacción formado en la
etapa (b).
19. El procedimiento de la reivindicación 17,
en el que dicho anticuerpo usado en la etapa (a) es un anticuerpo
monoclonal.
20. Un procedimiento de analizar la cantidad de
proteína S libre en una muestra de fluido vascular, que comprende
las etapas de:
(a) formar una mezcla de inmunorreacción de
competencia mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular
con:
- (1)
- un anticuerpo anti-proteína S que inmunorreacciona con:
- (i)
- proteína S, y
- (ii)
- un polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos correspondientes residuos se muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SGIKKIIQEKQNKC \+
(12:1-14)\cr}
pero no inmunorreacciona con el
polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos
representado por la fórmula: CTCCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS
(1:103-131), estando dicho anticuerpo unido
operativamente a una matriz sólida de forma que tal mezcla de
inmunorreacción de competencia posee una fase líquida y una fase
sólida,
y
(2) un polipéptido inmunorreactivo con el
anticuerpo, estando dicho polipéptido unido operativamente a un
medio indicador;
(b) mantener dicha mezcla de inmunorreacción de
competencia durante un tiempo suficiente para formar un producto de
inmunorreacción que contiene el medio indicador en la fase sólida,
y
(c) determinar la cantidad de medio indicador
presente en el producto formado en la etapa (b) y, de este modo, la
cantidad de proteína S libre en la muestra de fluido vascular.
21. Un procedimiento de analizar la cantidad de
proteína S libre en una muestra de fluido vascular, que comprende
las etapas de:
(a) formar una primera mezcla de inmunorreacción
mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular con un primer
anticuerpo anti-proteína S que inmunorreacciona con
la proteína S, pero no inhibe la unión de la proteína S a la
proteína de unión C4b, estando dicho primer anticuerpo unido
operativamente a una matriz sólida de forma que la primera mezcla
de inmunorreacción posea una fase líquida y una fase sólida;
(b) mantener dicha primera mezcla de
inmunorreacción durante un periodo de tiempo suficiente para formar
un producto de inmunorreacción que contiene proteína S en la fase
sólida;
(c) formar una segunda mezcla de inmunorreación
mediante la mezcla de dicho producto de inmunorreacción que
contiene proteína S en la fase sólida con un segundo anticuerpo
anti-proteína S que inmunorreacciona con:
- (i)
- proteína S, y
- (ii)
- un polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos correspondientes residuos se muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SGIKKIIQEKQNKC \+
(12:1-14)\cr}
pero no inmunorreacciona con el
polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos
representado por la
fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
CTCCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS \+
(1:103-131);\cr}
(d) mantener dicha segunda mezcla de
inmunorreacción durante un periodo de tiempo suficiente para que
dicho segundo anticuerpo inmunorreaccione con la proteína S en la
fase sólida y forme un segundo producto de inmunorreacción que
contiene proteína S en la fase sólida; y
(e) determinar la cantidad de producto formado
en la etapa (d) y, de este modo, la cantidad de proteína S libre en
la muestra de fluido vascular.
22. El procedimiento de la reivindicación 21,
en el que dicho primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal
producido por el hibridoma LJS S-7 que posee un
número de registro en la ATCC HB 10819.
23. Un procedimiento de analizar la cantidad de
proteína S libre en una muestra de fluido vascular, que comprende
las etapas de:
(a) formar una mezcla de inmunorreacción de
competencia mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular
con:
(1) un anticuerpo anti-proteína
S que inmunorreacciona con:
- (i)
- la proteína S, y
- (ii)
- un polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos correspondientes residuos se muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SGIKKIIQEKQNKC \+
(12:1-14)\cr}
pero no inmunorreacciona con el
polipéptido que posee una secuencia de residuos de aminoácidos
representado por la fórmula: CTCCKPGWQGEKCEFDINECKDPSNINGGCS
(1:103-131);
y
(2) un polipéptido inmunorreactivo con el
anticuerpo, estando dicho anticuerpo unido operativamente a una
matriz sólida de forma que la mezcla de inmunorreacción de
competencia posee una fase líquida y una fase sólida;
(b) mantener dicha mezcla de inmunorreacción de
competencia durante un tiempo suficiente para formar un producto de
inmunorreacción que contiene anticuerpo en la fase sólida; y
(c) determinar la cantidad de anticuerpo
presente en el producto formado en la etapa (b) y, de este modo, la
cantidad de proteína S libre en la muestra de fluido vascular.
24. El procedimiento de la reivindicación 23,
en el que dicho anticuerpo está operativamente unido a un medio
indicador y dicha determinación en la etapa (c) comprende determinar
la cantidad de medio indicador presente en el producto formado en
la etapa (b).
25. Un procedimiento para determinar la
cantidad de proteína de unión a C4b en una muestra de fluido
vascular que es capaz de unirse a la proteína S, que comprende las
etapas de:
(a) formar una mezcla de reacción de unión
mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular con un
polipéptido de proteína S que posee una longitud no superior a 100
residuos de aminoácidos e incluye una secuencia de residuos de
aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos correspondientes residuos se
muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-SGIKKIIQEK- \+
(12:1-10)\cr}
en el que dicho polipéptido inhibe
la unión de la proteína S a la proteína de unión C4b y dicho
polipéptido está operativamente unido a una matriz sólida de forma
que la mezcla de reacción de unión posee una fase líquida y una fase
sólida;
(b) mantener dicha mezcla de reacción de unión
durante un periodo de tiempo suficiente para que cualquier proteína
de unión C4b competente presente en la muestra de fluido vascular si
una al polipéptido y forme un producto de reacción que contiene la
proteína de unión de C4b en la fase sólida; y
(c) determinar la cantidad de proteína de unión
C4b presente en el producto de reacción de la fase sólida.
26. El procedimiento de la reivindicación 25,
en el que dicha determinación comprende las etapas de:
(i) mezclar el producto de reacción formado en
la etapa (b) con un anticuerpo anti proteína de unión C4b que
inmunorreacciona con la proteína de unión C4b para formar una mezcla
de inmunorreacción;
(ii) mantener dicha mezcla de inmunorreacción
durante un periodo de tiempo suficiente para que el anticuerpo
inmunorreaccione con cualquier proteína de unión C4b presente en la
fase sólida y forme un producto de inmunorreacción de fase sólida;
e
(iii) determinar la cantidad de anticuerpo
presente en el producto de inmunorreacción de fase sólida formado
en la etapa (ii) y, de este modo, la cantidad de proteína de unión
C4b competente en la muestra de fluido vascular.
27. El procedimiento de la reivindicación 25,
en el que dicho anticuerpo inmunorreacciona con la subunidad alfa de
la proteína de unión C4b.
28. El procedimiento de la reivindicación 25,
en el que dicho polipéptido posee una secuencia de residuos de
aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos residuos correspondientes se
muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SGIKKIIQEKQNKC \+
(12:1-14).\cr}
29. Un procedimiento para determinar la
cantidad de proteína de unión C4b en una muestra de fluido vascular
que es capaz de unirse a la proteína S, que comprende las etapas
de:
(a) formar una mezcla de inmunorreacción de
competencia mediante la mezcla de una muestra de fluido vascular
con:
- (i)
- un polipéptido de proteína S que posee una longitud no mayor a 100 residuos de aminoácidos y que incluye una secuencia de residuos de aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos residuos correspondientes se muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-SGIKKIIQEK- \+
(12:1-10)\cr}
En la que dicho polipéptido inhibe la unión de
la proteína S a la proteína de unión C4b, e
- (ii)
- un anticuerpo anti proteína de unión C4b que inmunorreacciona con la proteína de unión C4b, estando dicho anticuerpo operativamente unido a una matriz sólida de modo que la mezcla de inmunorreacción posee una fase líquida y una fase sólida;
(b) mantener dicha mezcla de inmunorreacción
durante un periodo de tiempo suficiente para que cualquier proteína
de unión C4b competente presente en la muestra de fluido vascular se
una al anticuerpo y forme un producto de inmunorreacción en la fase
sólida, y para que el polipéptido se una a dicho producto de
inmunorreacción; y
(c) determinar la cantidad de polipéptido
presente en el producto de reacción de la fase sólida y, de este
modo, la cantidad de proteína de unión C4b competente.
30. El procedimiento de la reivindicación 29,
en el que dicho anticuerpo inmunorreacciona con la subunidad alfa de
la proteína de unión C4b.
31. El procedimiento de la reivindicación 29,
en el que dicho polipéptido posee una secuencia de residuos de
aminoácidos, la SEC ID Nº y cuyos correspondientes residuos se
muestran entre paréntesis, representado por la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
SGIKKIIQEKQNKC \+
(12:1-14).\cr}
32. Un procedimiento para purificar la proteína
S libre (PS_{F}) de una solución acuosa, que comprende las etapas
de:
(a) mezclar una solución acuosa que contiene
PS_{F} con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5 que
inmunorreacciona de forma específica con PS_{F} para formar una
mezcla de inmunorreacción;
(b) mantener la mezcla de inmunorreacción en
condiciones de inmunorreacción durante un periodo de tiempo
suficiente para que la PS_{F} en solución inmunorreaccione con
dicho anticuerpo y forme un producto de inmunorreacción; y
(c) recuperar el producto de inmunorreacción de
la mezcla de inmunorreacción, de modo que se forma PS_{F}
purificada,
33. El procedimiento de la reivindicación 32,
en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo inmovilizado
operativamente unido a un soporte sólido de forma que la mezcla de
inmunorreacción posee una fase líquida y una fase sólida, y el
producto de inmunorreacción formado está en la fase sólida.
34. El procedimiento de la reivindicación 33,
en el que dicha recuperación en la etapa (c) comprende las etapas
de:
(i) mezclar el producto de inmunorreacción
formado en la etapa (b) con un tampón de elución para formar una
mezcla de elución;
(ii) mantener la mezcla de elución durante un
periodo de tiempo suficiente para eluir PS_{F} en el producto de
inmunorreacción de fase sólida fuera de la fase sólida y hacia la
fase líquida; y
(iii) recolectar la fase líquida, de modo que se
recupera la PS_{F} eluida y purificada.
35. Una composición de inmunoafinidad para
purificar la proteína S libre (PS_{F}) de una solución acuosa que
comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5
operativamente unido a un soporte sólido.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72474691A | 1991-07-02 | 1991-07-02 | |
| US724746 | 1991-07-02 | ||
| US907190 | 1992-07-01 | ||
| US07/907,190 US5321123A (en) | 1991-07-02 | 1992-07-01 | Protein S polypeptides and anti-peptide antibodies that inhibit protein S binding to C4B binding protein, diagnostic systems and therapeutic methods |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2279598T3 true ES2279598T3 (es) | 2007-08-16 |
Family
ID=27111033
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99202141T Expired - Lifetime ES2279598T3 (es) | 1991-07-02 | 1992-07-02 | Polipeptidos de proteinas y sus usos. |
| ES92915841T Expired - Lifetime ES2142317T3 (es) | 1991-07-02 | 1992-07-02 | Polipeptidos de proteinas s y uso de los mismos. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES92915841T Expired - Lifetime ES2142317T3 (es) | 1991-07-02 | 1992-07-02 | Polipeptidos de proteinas s y uso de los mismos. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0592600B1 (es) |
| AT (2) | ATE350398T1 (es) |
| AU (1) | AU674496B2 (es) |
| CA (1) | CA2112701C (es) |
| DE (2) | DE69230614T2 (es) |
| DK (2) | DK0592600T3 (es) |
| ES (2) | ES2279598T3 (es) |
| GR (1) | GR3033242T3 (es) |
| PT (1) | PT592600E (es) |
| WO (1) | WO1993001209A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5863896A (en) * | 1995-11-09 | 1999-01-26 | Immuno Ag | Evaluation of substances for altering and for increasing APC response |
| SE9604378D0 (sv) * | 1996-11-27 | 1996-11-27 | Tac Ab | Methods and reagents for determining protein S |
| US6379975B1 (en) | 1996-11-27 | 2002-04-30 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Methods and reagents for determining protein S |
| CA2522984A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-10-28 | Novartis Ag | Methods and compositions targeting tyrosine kinases for the diagnosis and treatment of osteoarthritis |
| FR2863616A1 (fr) * | 2003-12-12 | 2005-06-17 | Stago Diagnostica | Dosage de la proteine s libre non clivee par le facteur xa et utilisation de ce dosage pour l'evaluation du potentiel de coagulation |
| US20080161425A1 (en) * | 2005-07-29 | 2008-07-03 | Universiteit Van Maastricht | Regulation of Tissue Factor Activity by Protein S and Tissue Factor Pathway Inhibitor |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3789284T2 (de) * | 1986-12-15 | 1994-07-14 | Teijin Ltd | Immunologische Bestimmung von freiem menschlichem Protein-S und c4bp-Protein-S-Komplex. |
| EP0315447A3 (en) * | 1987-11-06 | 1990-07-18 | Teijin Limited | Method of immunological measurement of human protein s and reagent and kit therefor |
| JPH01231893A (ja) * | 1988-03-14 | 1989-09-18 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | 抗ヒトプロテインｓモノクローナル抗体およびその利用 |
-
1992
- 1992-07-02 EP EP92915841A patent/EP0592600B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-02 AT AT99202141T patent/ATE350398T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-07-02 AU AU23230/92A patent/AU674496B2/en not_active Ceased
- 1992-07-02 PT PT92915841T patent/PT592600E/pt unknown
- 1992-07-02 CA CA002112701A patent/CA2112701C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-02 WO PCT/US1992/005599 patent/WO1993001209A1/en active IP Right Grant
- 1992-07-02 DK DK92915841T patent/DK0592600T3/da active
- 1992-07-02 DE DE69230614T patent/DE69230614T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-02 EP EP9292306116A patent/EP0524737A3/en active Pending
- 1992-07-02 ES ES99202141T patent/ES2279598T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-02 DE DE69233673T patent/DE69233673T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-02 AT AT92915841T patent/ATE189232T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-07-02 ES ES92915841T patent/ES2142317T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-02 DK DK99202141T patent/DK0972781T3/da active
-
2000
- 2000-04-14 GR GR20000400924T patent/GR3033242T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU674496B2 (en) | 1997-01-02 |
| DE69233673D1 (de) | 2007-02-15 |
| DK0972781T3 (da) | 2007-03-05 |
| ATE189232T1 (de) | 2000-02-15 |
| EP0592600A1 (en) | 1994-04-20 |
| EP0524737A3 (en) | 1994-10-05 |
| WO1993001209A1 (en) | 1993-01-21 |
| PT592600E (pt) | 2000-05-31 |
| ES2142317T3 (es) | 2000-04-16 |
| EP0592600A4 (en) | 1994-10-12 |
| CA2112701C (en) | 2007-09-25 |
| GR3033242T3 (en) | 2000-09-29 |
| ATE350398T1 (de) | 2007-01-15 |
| DE69230614T2 (de) | 2000-06-21 |
| DE69233673T2 (de) | 2007-10-04 |
| EP0524737A2 (en) | 1993-01-27 |
| DK0592600T3 (da) | 2000-04-17 |
| DE69230614D1 (de) | 2000-03-02 |
| CA2112701A1 (en) | 1993-01-21 |
| AU2323092A (en) | 1993-02-11 |
| EP0592600B1 (en) | 2000-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2190799T5 (es) | Inmunogenos peptidicos para vacunacion y tratamiento contra la alergia. | |
| US6372884B1 (en) | Biologically active compounds and methods of constructing and using the same | |
| ES2231907T3 (es) | Epitopos de proteinas del estres. | |
| US5196511A (en) | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding | |
| US5262520A (en) | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding | |
| ES2320665T3 (es) | Anticuerpos especificos del factor ixa que presentan una actividad analoga a la del factor viiia. | |
| CA2000048A1 (en) | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand bindin g | |
| US6676940B2 (en) | Methods and compositions for inhibiting endothelial cell and fibrinogen mediated inflammation | |
| KR20010032436A (ko) | 단클론성 사람의 자연항체 | |
| ES2646792T3 (es) | Anticuerpos monoclonales contra bucles extracelulares de C5aR | |
| US5473051A (en) | Inhibition of Mac-1 receptor binding to fibrinogen using D30 homologs | |
| US6994852B1 (en) | Inhibition of angiogenesis by antibodies against high molecular weight kininogen domain 5 | |
| EP0972781B1 (en) | Proteins polypeptides and uses thereof | |
| ES2279598T3 (es) | Polipeptidos de proteinas y sus usos. | |
| Bidart et al. | Antigenic determinants on human choriogonadotropin alpha-subunit. I. Characterization of topographic sites recognized by monoclonal antibodies. | |
| ES2304782T3 (es) | Anticuerpos monoclonales para determinacion inmunologica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular, intactas en fluidos corporales. | |
| WO1993009803A1 (en) | Factor x-derived polypeptides and anti-peptide antibodies, systems and therapeutic methods for inhibiting inflammation | |
| WO1989010416A1 (en) | PROTECTIVE PEPTIDES DERIVED FROM HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS-1 gp160 | |
| US5338829A (en) | Peptides derived from human immunodeficiency virus-1 GP160 | |
| PT97389A (pt) | Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra proteina da placenta 4 (pp4) | |
| PT644768E (pt) | Metodos e composicoes para inibir a inflamacao mediada por celulas endoteliais e fibrinogenio | |
| PT98935A (pt) | Processo de preparacao de analogos de polipeptidos de local activo de interleucina-8, de anticorpos, de deteccao da presenca de il-8 e de composicoes terapeuticas |