ES2646792T3 - Anticuerpos monoclonales contra bucles extracelulares de C5aR - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que es reactivo con el segundo bucle extracelular, residuos 175 a 206, de C5aR humana, en el cual el anticuerpo se fija a C5aR y reduce o inhibe la fijación de C5a a C5aR y en donde el anticuerpo inhibe competitivamente la fijación de un anticuerpo que tiene: i) una secuencia de cadena ligera que se muestra en SEQ ID NO 19 y una secuencia de cadena pesada que se muestra en: SEQ ID NO:21; ii) una secuencia de cadena ligera que se muestra en SEQ ID NO 15 y una secuencia de cadena pesada que se muestra en: SEQ ID NO:17; o iii) una secuencia de cadena ligera que se muestra en SEQ ID NO 23 y una secuencia de cadena pesada que se muestra en: SEQ ID NO:25; a C5aR

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

aminoácidos 243.-.264 dominio transmembranal aminoácidos 265.-.283 dominio extracelular -bucle extracelular 3 aminoácidos 284.-.307 dominio transmembranal aminoácidos 308.-.350 dominio intracelular – término C

Detalles del depósito de microorganismos

El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal designado 7F3 se depositó el 6 de noviembre de 2000 con número de acceso ECACC 00110609.

El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal designado 6C12 (6C12 M12) se depositó en el 2 de septiembre de 2002 con número de acceso ECACC 02090226.

El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal designado 12D4 (12D4-P9) se depositó el 2 de septiembre de 2002 con número de acceso ECACC 02090227.

Estos depósitos se realizaron conforme a lo dispuesto en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patentes y las Regulaciones de conformidad con el mismo. Esto garantiza el mantenimiento de cultivos viables durante 30 años desde la fecha del depósito. Se podrá acceder a los microorganismos a través de la ECACC conforme a las condiciones del Tratado de Budapest que garantiza un acceso permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo al público tras la emisión de la patente pertinente.

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si el depósito del cultivo muriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en condiciones adecuadas, será reemplazado con prontitud tras la notificación con un espécimen viable del mismo cultivo. El acceso a una cepa depositada no se debe considerar como una licencia para llevar a la práctica la invención contraviniendo los derechos garantizados conforme a la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

Anticuerpos monoclonales y recombinantes

Anticuerpos monoclonales murinos específicos para C5aR, designados 7F3, 6C12 y 12D4, han sido producidos por los presentes inventores como se describe en esta memoria. Sorprendentemente, estos anticuerpos monoclonales (MAbs) son capaces de bloquear sustancial o completamente la fijación de C5a a C5aR. En particular, MAb 7F3 es totalmente neutralizante.

En contraste con otros anticuerpos anti-C5aR conocidos, los MAbs 7F3, 6C12 y 12D4 son reactivos con regiones de C5aR distintas de la región N-terminal. Se cree que MAbs 7F3, 6C12 y 12D4 son principalmente reactivos con el segundo bucle extracelular (residuos 175 a 206) de C5aR. Por ejemplo, la reactividad de MAb 12D4 con C5aR es casi totalmente anulada por mutación de los residuos 181 y 192 del segundo bucle extracelular de tirosina a fenilalanina. Esta inhibición fue observada en estudios de fijación que implicaban el mutante de C5aR L2-FF (Farzan et al., J. Exp. Med., 193: 1059-1065, 2001).

Debido a la probable conformación y la proximidad íntima de los bucles extracelulares y el dominio N-terminal, los MAbs pueden fijarse también simultáneamente a una región de uno de los otros bucles extracelulares del dominio Nterminal.

Sorprendentemente, se ha observado que los MAbs 7F3, 6C12 y 12D4 son capaces también de inhibir la activación de los neutrófilos por otros ligandos quimioatrayentes. Ejemplos de estos otros ligandos quimioatrayentes incluyen los ligandos de CXCR1 y CXCR2 IL-8, ENA-78 y GPC-2. Esta capacidad para inhibir la función de diferentes receptores quimioatrayentes proporciona una ventaja inusual e inesperada sobre otras moléculas anti-C5aR conocidas. En particular, las moléculas anti-C5aR que son capaces de inhibir la función de receptores quimioatrayentes múltiples de neutrófilos son probablemente muy eficientes como agentes terapéuticos en el tratamiento de trastornos inmunopatológicos.

En un aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos que se fijan al segundo bucle extracelular (residuos 175 a 206) de C5aR humana.

En un aspecto preferido, la invención proporciona anticuerpos que se fijan a C5aR humana y tienen especificidad de epítopo igual o similar a la de uno cualquiera de los MAbs 7F3, 6C12 o 12D4.

El término "anticuerpo", como se utiliza en esta invención incluye moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, y Fv que son capaces de fijar el determinante epitópico. Estos fragmentos de anticuerpo tienen cierta capacidad para fijarse selectivamente con su antígeno o receptor y se definen como sigue:

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(1)

Fab, el fragmento que contiene un fragmento monovalente de fijación de antígeno de una molécula de anticuerpo puede producirse por digestión del anticuerpo entero con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada;

(2)

Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo puede obtenerse por tratamiento del anticuerpo entero con pepsina, seguido por reducción, para proporcionar una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo;

(3)

F(ab')2, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse por tratamiento del anticuerpo entero con la enzima pepsina sin reducción subsiguiente; F(ab)2 es un dímero de dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos por dos puentes disulfuro;

(4)

Fv, definido como un fragmento diseñado genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y

(5)

anticuerpo monocatenario ("SCA"), definido como una molécula manipulada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria fusionada genéticamente.

Métodos para producción de estos fragmentos se conocen en la técnica. (Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988), que se incorpora a esta memoria a modo de referencia).

Como se utiliza en esta invención, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al cual se fija el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos consisten usualmente en agrupaciones de moléculas químicamente tensioactivas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen usualmente características estructurales tridimensionales específicas, así como características específicas de carga.

Pueden prepararse anticuerpos de la presente invención utilizando células que expresan C5sR, C5aR intacto o fragmentos que contienen uno o más bucles extracelulares como el antígeno inmunizador. Un péptido utilizado para inmunizar un animal puede derivarse de cDNA traducido o síntesis química y se purifica y conjuga a una proteína portadora, en caso deseado. Tales portadores utilizados comúnmente que están acoplados químicamente al péptido incluyen hemocianina de lapa bocallave (KLH), tiroglobulina, seroalbúmina bovina (BSA), y toxoide del tétanos. El péptido acoplado puede utilizarse luego para inmunizar el animal (v.g., un ratón o un conejo).

Si se desea, los anticuerpos policlonales pueden purificarse ulteriormente, por ejemplo, por fijación a y elución de una matriz a la cual está unido el péptido para el que se generan más anticuerpos.

Las personas con experiencia en la técnica conocerán diversos métodos comunes en las técnicas de inmunología para purificación y/o concentración de anticuerpos policlonales, así como anticuerpos monoclonales (véase por ejemplo, Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, que se incorpora a esta memoria a modo de referencia).

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por linajes de células continuos en cultivo, tales como, por ejemplo, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de las células B humanas, y la técnica del hibridoma EBW (Kohler et al. Nature 256, 495-497, 1975; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030, 1983; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984).

Métodos conocidos en la técnica permiten que anticuerpos que exhiben fijación para un bucle extracelular de C5aR sean identificados y aislados a partir de bibliotecas de expresión de anticuerpos. Por ejemplo, un método para la identificación y aislamiento de un dominio de fijación de anticuerpo que exhibe fijación a un bucle extracelular de C5aR es el sistema vector del bacteriófago. Este sistema vector ha sido utilizado para expresar una biblioteca combinatoria de fragmentos Fab a partir del repertorio de anticuerpos de ratón en Escherichia coli (Huse, et al., Science, 246: 1275-1281, 1989) y del repertorio de anticuerpos humanos (Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:8095-8099, 1990). Esta metodología puede aplicarse también a linajes de células de hibridoma que expresan anticuerpos monoclonales con fijación para un ligando preseleccionado. Hibridomas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado pueden producirse de diversas maneras utilizando métodos bien comprendidos por quienes poseen experiencia ordinaria en la técnica, y no se repetirán aquí. Detalles de estas técnicas se describen en referencias tales como Monoclonal Antibodies-Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, editado por Roger H. Kennett, et al., Plenum Press, 1980; y U.S. 4,172,124, que se incorpora a esta memoria a modo de referencia.

Adicionalmente, métodos de producción de películas quiméricas de anticuerpo con diversas combinaciones de anticuerpos "humanizados" se conocen en la técnica e incluyen combinar regiones variables murinas con regiones constantes humanas (Cabily, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3273, 1984), o por injerto de las regiones determinantes de la complementariedad de (CDRs) de anticuerpos murinos en el entramado humano (Riechmann, et al., Nature 332:323, 1988).

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Esta invención proporciona además anticuerpos quiméricos de los anticuerpos anti-C5aR de la presente invención o fragmentos biológicamente activos de los mismos. Como se utiliza en esta memoria, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie se combinan con las regiones constantes de anticuerpos derivados de una especie diferente o, alternativamente, se refiere a anticuerpos injertados en CDR. Los anticuerpos quiméricos se construyen por tecnología de DNA recombinante, y se describen en Shaw, et al., J. Immun., 138:4534 (1987), Sun, LK., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214-218 (1987), por ejemplo.

Cualquiera de los anticuerpos arriba descritos o fragmentos de anticuerpo biológicamente activos pueden utilizarse para generar anticuerpos injertados en CDR y quiméricos. "CDR" o "región determinante de la complementariedad"

o "región hipervariable" se define como las secuencias de aminoácidos en las cadenas ligera y pesada del anticuerpo que forman la estructura del bucle tridimensional que contribuye a la formación del sitio de fijación del antígeno.

Como se utiliza en esta memoria, el término anticuerpo de "injertado en CDR" se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos en la cual al menos parte de una o más secuencias CDR del dominio ligero y/o variable han sido reemplazadas por partes análogas de secuencias CDR de un anticuerpo que tiene una especificidad de fijación diferente para un antígeno o receptor dado.

Los términos "región variable de cadena ligera" y "región variable de cadena pesada" se refieren a las regiones o dominios en la porción N-terminal de las cadenas ligera y pesada respectivamente que tienen una secuencia primaria de aminoácidos variada para cada anticuerpo. La región variable del anticuerpo está constituida por el dominio amino-terminal de las cadenas ligera y pesada tales como se pliegan las mismas unidas para formar un sitio de fijación tridimensional para un anticuerpo. Se dice que las secuencias CDR análogas están "injertadas" en el sustrato o anticuerpo receptor. El anticuerpo "donante" es el anticuerpo que proporciona la secuencia CDR, y el anticuerpo que recibe las secuencias sustituidas es el anticuerpo "sustrato". Una persona con experiencia en la técnica puede producir fácilmente estos anticuerpos injertados en CDR utilizando la doctrina proporcionada en esta memoria en combinación con métodos bien conocidos en la técnica (véase Borrebaeck, C.A., Antibody Engineering: A Practical Guide, W.H. Freeman and Company, Nueva York, 1992, que se incorpora a esta memoria a modo de referencia).

Se describen en la presente linajes de células que producen anticuerpos monoclonales de la invención. El aislamiento de linajes de células que producen anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse utilizando técnicas rutinarias de cribado, que permiten la determinación del patrón de reacción elemental del anticuerpo monoclonal de interés. Así, si un anticuerpo monoclonal que se ensaya se fija al segundo bucle extracelular de C5aR y bloquea la actividad biológica mediada por C5a, entonces el anticuerpo monoclonal que se ensaya y el anticuerpo monoclonal producido por los linajes de células de la invención son equivalentes.

Anticuerpos con una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de MAbs 7F3, 6C12 y 12D4 pueden identificarse por su capacidad para competir con dicho MAb particular para fijarse a C5aR (v.g., a células portadoras de C5aR, tales como transfectantes portadores de C5aR, monocitos, células dendríticas, macrófagos y basófilos). Utilizando quimeras receptoras (Rucker et al., Cell 87:437-446 (1996)) u otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, puede mapearse el sitio de fijación de uno cualquiera de los MAbs 7F3, 6C12 o 12D4.

Es posible también determinar, sin experimentación excesiva, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal de la invención averiguando si el primero evita la fijación del último a un péptido que comprende el segundo bucle extracelular de C5aR. Si el anticuerpo monoclonal que se ensaya compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, como se muestra por una disminución en la fijación por el anticuerpo monoclonal de la invención, entonces los dos anticuerpos monoclonales se fijan al mismo epítopo, o un epítopo estrechamente afín.

Otra vía adicional para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la invención consiste en pre-incubar el anticuerpo monoclonal que se ensaya con un péptido al cual se supone que el anticuerpo es reactivo, y añadir luego el anticuerpo monoclonal de la invención para determinar si el anticuerpo monoclonal de la invención es inhibido en su capacidad para fijar el péptido. Si el anticuerpo monoclonal de la invención es inhibido entonces, con toda probabilidad, el anticuerpo monoclonal que se ensaya tiene la misma especificidad epitópica, o una especificidad funcionalmente equivalente, que el anticuerpo monoclonal de la invención. El cribado de anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse también utilizando péptidos adecuados y determinando si el anticuerpo monoclonal bloquea la fijación de C5a a C5aR.

Utilizando los anticuerpos monoclonales de la invención, es posible producir anticuerpos anti-idiotípicos que pueden utilizarse para cribar los anticuerpos monoclonales a fin de identificar si el anticuerpo tiene la misma especificidad de fijación que un anticuerpo monoclonal de la invención. Estos anticuerpos pueden utilizarse también para propósitos de inmunización (Herlyn, et al., Science, 232:100, 1986). Tales anticuerpos anti-idiotípicos pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma bien conocidas (Kohler y Milstein, Nature, 256:495, 1975). Un anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo que reconoce determinantes singulares presentes en el anticuerpo monoclonal producido por el linaje de células de interés. Estos determinantes están localizados en la región hipervariable del anticuerpo.

15

25

35

45

55

Es esta región (paratopo) la que se fija a un epítopo dado y, por tanto, es responsable de la especificidad del anticuerpo. Un anticuerpo anti-idiotípico se puede preparar por inmunización de un animal con el anticuerpo inmunizador de interés. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizador y producirá un anticuerpo para estos determinantes idiotípicos. Por utilización de los anticuerpos antiidiotípicos del animal inmunizado, que son específicos para un anticuerpo monoclonal de la invención producido por un linaje de células que se utilizó para inmunizar el segundo animal, es posible identificar otros clones con el mismo idiotipo que el anticuerpo del hibridoma utilizado para inmunización. La identidad idiotípica entre anticuerpos monoclonales de dos linajes de células demuestra que los dos anticuerpos monoclonales son iguales con respecto a su reconocimiento del mismo determinante epitópico. Así, por utilización de anticuerpos anti-idiotípicos, es posible identificar otros hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales que tienen la misma especificidad epitópica.

Es posible también utilizar la tecnología anti-idiotipo para producir anticuerpos monoclonales que mimetizan un epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-idiotípico monoclonal producido a partir de un primer anticuerpo monoclonal tendrá un dominio de fijación en la región hipervariable que es la "imagen" del epítopo fijado por el primer anticuerpo monoclonal. Así, el anticuerpo anti-idiotípico monoclonal puede utilizarse para inmunización, dado que el dominio de fijación del anticuerpo anti-idiotípico monoclonal actúa de hecho como antígeno.

Fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de fijación epitópicos de uno cualquiera de los MAbs de la presente invención pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, fragmentos de anticuerpo adecuados pueden obtenerse obteniendo en primer lugar mAb 7F3 del hibridoma depositado y tratando después el anticuerpo (v.g., mediante digestión proteolítica) de manera que se obtenga a partir de él la región hipervariable.

Como alternativa, el DNA que codifica la región hipervariable puede clonarse, utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante tales como los descritos en esta memoria, es un hospedador adecuado.

Anticuerpos preferidos de la presente invención comprenden regiones variables de uno o más bucles CDR que son sustancialmente iguales que los de los MAbs 7F3, 6C12 o 12D4. Se comprenderá que las regiones variables o los bucles de CDR que se muestran en los listados de secuencia pueden modificarse para uso en la presente invención.

Típicamente, se hacen modificaciones que mantienen la especificidad de fijación de la secuencia. Pueden hacerse sustituciones conservadoras, por ejemplo, sin afectar a la especificidad de fijación del anticuerpo. Así, en una realización, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones con tal que la secuencia codificada retenga sustancialmente la misma especificidad de fijación. No obstante, en una realización alternativa, pueden hacerse modificaciones de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la invención intencionalmente para reducir la actividad biológica del anticuerpo. Por ejemplo, anticuerpos modificados que se mantienen capaces de fijarse a C5aR pero carecen de dominios secretores funcionales pueden ser útiles como inhibidores de la actividad biológica de C5aR.

Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir también el uso de análogos no existentes naturalmente, por ejemplo para aumentar la semivida en plasma sanguíneo de un anticuerpo administrado terapéuticamente.

En general, preferiblemente menos de 20%, 10%, o 5% de los residuos de aminoácido o de una variante o derivado están alterados en comparación con las regiones variables o los bucles CDR correspondientes representados en los listados de secuencias.

En el contexto de la presente invención, una secuencia "sustancialmente igual" que una de las regiones variables representadas en el listado de secuencias puede incluir una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85% o 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 ó 98% idéntica al nivel de aminoácidos en al menos 20, preferiblemente al menos 50 aminoácidos con dicha región variable. La homología debería considerarse típicamente con respecto a aquellas regiones de la secuencia que se sabe son esenciales para la especificidad de fijación más bien que a secuencias no esenciales vecinas.

Las comparaciones de homología pueden realizarse a simple vista, o más usualmente, con ayuda de programas de comparación de secuencia disponibles fácilmente. Estos programas de computadora disponibles comercialmente pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más secuencias.

El porcentaje de homología puede calcularse con respecto a secuencias contiguas, es decir, una secuencia está alineada con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia compararse directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se conoce como un alineamiento "sin lagunas".

Típicamente, tales alineaciones sin lagunas se realizan sólo a lo largo de un número relativamente corto de residuos (por ejemplo menos de 50 aminoácidos contiguos).

Aunque éste es un método muy simple y consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias idénticas por lo demás, una inserción o deleción puede hacer que los residuos de aminoácido siguientes queden desalineados, dando así potencialmente como resultado una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que tienen en consideración las posibles inserciones y deleciones sin

10

15

20

25

30

35

40

45

50

penalización excesiva del registro de homología global. Esto se logra por inserción de "lagunas" en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología local.

La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalidades por laguna. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores por defecto cuando se utiliza dicho software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete Wisconsin Bestfit de GCG (véase más adelante) la penalidad de laguna por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 por laguna y -4 por cada extensión.

El cálculo del % máximo de homología requiere por tanto en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en consideración las penalidades por laguna. Un programa de computadora adecuado para realización de un alineamiento de este tipo es el paquete Wisconsin Bestfit de GCG (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencia incluyen, pero sin carácter limitante, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid – Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el conjunto de herramientas de comparación de GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas en línea y fuera de línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere utilizar el programa Bestfit de GCG.

Aunque el % final de homología puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineamiento propiamente dicho no está basado típicamente en una comparación por pares de tipo “todo-o-nada”. En lugar de ello, se utiliza generalmente una matriz de registro de semejanza en escala que asigna registros para cada comparación por pares basados en semejanza química o distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo utilizada comúnmente es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas Wisconsin de GCG utilizan generalmente los valores públicos por defecto o una tabla de comparación de símbolos habitual si está suministrada (véase el manual de usuario para detalles adicionales). Se prefiere utilizar los valores públicos por defecto para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo., es posible calcular el % de homología, preferiblemente % de identidad de secuencia. El software hace esto típicamente como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Humanización de anticuerpos

Se prefiere que un anticuerpo de la presente invención esté humanizado, es decir, sea un anticuerpo producido por técnicas de modelización molecular en las cuales el contenido humano del anticuerpo se maximiza al tiempo que causa poca o ninguna pérdida de afinidad de fijación atribuible a la región variable del anticuerpo murino. Así, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo quimérico que comprende la secuencia de aminoácidos de una región de entramado humana y de una región constante de un anticuerpo humano a fin de humanizar o hacer no inmunógena la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal de ratón tal como 7F3, 6C12 o 12D4.

Los métodos descritos a continuación son aplicables a la humanización de una gran diversidad de anticuerpos animales. Puede utilizarse un enfoque de dos pasos que implica (a) seleccionar secuencias de anticuerpo humanas que se utilizan como entramados humanos para humanización, y (b) determinar qué residuos de región variable del anticuerpo monoclonal animal debería seleccionarse para inserción en el entramado humano seleccionado.

El primer paso implica selección de las secuencias de entramado humano mejores disponibles para las cuales está disponible información de secuencia. Este proceso de selección está basado en los criterios de selección siguientes.

(1) Porcentajes de Identidad

Las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal animal que debe humanizarse se alinean óptimamente y se comparan preferiblemente con todas las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos humanos conocidas.

Una vez que las secuencias se han comparado de este modo, se anotan las identidades de residuos y se determinan los porcentajes de identidad. Siendo iguales todos los restantes factores, es deseable seleccionar un anticuerpo humano que tenga la máxima identidad porcentual con el anticuerpo animal.

(2) Ambigüedades de Secuencia

Las secuencias de cadena de anticuerpo humana conocidas se evalúan luego en cuanto a la presencia de residuos no identificados y/o ambigüedades, que son incertidumbre de secuencia. Las más comunes de dichas incertidumbres son identificación equivocada de un aminoácido de carácter ácido por un aminoácido amídico debida a la pérdida de amoníaco durante el procedimiento de secuenciación, v.g., identificación incorrecta de un residuo ácido glutámico, cuando el residuo presente realmente en la proteína era un residuo glutamina. Siendo iguales todos los factores restantes, es deseable seleccionar una cadena de anticuerpo humana que tenga el número menor posible de tales ambigüedades.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

(3) Espaciamiento de la Región Pin

Las regiones variables de cadena de anticuerpos contienen puentes disulfuro intra-dominio. La distancia (número de residuos) entre los residuos cisteína que comprenden estos puentes se conoce como el espaciamiento de la región Pin [Chothia et al., J. Mol. Biol. 126: 901 81987)]. Siendo iguales todos los factores restantes, es muy deseable que el espaciamiento de la región Pin de un anticuerpo humano seleccionado sea similar o idéntico al del anticuerpo animal. Es deseable también que el espaciamiento de la región Pin de la secuencia humana sea similar al de una estructura tridimensional de anticuerpo conocida, a fin de facilitar la modelización por computadora.

Basándose en los criterios que anteceden, el anticuerpo (o anticuerpos) humano(s) que tiene la mejor combinación global de características deseables se selecciona como el entramado para humanización del anticuerpo animal. Las cadenas pesada y ligera seleccionadas pueden ser del mismo o diferentes anticuerpos humanos.

El segundo paso en los métodos de la esta invención implica la determinación de cuál de las secuencias de reacción variable del anticuerpo animal debería seleccionarse para injertar en el entramado humano. Este proceso de selección está basado en los criterios de selección siguientes:

(1) Selección de Residuos

Se evalúan dos tipos de región variable potencial en las secuencias de anticuerpos animales, los primeros de los cuales se conocen como "residuos mínimos". Estos residuos mínimos comprenden bucles estructurales CDR más cualesquiera residuos adicionales requeridos, como se muestra por modelización por computadora, que soportan y/u orientan los bucles estructurales CDR.

El otro tipo de residuos potenciales de región variable se conocen como "residuos máximos". Estos comprenden los residuos mínimos más cualesquiera residuos adicionales que, como se determina mediante modelización por computadora, caen dentro de aproximadamente 10 Å de los residuos de bucle estructural CDR y poseen una superficie accesible al disolvente agua [Lee et al, J. Biol. Chem. 55:379 (1971)].

(2) Modelización por Computadora

Para identificar residuos de región variables potenciales, se realiza modelización por computadora sobre (a) las secuencias de región variable del anticuerpo animal que deben humanizarse, (b) las secuencias de entramado de anticuerpos humanos seleccionadas, y (c) todos los anticuerpos recombinantes posibles que comprenden las secuencias de entramado de anticuerpo humano en las cuales se han injertado los diversos residuos de anticuerpo animal mínimos y máximos.

La modelización por computadora se realiza utilizando software adecuado para modelización de proteínas e información estructural obtenida a partir de un anticuerpo que (a) tiene secuencias de aminoácido de la región variable que son las más aproximadamente idénticas a las del anticuerpo animal y (b) tiene una estructura tridimensional conocida. Un ejemplo de software que puede utilizarse es el software SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). El anticuerpo del que puede obtenerse información estructural puede ser, pero sin carácter necesario, un anticuerpo humano.

Basándose en los resultados obtenidos en el análisis que antecede, se seleccionan para humanización las cadenas recombinantes que contienen las regiones variables animales que producen una estructura de modelización por computadora que se aproximan más de cerca a la del anticuerpo animal.

Isotipos de Anticuerpos

En ciertas circunstancias, los anticuerpos monoclonales de un isotipo podrían ser más preferibles que los de otro en términos de su eficacia diagnóstica o terapéutica. Por ejemplo, por estudios de citólisis mediada por anticuerpos se sabe que los anticuerpos monoclonales de ratón sin modificar de los isotipos gamma-2a y gamma-3 son generalmente más eficaces en lo que se refiere al lisado de células diana que los anticuerpos del isotipo gamma-1. Se cree que esta eficacia diferencial es debida a la capacidad de los isotipos gamma-2a y gamma-3 para participar más activamente en la destrucción citolítica de las células diana. Isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal pueden prepararse en segundo lugar, a partir de un hibridoma parental que secreta anticuerpos monoclonales de isotipo diferente, por utilización de la técnica de selección de parientes para aislar variantes de cambio de clase (Steplewski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:8653,1985; Spira, et al., J. Immunol. Methods, 74:307, 1984). Así, los anticuerpos monoclonales de la invención podrían incluir variantes de cambio de clase que tengan la especificidad de uno cualquiera de los MAbs 7F3, 6C12 y 12D4.

Ensayos in vitro

Los anticuerpos monoclonales de la invención son adecuados para uso in vitro, por ejemplo, en inmunoensayos en los cuales pueden utilizarse los mismos en fase líquida o fijados a un portador en fase sólida. Los anticuerpos pueden ser útiles para monitorización del nivel de C5aR en una muestra. De manera análoga, anticuerpos antiidiotipo son útiles para medida del nivel de C5a en una muestra. Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales en

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

estos inmunoensayos pueden marcarse detectablemente de diversas maneras. Ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos monoclonales de la invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en formato directo o indirecto. Ejemplos de tales inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo sándwich (inmunométrico). La detección de los antígenos que utilizan los anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse utilizando inmunoensayos que se ejecutan en modos directo, inverso, o simultáneo, con inclusión de ensayos inmunohistoquímicos sobre muestras fisiológicas. Los expertos en la técnica conocerán, o podrán averiguar fácilmente, otros formatos de inmunoensayo sin experimentación excesiva.

Los anticuerpos de la invención pueden fijarse a muchos portadores diferentes y utilizarse para detectar la presencia de C5aR. Ejemplos de portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros portadores adecuados para fijación de anticuerpos monoclonales, o serán capaces de averiguar los mismos, utilizando experimentación de rutina.

En una realización, las células que expresan naturalmente C5aR o células que comprenden una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un C5aR o variante del mismo se utilizan en ensayos de fijación que se describen en esta memoria. Las células se mantienen en condiciones apropiadas para la expresión del receptor. Las células se ponen en contacto con un anticuerpo o fragmento en condiciones adecuadas para fijación (v.g., en un tampón de fijación adecuado), y la fijación se detecta por técnicas estándar. Para determinar la fijación, puede determinarse la extensión de fijación con relación a un control adecuado (v.g., comparada con el ruido de fondo determinado en ausencia de anticuerpo, comparada con la fijación de un segundo anticuerpo (a saber, un estándar), comparada con la fijación del anticuerpo a células no transfectadas). Una fracción celular, tal como una fracción de membrana, que contiene receptor, o liposomas que comprenden receptor pueden utilizarse en lugar de células enteras.

Pueden utilizarse también ensayos de inhibición de la fijación para identificar anticuerpos o fragmentos de los mismos que fijan C5aR e inhiben la fijación de C5a a C5aR o una variante funcional. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo de fijación en el cual se detecta o mide una reducción en la fijación de C5a (en presencia del anticuerpo), comparada con la fijación de C5a en ausencia del anticuerpo. Una composición que comprende un C5aR de mamífero aislado y/o recombinante o variante funcional del mismo puede ponerse en contacto con C5a y anticuerpo simultáneamente, o uno después del otro, en cualquier orden. Una reducción en la extensión de la fijación del ligando en presencia del anticuerpo es indicativa de inhibición de la fijación por el anticuerpo. Por ejemplo, la fijación del ligando podría disminuirse o anularse.

Están disponibles otros métodos de identificación de la presencia de un anticuerpo que fija C5aR, tales como otros ensayos de fijación adecuados, o métodos que monitorizan eventos que son desencadenados por fijación de receptores, con inclusión de la función de señalización y/o estimulación de una respuesta celular (v.g. tráfico de leucocitos). Los anticuerpos que se identifican de esta manera pueden evaluarse luego para determinar si, subsiguientemente a la fijación, los mismos actúan para inhibir otras funciones de C5aR y/o para evaluar su utilidad terapéutica.

Ensayos de señalización

La fijación de un ligando o promotor, tal como un agonista, a C5aR puede dar como resultado la señalización por este receptor acoplado a proteína G, y se estimula la actividad de las proteínas G así como otras moléculas de señalización intracelular. La inducción de la función de señalización por un compuesto (v.g., un anticuerpo o fragmento del mismo) puede monitorizarse utilizando cualquier método adecuado. Un ensayo de este tipo puede utilizarse para identificar agonistas de anticuerpos de C5aR. La actividad inhibidora de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo puede determinarse utilizando un ligando o promotor en el ensayo, y evaluando la capacidad del anticuerpo para inhibir la actividad inducida por el ligando o promotor.

La actividad de proteína G, tal como hidrólisis de GTP a GDP, o eventos de señalización posteriores desencadenados por fijación de receptores, tales como inducción de aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre intracelular (citosólico) pueden ensayarse por métodos conocidos en la técnica u otros métodos adecuados (véase, por ejemplo, Neote, K. et al., Cell, 72: 415-425,1993; Van Riper et al., J. Exp. Med.,

177: 851-856, 1993; Dahinden, C. A. et al., J. Exp. Med., 179: 751-756, 1994).

Por ejemplo, el ensayo funcional de Sledziewski et al., utilizando receptores híbridos acoplados a proteína G puede utilizarse para monitorizar la capacidad de un ligando o promotor para fijarse al receptor y activar una proteína G (Sledziewski et al., Patente U.S. No. 5.284.746).

Tales ensayos pueden realizarse en presencia del anticuerpo o fragmento del mismo a evaluar, y la capacidad del anticuerpo o fragmento para inhibir la actividad inducida por el ligando promotor se determina utilizando métodos conocidos y/o métodos descritos en esta memoria.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Quimiotaxis y Ensayos de Estimulación Celular

Pueden utilizarse también ensayos de quimiotaxis para evaluar la capacidad de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo para bloquear la fijación de un ligando C5aR y/o inhibir la función asociada con la fijación de ligando al receptor. Estos ensayos están basados en la migración funcional de células in vitro o in vivo inducida por un compuesto. La quimiotaxis puede ser evaluada por cualquier medio adecuado, por ejemplo, en un ensayo que utiliza una placa de quimiotaxis de 96 pocillos, o utilizando otros métodos reconocidos en la técnica para evaluación de la quimiotaxis. Por ejemplo, el uso de un ensayo de quimiotaxis transendotelial in vitro ha sido descrito por Springer et al. (Springer et al., WO 94/20142, publicado el 15 de septiembre de 1994; véase también Berman et al., Immunol. Invest. 17:625-677 (1988)). La migración a través del endotelio a geles de colágeno ha sido descrita también (Kavanaugh et al., J. Immunol. 146: 4149-4156 (1991)). Transfectantes estables de células (pre-B) de ratón L1-2 o de otras células hospedadoras adecuadas susceptibles de quimiotaxis pueden utilizarse en ensayos de quimiotaxis.

Generalmente, los ensayos de quimiotaxis monitorizan el movimiento direccional o migración de una célula adecuada (tal como un leucocito (v.g., linfocito, eosinófilo, basófilo)) en o a través de una barrera (v.g., endotelio, un filtro), hacia niveles incrementados de un compuesto, desde una primera superficie de la barrera hacia una segunda superficie opuesta. Las membranas o filtros proporcionan barreras convenientes, de tal modo que se monitoriza el movimiento o migración direccional de una célula adecuada hacia o a través de un filtro, hacia niveles incrementados de un compuesto, desde una primera superficie del filtro hacia una segunda superficie opuesta del filtro,. En algunos ensayos, la membrana está recubierta con una sustancia para facilitar la adhesión, tal como ICAM1, fibronectina o colágeno. Tales ensayos proporcionan una aproximación in vitro de "regreso" de los leucocitos.

Por ejemplo, es posible detectar o medir la inhibición de la migración de las células en un recipiente adecuado (un medio de contención), desde una primera cámara a o a través de una membrana microporosa a una segunda cámara que contiene un anticuerpo a ensayar, y que está separada de la primera cámara por la membrana. Se selecciona una membrana adecuada, que tiene un tamaño de poro adecuado para monitorización de la migración específica en respuesta al compuesto, con inclusión, por ejemplo, de nitrocelulosa o policarbonato. Por ejemplo, pueden utilizarse tamaños de poro de aproximadamente 3-8 micrómetros, y con preferencia aproximadamente 5-8 micrómetros. El tamaño de poro puede ser uniforme en un filtro o estar comprendido dentro de una gama de tamaños de poro adecuados.

Para evaluar la migración y la inhibición de la migración, la distancia de migración en el filtro, el número de células que atraviesan el filtro que pueden quedar adherentes a la segunda superficie del filtro, y/o el número de células que se acumulan en la segunda cámara pueden determinarse utilizando técnicas estándar (v.g., microscopía). En una realización, las células se marcan con un marcador detectable (v.g. radioisótopo, marcador fluorescente, marcador de antígeno o epítopo), y la migración puede evaluarse en presencia y ausencia del anticuerpo o fragmento por determinación de la presencia del marcador adherente a la membrana y/o presente en la segunda cámara utilizando un método apropiado (v.g., por detección de radiactividad, fluorescencia, inmunoensayo). Puede determinarse la extensión de migración inducida por un agonista de anticuerpo con relación a un control adecuado (v.g., comparada con la migración de ruido de fondo determinada en ausencia del anticuerpo, comparada con la extensión de migración inducida por un segundo compuesto (a saber, un estándar), comparada con la migración de células no transfectadas inducida por el anticuerpo). En una realización, particularmente para células T, monocitos o células que expresan C5aR, puede monitorizarse la migración transendotelial. En esta realización, se evalúa la transmigración a través de una capa de células endoteliales. Para preparar la capa de células, las células endoteliales pueden cultivarse sobre un filtro microporoso o membrana, recubierto opcionalmente con una sustancia tal como colágeno, fibronectina, u otras proteínas de la matriz extracelular, a fin de facilitar la fijación de las células endoteliales. Preferentemente, las células endoteliales se cultivan hasta que se forma una monocapa confluente.

Pueden estar disponibles una diversidad de células endoteliales de mamífero para formación de la monocapa, con inclusión, por ejemplo, de endotelio venoso, arterial o microvascular, tales como células endoteliales de la vena umbilical humana (Clonetics Corp. San Diego, Calif.). Para ensayar la quimiotaxis en respuesta a un receptor particular de mamífero, se prefieren células endoteliales del mismo mamífero; sin embargo, pueden utilizarse también células endoteliales de una especie o género de mamífero heteróloga.

Generalmente, el ensayo se realiza por detección de la migración direccional de células en o a través de una membrana o filtro, en dirección hacia los niveles aumentados de un compuesto, desde una primera superficie del filtro hacia una segunda superficie opuesta del filtro, en donde el filtro contiene una capa de células endoteliales en una primera superficie. La migración direccional ocurre desde el área adyacente a la primera superficie, a o a través de la membrana, hacia un compuesto situado en el lado opuesto del filtro. La concentración de compuesto presente en el área adyacente a la segunda superficie, es mayor que la existente en el área adyacente a la primera superficie.

En una realización utilizada para ensayar un inhibidor de anticuerpo, una composición que comprende células capaces de migración y que expresan C5aR puede ponerse en la primera cámara. Una composición que comprende uno o más ligandos o promotores capaces de inducir quimiotaxis de las células en la primera cámara (que tiene función quimioatrayente) se coloca en la segunda cámara. Preferentemente, poco antes de disponer las células en la primera cámara, o simultáneamente con las células, se dispone una composición que comprende el anticuerpo a testar, preferiblemente, en la primera cámara. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que pueden

imagen6

15

25

35

45

55

Así pues, se describe también en esta memoria un método de detección o identificación de un agente que se fija a C5aR o variante de fijación de ligando del mismo, con inclusión de ligandos, antagonistas, agonistas, y otras sustancias que se fijan a C5aR o variante funcional. De acuerdo con el método, puede combinarse un agente a testar, un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de la presente invención (v.g., un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica que es la misma que o similar a la de 7F3, y fragmentos de fijación de antígeno del mismo) y una composición que comprende un C5aR o una variante de fijación de ligando del mismo. Los componentes que anteceden se combinan en condiciones adecuadas para fijación del anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno a C5aR, y la fijación del anticuerpo o fragmento a C5aR se detecta o mide, directa o indirectamente, conforme a métodos descritos en esta memoria u otros métodos adecuados. Una disminución en la cantidad de complejo formada con relación a un control adecuado (v.g., en ausencia del agente a testar) es indicativa de que el agente se fija a dicho receptor o variante. La composición que comprende C5aR puede ser una fracción de membrana de una célula portadora de la proteína C5aR recombinante o variante de fijación de ligando de la misma. El anticuerpo o fragmento del mismo puede estar marcado con un marcador tal como un radioisótopo, marcador de espín, marcador de antígeno o epítopo, marcador enzimático, grupo fluorescente y grupo quimioluminiscente.

Modelos de Inflamación

Están disponibles modelos de inflamación in vivo que pueden utilizarse para evaluar los efectos de los anticuerpos y fragmentos de la invención in vivo como agentes terapéuticos. Por ejemplo, la infiltración de leucocitos después de inyección intradérmica de una quimiocina y un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con C5aR en un animal adecuado, tal como conejo, ratón, rata, cobayo o macaco Rhesus puede monitorizarse (véase v.g., Van Damme, J. et al., J. Exp. Med., 176: 59-65 (1992); Zachariae, C. O. C. et al., J. Exp. Med. 171: 2177-2182 (1990); Jose, P. J. et al., J. Exp. Med. 179: 881-887 (1994)). En una realización, se evalúan histológicamente biopsias de piel respecto a infiltración de leucocitos (v.g., eosinófilos, granulocitos). En otra realización, se administran al animal células marcadas (v.g., células transfectadas de manera estable que expresan C5aR) susceptibles de quimiotaxis y extravasación. Un anticuerpo o fragmento a evaluar puede administrarse, sea antes, simultáneamente a o después de administrar las células marcadas al animal de test. Una disminución de la magnitud de infiltración en presencia de anticuerpo en comparación con la magnitud de infiltración en ausencia de inhibidor es indicativa de inhibición.

Aplicaciones Diagnósticas y Terapéuticas

Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención son útiles en una diversidad de aplicaciones, que incluyen aplicaciones de investigación, diagnósticas y terapéuticas. En una realización, los anticuerpos se marcan con un marcador adecuado (v.g. marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcador isotópico, marcador antigénico o epitópico o marcador enzimático). Por ejemplo, los mismos pueden utilizarse para aislar y/o purificar un receptor o porciones del mismo, y para estudiar la estructura (v.g. conformación) del receptor y función del receptor.

Adicionalmente, los diversos anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para detectar C5aR o para medir la expresión del receptor, por ejemplo, en células T (v.g., células CD8+, células CD45RO+), monocitos y/o en células transfectadas con un gen del receptor. Así, aquéllos tienen también utilidad en aplicaciones tales como clasificación de células (v.g., citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia), para propósitos diagnósticos o de investigación.

Los anticuerpos anti-C5aR de la presente invención tienen valor en aplicaciones diagnósticas. Típicamente, los ensayos diagnósticos implican detección de la formación de un complejo resultante de la fijación de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo a C5aR. Para propósitos diagnósticos, los anticuerpos o fragmentos de fijación de antígeno pueden estar marcados o sin marcar. Los anticuerpos o fragmentos pueden marcarse directamente. Pueden emplearse una diversidad de marcadores, que incluyen, pero sin carácter limitante, radionucleidos, agentes de fluorescencia, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos y ligandos (v.g., biotina, haptenos). Numerosos inmunoensayos apropiados son conocidos por el profesional experto (véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Núms. 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654 y 4.098.876). La inmunohistoquímica de muestras de tejidos puede utilizarse también en los métodos de diagnóstico de la presente invención. Cuando están sin marcar, los anticuerpos o fragmentos pueden detectarse utilizando medios adecuados, tales como ensayos de aglutinación, por ejemplo. Los anticuerpos o fragmentos sin marcar pueden ser utilizados también en combinación con otro (a saber, uno o más) reactivo(s) adecuado(s) que pueden utilizarse para detectar un anticuerpo, tal como un anticuerpo marcado (es decir, un segundo anticuerpo) reactivo con el primer anticuerpo (v.g., anticuerpos antiidiotípicos u otros anticuerpos que son específicos para la inmunoglobulina sin marcar) u otro reactivo adecuado (v.g., proteína A marcada).

Pueden prepararse también kits para uso en la detección de la presencia de una proteína C5aR en una muestra biológica. Tales kits incluirán un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se fija a C5aR, así como uno o más reactivos auxiliares adecuados para detectar la presencia de un complejo entre el anticuerpo o fragmento y C5aR. Las composiciones de anticuerpos descritas en esta memoria pueden proporcionarse en forma liofilizada, sea solos

o en combinación con anticuerpos adicionales específicos para otros epítopos. Los anticuerpos, que pueden estar marcados o sin marcar, pueden incluirse en los kits con ingredientes adyuvantes (v.g., tampones, tales como Tris, fosfato y carbonato, estabilizadores, excipientes, biocidas y/o proteínas inertes, v.g., seroalbúmina bovina). Por ejemplo, los anticuerpos pueden proporcionarse como una mixtura liofilizada con los ingredientes adyuvantes, o los

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

ingredientes adyuvantes pueden proporcionarse por separado para combinación por el usuario. Generalmente, estos materiales adyuvantes estarán presentes en cantidades menores que aproximadamente 5% en peso basadas en la cantidad de anticuerpo activo, y usualmente estarán presentes en una cantidad total de al menos aproximadamente 0,001% en peso basada en la concentración de anticuerpo. En el caso de que se emplee un segundo anticuerpo capaz de fijarse al anticuerpo monoclonal, dicho anticuerpo puede proporcionarse en el kit, por ejemplo en un vial o recipiente separado. El segundo anticuerpo, si está presente, está marcado típicamente, y puede formularse de manera análoga con las formulaciones de anticuerpo descritas anteriormente.

De modo análogo, también se describe en esta memoria un método de detección y/o cuantificación de la expresión de C5aR por una célula, en el cual una composición que comprende una célula o fracción de la misma (v.g., fracción de membrana) se pone en contacto con un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se fija a C5aR en condiciones apropiadas para fijación al mismo del anticuerpo o fragmento, y se monitoriza la fijación. La detección del anticuerpo, indicativa de la formación de un complejo entre anticuerpo y C5aR, indica la presencia del receptor.

La fijación del anticuerpo a la célula puede detenerse como se ha descrito arriba bajo el encabezamiento "Ensayos de Fijación", por ejemplo. El método puede utilizarse para detectar la expresión de C5aR en células de un individuo (v.g., en una muestra, tal como un fluido corporal, tal como sangre, saliva u otra muestra adecuada). El nivel de expresión de C5aR en la superficie de las células T o monocitos puede determinarse también, por ejemplo, por citometría de flujo, y el nivel de expresión (v.g., intensidad de tinción) puede correlacionarse con la susceptibilidad, progreso o riesgo de enfermedad.

Los receptores quimioatrayentes actúan en la migración de los leucocitos a través del cuerpo, particularmente a sitios inflamatorios. La emigración de las células inflamatorias desde la vasculatura está regulada por un proceso de tres pasos que implica interacciones de leucocitos y proteínas de adhesión de células endoteliales y sustancias quimioatrayentes específicas y factores de activación (Springer, T. A., Cell, 76:301-314 (1994); Butcher, E. C., Cell, 67:1033-1036 (1991); Butcher, E. C. y Picker, L. J., Science (Wash. D.C.), 272:60-66 (1996)). Éstas son: (a) una interacción de afinidad baja entre la selección de leucocitos y carbohidratos de células endoteliales; (b) una interacción de afinidad alta entre receptores quimioatrayentes de leucocitos y factores quimioatrayentes/activadores; y (c) una fijación fuerte entre las integrinas leucocitarias y proteínas de adhesión de células endoteliales de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Subconjuntos de leucocitos diferentes expresan repertorios diferentes de selectinas, receptores de quimioatrayentes e integrinas. Adicionalmente, la inflamación altera la expresión de proteínas de adhesión endoteliales y la expresión de factores de activación quimioatrayentes y leucocitos. Como consecuencia, existe una gran diversidad para regulación de la selectividad del reclutamiento de leucocitos a sitios extravasculares. El segundo paso es crucial en el sentido de que se cree que la activación de los receptores quimioatrayentes de leucocitos causa la transición desde el balanceo celular mediado por selectinas a la fijación fuerte mediada por integrinas. Esto da como resultado que los leucocitos estén listos para transmigrar a sitios perivasculares. La interacción quimioatrayente/receptor del quimioatrayente es crucial también para la migración transendotelial y localización en un tejido (Campbell, J.J., et al., J. Cell Biol., 134: 255-266 (1996); Carr, M.W., et al., Immunity, 4: 179-187 (1996)). Esta migración está dirigida por un gradiente de concentración del quimioatrayente que se dirige hacia el foco de inflamación.

C5aR tiene un papel importante en el tráfico de leucocitos. Es probable que C5aR sea un receptor de quimioatrayentes fundamental para neutrófilos, eosinófilos, células T o subconjunto de células T o migración de los monocitos a ciertos sitios de inflamación, y por tanto puedan utilizarse mAbs anti-C5aR para inhibir (reducir o prevenir) la migración de leucocitos, particularmente la asociada con lesiones de tejido neutrófilo tales como lesión de reperfusión e ictus, disfunción de las células T, tal como enfermedad autoinmune, o reacciones alérgicas o con trastornos mediados por monocitos tales como ateroesclerosis.

De acuerdo con ello, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención pueden utilizarse también para modular la función de receptores en aplicaciones de investigación y terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos funcionales descritos en esta memoria pueden actuar como inhibidores para inhibir (reducir o prevenir)

(a) la fijación (v.g., de un ligando, un inhibidor o un promotor) al receptor, (b) una función de señalización de receptores, y/o (c) una función estimuladora. Los anticuerpos que actúan como inhibidores de la función de receptores pueden bloquear la fijación de ligandos o promotores directa o indirectamente (v.g. por causar un cambio de conformación). Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir la función de receptores por inhibición de la fijación de un ligando, o por desensibilización (con o sin inhibición de la fijación de un ligando). Los anticuerpos que se fijan a un receptor pueden actuar también como agonistas de la función del receptor, desencadenando o estimulando una función de receptor, tal como una señalización y/o función estimuladora de un receptor (v.g., tráfico de leucocitos) por fijación al receptor.

Así, también se describe en esta memoria un método de inhibición del tráfico de leucocitos en un mamífero (v.g. un paciente humano), que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención. También se describe un método de inhibición de otros efectos asociados con la actividad de C5aR tales como migración de histamina por basófilos y liberación de gránulos por eosinófilos, basófilos y neutrófilos. La administración de un anticuerpo o fragmento de la presente invención puede dar como resultado mejora o eliminación del estado de enfermedad.

imagen7

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

productos de inmunoglobulinas utilizados para tratamientos profilácticos o terapéuticos. Los anticuerpos o fragmentos de la presente invención pueden utilizarse como composiciones administradas por separado dadas en conjunción con antibióticos y/o agentes antimicrobianos.

Se administra una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento (es decir, uno o más anticuerpos o fragmentos). Una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para alcanzar el efecto terapéutico deseado (con inclusión del efecto profiláctico), en las condiciones de administración, tal como una cantidad suficiente para inhibición de una función de C5aR, y por tanto, la inhibición de una respuesta inflamatoria.

Son posibles una diversidad de rutas de administración que incluyen, pero sin carácter necesariamente limitante, la administración oral, dietética, tópica, parenteral (v.g., intravenosa, intraarterial, intramuscular, inyección subcutánea), inhalación (v.g., inhalación intrabronquial, intraocular, intranasal u oral, gotas intranasales), dependiendo de la enfermedad o afección a tratar. Otros métodos adecuados de administración pueden incluir también dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos polímeros de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse también como parte de una terapia de combinación con otros agentes.

La formulación de un anticuerpo o fragmento a administrar variará conforme a la ruta de administración y la formulación (v.g., solución, emulsión, cápsula) seleccionada. Una composición farmacéutica apropiada que comprende un anticuerpo o fragmento funcional del mismo a administrar puede prepararse en un vehículo o portador fisiológicamente aceptable. Puede utilizarse también una mixtura de anticuerpos y/o fragmentos. Para soluciones o emulsiones, portadores adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólico/acuosas, con inclusión de solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer's lactados o aceites fijos.

Una diversidad de portadores acuosos apropiados son conocidos por el profesional experto, que incluyen agua, agua tamponada, solución salina tamponada, polioles (v.g., glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido), solución de dextrosa y glicina. Vehículos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservantes, o restablecedores de fluidos, nutrientes o electrólitos (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Science, Edición 16ª, Mack editores, 1980). Las composiciones pueden contener opcionalmente sustancias adyuvantes farmacéuticamente aceptables en caso requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y agentes tampón así como agentes de ajuste de la toxicidad, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio. Los anticuerpos y fragmentos de esta invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su utilización conforme a métodos de liofilización y reconstitución conocidos en la técnica. La concentración óptima del o los ingredientes activos en el medio seleccionado puede determinarse empíricamente, conforme a procedimientos bien conocidos por el profesional experto, y dependerá de la formulación farmacéutica final deseada. Para inhalación, el anticuerpo o fragmento puede solubilizarse y cargarse en un dosificador adecuado para administración (v.g., un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosoles presurizados).

Los intervalos de dosificación para la administración de los anticuerpos monoclonales de la invención son aquéllos que son suficientemente amplios para producir el efecto deseado en el cual se mejoran los síntomas de la enfermedad inmunopatológica o se reduce la posibilidad de infección o sobre-estimulación del sistema inmunitario.

La dosificación no debería ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardiaca congestiva, y análogos. Generalmente, la dosificación variará con la edad, la afección, el sexo y la extensión de la enfermedad en el paciente y puede ser determinada por una persona con experiencia en la técnica. La dosificación puede ser ajustada por el médico individual en el supuesto de cualquier complicación. La dosificación puede variar desde aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, con preferencia desde aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, con gran preferencia desde aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones diarias, durante uno o varios días.

Será apreciado por los expertos en la técnica que los anticuerpos de la presente invención pueden introducirse en un individuo por administración de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el anticuerpo. La molécula de ácido nucleico puede encontrarse en la forma de DNA o RNA o una molécula quimérica que comprende a la vez DNA o RNA. Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo puede clonarse en un vector de expresión en el que la secuencia de codifica el agente está ligado operativamente a elementos de control de la expresión. Los elementos de control de la expresión son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, promotores, intensificadores y codones de comienzo y parada apropiados.

Pueden utilizarse una diversidad de métodos para introducir un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en una célula diana in vivo. Por ejemplo, el ácido nucleico desnudo puede inyectarse en el sitio diana, puede encapsularse en liposomas, o puede ser introducido por un vector viral.

La inyección directa de una molécula de ácido nucleico sola o encapsulada, por ejemplo, en liposomas catiónicos puede utilizarse para transferencia estable de genes de un ácido nucleico que codifica TSP-1 en células que se encuentran o no en división in vivo (Ulmer et al., Science 259: 1745-1748 (1993)). Adicionalmente, el ácido nucleico

10

15

20

25

30

35

40

45

50

puede transferirse a una diversidad de tejidos in vivo utilizando el método de bombardeo de partículas (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726-2730 (1991)).

Los vectores virales son útiles para la transferencia de genes de moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo a un tipo de célula específico in vivo. Los virus son agentes infecciosos especializados que pueden infectar y propagarse en tipos de células específicos y propagarse en ellas. Esta especificidad para infectar tipos de células particulares es especialmente adecuada para direccionamiento del anticuerpo a las células seleccionadas in vivo. La sección de un vector viral dependerá, en parte, del tipo de célula a direccionar.

Vectores virales especializados son bien conocidos en la técnica y pueden direccionarse a tipos de células específicos. Tales vectores incluyen, por ejemplo, vectores virales recombinantes adeno-asociados que tienen promotores generales la ventaja añadida de que el virus recombinante puede integrarse de manera estable en la cromatina o incluso ... no proliferantes en reposo (Ledkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3988-3996 (1988)).

Pueden construirse vectores virales para controlar adicionalmente el tipo de célula que expresa el anticuerpo codificado por incorporación de un promotor o intensificador específico de tejido en el vector (Dai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895 (1992)).

Los vectores retrovirales son adecuados también para los métodos de suministro de moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo in vivo. Tales vectores pueden construirse sea para funcionar como partículas infecciosas o como partículas no infecciosas que sufren únicamente una sola tanda de infección inicial.

Pueden utilizarse también enfoques de suministro de DNA mediados por receptores para suministrar una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo en una célula de una manera específica de tejido utilizando un ligando específico de tejido o un anticuerpo que está complejado de modo no covalente con la molécula de ácido nucleico por una molécula formadora de puente (Currier et al., Hum. Gene Ther, 3:147-154 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem.

262: 4429-4432 (1987)).

La transferencia de genes para obtener la expresión del anticuerpo en un individuo puede realizarse también mediante, por ejemplo, transfección ex vivo de células autólogas. Las células adecuadas para dicha transferencia ex vivo incluyen células de la sangre, dado que estas células son fácilmente accesibles para manipulación y reintroducción de nuevo en el individuo por métodos bien conocidos en la técnica.

La transferencia de genes por transfección de células ex vivo puede realizarse por una diversidad de métodos, que incluyen, por ejemplo, precipitación con fosfato de calcio, dietilaminoetil-dextrano, electroporación, lipofección, o infección viral. Tales métodos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbour Laboratory Press (1989)). Una vez que se transfectan las células, las mismas se trasplantan luego o se injertan de nuevo en un individuo a tratar. Las células una vez introducidas en el cuerpo pueden producir el anticuerpo, el cual puede entrar en la circulación e inhibir la agregación plaquetaria en el sitio de la enfermedad o afección.

A lo largo de esta memoria descriptiva, el término "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende(n)", se entenderá que implican la inclusión de un elemento, número entero o paso establecido, o grupo de elementos, números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

En la presente invención se ilustrará a continuación por los ejemplos que siguen, que no deben interpretarse como limitantes en modo alguno.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

Materiales y Métodos

1.

Producción de anticuerpos monoclonales y citometría de flujo

Los anticuerpos monoclonales (MAbs) reactivos con C5aR se generaron por inmunización de ratones C57BL/6 con 107 células L1.2 transfectadas con C5aR [8], intraperitonealmente, 5 a 6 veces a intervalos de dos semanas. La inmunización final se inyectó por vía intravenosa. Cuatro días después, se extirpó el bazo y las células se fusionaron con el linaje de células SP2/0 como se ha descrito [9]. Los MAbs reactivos con C5aR se identificaron utilizando células L1.2 transfectadas con C5aR y células L1.2 no transfectadas, o células L1.2 transfectadas con receptores no afines tales como CXCR2 o CX3CR1 (V28) utilizando tinción inmunofluorescente y análisis utilizando un FACScan® (Becton Dickinson & CO., Mountain View, CA). La tinción MAb de las células se realizó utilizando procedimientos estándar, como se ha descrito previamente [10].

2.

Ensayo de fijación de ligandos

Se obtuvo C5a humano recombinante de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). C5a del complemento marcado con 125I-Bolton-Hunter se adquirió de NEN-Dupont (Boston, MA), con una actividad específica de 2200 Ci/mM. La fijación

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de C5a a los transfectantes L1.2 C5aR se llevó a cabo como se ha descrito previamente [9, 11]. Resumidamente, las células se lavaron una sola vez en PBS y se resuspendieron en tampón de fijación (Hepes 50 mM, pH 7,5, CaCl 1 mM, MgCl2 5 mM, 0,5% BSA y 0,05% azida) a una concentración de 107/ml). Se dispensaron partes alícuotas de 50 ml (5 x 105 células) en tubos de microcentrífuga, seguido por la adición de competidor frío y 1 nM de C5a radiomarcado. El volumen de reacción final era 200 μL. Después de una incubación de 60 min a la temperatura ambiente, las células se lavaron 3 veces con 1 mL de tampón de fijación que contenía NaCl 0,5 M. Los sedimentos de células se sometieron luego a recuento. Se obtuvo la fijación de ruido de fondo por incubación de células C5a radiomarcado y al menos un exceso de 400 veces de C5a sin marcar. Se utilizaron duplicados a lo largo de los experimentos y las detecciones estándar eran siempre < 10% del valor medio.

3.

Ensayo de quimiotaxis de transfectantes

Las células L1.2 transfectadas con C5aR se centrifugaron y se lavaron en medio de migración (MM = RPMI 1640, 0,5% BSA) y se resuspendieron a 107 células/ml. Las inserciones de cultivo de tejido (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) se pusieron en cada uno de los pocillos de placas de cultivo de tejido de 24 pocillos, formando una cámara superior e inferior separada por una membrana de poli(etileno-tereftalato) que contenía poros de 3 mm de diámetro. Se añadió C5a quimiotáctico (diluido en medio de ensayo) a 600 μL de medio de ensayo en las placas de cultivo de tejido de 24 pocillos para una concentración final de 1 nM. Un millón de células en 100 μL se preincubaron durante 30 min con los sobrenadantes de los hibridomas que contenían el anticuerpo. La mixtura células-sobrenadante de MAb purificado se añadió a la cámara superior de los pocillos y las células se dejaron migrar a su través a la cámara interior en una incubadora con 5% de CO2 a 37ºC durante 18 horas. Las inserciones se eliminaron después de la migración y las células se contaron mediante el FACScan®. Se obtuvieron los recuentos relativos de células por adquisición de los eventos durante un periodo de tiempo fijado de 30 segundos. Se encontró que el método era altamente reproducible, y hacía posible la discriminación de los leucocitos y la exclusión de residuos.

4.

Ensayos de quimiotaxis de los neutrófilos

Preparación de las células: los neutrófilos se aislaron de la sangre periférica por obtención en primer lugar de la fracción de leucocitos por un paso de sedimentación en dextrano durante 40 min a la temperatura ambiente. Las células se estratificaron luego en Ficoll-Paque (Amersham Biosciences) para centrifugación en gradiente de densidad a 2500 rpm durante 15 min a la temperatura ambiente. Después de la lisis hipotónica de células de glóbulos rojos residuales, los neutrófilos se resuspendieron en volúmenes iguales de RPMI 1640 (Invitrogen Inc.), M199 (Invitrogen Inc.) y 2% FCS (Hyclone).

Ensayo de quimiotaxis: se añadieron MAbs anti-C5aR, 6C12, 7F3 y 12D4 a neutrófilos (1 x 107/ml) a concentraciones comprendidas entre 0,5 y 10 μg/ml. Las células se cargaron luego en la capa superior de inserciones de 24 pocillos (Corning Inc., NY) con una membrana de policarbonato de porosidad 3,0 μm y se incubaron durante 10 min a la temperatura ambiente. Las inserciones se pusieron luego en cámaras inferiores que contenían quimioatrayentes de neutrófilos humanos tales como C5a (0,1 a 100 nM) e IL-8 (ambos de 1,12 ng/ml a 11,2 μg/ml). Los extractos se incubaron luego durante 30 min a 37ºC. El número de neutrófilos que migraban a través de la membrana a la cámara inferior se cuantificó por citometría de flujo (FACSCalibur; BC Biosciences).

5.

Ensayo de Inhibición Competitiva

Se añadieron MAbs anti-C5aR a 50 μg/ml, a un péptido C5aR N-terminal producido por síntesis (residuos 9-29) conocido como "PEPI" (procedencia biológica: Eldridge) a concentraciones comprendidas entre 1 y 100 μm. Células L1.2 de ratón transfectadas con el receptor de C5a humano y resuspendidas en seroalbúmina bovina al 1% (BSA; GibcoBRL) (1 x 107/ml) se añadieron luego para dar un volumen total de 100 μL. . Las células se incubaron durante 30 min a 4ºC y se lavaron una sola vez con BSA al 0,1%. Se utilizó IgG anti-ratón de oveja conjugado con fluoresceína (FITC), F(ab')2 (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.) como Ab secundario (1:200) y se incubó durante 15 min a 4ºC, seguido por un paso de lavado adicional con 0,1% BSA. Las células se resuspendieron en 0,1 BSA y se analizaron por citometría de flujo.

6.

Ensayos ELISA

Los ELISAs se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Unidzel 2.1) (Editado por J.F. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.B. Margulies, E.M. Shevach y W. Strober), John Wiley and Sons, Nueva York. Resumidamente, placas ELISA de 96 pocillos con fondo plano (Maxisorp; Nunc) se recubrieron con un μg/ml de proteína (PEPI u OPG) en PBS a 37ºC durante 1 hora, y se bloquearon luego con BSA a 4ºC durante una noche. Las placas se lavaron luego, se incubaron con anticuerpo, se lavaron y se incubaron con anticuerpo IgG anti-ratón de oveja conjugado con peroxidasa. El sustrato utilizado era el reactivo sustrato TMB (PharMingen).

EJEMPLO 1: Producción de MAb y citometría de flujo

Transfectantes L1.2 que expresaban niveles altos de C5aR [8] se utilizaron para inmunizar ratones, y se identificaron 10 MAbs por citometría de flujo que reaccionaban específicamente con las células L1.2 transfectadas con C5aR, pero no con células L1.2 transfectadas con CX3CR1 (V28) o CXCR2. Estos 10 MAbs se designaron

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La Figura 1 es un conjunto de histogramas que muestran que MAb 7F3 reacciona con los transfectantes C5aR (L1.2C5aR) y con los neutrófilos humanos pero no con células transfectadas con CX3CR1 (L1.2 V28) o con células transfectadas con CXCR2 (L1.2 CXCR2). Estos resultados de MAb 7F3 son representativos de los 10 MAbs identificados.

EJEMPLO 2: Inhibición de la fijación de C5a a células transfectadas con C5aR

La capacidad de los MAbs para inhibir la fijación de C5a marcado con 125I a los transfectantes C5aR se ensayó. La Figura 2 muestra que MAb 7F3 inhibía completamente la fijación de C5a marcado con 125I a los transfectantes, y que esta inhibición era mayor que la obtenida con C5a 400 nM frío. Esto indica que MAb 7F3 es capaz de bloquear completamente la fijación de C5a a C5aR. Los MAbs 6C12 y 12D4 exhibían también una inhibición sustancial de la fijación de C5a marcado con 125I a los transfectantes C5aR. La inhibición de respuesta a la dosis de la fijación de C5a a los transfectantes C5aR por MAb 7F3 se muestra en la Figura 3.

EJEMPLO 3: Inhibición de la migración de los transfectantes C5aR dirigida por C5a humano por MAb 7F3

Se realizaron experimentos de quimiotaxis como se ha descrito arriba utilizando células L1.2 transfectadas con C5aR. La Figura 4 muestra que los MAbs 7F3, 6C12 y 12D4 inhibían completa o sustancialmente la quimiotaxis de las células C5aR-L1.2 a C5a. La Figura 5 muestra la inhibición de la respuesta a la dosis de la quimiotaxis de las células C5aR-L1.2 a C5a por mAb 7F3.

EJEMPLO 4: Inhibición de la migración de los neutrófilos dirigida por C5a humano por MAb 7F3

Se dializaron MAbs anti-C5aR en 1 x PBS (5BRL), y los MAbs 7F3 tanto dializados como no dializados se añadieron a neutrófilos (1 x 107/ml a 5 μg/ml). Se incluyen controles negativos (sin adición alguna de Ab, y con adición de 1 x PBS). Las células se cargaron luego en la cámara superior de inserciones de 24 pocillos (Corning Inc., NY) una membrana de policarbonato de porosidad 3,0 μm y se incubaron durante 10 min a la temperatura ambiente. Las inserciones se pusieron luego en cámaras inferiores que contenían el C5a quimioatrayente de los neutrófilos humanos (0,1 a 100 nM). Los neutrófilos se incubaron luego durante 30 min a 37ºC. El número de neutrófilos que migraban a través de la membrana a la cámara inferior se cuantificó por citometría de flujo (FACSCalibur; BD Biosciences).

La Figura 6 muestra que la adición de MAb 7F3 (dializado o no dializado) daba como resultado la inhibición de la dilución de los neutrófilos comparada con los dos controles negativos.

EJEMPLO 5: Inhibición de la migración de los neutrófilos dirigida por C5a humano por MAbs 7F3, 6C12 y 12D4

Los tres MAbs anti-C5aR, 7F3, 12D4, y 6C12 se añadieron a neutrófilos (1 x 107/ml) a razón de 5 μg/ml. Se incluyeron controles negativos (sin adición alguna de Ab, y con adición de 1 x PBS). Las células se cargaron luego en la cámara superior de inserciones de 24 pocillos (Corning Inc., NY) con una membrana de policarbonato de porosidad 3,0 μm y se incubaron durante 10 min a la temperatura ambiente. Las inserciones se pusieron luego en cámaras inferiores que contenían el quimioatrayente de los neutrófilos humanos C5a (0,11 a 1120 ng/ml). Los neutrófilos se incubaron luego durante 30 min a 37ºC. El número de neutrófilos que migraba a través de la membrana a la cámara inferior se cuantificó por citometría de flujo; (FACSCalibur; BD Biosciences).

Los resultados presentados en la Figura 7 demuestran que los 3 MAbs exhibían inhibición de la migración de neutrófilos hacia C5a comparados con los dos controles negativos. En particular, el MAb 7F3 exhibía la inhibición más eficaz, dando como resultado una reducción de 140 veces en los números de migración de neutrófilos respecto a los niveles de ruido de fondo.

EJEMPLO 6: Inhibición de la migración de neutrófilos dirigida por IL-8 humano por los MAbs 7F3, 12D4 y 6C12

Los tres 3MABS anti-C5aR, 7F3, 12D4 y 6C12; y la muestra dializada de 7F3 se añadieron a neutrófilos purificados (1 × 107/ml) a 5 µg/ml y se cargaron en la cámara superior de inserciones de 24 pocillos. Se incluyeron nuevamente controles negativos (sin adición alguna de Ab, y con adición de 1x PBS). Después de 10 minutos de incubación a la temperatura ambiente, se pusieron luego las inserciones en cámaras inferiores que contenían IL-8 (1,12 a 1120 ng/ml), un quimioatrayente de neutrófilos humanos que fija los receptores CXCR1 y CXCR2 expresados en la superficie de los neutrófilos. Los neutrófilos se incubaron luego durante 30 minutos a 37° de. El número de neutrófilos que migraban a través de la membrana a la cámara inferior se cuantificó por citometría de flujo (FACSCalibur; BD Biosciences).

La Figura 8 (a) muestra que los tres MAbs exhibían inhibición de la migración de neutrófilos hacia IL-8. MAb 7F3 (tanto dializado como no dializado) era el inhibidor más eficaz, dando como resultado una reducción de 5 veces en los números de migración de neutrófilos.

Se testó también MAb 7F3 respecto a su capacidad para inhibir otros quimioatrayentes de neutrófilos, particularmente los ligandos CXCR1 y CXCR2. La Tabla 1 muestra la inhibición sustancial de la migración de

imagen8

12D4: IgG3 de cadena pesada

Se aisló el RNA total de las células de hibridoma utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Cat. No. 15.596-018). Se aisló el RNA como se describe por el fabricante. De manera resumida, se lisaron aproximadamente 5 × 106 células en 1 ml de reactivo Trizol. Los residuos celulares se aclararon con 200 μ de cloroformo y centrifugación. La capa

5 acuosa que contenía RNA se separó y el RNA se precipitó con 250 μ de isopropanol.

Se utilizó el RNA total (2μg) para producir cDNA utilizando la transcriptasa inversa AMV (Promega Cat. No. M5101). El cDNA se utilizó luego como molde para amplificar la secuencia codificante de la región variable utilizando los cebadores siguientes:

Cebadores para la cadena ligera variable de 6C12:

10 mIgkapFR15': GATGTTTTGATGACCCAAACTCC (SEQ ID NO:2) mIgkapcon3': ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (SEQ ID NO:3)

Cebadores para la cadena pesada variable de 6C12:

15 mIgVh2 5' SAGGTCCAGCTGCARCAGTC (SEQ ID NO:4) Familia FR1 VhIIA mIgG3con3' TGGGCATGAAGAACCTGG (SEQ ID NO:5) Región bisagra

Cebadores para la cadena ligera variable de 7F3:

20 mIgkapFR15': GATGTTTTGATGACCCAAACTCC (SEQ ID NO:6) mIgkapcon3': ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (SEQ ID NO:7)

Cebadores para la cadena pesada variable de 7F3:

25 mIgVh2 5': SAGGTCCAGCTGCARCAGTC (SEQ ID NO:8) Familia FR1 VhIIA mIgG2acon3': TTTGCATGGAGGACAGGG (SEQ ID NO:9)

Cebadores para la cadena ligera variable de 12D4:

30 mIgkapFR15': GATGTTTTGATGACCCAAACTCC (SEQ ID NO:10) mIgkapcon3': ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (SEQ ID NO 11)

Cebadores para la cadena pesada variable de 12D4 :

35 mIgVh1 5': CAGGTGCAGCTGAAGSAGTC (SEQ ID NO:12) Familia FR1 VhIB mIgG3con3': TGGGCATGAAGAACCTGG (SEQ ID NO:13) Región bisagra

Se llevó a cabo la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando la polimerasa Pfu de alta fidelidad (Promega 40 Cat. No. M7741) con una temperatura de reasociación de 60 ºC y una extensión de cebadores a 72 ºC durante 3 minutos. El fragmento PCR de aproximadamente 700 pares de bases resultante se clonó en pGEM-Teasy (Promega

Cat. No. A1360). Las colonias simples se aislaron y se secuenciaron por medio de secuenciación (SUPAMAC).

Las secuencias resultantes se proporcionan a continuación como sigue:

45 Secuencia variable de cadena ligera (DNA) de 6C12: SEQ ID NO:14 Secuencia variable de cadena ligera (proteína) de 6C12: SEQ ID NO:15 Secuencia variable de cadena pesada (DNA) de 6C12: SEQ ID NO: 16 Secuencia variable de cadena pesada (proteína) de 6C12: SEQ ID NO:17

50 Secuencia variable de cadena ligera (DNA) de 7F3: SEQ ID NO:18 Secuencia variable de cadena ligera (proteína) de 7F3: SEQ ID NO:19 Secuencia variable de cadena pesada (DNA) de 7F3: SEQ ID NO:20 Secuencia variable de cadena pesada (proteína) de 7F3: SEQ ID NO:21 Secuencia variable de cadena ligera (DNA) de 12D4: SEQ ID NO:22

55 Secuencia variable de cadena ligera (proteína) de 12D4: SEQ ID NO:23 Secuencia variable de cadena pesada (DNA) de 12D4: SEQ ID NO:24 Secuencia variable de cadena pesada (proteína) de 12D4: SEQ ID NO:25

un equipo comercial de

imagen9

imagen10

7. Morgan, E.L. et al., Anti-C5a receptor antibodies. Characterization of neutralizing antibodies specific for a peptide, C5aR-(9-29), derived from the predicted amino-terminal sequence of the human C5a receptor. Journal of Immunology, 1993. 151(1): págs. 377-88.

8. Campbell, J.J. et al., Biology of chemokine and classical chemoattractant receptors: differential requirements for 5 adhesion-triggering versus chemotactic responses in lymphoid cells. J Cell Biol, 1996. 134(1): págs. 255-66.

9.

Heath, H. et al., Chemokine receptor usage by human eosinophils. The importance of CCR3 demonstrated using an antagonistic monoclonal antibody. J Clin Invest, 1997. 99(2): págs. 178-84.

10.

Ponath, P.D. et al., Molecular cloning and characterization of a human eotaxin receptor expressed selectively on eosinophils [véanse los comentarios]. J Exp Med, 1996. 183(6): págs. 2437-48.

10 11. Ponath, P.D. et al., Cloning of the human eosinophil chemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils. J Clin Invest, 1996. 97(3): págs. 604-12.

Claims (1)

1. imagen1