JP4559081B2 - 抗C5aR抗体及びその使用 - Google Patents
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Description
配列番号1 ヒトC5aRタンパク質配列
配列番号2 6C12可変軽鎖用のPCRプライマー
配列番号3 6C12可変軽鎖用のPCRプライマー
配列番号4 6C12可変重鎖用のPCRプライマー
配列番号5 6C12可変重鎖用のPCRプライマー
配列番号6 7F3可変軽鎖用のPCRプライマー
配列番号7 7F3可変軽鎖用のPCRプライマー
配列番号8 7F3可変重鎖用のPCRプライマー
配列番号9 7F3可変重鎖用のPCRプライマー
配列番号10 12D4可変軽鎖用のPCRプライマー
配列番号11 12D4可変軽鎖用のPCRプライマー
配列番号12 12D4可変重鎖用のPCRプライマー
配列番号13 12D4可変重鎖用のPCRプライマー
配列番号14 6C12可変軽鎖(DNA)配列
配列番号15 6C12可変軽鎖(タンパク質)配列
配列番号16 6C12可変重鎖(DNA)配列
配列番号17 6C12可変重鎖(タンパク質)配列
配列番号18 7F3可変軽鎖(DNA)配列
配列番号19 7F3可変軽鎖(タンパク質)配列
配列番号20 7F3可変重鎖(DNA)配列
配列番号21 7F3可変重鎖(タンパク質)配列
配列番号22 12D4可変軽鎖(DNA)配列
配列番号23 12D4可変軽鎖(タンパク質)配列
配列番号24 12D4可変重鎖(DNA)配列
配列番号25 12D4可変重鎖(タンパク質)配列
配列番号26 7F3可変重鎖CDR1ループ
配列番号27 7F3可変重鎖CDR2ループ
配列番号28 7F3可変重鎖CDR3ループ
配列番号29 6C12可変重鎖CDR1ループ
配列番号30 6C12可変重鎖CDR2ループ
配列番号31 6C12可変重鎖CDR3ループ
配列番号32 12D4可変重鎖CDR1ループ
配列番号33 12D4可変重鎖CDR2ループ
配列番号34 12D4可変重鎖CDR3ループ
ヒトC5aRのアミノ酸配列は配列番号1に示す。
このヒトC5aRの各種ドメインは以下のように定義する:
アミノ酸1−37 細胞外ドメインN末端
アミノ酸38−61 膜貫通ドメイン
アミノ酸62−71 細胞内ドメイン
アミノ酸72−94 膜貫通ドメイン
アミノ酸95−110 細胞外ドメイン−細胞外ループ1
アミノ酸111−132 膜貫通ドメイン
アミノ酸133−149 細胞内ドメイン
アミノ酸150−174 膜貫通ドメイン
アミノ酸175−206 細胞外ドメイン−細胞外ループ2
アミノ酸207−227 膜貫通ドメイン
アミノ酸228−242 細胞内ドメイン
アミノ酸243−264 膜貫通ドメイン
アミノ酸265−283 細胞外ドメイン−細胞外ループ3
アミノ酸284−307 膜貫通ドメイン
アミノ酸308−350 細胞内ドメイン−C末端
微生物寄託の説明
7F3と呼称するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ECACCに2000年11月6日付けで受託番号00110609として寄託された。
6C12(6C12 M12)と呼称するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ECACCに2002年9月2日付けで受託番号02090226として寄託された。
12D4(12D4−P9)と呼称するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ECACCに2002年9月2日付けで受託番号02090227として寄託された。
7F3、6C12及び12D4と呼称するC5aRに特異的なマウスモノクローナル抗体は、本明細書に記載されているとおり、本発明者らによって得られたものである。驚いたことに、これらのモノクローナル抗体(Mab)は、C5aRへのC5aの結合を実質的に又は完全に遮断することができる。特に、モノクローナル抗体7F3は完全に中和するものである。
(1)Fab、抗体分子の1価抗原結合性フラグメントを含有するこのフラグメントは、酵素パパインにより全抗体を消化することによって生成され、完全な軽鎖と1本の重鎖の一部が得られる
(2)Fab’、抗体分子のこのフラグメントは、ペプシンで完全抗体を処理し、続いて還元することにより得られ、完全な軽鎖と重鎖の一部が得られる。抗体一分子当たり2個のFab’フラグメントが得られる
(3)(Fab’)2、抗体のこのフラグメントは、酵素ペプシンで完全抗体を処理するが、その後還元を行わないことにより得られる。F(ab)2は、2個のジスルフィド結合により互いに結合されている2個のFab’フラグメントからなる二量体である
(4)Fv、2本の鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子組換えフラグメントとして定義される
(5)一本鎖抗体(「SCA」)、遺伝学的に結合された一本鎖分子としての、好適なポリペプチドリンカーによって結合されている軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する遺伝子組換え分子として定義される。
本発明の抗体は、ヒト化抗体、すなわち、ヒト抗体の含量を最大限にし、一方、マウス抗体の可変領域による結合能がほとんどあるいは全く生じない、分子モデリング技術によって作製された抗体であることが好ましい。したがって、一実施形態では、本発明は、ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列と、ヒト抗体由来の定常領域のアミノ酸配列とを含み、7F3、6C12又は12D4などのマウスモノクローナル抗体由来の超可変領域をヒト化又は非免疫原性とするキメラ抗体を提供する。
ヒト化される動物モノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は、アライメントを行って配列比較されるのが好適であり、好ましくは、すべての既知のヒト抗体重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と比較する。
次いで、周知のヒト抗体鎖配列について、未確認の残基及び/又は不確定性の存在を評価する。前記不確定性は配列不確実性である。最も多く共通するかかる不確実性は、シーケンシング法の実施時にアンモニアが消失することによりアミドアミノ酸についての酸性アミノ酸の同定に誤りが生じるものであり、例えば、タンパク質中に実際に存在する残基がグルタミン残基であった場合の、グルタミン酸残基の同定における誤りである。他のすべての因子が等しい場合、かかる不確定性をほとんど持たないヒト抗体鎖をできるだけ選択することが望ましい。
抗体鎖可変領域は、ドメイン内ジスルフィド架橋を有している。これらの架橋を含むシステイン残基間の距離(残基数)をピン領域間隔と称する[Chothia et al、J.Mol.Biol.196:901(1987)]。他のすべての因子が等しい場合、選択するヒト抗体のピン領域間隔は、動物抗体のものに類似しているか、又は同じであることが最も望ましい。さらに、コンピュータモデリングを容易にするために、ヒト配列のピン領域間隔が、公知の抗体の三次元構造のものに類似していることが望ましい。
2種類のタイプの潜在的可変領域残基を動物抗体配列で評価する。そのうちの第1の残基は「最小残基(minimal residues)」と呼ばれる。これらの最小限の残基は、CDR構造ループと、コンピュータモデリングによって示した場合に、CDR構造ループを支え、かつ/又は配列させるのに必要な任意の追加残基とを含む。
潜在的可変領域残基を同定するために、(a)ヒト化しようとする動物抗体の可変領域配列、(b)選択したヒト抗体フレームワーク配列、ならびに(c)種々の最小及び最大動物抗体残基が移植されているヒト抗体フレームワーク配列を含むすべての可能性ある組換え抗体において実施した。
ある状況下では、ある種のアイソタイプのモノクローナル抗体は、それらの診断又は治療効果の点で他の抗体の効果よりも好適であり得る。例えば、抗体媒介性細胞溶解に関する研究から、ガンマ−2a及びガンマ−3アイソタイプの未改変マウスモノクローナル抗体は、一般に、ガンマ−1アイソタイプの抗体よりも標的細胞を溶解するのに有効であることが知られている。この効果の差異は、ガンマ−2a及びガンマ−3アイソタイプが、より活性的に標的細胞の細胞溶解による破壊に関与する能力を有することに基づいていると考えられる。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、クラススイッチ変異体を単離するための同胞選抜技術を用いることにより、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製することができる(Steplewski,et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:8653, 1985;Spira,et al.、J.Immunol.Methods, 74:307, 1984)。したがって、本発明のモノクローナル抗体には、モノクローナル抗体7F3、6C12及び12D4のうちのいずれか1種の特異性を有するクラススイッチ変異体が含まれ得る。
本発明のモノクローナル抗体は、in vitroにおける使用、例えば、抗体を液相中で利用し得る、あるいは固相単体に結合し得るイムノアッセイに好適である。本抗体は、サンプル中のC5aRの濃度をモニターするのに有用であり得る。同様に、抗イディオタイプ抗体は、サンプル中のC5aの濃度を測定するのに有用である。さらに、これらのイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は、検出可能なように種々の方法で標識することができる。本発明のモノクローナル抗体を利用可能なイムノアッセイのタイプの例としては、直接又は間接形式の競合イムノアッセイ及び非競合イムノアッセイがある。かかるイムノアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ(RIA)及びサンドイッチ(免疫定量)アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、前モード、逆モード、又は同時モードのいずれかで行うイムノアッセイを利用して実施することができ、例えば生理学的サンプルについての免疫組織化学的アッセイが含まれる。当業者は、過度な実験を行うことなく、他のイムノアッセイ形式が分かり、あるいは容易に理解することができる。
C5aRへリガンド又は促進剤(例えば、アゴニスト)が結合すると、Gタンパク質共役型受容体によるシグナル伝達が生じ、他の細胞内シグナル伝達分子と同様にGタンパク質の活性を刺激する。化合物(例えば、抗体又はそのフラグメント)によるシグナル伝達機能の誘導は、すべての好適な方法を用いてモニターすることができる。かかるアッセイを用いてC5aRの抗体アゴニストを同定することができる。抗体又はその機能的フラグメントの阻害活性は、アッセイでリガンド又は促進剤を用い、リガンド又は促進剤によって誘導された活性を阻害する抗体の能力を評価することにより判定することができる。
また、走化性アッセイは、C5aRへのリガンドの結合を遮断し、かつ/又は受容体へのリガンドの結合に関する機能を阻害する抗体又はその機能的フラグメントの能力を評価するために用いることができる。これらのアッセイは、化合物によって誘導されたin vitro又はin vivoにおける細胞の機能的移動(遊走)に基づいている。走化性は、すべての好適な手段によって、例えば、96ウェル走化性プレートを利用するアッセイ、又は走化性評価のための他の当技術分野で理解されている方法を用いるアッセイにおいて、評価することができる。例えば、in vitroにおける経内皮走化性アッセイの使用は、Springer et al.によって記載されている(Springer et al.、WO94/20142、1994年9月15日発行;さらにBerman et al.、Immunol.Invest.17:625-677(1988)を参照)。また、内皮を通過するコラーゲンゲルへの移動(遊走)も記載されている(Kavanaugh et al.、J.Immunol.、146:4149-4156(1991))。マウスL1−2前駆B細胞の安定したトランスフェクタント、又は走化性能力のある他の好適な宿主細胞の安定なトランスフェクタントは、走化性アッセイに用いることができる。
本発明の抗体及びフラグメントの結合及び機能を評価するために用いることができる上に記載したアッセイは、C5aRと結合する追加のリガンド若しくは他の物質又はその機能的変異体、ならびにC5aR機能の阻害剤及び/又は促進剤を同定するために改良することができる。例えば、本発明の抗体又はその機能的部分の結合特異性と同一又は類似の特異性を有する薬剤は、前記抗体又はその一部による競合アッセイにより同定することできる。したがって、さらに、本発明は、C5aRと結合する受容体のリガンド又は他の物質、ならびに受容体機能の阻害剤(例えばアンタゴニスト)又は促進剤(例えばアゴニスト)を同定する方法を含む。一実施形態では、C5aRタンパク質又はその機能的変異体を担持する細胞(例えば、細胞へ導入された核酸によってコードされている哺乳動物のC5aRタンパク質又は機能的変異体を発現するように遺伝子操作される白血球、細胞系又は好適な宿主細胞)は、受容体機能の阻害剤又は促進剤をはじめとする、受容体と結合するリガンド又は他の物質の効果を同定及び評価するためのアッセイにおいて用いられる。さらに、かかる細胞は、発現された受容体タンパク質又はポリペプチドの機能を評価するのに有用である。
治療剤としてin vivoにおける本発明の抗体及びフラグメントの効果を評価するために炎症のin vivoモデルを用いることができる。例えば、ケモカイン及びC5aRと反応する抗体又はそのフラグメントを好適な動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット又はアカゲザルなど)へ皮内注射した場合の白血球浸潤をモニターすることができる(例えば、Van Damme,J.et al.、J.Exp.Med.、176:59-65(1992);Zachariae,C.O.C.et al.、J.Exp.Med.171:2177-2182(1990);Jose,P.J.et al.、J.Exp.Med.179:881-887(1994)を参照)。一実施形態では、白血球(例えば、好酸球、顆粒球)の浸潤について皮膚生検を組織学的に評価する。別の実施形態では、走化能及び血管外遊走能のある標識細胞(例えば、C5aRを発現する、トランスフェクトした安定性のある細胞)を動物に投与する。評価する抗体又はフラグメントは、標識細胞を試験動物に投与する前後に、あるいは同時に投与することができる。阻害剤不在時の浸潤の程度と比較して抗体存在時の浸潤の程度が低減している場合、それは阻害を表している。
本発明の抗体及びフラグメントは、研究、診断及び治療用途をはじめとする、種々の用途に有用である。一実施形態では、抗体は好適な標識(例えば、蛍光標識、化学発光標識、アイソトープ標識、抗原又はエピトープ標識、あるいは酵素標識)で標識する。例えば、それらは、受容体又はその部分を単離及び/又は精製し、かつ受容体構造(例えばコンホメーション)及び機能を研究するために用いることができる。
(a)炎症性又はアレルギー性疾患及び症状、例えば、呼吸器系アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、間質性肺疾患(ILD)(例えば、特発性肺線維症、又は慢性関節リウマチを随伴するILD、全身性紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎又は皮膚筋炎);アナフィラキシー又は過敏性応答、薬物アレルギー(例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対するもの)、虫刺されによるアレルギー;クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患;脊椎関節症;硬皮症;乾癬及び炎症性皮膚病、例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹;脈管炎(例えば、壊死性脈管炎、皮膚血管炎及び過敏性血管炎);
(b)自己免疫性疾患、例えば、関節炎(例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎)、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、若年性糖尿病、糸球体腎炎などの腎炎網膜炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病;
(c)移植片拒絶(例えば、移植時の)、例えば、同種異系移植片拒絶反応又は移植片対宿主疾患;
(d)アテローム性動脈硬化;
(e)皮膚又は器官の白血球浸潤のある癌;
(f)他の疾患又は症状(C5aRを媒介とした疾患又は症状を含む)、この場合、これらに限定されるものではないが、再潅流傷害、卒中、成人型呼吸窮迫症候群、ある種の血液悪性腫瘍、サイトカイン誘導型毒性(例えば、敗血症性ショック、内毒素性ショック)、多発性筋炎、皮膚筋炎、天疱瘡様、アルツハイマー疾患、サルコイドーシスをはじめとする肉芽腫性疾患をはじめとする、阻害される不適当な炎症反応は治療することができる。
本発明の免疫療法の方法は、免疫病理学上の疾患の発症の前(予防)又は後(治療)に、本発明の治療剤の注射又は注入により投与することを必要とする。
<実施例>
1.モノクローナル抗体の作製とフローサイトメトリー
C5aRと反応するモノクローナル抗体(MAb)は、C57BL/6マウスに107個のL1.2 C5aRトランスフェクト細胞[8]を2週間間隔で5〜6回腹腔内に免疫にすることにより得た。最終免疫は静脈注射で行った。4日後、脾臓を取り出し、[9]に記載されているようにして、細胞をSP2/0細胞系と融合させた。C5aRと反応するモノクローナル抗体は、免疫蛍光検査法染色及びFACScan(登録商標)(Becton Dickinson & Co.、Mountain View、CA)を用いる分析を用いて、C5aRトランスフェクトL1.2細胞及び非トランスフェクトL1.2細胞、あるいはCXCR2又はCX3CR1(V28)などの無関係な受容体でトランスフェクトしたL1.2細胞を用いて同定した。細胞のモノクローナル抗体染色は、すでに報告のある[10]に記載されているようにして標準的方法により実施した。
組換えヒトC5aは、Sigma Chemical Co.(St.Louis、MO)から入手した。2200Ci/mMの比活性を有する125I−ボルトンハンター標識補体C5aは、NEN-Dupont(Boston, MA)から購入した。L1.2 C5aRトランスフェクタントへのC5a結合は、すでに報告のある[9、11]に記載されているようにして実施した。簡単に説明すると、細胞をPBS中で一回洗浄し、結合バッファー(50mM Hepes、pH7.5、1mM CaCl、5mM MgCl2、0.5%BSA、及び0.05%アジ化物)中、107細胞/mlの濃度で再懸濁させた。50ml(5×105細胞)のアリコートを遠心管へ入れ、その後、冷競合因子と放射性標識した1nMのC5aを添加した。最終反応容量は200μlであった。室温にて60分間インキュベーションした後、0.5MのNaClを含有する結合バッファー1mlで細胞を3回洗浄した。次いで、細胞ペレットをカウントした。バックグラウンド結合は、放射性標識したC5aと少なくとも400倍過剰の未標識C5aと共に細胞をインキュベートすることにより得た。実験はすべて二重反復試験を用い、標準偏差は常に平均値の<10%であった。
C5aRトランスフェクトL1.2細胞を遠沈させ、遊走培地(MM=RPMI1640、0.5%BSA)中で洗浄し、107細胞/mlで再懸濁した。組織培養インサート(Becton Dickinson & Co.、Mountain View、CA)を、3mm直径の孔を有するポリエチレンテレフタレート膜によって分離されて上部及び下部チャンバーを形成している、24ウェルの組織培養プレートの各ウェルに置いた。走化性C5a(アッセイ培地で希釈されているもの)を24ウェル組織培養プレート中のアッセイ培地600μlに添加し、最終濃度1nMとした。100μl中の100万個の細胞を、抗体を含有するハイブリドーマ由来の上清と30分間予めインキュベートした。細胞−上清混合物又は精製モノクローナル抗体をウェル中の上部チャンバーに添加し、5%CO2、37℃のインキュベーター内で18時間、細胞を下部チャンバーまで遊走させた。遊走後にインサートを取り出し、FACScan(登録商標)により細胞をカウントした。設定時間30秒の現象を取得することにより、相対的細胞数を得た。この方法は高度に再現可能であることが分かり、かつ白血球のゲーティングと組織片の除外が可能であった。
細胞調製:室温で40分間、デキストラン沈降ステップによって白血球画分を最初に得ることにより、末梢血から好中球を単離した。次いで、室温にて15分間、2500rpmで密度勾配遠心法を行い、Ficoll−Paque(Amersham Biosciences)上に細胞の層を形成させた。残留している赤血球を低張溶解した後、等量のRPMI1640(Invitrogen Inc.)、M199(Invitrogen Inc.)及び2%FCS(HyClone)中に好中球を再懸濁した。
1〜100μMの範囲の濃度で、「PEPI」(Biosource;Eldridge)として知られているC5aR N末端合成的産生ペプチド(残基9〜29)に抗C5aRモノクローナル抗体を50ug/ml添加した。マウスL1.2細胞をヒトC5a受容体でトランスフェクトし、1%ウシセリンアルブミン(BSA;GibcoBRL)中に再懸濁し(1×107細胞/ml)、次いで、100μlの全容量が得られるように添加した。4℃にて30分間、細胞をインキュベートし、0.1%BSAで一回洗浄した。フルオレセイン(FITC)結合のヒツジ抗マウスIgGのF(ab’)2(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.)を二次抗体(1:200)として用い、4℃にて15分間インキュベートし、0.1%BSAを用いてさらに洗浄ステップを行った。0.1%BSA中に細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
ELISAは、Current Protocols in Immunology(Unit 2.1)(J.F.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.B.Margulies,E.M.Shevach and W.Strober編)、John Wiley and Sons、New Yorkに記載されているようにして行った。簡単に説明すると、96ウェルの平底ELISAプレート(Maxisorp;Nunc)を、37℃にて1時間かけてPBSに溶解した1μg/mlのタンパク質(PEPI又はOPG)でコーティングし、次いで、4℃にて一晩BSAでブロッキングした。次いで、プレートを洗浄し、抗体と共にインキュベートし、その後洗浄し、ペルオキシダーゼ結合のヒツジ抗マウスIgG抗体と共にインキュベートした。用いた基質はTMB基質試薬(PharMingen)であった。
高レベルのC5aRを発現するL1.2トランスフェクタント[8]をマウスの免疫に用い、フローサイトメトリーによって、C5aRでトランスフェクトしたL1.2細胞と特異的に反応するが、CX3CR1(V28)又はCXCR2でトランスフェクトしたL1.2細胞とは反応しなかった10個のモノクローナル抗体を同定した。これらの10個のモノクローナル抗体は、12D4、10G1、5H11、6C12、10D4、5F3、7F3、8D6、11B9及び1D12と命名した。
C5aRトランスフェクタントへの125I標識C5a結合を阻害するモノクローナル抗体の能力を試験した。図2は、モノクローナル抗体7F3が、トランスフェクタントへの125I標識C5aの結合を完全に阻害したことを示しており、この阻害は、400nMの冷却C5aで得られた阻害よりも大きかった。このことは、モノクローナル抗体7F3がC5aRへのC5aの結合を完全に遮断し得ることを示唆している。さらに、モノクローナル抗体6C12及び12D4は、C5aRトランスフェクタントへの125I標識C5aの結合を実質的に阻害することがわかった。モノクローナル抗体7F3によるC5aRトランスフェクタントへのC5a結合の用量反応阻害を図3に示す。
走化性実験は、C5aRでトランスフェクトしたL1.2細胞を用いて、上に記載したようにして実施した。図4は、モノクローナル抗体7F3、6C12及び12D4が、C5aへのC5aR−L1.2細胞の走化性を完全に又は実質的に阻害したことを示す。図5は、モノクローナル抗体7F3によるC5aへのC5aR−L1.2細胞の走化性の用量反応阻害を示す。
抗C5aRモノクローナル抗体を1×PBS(GibcoBRL)中で透析させ、透析済み及び未透析の7F3モノクローナル抗体双方を5ug/mlで好中球に添加した(1×107細胞/ml)。陰性対照(抗体無添加、及び1×PBS添加)も含めた。次いで、孔隙率3.0μmのポリカーボネート膜を備えた24ウェルインサート(Corning Inc.、NY)の上部チャンバーに細胞を充填し、室温にて10分間インキュベートした。次いで、ヒト好中球走化因子C5a(0.1〜100nM)を含有する下部チャンバーにインサートを置いた。次いで、37℃にて30分間、好中球をインキュベートした。下部チャンバーへ膜を介して遊走している好中球の数は、フローサイトメトリー(FACSCalibur;BD Biosciences)により定量した。
3種類の抗C5aRモノクローナル抗体7F3、12D4及び6C12を5ug/mlで好中球に添加した(1×107細胞/ml)。陰性対照(抗体無添加、及び1×PBS添加)も含めた。次いで、孔隙率3.0μmのポリカーボネート膜を備えた24ウェルインサート(Corning Inc.、NY)の上部チャンバーに細胞を充填し、室温にて10分間インキュベートした。次いで、ヒト好中球走化因子C5a(1.12〜1120ng/ml)を含有する下部チャンバーにインサートを置いた。次いで、37℃にて30分間、好中球をインキュベートした。下部チャンバーへ膜を介して遊走している好中球の数は、フローサイトメトリー(FACSCalibur;BD Biosciences)により定量した。
3種類の抗C5aRモノクローナル抗体7F3、12D4及び6C12と、7F3の透析済みサンプルを5ug/mlで精製好中球に添加し(1×107細胞/ml)、24ウェルインサートの上部チャンバーに充填した。陰性対照(抗体無添加、及び1×PBS添加)も再度含めた。室温にて10分間インキュベーションを行った。次いで、IL−8(1.12〜1120ng/ml)を含有する下部チャンバーにインサートを置いたところ、CXCR1及びCXCR2受容体と結合するヒト好中球走化因子は好中球の表面上に発現した。次いで、37℃にて30分間好中球をインキュベートした。下部チャンバーへ膜を介して遊走している好中球の数は、フローサイトメトリー(FACSCalibur;BD Biosciences)により定量した。
走化因子(112ng/ml) 阻害率%
C5a 98
IL−8 81
GCP−2 91
ENA−78 83
C5aRでトランスフェクトした細胞へのモノクローナル抗体7F3、12D4及び6C12の結合は、フルオレセイン(FITC)結合ヒツジ抗マウスIgGで染色することにより測定した。次いで、C5aR N末端ペプチド(残基9〜29)がこの結合を阻害する能力は、上に記載されている方法に従って評価した。このC5aR N末端ペプチドは、配列:PDYGHYDDKDTLDLNTPVDKTを有しており、本明細書では「PEPI」と称している。
ELISAアッセイは、PEPI及びOPGを用いて、モノクローナル抗体6C12、12D4、7F3の反応性を測定するために上に記載されているようにして実施した。OPGは、そのリガンドTNFSF11/OPGLに特異的に結合する、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーである。より詳しくは、OPGは、骨吸収の負の調節因子として機能する骨芽細胞分泌デコイ受容体である。
抗C5aR抗体7F3、12D4及び6C12のヌクレオチド配列は、抗体を発現するハイブリドーマ細胞から抽出したRNAから決定した。重鎖及び軽鎖の可変領域を増幅するために使用するプライマーを決定するため、3つの抗体の可変領域のタンパク質配列をBiogen Incにより決定し、該抗体のアイソタイプはマウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キットIsoStrip(Rocheカタログ番号1 493 027)を使用して決定した。従って、5’フレームワーク1プライマーは、Biogen Inc.のタンパク質配列から誘導し、3’プライマーは抗体のアイソタイプに基づいた。
6C12:軽鎖κ
6C12:重鎖IgG3
7F3: 軽鎖κ
7F3: 重鎖IgG2a
12D4:軽鎖κ
12D4:重鎖IgG3
6C12可変軽鎖のプライマー:
mIgkapFR15':GATGTTTTGATGACCCAAACTCC (配列番号2)
mIgkapcon3':ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (配列番号3)
6C12可変重鎖のプライマー:
mIgVh2 5':SAGGTCCAGCTGCARCAGTC(配列番号4)FR1 VhIIA ファミリー
mIgG3con3':TGGGCATGAAGAACCTGG(配列番号5)ヒンジ領域
7F3可変軽鎖のプライマー:
mIgkapFR15':GATGTTTTGATGACCCAAACTCC(配列番号6)
mIgkapcon3':ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG(配列番号7)
7F3可変重鎖のプライマー:
mIgVh2 5':SAGGTCCAGCTGCARCAGTC(配列番号8)FR1 VhIIA ファミリー
mIgG2acon3':TTTGCATGGAGGACAGGG(配列番号9)
12D4可変軽鎖のプライマー:
mIgkapFR15':GATGTTTTGATGACCCAAACTCC(配列番号10)
mIgkapcon3':ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG(配列番号11)
12D4可変重鎖のプライマー:
mIgVh1 5':CAGGTGCAGCTGAAGSAGTC(配列番号12)FR1 VhIB ファミリー
mIgG3con3’:TGGGCATGAAGAACCTGG(配列番号13)ヒンジ領域
6C12 可変軽鎖(DNA)配列: 配列番号14
6C12 可変軽鎖(タンパク質)配列:配列番号15
6C12 可変重鎖(DNA)配列: 配列番号16
6C12 可変重鎖(タンパク質)配列:配列番号17
7F3 可変軽鎖(DNA)配列: 配列番号18
7F3 可変軽鎖(タンパク質)配列:配列番号19
7F3 可変重鎖(DNA)配列: 配列番号20
7F3 可変重鎖(タンパク質)配列:配列番号21
12D4 可変軽鎖(DNA)配列: 配列番号22
12D4 可変軽鎖(タンパク質)配列:配列番号23
12D4 可変重鎖(DNA)配列: 配列番号24
12D4 可変重鎖(タンパク質)配列:配列番号25
3つの抗C5aR抗体(7F3、12D4及び6C12)のDNA及びタンパク質の配列をMacVector6.5.3を用いて比較した。この解析には、ClustalW(1.4)マルチプルアライメントプログラムを利用した。
7F3、12D4及び6C12の可変軽鎖DNA配列のアライメントを図11に示す。
Clustal W(1.4)マルチプル配列アライメント解析により以下の結果が得られた:
3つの配列のアライメントを行った アライメントスコア=6612
挿入したギャップ=0 保存された同一性=315
ペアワイズアライメントモード:Slow
ペアワイズアライメントパラメータ:
オープンギャップペナルティ=10.0 伸長ギャップペナルティ=5.0
マルチプルアライメントパラメータ:
オープンギャップペナルティ=10.0 伸長ギャップペナルティ=5.0
後発多様性(Delay Divergent)=40% 遷移(Transitions)=重み付
処理時間:0.4秒
アライメントを行った長さ=336 ギャップ=0
同一性=329(95%)
2.7F3 Vkと12D4 Vk
アライメントを行った長さ=336 ギャップ=0
同一性=320(95%)
3.6C12 Vkと12D4 Vk
アライメントを行った長さ=336 ギャップ=0
同一性=326(97%)
7F3、12D4及び6C12の可変重鎖DNA配列のアライメントを図12に示す。
Clustal W(1.4)マルチプル配列アライメント解析により以下の結果が得られた:
3つの配列のアライメントを行った アライメントスコア=5346
挿入したギャップ=3 保存された同一性=200
ペアワイズアライメントモード:Slow
ペアワイズアライメントパラメータ:
オープンギャップペナルティ=10.0 伸長ギャップペナルティ=5.0
マルチプルアライメントパラメータ:
オープンギャップペナルティ=10.0 伸長ギャップペナルティ=5.0
後発多様性=40% 遷移=重み付
処理時間:0.5秒
アライメントを行った長さ=363 ギャップ=0
同一性=333(91%)
2.7F3 Vhと12D4 Vh
アライメントを行った長さ=363 ギャップ=3
同一性=210(57%)
3.6C12 Vhと12D4 Vh
アライメントを行った長さ=363 ギャップ=3
同一性=210(57%)
7F3、12D4及び6C12の可変軽鎖タンパク質配列のアライメントを図13に示す。
Clustal W(1.4)マルチプル配列アライメント解析により以下の結果が得られた:
3つの配列のアライメントを行った アライメントスコア=1902
挿入したギャップ=0 保存された同一性=99
ペアワイズアライメントモード:Slow
ペアワイズアライメントパラメータ:
オープンギャップペナルティ=10.0 伸長ギャップペナルティ=0.1
類似性行列:blosum
マルチプルアライメントパラメータ:
オープンギャップペナルティ=10.0 伸長ギャップペナルティ=0.1
後発多様性=40% ギャップ距離=8
類似性行列:blosum
処理時間:0.1秒
アライメントを行った長さ=112 ギャップ=0
同一性=102(91%) 類似性=5(4%)
2.7F3 Vkと12D4 Vk
アライメントを行った長さ=112 ギャップ=0
同一性=103(91%) 類似性=4(3%)
3.6C12 Vkと12D4 Vk
アライメントを行った長さ=112 ギャップ=0
同一性=104(92%) 類似性=4(3%)
7F3、12D4及び6C12の可変重鎖タンパク質配列のアライメントを図14に示す。
Clustal W(1.4)マルチプル配列アライメント解析により以下の結果が得られた:
3つの配列のアライメントを行った アライメントスコア=1432
挿入したギャップ=2 保存された同一性=51
ペアワイズアライメントモード:Slow
ペアワイズアライメントパラメータ:
オープンギャップペナルティ=10.0 伸長ギャップペナルティ=0.1
類似性行列:blosum
マルチプルアライメントパラメータ:
オープンギャップペナルティ=10.0 伸長ギャップペナルティ=0.1
後発多様性=40% ギャップ距離=8
類似性行列:blosum
処理時間:0.1秒
アライメントを行った長さ=121 ギャップ=0
同一性=107(88%) 類似性=6(4%)
2.7F3 Vhと12D4 Vh
アライメントを行った長さ=121 ギャップ=2
同一性=52(42%) 類似性=25(20%)
3.6C12 Vhと12D4 Vh
アライメントを行った長さ=121 ギャップ=2
同一性=54(44%) 類似性=25(20%)
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Claims (32)
- 受託番号ECACC 00110609のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体7F3が反応するのと同じC5aRのエピトープと反応し、かつ、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- 受託番号ECACC 02090226のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体6C12が反応するのと同じC5aRのエピトープと反応し、かつ、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- 受託番号ECACC 02090227のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体12D4が反応するのと同じC5aRのエピトープと反応し、かつ、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- C5aRに結合し、かつ、受託番号ECACC 00110609のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体7F3のC5aRへの結合を競合的に阻害する抗体。
- C5aRに結合し、かつ、受託番号ECACC 02090226のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体6C12のC5aRへの結合を競合的に阻害する抗体。
- C5aRに結合し、かつ、受託番号ECACC 02090227のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体12D4のC5aRへの結合を競合的に阻害する抗体。
- 比較結合特異性が、C5aR、又はC5aRの細胞外ループを含むポリペプチド、の存在下における抗体−抗体競合アッセイにより決定される、請求項4〜6のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号19及び配列番号21にそれぞれ示される軽鎖及び重鎖配列を含む、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- 配列番号26、配列番号27及び配列番号28にそれぞれ示される可変重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ループ配列を含む可変重鎖配列と、配列番号19に示される可変軽鎖配列のアミノ酸残基24〜39、55〜61及び94〜102と同一のCDRループ配列を含む可変軽鎖配列とを含む、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- 配列番号15及び配列番号17にそれぞれ示される軽鎖及び重鎖配列を含む、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- 配列番号29、配列番号30及び配列番号31にそれぞれ示される可変重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ループ配列を含む可変重鎖配列と、配列番号15に示される可変軽鎖配列のアミノ酸残基24〜39、55〜61及び94〜102と同一のCDRループ配列を含む可変軽鎖配列とを含む、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- 配列番号23及び配列番号25にそれぞれ示される軽鎖及び重鎖配列を含む、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- 配列番号32、配列番号33及び配列番号34にそれぞれ示される可変重鎖CDR1、CDR2及びCDR3ループ配列を含む可変重鎖配列と、配列番号23に示される可変軽鎖配列のアミノ酸残基24〜39、55〜61及び94〜102と同一のCDRループ配列を含む可変軽鎖配列とを含む、C5aのC5aRへの結合を低減又は阻害する抗体。
- C5a以外の走化因子リガンドによる好中球の活性化をも阻害する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
- モノクローナル抗体又は組換え抗体である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の抗体。
- キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の抗体。
- クラスIgG2a又はクラスIgG3抗体である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗体。
- 受託番号ECACC 00110609のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体7F3、受託番号ECACC 02090226のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体6C12及び受託番号ECACC 02090227のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体12D4からなる群より選択されるモノクローナル抗体。
- ECACCに受託番号00110609で寄託されているハイブリドーマ。
- ECACCに受託番号02090226で寄託されているハイブリドーマ。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体と治療剤とを含む複合体。
- 治療剤がトキシンである、請求項21記載の複合体。
- トキシンがシュードモナスエキソトキシン又はその誘導体である、請求項22記載の複合体。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体と検出用標識を含む複合体。
- 標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素標識及び造影剤からなる群より選択される、請求項24記載の複合体。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体をコードする配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体と薬学的に許容される担体を含む組成物。
- C5aR含有細胞とそのリガンドとの相互作用をインビトロで阻害する方法であって、該細胞を請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体に曝露するステップを含む、上記方法。
- 細胞においてC5aR活性をインビトロで阻害する方法であって、該細胞を請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体に曝露するステップを含む、上記方法。
- 免疫病理学的疾患の治療用薬剤の製造における、請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 被験体における好中球の移動に関する疾患を検出する方法であって、該被験体から得たサンプルと請求項24又は25記載の複合体とをインビトロで接触させるステップ、及び該複合体と該サンプルとの免疫特異的結合を検出するステップを含む、上記方法。
- 好中球の移動に関する疾患の治療用薬剤の製造における、請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドの使用。
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