CN103596982B

CN103596982B - 治疗性抗体

Info

Publication number: CN103596982B
Application number: CN201280028064.1A
Authority: CN
Inventors: S.扎恩; L.H.泽尤特恩; A.J.汉森; K.克杰加亚尔德; S.伦德
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2011-06-06
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2016-11-02
Anticipated expiration: 2032-06-04
Also published as: AU2012266487A1; EP3798230B1; KR101978757B1; CA2838497A1; BR112013031198A2; BR112013031198A8; BR112013031198B1; US10323097B2; US20130004514A1; CN103596982A; AU2012266487B2; JP6416177B2; US20130295116A1; US20210238300A1; US8846045B2; WO2012168199A1; DK3798230T3; ES2693647T3; IL229254A; JP2017081941A

Abstract

本发明涉及识别人C5a受体的人抗体。通过与C5aR结合，所述抗体抑制C5a信号传导，从而抑制促炎信号。基于C5a及其受体在刺激炎症中的作用，本发明还涉及所述人抗C5aR抗体的治疗用途，尤其是关于免疫病症的治疗。

Description

治疗性抗体

技术背景

本发明涉及治疗性抗体领域。

背景

每种补体蛋白C3-C5的蛋白水解都会产生具有信号传导分子的氨基-末端阳离子片段(称为过敏毒素)。这其中最强效的C5a引发最广泛的反应。考虑到炎性反应的组成部分为白细胞着边(margination)和浸润、颗粒结合型蛋白水解酶的释放、活性氧和氮-衍生的自由基的产生、血流和毛细血管渗漏的改变以及收缩平滑肌的能力，C5a分子是“完全的”促炎介质。在亚毫微摩尔至毫微摩尔水平上，C5a分子引发所有髓样谱系(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞)的趋化作用，并引起由前列腺素和循环白细胞显著增强的血管通透性。较高的毫微摩尔浓度引发NADPH氧化酶脱粒和活化。这种生物活性的广度与其它炎性介质形成对比。C5a参与包括类风湿性关节炎、银屑病、脓毒病、再灌注损伤和成人呼吸窘迫综合征在内的多种病症的发病机理(Gerard和Gerard, 1994；Murdoch和Finn, 2000)。

C5a的活性通过C5a与其受体(C5aR)的结合而介导。C5aR属于七次跨膜G-蛋白-偶联受体的家族。C5aR是C5a的高亲和力受体，Kd为约1 nM，并且C5aR位于多种不同细胞类型(包括白细胞)上。每个细胞的受体数量都相当高，多达200,000个位点/白细胞。该受体的生物活化发生在使结合饱和的范围内。

C5aR结构符合七次跨膜受体家族，紧接于其胞外N-末端之后的是通过胞内环和胞外环交替的螺旋间结构域相连的七个跨膜螺旋，末端是是胞内C-末端结构域。C5aR含有延长的N-末端胞外结构域。这种大型N-末端结构域是G-蛋白偶联受体(其结合包括IL-8和fMet-Leu-Phe (FMLP)受体家族在内的肽)所特有的。

C5aR拮抗剂对C5a反应的抑制降低了经由C5a介导的急性炎性反应，而不影响其他补体成分。为了这个目的，先前已经描述了C5aR肽拮抗剂和抗C5a受体抗体(Watanabe等人,1995；Pellas等人, 1998；Konteatis等人, 1994；Kaneko等人, 1995；Morgan等人, 1993)。例如，WO 95/00164描述了针对C5aR的N-末端肽(残基9-29)的抗体。WO 03/062278也描述了针对C5aR的抗体。这些小鼠抗体中的3种称为7F3、6C12和12D4。已经证明这些抗体具有优良性能，例如非常有效地阻断C5a与其受体的结合，在体外终止C5a-引导的嗜中性粒细胞的迁移，并在动物模型中预防炎症。为了控制慢性疾病，可能有必要在数月或数年内连续几次给予所述抗体。然而，给予小鼠抗体的一个缺点就是：人体免疫系统可以产生其针对小鼠抗体的自身抗体(HAMA反应)。HAMA反应可通过从血液中快速清除小鼠抗体而中和它们，因此阻止小鼠抗体与其靶结合。为了避免HAMA反应的发生，已经采用的一个策略就是使小鼠抗体“人源化”，即通过在非表位结合区用人序列替换尽可能多的“外源”残基。

人源化程序的一个主要问题是对抗原的亲和力的损失(Jones等人, 1986)，在某些情况下多达10倍或更高，尤其是当抗原是蛋白质时(Verhoeyen等人, 1988)。任何亲和力的损失当然都是非常不希望的。至少，它意味着不得不将更多的人源化抗体以更高的成本和更大的不良反应风险注入患者中。甚至更严重的是，具有减少的亲和力的抗体可能具有更差的生物学功能，所述功能例如补体溶解、抗体-依赖性细胞毒性或病毒中和作用。尽管面对这些困难，抗人C5aR抗体的成功的人源化已经描述于WO 2009/103113。

多年来已经开发了多种策略以便进一步使将抗体给予患者所致的任何不想要的副反应的风险减至最小，其包括通过产生“完全”人抗体而在患者中降低形成抗药物抗体的可能性。

甚至在今天，对适合于治疗应用的抗体的鉴定也是一项挑战性任务。因此，可用于诊断和/或治疗方法的替代的和/或改进的C5aR拮抗剂仍然令人非常感兴趣。

概述

本发明涉及抗C5aR抗体以及它们在诊断和/或治疗方法中的用途。本发明人已经鉴定了与人C5aR结合的一系列抗体，在若干方面，所述抗体在功能上都优于先前所述的抗C5aR抗体。

如本文所示，本发明人已经鉴定了与人C5aR (hC5aR)结合的一系列人抗体并可取代hC5a与hC5aR的结合和抑制hC5a介导的嗜中性粒细胞迁移。另外本发明人已经成功地将这些抗hC5aR抗体中的一个的框架区中存在的非人残基转化为人种系残基，而不影响抗体效能。

此外，通过改变Fc区，本发明人已经建立了抗hC5aR抗体，所述抗体在体外不诱导吞噬作用、ADCC或CDC。根据示例性实施方案的公开内容，本发明的详情将会是显而易见的。

本发明的一方面涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列组之一：SEQ ID 1、2和3，SEQ ID 9、10和11，SEQ ID 17、18和19，SEQ ID 25、26和27或每种所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

本发明的一方面涉及抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列组之一；SEQ ID 5、6和7，SEQ ID 13、14和15，SEQ ID21、22和23，SEQ ID 29、30和31或每种所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

本发明的一方面涉及特异性结合hC5aR的人抗体，其中所述抗体优选地结合hC5aR的第二胞外环。

本发明的一方面涉及特异性结合hC5aR的抗体，其中与IgG1、IgG2、IgG4和IgG4/G2参考序列相比，所述抗体Fc区已被修饰，降低了所述抗体经由Fcγ受体(FcγR)相互作用而诱导吞噬作用、ADCC和/或CDC的能力。在一个具体实施方案中，所述抗体Fc区是IgG1，在另一个特别的实施方案中，所述Fc区包含一个或多个以下点突变组：

I) N297Q和/或

II) L234A和L235E和/或

III) G236R和L328R和/或

IV) N297Q、L234A和L235E和/或

V) N297Q、L234A、L235E和G237A和/或

VI) L234A、L235E、G237A、A330S和P331S

另一方面，本发明涉及本发明的抗体在治疗免疫疾病或病症中的用途。

另一方面，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗量的本文所述的抗体。

另一方面，本发明提供在受试者中治疗或预防病症的方法，所述方法包括给予所述受试者本发明的抗体。在一个实施方案中，所述病症是免疫病理性病症例如自身免疫性疾病。

根据本文的公开内容(包括示例性的实施方案)，本发明的进一步的方面和实施方案将会是显而易见的。由公开内容可得出的是，本发明提供具有本文所表征的多种益处和优势的新的治疗性抗体。

附图简述

图1显示了在本申请中分离和表征的所选单克隆抗体的可变区的比对。

图2显示了针对小鼠和人C5aR嵌合体的所选抗体的结合特异性。将32F3A6、35F12A2和35F32A3与嵌合人/小鼠C5aR的结合同与Ref Ab Q的结合进行比较。示意性地显示了嵌合受体。源自人和小鼠C5aR的区域分别用细线和粗线显示。

图3显示了一个抗体的可变区与最近的种系人抗体的可变重链和轻链序列的比对。"/"表示“在序列中中断，例如在V、D或J区段之间。

图4是在K/BxN-hC5aR-KO/KI血清转移模型模型中建立炎症后5天，i.p.给予0.5、1.5或10mg/kg的单负荷剂量(箭头)，接着分别给予0.25、0.5或2 mg/kg的9个日剂量的3个治疗组的临床评分，误差棒表示±SD。对照接受IgG1 3G12。

图5是在银屑病性关节炎患者和骨关节炎患者(对照)的滑液中的C5a蛋白表达。C5a水平在银屑病性关节炎患者组中显著升高(p=0.001; Mann-Whitney)。

图6是在克罗恩病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎中的C5aR蛋白表达的半定量分析。通过免疫组织化学来研究C5aR蛋白表达并在GraphPad Prism 5中通过Kruskal-Wallis检验以及Dunn氏多重比较事后检验进行分析，P<0.05被认为是显著的。* P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001。

定义

除非另有说明，否则本发明所用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术都是本领域技术人员众所周知的标准程序。这些技术在例如以下文献来源中有描述和解释：J.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984),J. Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory Press (1989), T.A. Brown (编辑), Essential Molecular Biology: APractical Approach, 第1和2卷, IRL Press (1991), D.M. Glover和B.D. Hames (编辑), DNA Cloning: A Practical Approach, 第1-4卷, IRL Press (1995和1996),和F.M. Ausubel等人(编辑), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley- Interscience (1988, 包括至今的所有更新), Ed Harlow和David Lane (编辑) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory, (1988),和J.E. Coligan等人(编辑) Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons (包括至今的所有更新)。

如本文所用，“C5a受体”、“C5aR”、“C5aRl”或“人C5aR”及其变化形式是指人补体成分5受体1，在本领域中也称为C5a过敏毒素受体和CD88抗原。C5aR属于七次跨膜G-蛋白-偶联受体家族，并结合C5a (Gerard和Gerard, 1991)。人C5aR氨基酸序列的实例在SEQ IDNO:41中提供，然而，正如技术人员将会知道的，该分子具有天然存在的等位基因变体，它们也包括在该术语“C5aR”中。人C5aR的各种结构域定义如下：

氨基酸1 – 37: 胞外结构域N-末端，

氨基酸38 – 61: 跨膜结构域，

氨基酸62 – 71: 胞内结构域，

氨基酸72 – 94: 跨膜结构域，

氨基酸95 – 110: 胞外结构域 - 胞外环1，

氨基酸111 – 132: 跨膜结构域，

氨基酸133 – 149: 胞内结构域，

氨基酸150 – 174: 跨膜结构域，

氨基酸175 – 206: 胞外结构域 - 胞外环2，

氨基酸207 – 227: 跨膜结构域，

氨基酸228 – 242: 胞内结构域，

氨基酸243 – 264: 跨膜结构域，

氨基酸265 – 283: 胞外结构域 - 胞外环3，

氨基酸284 – 307: 跨膜结构域，

氨基酸308 – 350: 胞内结构域 - C-末端。

术语“治疗”，如本文所用，是指有需要的任何人类或其它动物受试者的医学治疗。所述受试者预期已由医学或兽医学从业人员进行体检，所述从业人员已给出试验性或确定的诊断，表明使用所述特定治疗对所述人类或其它动物受试者的健康是有益的。所述治疗的时间安排和目的可根据受试者的健康状况，因个体不同而异。因此，所述治疗可以是预防性的、姑息性的、对症的和/或治愈性的。就本发明而言，预防性的、姑息性的、对症的和/或治愈性的治疗可以代表本发明的各个方面。

与医学治疗相关，本文所用的术语“受试者”意图是指任何动物，尤其是哺乳动物，例如人、马、牛、猫和狗，并且在合适时可与术语“患者”互换使用。优选地，所述受试者是人。本文所用的术语“治疗”、“医治”或“疗法”及其变化形式包括给予治疗有效量的本发明的抗体，其足以减少或消除病症的至少一种症状。

本文所用的术语“预防”、“防止”或“阻止”或其变化形式是指保护受试者免于发展疾病的至少一种症状，或者降低病症症状的严重程度。

本文所用的术语“暴露细胞”是指提供抗体，使其能够接触/结合人C5aR，只要C5aR存在于细胞上。

术语“有效浓度50%”(缩写为“EC50”)代表抗体靶向的分子的特定作用(例如抑制/取代(displace)人C5a与人C5aR的结合)的50%所需的本发明抗体的浓度。本领域人员将会理解，较低的EC50值相当于更强效的抗体。

本文所用的术语“抑制”是指显著降低、和可能完全消除确定的活性。优选地，确定的活性被降低或抑制至少50%，更优选地至少75%和甚至更优选地至少90%。

在本说明书全文中，术语“包括”或诸如“包含”、“含有”等变化形式将被理解为是暗指包括所陈述的要素、整数或步骤或者要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其他要素、整数或步骤或者要素组、整数组或步骤组。

在一个实施方案中，分子基本上由确定序列组成。

在另一个实施方案中，分子由确定序列组成。

在一个实施方案中，所述分子例如抗体或DNA序列是分离的分子。术语“分离的抗体”是指已经从其天然环境的另外的/其它的组分中分离和/或回收的和/或从其天然环境中的组分混合物中纯化的抗体。

本文所用的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。全长抗体(或完整抗体)包含4条多肽链，即通过二硫键相连的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。每条轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。重链恒定区包括3个结构域：CH1、CH2和CH3。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。每条轻链包括轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括1个结构域CL。VH区和VL区可进一步细分为超变区(称为互补决定区(CDR))，其间插有更保守的区(称为框架区(FR))。

每个VH和VL包括三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。

本文所用的术语“抗体”用于描述完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链，其特异性结合其相应抗原。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv (典型地，抗体单臂的VL区和VH结构域)、单链Fv (scFv；参见例如Bird等人, Science 1988；242:42S-426; 和Huston等人, PNAS 1988；85:5879-5883)、dsFv、Fd(典型地，VH区和CHI结构域)和dAb (典型地，VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；一价分子，包括单条VH和单条VL链；微抗体(minibodies)、双链抗体、三链抗体、四链抗体和κ体(kappa bodies) (参见例如Ill等人, Protein Eng 1997;10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或功能性互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可结合或连接在一起，以便形成功能性抗体片段。不同类型的抗体片段已经描述或综述于例如Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136；WO2005040219和已公布的美国专利申请20050238646和20020161201。

术语“互补决定区”(“CDR”)或“超变区”，当用于本文时，是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。CDR通常包括以下：轻链可变结构域中的氨基酸残基24-34 (L1)、50-56(L2)和89-97 (L3)以及重链可变结构域中的氨基酸残基31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102(H3) (Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版,U.S. Department of Health and Human Services, NIH公布号. 91-3242)和/或轻链可变结构域中来自“超变环”的那些残基(残基26-32 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)以及重链可变结构域中的残基26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)；Chothia和Lesk, J. Mol.Biol 1987;196:901-917)。典型地，通过例如以下文献描述的方法，在该区中对氨基酸残基进行编号：Kabat等人，同上。短语例如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“按照Kabat”在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的该编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可含有较少或另外的氨基酸，对应于可变结构域的FR或CDR的缩短，或插入可变结构域的FR或CDR中。例如，重链可变结构域可包括在CDR H2的残基52之后的氨基酸插入(残基52a、52b和52c，按照Kabat)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如残基82a、82b和82c等，按照Kabat)。对于给定的抗体，可通过抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号的序列的比对，确定残基的Kabat编号。

术语“框架区”或“FR”残基是指不在CDR内的那些VH或VL氨基酸残基，如本文中定义。

抗体的片段结晶区(“Fc区”/“Fc结构域”)是与细胞表面受体(称为Fc受体)相互作用的抗体的“尾”区，以及补体系统的一些蛋白。

单克隆抗体通常通过将骨髓瘤细胞与来自经所需抗原免疫的小鼠的脾细胞融合而制备。人单克隆抗体可得自编码人抗体的转基因动物(例如小鼠或其它合适物种)。或者，可通过包括被称为库克隆(repertoire cloning)或噬菌体展示/酵母菌展示的技术来制备重组单克隆抗体。重组抗体工程包括使用病毒或酵母菌、而不是小鼠，以产生抗体。

术语“人源化抗体”，如本文所用，是指人/非人嵌合抗体，其含有序列，通常至少是衍生自非人种系免疫球蛋白序列的最小互补决定区(CDR序列)。因此，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)：其中来自受者超变区的残基被来自非人类物种(供者抗体)的超变区残基置换，所述非人类物种例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类，所述抗体具有所需的特异性、亲和力和能力。

至少包含并非衍生自人种系序列的CDR区的人源化抗体也可称为“嵌合抗体”，如果典型地通过遗传工程，由源自不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建抗体轻链和重链基因的话。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段连接到人恒定区段。

术语“人抗体”，如本文所用，意图包括具有这样的可变区的抗体：其中框架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。注意到这样的抗体可仍然包含人种系序列中不存在的氨基酸残基，因为在体内或体外成熟化而发生的突变。此外，如果抗体含有恒定区，该恒定区也主要源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可仍然包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过在体外的随机或定点诱变或者通过在体内的体细胞突变而引入的突变)。另一方面，术语“人抗体”，如本文所用，无意包括其中CDR序列衍生自其它哺乳动物物种例如小鼠的种系并且随后被移植到人框架序列的抗体或替代的抗原结合区(参见以上的人源化抗体)。人抗体可以是人单克隆抗体。这类人单克隆抗体可以通过杂交瘤而产生，所述杂交瘤包括融合到永生化细胞的、得自转基因的非人类动物(例如转基因小鼠，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组)的B细胞。人抗体也可分离自在所选人种系序列上构建的序列文库，用天然的和合成的序列多样性而进一步多样化。可通过体外免疫人淋巴细胞，然后用EB病毒转化该淋巴细胞，制备人抗体。可以鉴定人抗体的序列，允许通过重组方法产生抗体。

此外，人源化抗体、人抗体和完全人抗体可包含受者抗体或供者抗体中不存在的残基。可以进行这样的修饰以进一步改进抗体性能。

术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种试剂或抗体的缀合物。

术语“抗原”是指用于免疫具有免疫活性的脊椎动物以产生识别该抗原的抗体的分子实体。本文的术语抗原使用更广泛并且通常意图包括被抗体特异性识别的靶分子，因此包括用于免疫过程以产生抗体的分子的片段或模拟物，或者在免疫后用于筛选的这样的分子，以及用于在通过替代方法(例如噬菌体展示筛选)而获得抗体的情况下用于筛选的分子。

术语“表位”，如本文所用，是在“抗原结合多肽”例如抗体与其相应“抗原”间的分子相互作用的情况下定义。通常，“表位”是指抗体特异性结合的抗原的区域或区，即与抗体物理接触的区域或区。蛋白表位可包含直接参与抗体结合的抗原中的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性成分)和并非直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被Ab有效阻断的抗原的氨基酸残基(换句话说，所述氨基酸残基在“溶剂-排除的表面”和/或抗体“足迹”内)。给定的抗原可包含多个不同表位，其可包括但不限于：线性肽抗原决定簇，构象抗原决定簇，其由在天然(成熟)构象中彼此位置靠近的一个或多个非毗邻氨基酸组成；和翻译后的抗原决定簇，其全部或者部分地由共价连接到该抗原上的分子结构(例如碳水化合物基团)组成。

由事实(即，取决于所用的表位作图方法，在不同细节水平上得到表位的描述和定义)可得出的是，可类似地在不同细节水平上，对于相同Ag上的不同Ab的表位进行比较。

术语“结合”、“特异性结合”和“结合特异性”在本文中用于描述抗体或其抗原结合片段的选择性。

本发明的抗体可特异性结合C5aR，表明该抗体对于其它抗原具有显著更低的亲和力，其中显著更低可以是例如至多为1/2，或至多为1/5或至多为1/10。抗体可以进一步是物种特异性的，例如抗体以高亲和力特异性结合人C5aR，而非小鼠C5aR。

术语“结合亲和力”在本文中用作两个分子(例如抗体或其片段与抗原)间非共价相互作用的强度的度量。该术语“结合亲和力”用于描述一价相互作用(内在活性)。可通过测定解离常数(K_D)定量测定通过一价相互作用的两个分子(例如抗体或其片段与抗原)间的结合亲和力。继而可通过复合物形成和解离的动力学测量例如通过SPR方法测定K_D。对应于一价复合物的结合和解离的速率常数分别称为结合速率常数k_a (或k_on)和解离速率常数k_d (或k_off)。K_D通过等式K_D = k_d/k_a与k_a和k_d相关。

此外，“亲和力”涉及分子(例如抗体)的单个结合位点和配体(例如抗原)之间的结合强度。分子X对配体Y的亲和力用解离常数(K_d)来表示，该常数是占据溶液中存在的半数X分子的结合位点所需的Y的浓度。较小的K_d表示较强或较高的亲和力相互作用，并且需要较低的配体浓度占据这些位点。同样，可通过测定和比较目标相互作用(例如抗体与抗原间的特异性相互作用)的K_D值与非目标相互作用的K_D值，来评价相互作用的特异性。

典型地，抗体对靶的K_D可比对其它非靶分子(例如无关物质或环境中的伴随物质或对照)的K_D小2倍，优选地5倍，更优选地10倍。更优选地，K_D可为小50倍，例如小100倍，或小200倍；甚至更优选小500倍，例如小1,000倍，或小10,000倍。

该解离常数的值可通过众所周知的方法直接测定，甚至对于复杂混合物可通过例如以下文献给出的方法计算：Caceci等人(Byte 9:340-362, 1984)。例如，可通过例如以下文献中公开的方法，用双过滤硝基纤维素滤器结合测定来确定K_D：Wong & Lohman (Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)。评价配体例如抗体对于靶的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。也可通过本领域已知的标准测定例如SPR来评价抗体的结合动力学和结合亲和力。

可进行竞争性结合测定，其中将抗体与靶的结合同该靶的另一种配体(例如另一种抗体)与该靶的结合进行比较。发生50%抑制时的浓度称为Ki。在理想条件下，Ki等于K_D。Ki值绝不会小于K_D，因此对Ki的测量可被方便地替代为提供K_D的上限。

正如技术人员将会理解的，“亲合力(avidity)”涉及两分子例如抗体和抗原之间的相互关系的总体强度。亲合力同时取决于亲和力和相互作用的效价(valency)。

用于确定给定抗体的功能性的另外测定可包括基于细胞的测定，其对给定抗原和抗体结合的作用是特异性的。

本领域已知的术语“同一性”是指通过比较序列而确定的两个或更多个多肽的序列间的关系。在本领域，“同一性”也指通过两个或更多个氨基酸残基串(string)之间的匹配数而确定的多肽间的序列相关性程度。“同一性”测量两个或更多个序列中较小的之间相同匹配的百分比，其中通过具体的数学模型或计算机程序(即“算法”)处理空位(gap)比对(如果有的话)。可通过已知方法容易地计算出相关多肽的同一性。这类方法包括但不限于以下文献中描述的那些：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.编辑, OxfordUniversity Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and GenomeProjects, Smith, D. W.编辑, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysisof Sequence Data, 第1部分, Griffin, A. M.,和Griffin, H. G.编辑, Humana Press,New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和Devereux, J.编辑, M. Stockton Press, New York, 1991; 和Carillo等人, SIAM J. Applied Math.48, 1073 (1988)。

设计了用于确定同一性的优选方法，以得到所测试序列间的最大匹配。确定同一性的方法描述于公众可得的计算机程序中。用于确定两个序列间同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP (Devereux等人, Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul等人, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX程序可公开获自美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)和其它来源(BLAST Manual, Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda,Md. 20894；Altschul等人, 同上)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。

例如，使用计算机算法GAP (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, Wis.)，比对待确定%序列同一性的两个多肽，用于相应氨基酸的最佳匹配(“匹配跨度(matched span)”，由算法确定)。空位开放罚分(经计算为平均对角线的3倍；“平均对角线”是所用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过特定比较矩阵而赋值给每个完美氨基酸匹配的分值或数量)和空位延伸罚分(其通常是{分数(1/10)}乘以空位开放罚分)、以及比较矩阵例如PAM 250或BLOSUM 62共同用于该算法。该算法还使用标准比较矩阵(参见Dayhoff等人, Atlas of Protein Sequence and Structure, 第5卷,附录3 (1978)用于PAM 250 比较矩阵；Henikoff等人, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89,10915-10919 (1992)用于BLOSUM 62比较矩阵)。

用于肽序列比较的优选参数包括如下：

算法: Needleman等人, J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)；比较矩阵:BLOSUM 62来自Henikoff等人, PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)；空位罚分：12, 空位长度罚分：4，相似性阈值：0。

用上述参数，GAP程序是有用的。使用GAP算法，上述参数对于肽比较是默认参数(连同末端空位无罚分)。

“保守的氨基酸取代”可以包括一个氨基酸残基被另一残基取代，使得对该位置上的氨基酸残基的极性或电荷很少或没有影响。这以下述氨基酸组为例，其中一个氨基酸被同组中的不同氨基酸取代被认为是保守的取代：亲水性：Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser、Thr；脂族: Val、Ile、Leu、Met；碱性：Lys、Arg、His；芳族：Phe、Tyr、Trp。此外，任何残基都可以频繁地被丙氨酸取代。

此外，若期需，可将非天然氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加引入到本发明的抗体和/或免疫球蛋白链。这样的氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、a-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计氨基酸(designer amino acid)例如β-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸和一般而言的氨基酸类似物。

可通过将合适核苷酸变化引入本发明的核酸，或通过所需多肽的体外合成，制备本发明的抗体和/或免疫球蛋白链的氨基酸序列突变体。这样的突变体包括例如氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代。可制备缺失、插入和取代的组合，以得到最终的构建体，只要最终的多肽产物具有所需特征。可使用本领域已知的任何技术来制备突变的(改变的)多肽。例如，可使本发明的多核苷酸经历体外诱变。这样的体外诱变技术包括使该多核苷酸亚克隆到合适的载体，将该载体转化到“增变(mutator)”菌株例如大肠杆菌(E. coli) XL-Ired (Stratagene)并将该转化的细菌增殖合适的传代次数。可使用本文所述的技术容易地筛选源自突变的/改变的DNA的产物，以确定它们是否具有受体结合活性和/或受体抑制活性。

在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的特征。突变的位点可被单独修饰或系列修饰，例如，通过(1)首先用保守氨基酸选择物取代，然后根据获得的结果用更激进的选择物取代，(2)删除靶残基，或(3)插入与定位位点(located site)相邻的其他残基。

氨基酸序列缺失范围一般为约1-15个残基，更优选为约1-10个残基，以及典型地为约1-5个连续的残基。

描述

本发明人已经鉴定了对于生物治疗剂和特定抗体的功能性和功效的若干相关方面，本发明的主要领域是用于通过抑制C5a与C5aR的结合而治疗炎性疾病的抗体。

本发明的一方面涉及一系列抗体中的一种或多种，其特征在于它们的功能性和/或CDR的氨基酸序列、重链和轻链的可变区和/或Fc结构域的序列。

在一个实施方案中，所述抗体是全长抗体，其包括标准抗体结构域和区。

在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段，所述片段可使用常规重组或蛋白质工程技术而获得。本发明的抗体片段可通过截短而制备，例如通过从多肽的N-端和/或C-端末端除去一个或多个氨基酸。片段也可通过一个或多个内部缺失而产生。本发明的抗体可以是或可包含本发明所基于的抗体中的任何一个的片段。本发明的抗体可以是或可包含这些抗体或其变体中的一个的抗原结合部分。例如，本发明的抗体可以是这些抗体或其变体中的一个的Fab片段，或者它可以是源自这些抗体或其变体中的一个的单链抗体。

本发明的抗体可来自不同物种，包括哺乳动物物种，例如小鼠、大鼠、兔、猪或非人类灵长类。所述抗体可以是啮齿类抗体和更特别的是小鼠抗体。或者所述抗体可来自非哺乳动物物种，例如鸡。所述抗体还可以是人源化抗体或人抗体。

本发明的抗体可具有与另一种本发明的抗体竞争性结合C5aR的能力，如本文所述。可在标准结合测定中，根据它们与已知的本发明抗体交叉竞争的能力而鉴定这类交叉竞争的抗体。这类交叉竞争可表明两种抗体结合到相同的、重叠的或相似的表位上。

人抗体

如本文的实施例所述，本发明人已经鉴定了源自转基因小鼠并包含人免疫球蛋白种系基因座的一系列抗C5aR抗体。所述抗体被分离成单克隆杂交瘤抗体并评价其结合特征。正如所述，C5aR是七次跨膜GPCR和保留了天然构象的可溶性形式(不可能生产)。为了产生阻断hC5a与hC5aR结合的人抗体，转基因小鼠用表达天然hC5aR的细胞来免疫。然而，阻断的抗体非常难以获得，在鉴定具有所需阻断特性的人抗体之前，本发明人进行了32次融合。从35次融合和超过100,000个杂交瘤上清液的筛选中，总共得到11种阻断的抗体。

此外，因为hC5aR的性质，不可能通过标准Biacore分析而测定抗体的亲和力，因此根据功能性hC5aR-依赖性读出而建立测定，从中测定IC50和EC50值，如实施例2和实施例7所述。

一方面，本发明涉及结合C5aR的人抗体，并且进一步优选的是所述抗体特异性结合hC5aR，使得与hC5aR的结合强于与来自其他物种例如尤其是小鼠C5aR的结合。在一个实施方案中，优选的是所述抗体结合C5aR的第二胞外环和更优选人C5aR的第二环。在一个实施方案中，所述抗体结合人C5aR的第二胞外环，而非鼠C5aR的第二胞外环。在进一步的实施方案中，本发明的抗体仅可结合天然构象的C5aR的第二胞外环。

抗C5aR抗体的功能性依赖于所述抗体显著抑制或降低C5a与C5aR的结合的能力。

在一个实施方案中，本发明涉及结合C5aR的人抗体或涉及本文所述的由序列定义的抗体(参见下文)，其中所述抗体能够显著抑制或降低C5a与C5aR的结合。这可以通过本文的实施例2中所述的取代(displacement)测定(SPA)而测定，从中可测定IC50值。如表1所示，所分离和描述的11种抗体的IC50浓度低于50nM。在本发明的进一步的实施方案中，所述抗体在SPA测定中能够取代hC5a，其IC50低于50nM，例如低于40nM，例如低于30nM，例如低于20nM，例如低于10nM，例如低于5nM或甚至低于4nM，或其中IC50低于3nM或甚至低于2.5nM或2.0nM。

在进一步测定中，评价了抗C5aR抗体抑制C5a-依赖性的人嗜中性粒细胞迁移的能力并且发现一些所鉴定的人抗体与先前所述的C5aR抗体相比是C5a-介导的嗜中性粒细胞迁移的更强效的抑制剂(WO 2009/103113的Q)。在一个实施方案中，本发明因此涉及本文所述的由序列定义的抗体(参见下文)或结合C5aR的人抗体，其中所述抗体能够显著抑制人嗜中性粒细胞的迁移。在一个实施方案中，与在10nM C5a和无抗C5aR抗体存在下观察到的迁移水平相比，所述抗体抑制迁移至小于50%，小于40%，小于30%，小于20%，或小于10%。在一个这样的实施方案中，在10 nM C5a和抗体存在下在30分钟后测定迁移，与在10 nM C5a和无抗体存在下在30分钟后所观察到的迁移水平相比。或者，根据同样的设置，使用IC50值，可表示抗体抑制嗜中性粒细胞迁移的能力。在一个这样的实施方案中，IC50低于2.5 µg/ml，例如低于2.5 µg/ml，例如低于1.5 µg/ml，例如低于1.2 µg/ml或甚至低于1.0 µg/ml。

作为标准Biacore分析的替代方法，可以通过实施例7所述的对嗜中性粒细胞的竞争结合测定来测定hC5aR抗体的功能性。该功能性是指通过竞争配体结合测定而测量的抗体亲和力，但是也可认为是相互作用的亲合力的度量。本发明在一个实施方案中涉及本文所述的由序列定义的抗体(参见下文)或结合C5aR的人抗体，其中通过对嗜中性粒细胞的竞争配体结合测定而测量的抗体亲和力或亲合力低于0.80nM、0.70nM、0.60nM，例如低于0.50nM、0.45nM、0.40nM或0.35nM。

使用钙流量(calcium-flux)测定，探究了用于表征抗体的另外选项，所述测定测量抗体在离体时抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞活化的能力，同样描述于实施例7。在一个进一步的实施方案中，本发明涉及本文所述的由序列定义的抗体(参见下文)或结合C5aR的人抗体，其中在钙流量测定中测定的IC50低于7.0µg/ml，例如低于5.0µg/ml，例如低于2.5µg/ml。

基于次级效应例如CD11b和CD62L表达，额外的离体测定可用于测定抗体抑制或中和C5a诱导的嗜中性粒细胞成熟的能力。CD11b和CD62L是嗜中性粒细胞的成熟标记，因为它们在通过C5a/C5aR相互作用而活化之后分别被上调和下调。

测定了在CD11b上调测定中的作用。在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的由序列定义的抗体(参见下文)或结合C5aR的人抗体，其中在CD11b上调测定中测定的IC50低于3.5µg/ml，例如3.0µg/ml，例如低于2.5µg/ml，例如低于2.0µg/ml或例如1.5µg/ml或甚至低于1.0µg/ml。

同样，测定了在CD62L下调测定中抗体的作用。在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的由序列定义的抗体(参见下文)或结合C5aR的人抗体，其中在CD62L下调测定中测定的IC50低于1.8 µg/ml，例如低于1.5 µg/ml，例如低于1.2 µg/ml或甚至低于1.0 µg/ml。

选择了4种单克隆抗体用于测序，以测定可变区序列和尤其是CDR序列。序列比对见图1并且序列同样包括在所附序列表中。

序列表包括分离的抗体相关的以下序列：

SEQ ID 1-3:Vh 35F32A3 CDR 1-3

SEQ ID 4:Vh 35F32A3

SEQ ID 5-7:Vl 35F32A3 CDR 1-3

SEQ ID 8:Vl 35F32A3

以类似方式，SEQ ID 9-16描述了32F3A6

以类似方式，SEQ ID 17-24描述了35F12A2

以类似方式，SEQ ID 25-32描述了35F24A3

可变区或CDR序列所定义的抗体

因此，本发明的抗体可以根据CDR序列、重链和轻链的可变区序列和其上的小修饰(本领域技术人员可进行这样的修饰而不改变抗体功能性)而定义。这包括每个CDR序列内的一个或多个(例如1、2或3个氨基酸残基)的氨基酸取代、缺失或插入。

一方面，本发明涉及结合C5aR的抗体，其由CDR区序列定义，其中所述抗体的重链可变区包含选自以下组的CDR1、CDR2和CDR3序列：

a) SEQ ID 1、2和3，其中所述序列中的0、1、2或3个包含被不同的氨基酸残基取代的1、2或3个氨基酸；和

b) SEQ ID 9、10和11，其中所述序列中的0、1、2或3个包含被不同的氨基酸残基取代的1、2或3个氨基酸；和

c) SEQ ID 17、18和19，其中所述序列中的0、1、2或3个包含被不同的氨基酸残基取代的1、2或3个氨基酸；和

d) SEQ ID 25、26和27，其中所述序列中的0、1、2或3个包含被不同的氨基酸残基取代的1、2或3个氨基酸。

在一个实施方案中，本发明涉及结合C5aR的抗体，其由CDR区序列定义，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列；

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 1、9、17、25或所述序列中的一个，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代；和

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 2、10、18、26或所述序列中的一个，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代；和

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 3、11、19、27 或所述序列中的一个，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

在一个实施方案中，本发明涉及结合C5aR的抗体，其由CDR区序列定义，其中所述抗体的轻链可变区包含选自以下组的CDR1、CDR2和CDR3序列：

a) SEQ ID 5、6和7，其中所述序列中的0、1、2或3个包含被不同的氨基酸残基取代的1、2或3个氨基酸；和

b) SEQ ID 13、14和15，其中所述序列中的0、1、2或3个包含被不同的氨基酸残基取代的1、2或3个氨基酸；和

c) SEQ ID 21、22和23，其中所述序列中的0、1、2或3个包含被不同的氨基酸残基取代的1、2或3个氨基酸；和

d) SEQ ID 29、30和31，其中所述序列中的0、1、2或3个包含被不同的氨基酸残基取代的1、2或3个氨基酸。

一方面，本发明涉及结合C5aR的抗体，其由CDR区序列定义，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列；

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 5、13、21、29或所述序列中的一个，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代；和

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 6、14、22、30或所述序列中的一个，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代；和

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 7、15、23、31或所述序列中的一个，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，其中重链可变区的CDR包含SEQ ID 1、2和3或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中可变轻链的CDR包含SEQID 5、6和7或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，其中重链可变区的CDR包含SEQ ID 9、10和11或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中可变轻链的CDR包含SEQ ID 13、14和15或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，其中重链可变区的CDR包含SEQ ID 17、18和19或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中可变轻链的CDR包含SEQ ID 21、22和23或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，其中重链可变区的CDR包含SEQ ID 25、26和27或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列和其中可变轻链的CDR包含SEQ ID 29、30和31或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失和/或插入的所述序列。

因此本发明的实施方案涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列组之一：SEQ ID 1、2和3，SEQ ID 9、10和11，SEQID 17、18和19，SEQ ID 25、26和27或者每一序列具有至多两个取代、缺失和/或插入的所述序列和其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列组之一：SEQ ID 5、6和7，SEQ ID 13、14和15，SEQ ID 21、22和23，SEQ ID 29、30和31或者每一序列具有至多两个取代、缺失和/或插入的所述序列。

因此本发明的实施方案涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列组之一：SEQ ID 1、2和3，SEQ ID 9、10和11，SEQID 17、18和19，SEQ ID 25、26和27或者每一序列具有至多一个取代、缺失和/或插入的所述序列和其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列组之一：SEQ ID 5、6和7，SEQ ID 13、14和15，SEQ ID 21、22和23，SEQ ID 29、30和31或者每一序列具有至多一个取代、缺失和/或插入的所述序列。

因此本发明的实施方案涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列组之一：SEQ ID 1、2和3，SEQ ID 9、10和11，SEQID 17、18和19，SEQ ID 25、26和27，和其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含以下序列组之一：SEQ ID 5、6和7，SEQ ID 13、14和15，SEQ ID21、22和23，SEQ ID 29、30和31。

本发明的实施方案涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 4、12、20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ IDNO: 4、12、20或28具有至少96、97、98或99%同一性的序列。

本发明的一方面涉及抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。

在本发明的一个实施方案中涉及抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQ IDNO 8、16、24或32具有至少96、97、98或99%同一性的序列。

因此本发明的实施方案涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO:4、12、20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列和/或其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。

在本发明的一个实施方案中涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ IDNO: 4具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQID NO 8具有至少96、97、98或99%同一性的序列。

在本发明的一个实施方案中涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ IDNO: 12具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQID NO 16具有至少96、97、98或99%同一性的序列。

因此在本发明的一个实施方案中涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 20具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 24具有至少96、97、98或99%同一性的序列。

因此在本发明的一个实施方案中涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO：28具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 32具有至少96、97、98或99%同一性的序列。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ IDNO 39具有至少96、97、98或99%同一性的序列和/或其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQID NO 40具有至少96、97、98或99%同一性的序列。

在本发明的一个实施方案中是抗体，其中所述抗体的重链可变区由SEQ ID NO 39确定和/或其中所述抗体的轻链可变区由SEQ ID NO 40确定。

在抗体成熟期间，自发突变可发生在框架区中，如本文实施例6和7所述，将所分离的单克隆抗体中的一个的可变区与人抗体种系序列进行比较，以对于重链和轻链两者鉴定最近的人种系序列。为了使免疫反应风险最小化，因此决定进一步优化抗体，即通过在框架区内引入点突变以构建在框架区内具有人种系序列的抗体，正如实验中可见，这不影响抗体功能性。

在一个实施方案中，本发明涉及抗体，所述抗体由与上文所述的参考抗体的可变区的序列同一性来定义，其中所述抗体的重链和/或轻链的可变区在框架区中包含一个或多个突变。依据本发明，可能有吸引力的是，引入一个或多个突变，以增加与最近的人种系序列的同一性，尽管也可考虑其它突变。在一个实施方案中，这样的突变是保守的突变。

通过Fc区定义的抗体

Fc区使抗体能够活化免疫系统，抗体可经工程改造以便在Fc区内包含修饰，通常改变一种或多种其功能性质，例如血清半衰期、补体结合、Fc-受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原-依赖性细胞毒性，或缺乏它们。此外，本发明的抗体可经化学修饰(例如可将一个或多个化学部分连接到抗体)或经修饰以改变其糖基化，此外也改变抗体的一种或多种功能性质。

本发明的一方面涉及结合C5aR的抗体或本文所述的由序列定义的抗体(参见下文)，其中Fc区具有针对一个或多个FcγR的降低的或消除的结合亲和力。

在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的结合C5aR、优选人C5aR的抗体，或本文所述的由序列定义的抗体(参见下文)，其中Fc区具有针对一个或多个FcγR的降低的结合亲和力。

在一个实施方案中，与分别由SEQ ID NO 33、34、35和36定义的IgG1、IgG2、IgG2/4或IgG4 Fc参考序列相比，本发明的抗体表现出针对一个或多个FcγR的降低的结合亲和力。因为特定的氨基酸残基可负责FcγR相互作用和在本文中所考虑的作用，所以可能有利的是，应用这样的抗体，其中Fc区的所述特定氨基酸残基已被不同的氨基酸取代。

在一个实施方案中，与分别由SEQ ID 33、34、35和36定义的IgG1、IgG2、IgG4/G2或IgG4 Fc参考序列相比，所述Fc区包括一个或多个点突变，降低了针对一个或多个Fcγ受体或补体成分的亲和力。

为了评价在Fc区内引入点突变的结果，如实施例4所述，评价了一系列抗C5aR抗体的效应子功能。建立了吞噬作用测定以测定Fc区在抗hC5aR抗体诱导人单核细胞的嗜中性粒细胞(表达hC5aR)吞噬作用的能力中的作用。可从表2看出，在所述测定中，若干Fc变体降低了抗C5aR抗体所诱导的吞噬作用水平。

在本发明抗体的一个实施方案中，所述抗体在体外不显著诱导嗜中性粒细胞的吞噬作用，意味着吞噬作用水平并未显著超过背景，当在抗C5aR抗体不存在时测定。在一个实施方案中，所述抗体不产生对吞噬作用的任何可检测的诱导。如实施例4所述，可使用人嗜中性粒细胞进行用于评价吞噬作用水平的测定。

在替代测定中，评价了抗hC5aR抗体诱导ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)的能力。建立这些测定以测试Fc变体经由ADCC或CDC依赖性机制而介导细胞消耗的能力，并假定能够模拟在体内环境中的活性。

如实施例4所述，这些测定应用表达hC5aR的细胞作为靶细胞和效应细胞(单核细胞-消耗的PMBC)或含有补体的血清，以引发反应。

在本发明抗体的一个实施方案中，所述抗体不显著诱导ADCC，意味着ADCC水平并未显著超过背景，当在抗C5aR抗体不存在时测定。在一个实施方案中，所述抗体不产生对ADCC的任何可检测的诱导，也就是说ADCC水平并未超过背景。

在本发明抗体的一个实施方案中，所述抗体不显著诱导CDC。在一个实施方案中，所述抗体不产生对CDC的任何可检测的诱导，也就是说CDC水平并未超过背景。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含Fc区，其中所述序列已经修饰以改变效应细胞的一种或多种功能。可通过在氨基酸序列内的点突变而得到Fc序列的修饰。重链Fc区可以是IgG1、IgG2、IgG4或IgG2/4嵌合序列。参考序列在序列表中定义如下：IgG1由SEQ IDNO: 33定义，IgG2由SEQ ID NO: 34定义，IgG2/4由SEQ ID NO: 35定义和IgG4由SEQ IDNO: 36定义。

在一个实施方案中，Fc区是IgG1 (SEQ ID NO: 33)、IgG2 (SEQ ID NO: 34)、IgG2/4 (SEQ ID NO: 35)或IgG4 (SEQ ID NO: 36)，其具有一个或多个以下点突变：

a. E233P

b. L234A或V234A或F234L或F234V

c. L235E或L235A

d. G236R或G236A

e. G237A

f. S239D

g. S254W

h. N297Q

i. L328R

j. A330S

k. P331S

l. I332E

Fc变体间的差异在于它们与FcγR或补体系统的成分相互作用的能力，如上所述。Fc区中的序列差异进一步影响了抗体的结构和灵活性，这也可能影响抗体功能。如实施例5和表3所述，本发明人进一步证明了与具有IgG4型的Fc区的相应抗体相比，抗hC5aR抗体(其中Fc区是IgG1型的，其具有或没有额外的点突变)是hC5aR介导的作用的更强效的抑制剂。因此，本发明的实施方案涉及本文定义的任何抗体，其具有IgG1同种型的Fc区或至少IgG1同种型的Fc铰链区。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO.33所定义的IgG1 Fc参考序列相比，所述IgG1Fc区包含1-10个氨基酸取代。优选的是Fc区包含较少突变，例如在AA 231-240中的1-8个氨基酸取代，或例如在AA 328-334中的1-5个氨基酸取代。氨基酸取代优选在如上所述的体外降低抗体显著诱导嗜中性粒细胞的吞噬作用、ADCC和/或CDC的能力的取代中选择。

在一个实施方案中，所述抗体Fc区是包含一个或多个以下点突变的IgG1：

a) N297Q和/或

b) L234A和/或

c) L235E或L235A和/或

d) G236R或G236A和/或

e) G237A和/或

f) L328R和/或

g) A330S和/或

h) P331S。

在一个实施方案中，所述抗体Fc区是包含一个或多个以下点突变组的IgG1：

a) N297Q和/或

b) L234A和L235E和/或

c) L234A和G236R和/或

d) L235E和G236R和/或

e) L234A、L235E和G236R和/或

f) G236R和L328R和/或

g) N297Q、L234A和L235E和/或

h) N297Q、L234A、L235E和G236R和/或

i) N297Q、L234A、L235E和G237A和/或

j) L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。

k) N297Q、L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。

a) N297Q和/或

b) L234A和L235E和/或

c) G236R和L328R和/或

d) N297Q、L234A和L235E和/或

e) N297Q、L234A、L235E和G237A和/或

f) L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。

技术人员清楚，根据标准准则，可引入重链和轻链的框架区内的点突变，因为取代氨基酸残基在本发明范围内。本文所述的功能性测定可用于证实这样的突变不影响抗体的功能性。

由上文显然的是，所鉴定的抗体的结合特异性由可变区或CDR提供，并且显然，本发明包括具有类似抗原结合区的不同类型的抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体是全长抗体。在本发明的一个实施方案中，所述抗体是抗体片段或单链抗体。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体是人、小鼠、大鼠、兔、猪或非人类灵长类的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是小鼠抗体或人抗体。在一个实施方案中，所述抗体是人抗体。在一个实施方案中，所述抗体是人源化抗体。正如本申请的定义部分所述，人源化抗体至少包括并非源自人种系序列的CDR区。由上文还显然的是，与种系序列相比，人抗体可包含一个或多个点突变，但通常认为所述序列应当至少在框架区或Fc区内与人种系序列具有至少95%同一性。

药物制剂

本发明还包括药物组合物/制剂，所述药物组合物/制剂包含药学上可接受的载体和本发明的多肽或抗体，以及包含所述组合物的药盒。

在本发明的一方面，本发明的抗体可以配制在药物组合物中。可根据本领域的通用知识配制这样的药物组合物，所述知识例如参见药典或Remington。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含本文所述的抗体以及药学上可接受的载体。所述制剂可以呈水性制剂或干制剂形式，在给药之前将其在水或水性缓冲液组合物中重构。

本发明的抗体的药物组合物可包含盐和/或缓冲剂，例如WO2011/104381中所述的组合物。

在进一步的实施方案中，本发明的抗体的药物组合物可适于多种用途，例如WO2011/147921中所述的组合物。

治疗方法

本发明的一方面涉及在受试者中治疗或预防病症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗量的本文所述的抗体。正如先前的公开例如WO 2009/103113中所述，抗C5aR抗体可用于/适合于治疗多种疾病和病症。因此，本发明的实施方案涉及治疗免疫性疾病或病症、尤其是炎性疾病的方法。本文的实施例8进一步支持这一点，即通过在小鼠关节炎模型中证明本发明的抗C5aR抗体的功能性。实施例9-11证明了在来自银屑病性关节炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎患者的组织样品中C5aR的上调。这进一步证明了抗C5aR抗体可抑制来自银屑病性关节炎患者的滑液所诱导的PMN的细胞迁移。

治疗方法可旨在治愈疾病或病症，但对于包括免疫性和炎性疾病例如慢性疾病或病症在内的某些疾病，缓解一种或多种症状也认为是治疗，其对于受试者可以是显著的改善，甚至只要达到部分症状缓解或者作用仅是暂时的或部分的。

本发明的方法包括治疗一种或多种疾病，包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、炎性肠病(IBD)、克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、肠易激综合征、多发性硬化(MS)、自身免疫性心肌炎、川崎病(Kawasaki disease)、冠状动脉病、慢性阻塞性肺病(COPD)、间质性肺病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病、系统性硬化病、骨关节炎、特应性皮炎、白癜风、移植物抗宿主病、斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、自身免疫性肾炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、慢性炎性脱髓鞘多神经病、ANCA-相关的脉管炎、葡萄膜炎、硬皮病、大庖性类天疱疮、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s Chorea)、囊性纤维化、痛风、年龄相关性黄斑变性、变态反应、哮喘和急慢性炎症所致的其它自身免疫性疾病。在一个进一步的实施方案中，所述疾病或病症是急性或慢性炎症，其中所述病症可以是自身免疫性疾病。在一个实施方案中，所述病症是类风湿性关节炎(RA)、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病(IBD)包括克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)或肠易激综合征。在进一步的实施方案中，所述病症是RA或SLE。除了慢性疾病之外，抗C5aR抗体可能与例如以下急性指征有关：移植、局部缺血/再灌注损伤(例如急性心肌梗塞、中风)、脓毒病(例如SIRS、MODS、ALI)、动脉粥样硬化和脑内出血(ICH)。

另一方面，本发明涉及用于治疗疾病或病症的本文所述的抗体、分离的抗体或抗体组合物。在进一步的实施方案中，所述抗体、分离的抗体或抗体组合物用于治疗本文在以上对于治疗方法所述的一种或多种疾病和病症。

本发明的一方面涉及本文所述的抗体、分离的抗体或抗体组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症可以是如同本文在以上对于治疗方法所述的。

给药方式

本发明的抗体可经胃肠外、例如静脉内、例如肌内、例如皮下给予。或者，本发明的抗体可以经由非胃肠外途径例如经口或局部给予。本发明的抗体可以预防性地给予。在一个优选的实施方案中，所述抗体经静脉内或皮下给予。

给药剂量和时间安排将很可能取决于多种因素，包括所涉及的疾病/病症或症状以及目的受试者。通常，预期给予所述抗体的剂量为0.010 mg/kg至4-6 mg/kg。同样，所述抗体的剂量方案也将取决于各受试者和所述受试者的疾病状态，但合乎需要的是，按照本发明采用一种治疗，其中将所述抗体(或抗体组合物)每周一次或每两周一次或甚至以更低的间隔，例如每月一次给予受试者。

本发明的抗体可以按需要而给予，也就是说所述抗体可根据患者的体验而给予，例如当特定症状出现或当特定生物标记的量达到预定水平时。

具体的联合治疗

本发明的抗体可与一种或更多种其它治疗药剂或制剂联合给予。其它药剂可以是增强本发明的抗体的效果的药剂。其它药剂可以是预期用于治疗患者的其它症状或病况。例如，其它药剂可以是镇痛药、免疫抑制剂或抗炎药。其它药剂可以是另一种单克隆抗体，例如国际专利申请WO 2008/022390和WO 2009/103113中所述的那些中的一种。

可以多种不同方式实现两种或更多种药剂的联合用药。在一个实施方案中，所述抗体和其它药剂可以在单个组合物中一起给予。在另一个实施方案中，所述抗体和其它药剂可以在作为联合治疗的组成部分的单独组合物中给予。例如，调节剂可以在给予其它药剂之前、之后或同时给予。

本发明的抗体可与其它药物(例如甲氨蝶呤、地塞米松和泼尼松)和/或其它生物药物联合给予。在一个实施方案中，按照本发明，抗体可以与一种或多种选自ATC codeM01C类的抗风湿药和ATC code L04的免疫抑制剂(描述于WO 2009/103113)的治疗药剂联合给予，所述治疗药剂包括但不限于硫唑嘌呤、氯喹、羟氯喹、环孢菌素、D-青霉胺、金盐(金硫基苹果酸钠、金诺芬(auranofm))、来氟米特、甲氨蝶呤、二甲胺四环素、柳氮磺胺吡啶和环磷酰胺、糖皮质类固醇、麦考酚酸或麦考酚酯和他克莫司，和在一个单独的实施方案中，一种或多种羟氯喹(Plaquenil)、柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)和甲氨蝶呤、地塞米松和/或泼尼松。

在另一个实例中，本发明的抗体也可与其它抗体联用(例如与结合趋化因子受体(包括但不限于CCR2和CCR3)的抗体联用，或与抗TNF或其它抗炎药或与现有的血浆制品(例如用于预防性或治疗性治疗的市售的丙种球蛋白和免疫球蛋白)联用。本发明的抗体也可用作单独给予的组合物，与抗生素和/或抗微生物药联合给予。

抗体可以与药剂例如已经用于自身免疫的药剂联合给予，所述药剂包括但不限于免疫调节剂，例如IFN-beta、Orencia™ (CTLA4-Ig)、Humira™ (抗TNF)、Cimzia™ (抗TNF、PEG Fab)、Tysabri™ (a4-整联蛋白 mAb)、Simponi™、Rituxan/MabThera™、Actemra/RoActemra™、Kineret™、Raptiva、Ustekimumab、非甾体抗炎药(NSAID)例如Asprin™、Ibuprofen™等，皮质类固醇、疾病修饰性抗风湿药(DMARD)例如Plaquenil™(羟氯喹)、Azulfidine™ (柳氮磺胺吡啶)、Methotrexate ™ (甲氨蝶呤)等、Copaxone™(glatirimer acetate)、Gilneya™ (芬戈莫德)，抗生素例如Flagyl™、Cipro™、局部(皮肤施用的)药物包括局部皮质类固醇、维生素D类似物乳膏(Dovonex™)、局部类视色素(Tazorac™)、润湿剂、局部免疫调节剂(他克莫司和吡美莫司)、煤焦油、地蒽酚等等，此外，还有光疗例如PUVA、UVB和CellCept™ (麦考酚酸吗乙酯)可以与采用本发明抗体的治疗联合。

可以是待治疗受试者已经接受一种或多种其它药物治疗(在可将本发明的抗体加入到所述治疗方案中的情况下)。

抗体制备的方法

可通过本领域已知的多种方法制备抗体，主要依赖于杂交瘤克隆用于产生抗体，或者在重组宿主中表达抗体，其中后者描述于WO2010/000864。根据本领域的知识，可以构建编码所需抗体链的核苷酸序列并用于抗体的重组表达，其中可从一条或两条多核苷酸表达重链和轻链。

本发明在另一方面涉及一个或多个分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本文所述的抗体的抗体链的多肽序列。

一个进一步的实施方案涉及包含一个或多个多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码本文所述的抗体的抗体链的多肽序列。

本发明还涉及生产本发明的抗体的方法，所述方法包括在支持抗体链的一个或多个多肽序列表达的条件下培养上述宿主细胞。所述方法可以进一步包括抗体链由在一个毗邻的多核苷酸上的两个单独的可读框编码和任选地从所述宿主细胞培养物中回收抗体。

本发明可由以下实施方案来描述，但并非将本发明限制于此。

实施方案

1. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 1或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 2或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 3或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。

2. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含SEQ ID 1、2和3或所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

3. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列与SEQ ID 1、2和3相同。

4. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 5或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 6或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 7或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。

5. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含SEQ ID 5、6和7或所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

6. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列与SEQ ID 5、6和7相同。

7. 抗体，其中重链可变区如实施方案1、2或3中的任一个所定义和其中轻链可变区如实施方案4、5或6中的任一个所定义。

8. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 9或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 10或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 11或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。

9. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含SEQ ID 9、10和11或所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

10. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列与SEQ ID 9、10和11相同。

11. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 13或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 14或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 15或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。

12. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含SEQ ID 13、14和15或所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

13. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列与SEQ ID 13、14和15相同。

14. 抗体，其中重链可变区如实施方案8、9或10中的任一个所定义和其中轻链可变区如实施方案11、12或13中的任一个所定义。

15. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 17或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 18或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 19或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。

16. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含SEQ ID 17、18和19或所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

17. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列与SEQ ID 17、18和19相同。

18. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 21或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 22或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 23或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。

19. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含SEQ ID 21、22和23或所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

20. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列与SEQ ID 21、22和23相同。

21. 抗体，其中重链可变区如实施方案15、16或17中的任一个所定义和其中轻链可变区如实施方案18、19或20中的任一个所定义。

22. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 25或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 26或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 27或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。

23. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含SEQ ID 25、26和27或所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

24. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列与SEQ ID 25、26和27相同。

25. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，

其中所述CDR1序列包含SEQ ID 29或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR2序列包含SEQ ID 30或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列和/或

其中所述CDR3序列包含SEQ ID 31或者具有1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入的所述序列。

26. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列包含SEQ ID 29、30和31或所述序列的变体，其中1、2或3个氨基酸被不同的氨基酸残基取代。

27. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列与SEQ ID 29、30和31相同。

28. 抗体，其中重链可变区如实施方案22、23或24中的任一个所定义和其中轻链可变区如实施方案25、26或27中的任一个所定义。

29. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 4、12、20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列。

30. 实施方案29的抗体，其中所述抗体的重链可变区在框架区中包含一个或多个突变。

31. 实施方案29的抗体，其中所述突变是保守的突变。

32. 实施方案29的抗体，其中所述突变增加与最近的人种系序列的同一性。

33. 实施方案32的抗体，其中所述抗体的重链可变区由SEQ ID NO 39确定。

34. 抗体，其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO: 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。

35. 实施方案34的抗体，其中所述抗体的轻链可变区在框架区中包含一个或多个突变。

36. 实施方案35的抗体，其中所述突变是保守的突变。

37. 实施方案35的抗体，其中所述突变增加与最近的人种系序列的同一性。

38. 实施方案34的抗体，其中所述抗体的轻链可变区由SEQ ID NO 40确定。

39. 抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 4、12、20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列和其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO: 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。

40. 实施方案39的抗体，其中所述重链可变区的序列与SEQ ID NO: 4、12、20或28具有至少96%，例如97%，例如98%或例如99%同一性和其中所述轻链可变区的序列与SEQ IDNO: 8、16、24或32具有至少96%，例如97%，例如98%或例如99%同一性。

41. 实施方案39或40的抗体，其中所述抗体的重链可变区在框架区中包含一个或多个突变和/或其中所述抗体的轻链可变区在框架区中包含一个或多个突变。

42. 实施方案41的抗体，其中所述突变是保守的突变。

43. 实施方案41的抗体，其中所述突变增加与最近的人种系序列的同一性。

44. 实施方案41的抗体，其中所述抗体的重链可变区由SEQ ID NO 39确定和/或其中所述抗体的轻链可变区由SEQ ID NO 40确定。

45. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体结合C5aR。

46. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是全长抗体或抗体片段或单链抗体。

47. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

48. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是人、小鼠、大鼠、兔、猪或非人类灵长类的抗体。

49. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是小鼠抗体或人抗体。

50. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

51. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是人抗体。

52. 结合C5aR的人抗体。

53. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体结合人C5aR。

54. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体结合C5aR的第二胞外环。

55. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体结合人C5aR的第二胞外环。

56. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体结合人C5aR，而非鼠C5aR。

57. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体结合人C5aR的第二胞外环、而非鼠C5aR的第二胞外环。

58. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体仅结合天然构象的人C5aR的第二胞外环。

59. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体显著抑制或降低C5a与人C5aR的结合。

60. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体在SPA测定中能够取代C5a，其IC50低于10 nM或低于5 nM或优选地低于3 nM。

61. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体在体外显著抑制嗜中性粒细胞的迁移。

62. 前述实施方案中任一个的抗体，其中与在10nM C5a和无抗体存在下30分钟后观察到的迁移水平相比，当在10 nM C5a存在下30分钟后测定，所述抗体减少迁移至小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于15%或小于10%，或其中在相同设置下IC50低于2.5 µg/ml，例如低于2.5 µg/ml，例如低于1.5 µg/ml，例如低于1.2 µg/ml或甚至低于1.0 µg/ml。

63. 前述实施方案中任一个的抗体，其中当通过对嗜中性粒细胞的竞争配体结合测定而测定的所述抗体的亲和力低于0.80 nM，例如低于0.50 nM或0.35 nM。

64. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体在离体中和C5a诱导的嗜中性粒细胞活化，且在钙流量测定中测定的IC50低于7.0 µg/ml，例如低于5.0 µg/ml，例如低于2.5 µg/ml。

65. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体在离体抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞成熟，且

a. 在CD11b上调测定中测定的IC50低于3.5 µg/ml，例如低于2.5 µg/ml，例如低于1.5 µg/ml或甚至低于1.0 µg/m或

b. 在CD62L下调测定中测定的IC50低于1.8 µg/ml，例如低于1.5 µg/ml，例如低于1.2 µg/ml或甚至低于1.0 µg/ml。

66. 结合C5aR的抗体，其中与分别由SEQ ID 33、34、35和36定义的IgG1、IgG2、IgG4或IgG4/G2 Fc参考序列相比，Fc区具有与一个或多个Fcγ受体的减少的亲和力/降低的结合。

67. 前述实施方案中任一个的抗体，其中与分别由SEQ ID 33、34、35和36定义的IgG1、IgG2、IgG4或IgG4/G2 Fc参考序列相比，Fc区包括一个或多个点突变，降低了针对一个或多个Fcγ受体的亲和力。

68. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体在体外不显著诱导嗜中性粒细胞的吞噬作用。

69. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体在体外不显著诱导ADCC。

70. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体在体外不显著诱导CDC。

71. 前述实施方案中任一个的抗体，其中Fc区是IgG1 (SEQ ID NO: 33)、IgG2(SEQ ID NO: 34)、IgG2/4 (SEQ ID NO: 35)或IgG4 (SEQ ID NO: 36)，其具有一个或多个以下点突变：

a. E233P

b. L234A或V234A或F234L或F234V

c. L235E或L235A

d. G236R或G236A

e. G237A

f. N297Q

g. L328R

h. A330S

i. P331S。

72. 前述实施方案中任一个的抗体，其中Fc区是IgG1或IgG1突变体。

73. 前述实施方案中任一个的抗体，其中与SEQ ID NO. 33中所定义的IgG1 Fc参考相比，Fc区是包含1-10个氨基酸取代的IgG1 Fc突变体。

74. 前述实施方案中任一个的抗体，其中Fc区是包含在AA 231-240中的1-8个氨基酸取代的IgG1 Fc突变体，其中IgG1 Fc参考序列如SEQ ID NO. 33中所定义。

75. 前述实施方案中任一个的抗体，其中Fc区是包含在AA 328-334中的1-5个氨基酸取代的IgG1 Fc突变体，其中IgG1 Fc参考序列如SEQ ID NO. 33中所定义。

76. 前述实施方案中任一个的抗体，其中抗体Fc区是IgG1，其具有一个或多个以下点突变组：

a. N297Q和/或

b. L234A和L235E和/或

c. G236R和L328R和/或

d. N297Q、L234A和L235E和/或

e. N297Q、L234A、L235E和G237A和/或

f. L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。

77. 前述实施方案52-76中任一个的抗体，其中所述抗体是全长抗体或抗体片段或单链抗体。

78. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

79. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是人、小鼠、大鼠、兔、猪或非人类灵长类的抗体。

80. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是小鼠抗体或人抗体。

81. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

82. 前述实施方案中任一个的抗体，其中所述抗体是人抗体。

83. 用于治疗免疫性疾病或病症的前述实施方案中任一个的抗体。

84. 实施方案83的抗体，其中所述病症是炎性疾病。

85. 实施方案83的抗体，其中所述病症是急性或慢性炎症。

86. 实施方案83的抗体，其中所述病症是自身免疫性疾病。

87. 实施方案83-86中任一个的抗体，其中所述抗体经静脉内或皮下给予。

88. 前述实施方案83-87中任一个的抗体，其中给予所述抗体的剂量为0.010 mg/kg直至6 mg/kg。

89. 前述实施方案83-88中任一个的抗体，其中每周一次或每两周一次给予所述抗体。

90. 前述实施方案83-89中任一个的抗体，其中所述抗体与其它药物联合给予。

91. 前述实施方案83-90中任一个的抗体，其中所述疾病或病症是类风湿性关节炎(RA)、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)或肠易激综合征。

92. 前述实施方案83-91中任一个的抗体，其中所述患者正用其它药物例如甲氨蝶呤治疗。

93. 在受试者中治疗或预防病症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者治疗量的实施方案1-82中任一个的抗体。

94. 实施方案93的方法，其中所述病症是免疫性疾病或病症。

95. 实施方案93或94的方法，其中所述抗体经静脉内或皮下给予。

96. 实施方案93-95中任一项的方法，其中给予所述抗体的剂量为0.010 mg/kg直至6 mg/kg。

97. 实施方案93-96中任一项的方法，其中每周一次或每两周一次给予所述抗体。

98. 实施方案93-97中任一项的方法，其中所述抗体与至少一种其它药物联合给予。

99. 实施方案93-98中任一项的方法，其中所述病症是免疫病理性病症例如自身免疫性疾病。

100. 实施方案93-99中任一项的方法，其中所述受试者是罹患以下疾病的患者：类风湿性关节炎(RA)、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病(IBD)、克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)或肠易激综合征。

101. 实施方案93-101中任一项的方法，其中所述患者正用其它药物治疗。

102. 药物组合物，所述药物组合物包含实施方案1-82中任一个的抗体以及任选的药学上可接受的载体。

103. 实施方案102的药物组合物，所述药物组合物呈水性制剂或干制剂形式，在给药之前将其在水/水性缓冲液中重构。

104. 分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码实施方案1-82中任一个的抗体的多肽序列。

105. 宿主细胞，所述宿主细胞包含实施方案104的一个或多个多核苷酸。

106. 生产实施方案1-82中任一个的抗体的方法，所述方法包括在支持所述抗体的一个或多个多肽序列表达的条件下培养实施方案105的宿主细胞。

107. 实施方案106的方法，其中所述重链和轻链由在一个毗邻的多核苷酸上的两个单独的可读框编码。

108. 实施方案106或107的方法，所述方法进一步包括从所述宿主细胞培养物中回收所述抗体。

109. 实施方案1-82中任一个的抗体在制备药物中的用途。

110. 实施方案1-82中任一个的抗体在制备用于治疗以下免疫性疾病或病症的药物中的用途：例如类风湿性关节炎(RA)、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病(IBD)或肠易激综合征。

实施例

实施例1: 人抗hC5aR抗体的产生

免疫和筛选

一般而言，产生针对GPCR的抗体是困难的，因为具有正确天然蛋白构象的可溶性蛋白是非常难以生产(如果不可能)。传统地，过量表达GPCR的细胞已经用于免疫，但是所导致的抗体反应却趋向于非常不特异，这使得难以鉴定具有所需特性即能够阻断配体结合和GPCR信号传导)的抗体。的确，本发明人发现开发可阻断C5a与C5aR结合的人抗hC5aR抗体是非常具有挑战性的，并且在鉴定这些抗体之前应用多种免疫策略。

HumAb小鼠(Medarex)用具有高表达人C5aR (约80,000拷贝/细胞)的L1.2-小鼠细胞(小鼠B细胞淋巴瘤系)免疫(Lee等人Nat. Biotechnol, 2006；10:1279-1284)，然后使用标准程序，将来自免疫小鼠的脾细胞用于细胞融合。因为缺乏可溶性hC5aR，所以不能在标准ELISA测定中筛选上清液，因此建立了基于细胞的结合测定。通过WO2008/022390中所述的FACS分析，测试所得杂交瘤上清液与稳定表达高数量(约1,000,000拷贝/细胞)天然hC5aR的经转染大鼠细胞系(RBL)的结合。通常，将杂交瘤上清液与未转染的细胞(用CellTracker标记)和hC5aR-转染的细胞、或来自hC5aR敲出/敲入(KOKI)小鼠的嗜中性粒细胞的混合物一起孵育(WO 2005/060739)，并与APC-缀合的F(ab')2山羊抗人IgG (IgG-APC)一起孵育。鉴定与hC5aR-转染的细胞、而非未转染的细胞结合的上清液，然后将产生抗hC5aR的杂交瘤亚克隆并测试与人嗜中性粒细胞和分离自KOKI小鼠的骨髓衍生的嗜中性粒细胞的结合(数据未显示)。使用蛋白A琼脂糖和标准方案，从杂交瘤上清液中纯化抗hC5aR抗体。

实施例2:抗hC5aR抗体的鉴定和表征

如所述的，获取人抗hC5aR抗体的方法是有问题的，在鉴定hC5a/hC5aR阻断的抗体之前，必须进行32次融合。从35次融合和超过100,000个杂交瘤上清液的筛选中，仅鉴定出11个可阻断hC5a与hC5aR结合的克隆。用于表征抗体的测定描述如下。参考抗体(Ref. AbQ)描述于WO2009/103113。另外，适于在钙流量测定中和在CD11b上调中测定亲和力和功能性的进一步测定描述于实施例7。

取代测定

应用闪烁接近测定(Scintillation Proximity Assay, SPA)，以便测定抗hC5aR抗体取代hC5a与hC5aR的结合的效能。SPA的详述在美国专利4568649和制造商(AmershamBiosciences)给出的方案中提供。简而言之，纯化自RBL-hC5aR细胞的携带受体的膜片段结合到包被有麦胚凝集素(WGA)的闪烁微颗粒。加入放射标记的hC5a (¹²⁵I)示踪物之后，与受体的结合将导致从颗粒发射光。特别对于SPA原理，仅彼此直接接近的放射性同位素和颗粒将发射光。即只有与受体结合的放射标记的hC5a与WGA-颗粒足够接近，以产生光。因此，所发射的光量表示结合受体的¹²⁵I-hC5a的量。该测定是竞争测定，其中抗hC5aR/未标记的hC5a与示踪物竞争性结合到受体。在该测定中，将固定量的¹²⁵I-标记的C5a加入到WGA-颗粒和C5aR受体，导致一定量的光发射，测定为每分钟的计数(cpm)。如果加入未标记的C5a或抗C5aR，其与受体的结合将导致较低的cpm，因为¹²⁵I C5a的取代。%取代计算如下：

S: 样品

S_max: 非特异性结合。通过添加足以替代特异性结合的¹²⁵I-hC5a的量的未标记的hC5a而测定。

S₀: 最大结合。不加入未标记的hC5a。

IC50值定义为取代50% C5a的浓度。在实验之间cpm保持恒定，IC50值相当于示踪物随时间的衰减。测定人抗hC5aR抗体取代¹²⁵I-hC5a的效能(IC50)，数据在表1中提供。

嗜中性粒细胞迁移(趋化作用)测定

在Boyden室中分析了抗体抑制hC5a (或mC5a)-依赖性嗜中性粒细胞迁移的效能。分离自人或动物血的嗜中性粒细胞用钙黄绿素染色并加入到Boyden室的上区室并与抗体混合。将hC5a或mC5a施加到Boyden室的下区室并作为嗜中性粒细胞的化学引诱物起作用。通过对通过3或5μm fluoroblok膜的钙黄绿素染色的嗜中性粒细胞计数，测定嗜中性粒细胞迁移到下室的能力。

人PMN (多形核白细胞；粒细胞)得自抽入含有EDTA的小管中的人血样品。通过在室温下使血(4份)通过Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care)梯度(3份)离心30分钟(400x g)，分离血细胞。将含PMN的层悬浮于含有葡聚糖-500 (Sigma)的PBS (磷酸缓冲盐水) 1小时，以除去污染的红细胞。将上清液在室温下离心5分钟(250 x g)，然后使用0.2% NaCl，使剩余红细胞经渗透性裂解55秒。通过1.2% NaCl + PBS使溶液等渗并在250 x g离心5分钟，然后重复渗透性裂解。离心后，将PMN重悬于反应混合物(RM): HBSS (目录号14175Gibco)，其含有NaCl 137mM, KCl 5.3mM, Na₂HPO₄ 0.33mM, NaHCO₃ 4mM, KH₂PO₄ 0.44mM,葡萄糖 5mM；补充有MgSO₄•7H₂O 0.4mM, MgCl₂, 0.5mM, CaCl₂ 0.5mM, HEPES 20mM。通过NucleoCounter (Chemometec)测定细胞密度。通过显微术评价吉姆萨-染色的样品，PMN悬液含有>95%嗜中性粒细胞。

装载PMN: 钙黄绿素, AM, (Fluka)溶于DMSO (二甲亚砜)并用含有细胞(2x10⁶细胞/ml)的RM稀释1000X，得到10 µM浓度。将悬液在37°C温箱中孵育30分钟，然后用RM洗涤3次以除去过量钙黄绿素。最后将细胞重悬于RM (4x10⁶细胞/ml)。

通过Boyden室技术，使用FluoroBlok^® 3μm孔径大小96-孔(目录号351161.BDFalcon (VWR))评价迁移。含有Fluoroblok膜的上室即插入物用在1mg/ml PBS中的人纤维蛋白原(目录号F3879-1G, Sigma)在37°C包被2小时。洗涤后，所述膜用含有2%牛血清白蛋白 (BSA)的PBS溶液封闭。用RM再次洗涤后，将10⁵钙黄绿素-装载的PMN (有或无hC5aR-抗体)加入到各孔并放入含有对照溶液或化学引诱物hC5a (Sigma, C5788)的接收板(下室)。每组包括至少6孔。然后，在读板器(SpectraMax, Molecular devices或Fluoroscan,Thermo Labsystems.)中，在485/538nm处，在37°C，每5分钟测定板，达60分钟。在30分钟时的值(以相对荧光单位计)用作迁移的度量。

曲线拟合。抗体抑制迁移的能力使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software,Inc.)测定，表示为IC50。

表1包括来自取代测定和趋化测定的数据，所述测定测试了10μg/ml 人mAb抑制人嗜中性粒细胞的hC5a-依赖性(10nM)迁移的能力。将抗体不存在时所得的值设置为100。从3个供体汇集数据。平均值包括在表1中。3种mAb 32F3A6、35F12A2和35F32A3在这两种测定中都显示最强效能，其等于或略高于对照抗体Ref的效能。Ab是WO2009/103113中所述的Q。

表1.抗hC5aR抗体的功能性特征.

抗hC5aR mAb CDR序列的表征

来自抗hC5aR Ab 35F32A3、32F3A6、35F12A2和35F24A3的可变区经重组克隆，然后使用标准方法对其核苷酸序列和氨基酸序列进行表征。氨基酸序列包括在图1和所附序列表中。

结合特异性的表征

人-小鼠C5aR嵌合构建体用于测定C5aR的结合区。嵌合受体在HEK细胞中瞬时表达并通过先前在WO 2008/022390中所述的FACS (除了改变细胞系之外)测定单个抗体的结合。32F3A6、35F32A3和35F12A2的结合依赖于人胞外环2序列，而人N-末端是非必需的(图2)。

实施例3. Fc变体的产生

4种人IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)在Fc区中共享超过95%同源性，但在铰链区则显示较大差异。Fc区介导效应子功能，例如抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区结合到免疫效应细胞(例如天然杀伤细胞和单核细胞)表面上的活化Fc受体(FcγR)，导致靶向细胞的吞噬作用或裂解。在CDC中，Fc区在不同于FcγR-结合位点的位点上结合到补体，并且抗体通过在细胞表面触发补体级联而杀伤靶向细胞。各种IgG同种型发挥不同水平的效应子功能，按以下顺序增加：IgG4 < IgG2 < IgG1 < IgG3。按照实施例4所述，通过使用QuickChange^®定点诱变试剂盒(目录号200518, Stratagene)的定点诱变，产生多种IgG Fc变体(其都包含Ref Ab Q的可变区)并表征。

实施例4: Fc变体的效应子功能的表征

Fc变体对FcgR的结合亲和力

通过在BIAcore T100仪器上进行的表面等离振子共振(SPR)测定，使用CM5传感器芯片(GE)，测定Fc变体对FcγR的亲和力。使用胺-偶联化学，将Fc变体固定化到流动室上。对于测定FcγR对Fc变体的亲和力的动力学SPR，将His-FcγR用作分析物并注入到在HBS-EP缓冲液中的流动室。将高亲和力受体FcγRI注入，流速40μl/min，接触时间180秒和解离时间300秒。将其它FcγR注入，流速50μl/min，接触时间30秒和解离时间120秒。芯片表面用含有10mM NaOH和500mM NaCl的溶液再生。亲和力(Kd值)列于表2A中。

表2A. 对Fc变体针对FcγR的亲和力的分析得到的结果概述(Kd以M计)。(- =无结合；0 = 结合无变化；nd^a =因为结合太弱而未计算Kd)。(1)包含IgG2的CH1和较低铰链区，和IgG4的剩余CH2-CH3的IgG2/IgG4 Fc变体；(2)包括点突变S228P的IgG4突变体。

吞噬作用测定

为了鉴定具有介导嗜中性粒细胞的吞噬作用的降低的或消除的能力的Fc变体，建立了体外吞噬作用测定。以下所述的吞噬作用测定包括用荧光染料CMFDA标记分离自外周人血的人嗜中性粒细胞(吞噬作用的靶细胞)，再将它们加入到人单核细胞培养物(也分离自人外周血)。CMFDA-标记的嗜中性粒细胞用试验mAb (或PBS)预先包被，并且与人单核细胞一起孵育之后，通过FACS测定CD14/CMFDA双重阳性单核细胞的数目。来自多个Fc变体的结果见表2B。

所测的所有抗体都包含WO2009/103113中所述的Q抗体的可变区并用作上文的RefAb。

发现单核细胞和巨噬细胞都能够介导嗜中性粒细胞的抗体依赖性吞噬作用，并且建立了使用这两种细胞类型的吞噬作用测定。这两种测定的结果在定性上类似，但是因为巨噬细胞测定更可变，所以分析主要用单核细胞进行。

人单核细胞的制备

人单核细胞和淋巴细胞分离自外周静脉血，其自健康人志愿者中收集到含有EDTA作为抗凝剂的管(K2E, BD Biosciences, 目录号367525)中，使用percoll梯度离心。100ml血通常得到约8 - 20 x 10⁷个外周血单核细胞(PBMC)。将至少3体积的dPBS加入到分离的细胞，然后在室温下(RT)将其在100x g离心10分钟。弃去上清液之后，将淋巴细胞/单核细胞层重悬于与先前步骤相同体积的50:50混合的dPBS:培养基，并再次在室温下在100x g离心10分钟。弃去上清液并在培养基中以1-2x10⁶个细胞/ml重悬淋巴细胞/单核细胞层。重悬的细胞以2 ml/孔，4x10⁶细胞/孔铺板到6孔组织培养板(Corning, Costar目录号3516)，并在37℃在5% CO₂中孵育2小时。通过抽吸而除去非贴壁细胞(淋巴细胞和死细胞)，而贴壁细胞(单核细胞)在1 ml培养基(RPMI 1640 (Invitrogen-GIBCO, 目录号11875) +在56°C加热灭活30分钟的10% FCS (Invitrogen-GIBCO, 目录号16000) + 25 mM Hepes(Invitrogen-GIBCO, 目录号15630) + 1%青霉素/链霉素(Invitrogen-GIBCO, 目录号15070))中洗涤4次，同时温和涡旋，然后吸去洗涤培养基。洗涤血来源的单核细胞之后，将1ml新鲜培养基加入到各孔。从一个孔刮取细胞并悬浮于培养基中，以估测每孔的单核细胞数目。

人嗜中性粒细胞的制备

人嗜中性粒细胞分离自外周静脉血，其收集自健康志愿者，使用percoll梯度离心并用CellTracker™ Green (5-氯甲基荧光素二乙酸酯, CMFDA)染色。100 ml血通常得到约10-20x10⁷个嗜中性粒细胞。通过将CellTracker™ Green CMFDA溶于DMSO至10 mM终浓度，进行染色。以1 x 10⁷细胞/ml在dPBS中重悬嗜中性粒细胞并加入CMFDA至终浓度为2μM。将细胞和染料在37℃一起孵育15分钟。通过用10 ml dPBS洗涤细胞3次以除去过量染料(通过在室温下在300x g离心5分钟)。在最后的洗涤步骤之后进行细胞计数。以2 x 10⁶细胞/ml在dPBS中重悬CMFDA-标记的-嗜中性粒细胞并与抗体(终浓度 0.001, 0.01, 0.1, 1,10或100 µg/ml)或PBS (用于无抗体对照)一起孵育。在某些测定(如所示)中，嗜中性粒细胞+Ab孵育步骤也含有4 mg/ml人IgG。细胞+抗体在37℃孵育30分钟。嗜中性粒细胞用dPBS洗涤2次，然后在室温下在300x g离心5分钟并以1 x 10⁷细胞/ml重悬于培养基。

FACS分析

以在1 ml培养基中的所需浓度，将预先包被抗体(如上所述制备)的CMFDA-标记的嗜中性粒细胞加入到单核细胞(如上所述)。6孔板的各孔中的总体积为2 ml。在某些测定(如所示)中，培养基也含有4 mg/ml 人IgG。通常使用的比率为5:1 (嗜中性粒细胞:单核细胞)。如果贴壁单核细胞数目小于4 x 10⁵/孔，则加入2 x 10⁶个嗜中性粒细胞(即嗜中性粒细胞:单核细胞之比超过5:1)。如果单核细胞数目超过4 x 10⁵个/孔，则加入5倍于嗜中性粒细胞的数目以保持嗜中性粒细胞:单核细胞之比为5:1。在37℃在5% CO₂温箱中将培养物孵育1小时。

孵育后，吸出培养基以去除未贴壁和未摄取的嗜中性粒细胞。贴壁单核细胞用1ml/孔的培养基洗涤(同时温和涡旋)3次。通过使用Cell Scrapers (Corning, 目录号CP3010)从各孔的培养基中刮取细胞，将单核细胞收集到15 ml管中。在室温下将细胞在300x g离心5分钟并去除上清液。将细胞沉淀重悬于在PBS中的160 µl 1% (w/v)多聚甲醛以便固定，然后FACS。

在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上分析样品。在FL-1 (荧光通道1)中使用异硫氰酸荧光素(FITC)鉴定并测定用CMFDA标记的嗜中性粒细胞，并且单核细胞通过用藻红蛋白标记的抗CD14对仅含单核细胞的样品染色而鉴定，其在FL-2 (荧光通道2)中测定。使用仅含单核细胞的样品的FSC (正向散射) vs. SSC (侧向散射)图，限定单核细胞门(gate)，并扩展(沿FSC和SSC轴)，使其包括在孵育期间大小增加的单核细胞。该门排除了含有嗜中性粒细胞的FSC vs. SSC图的区(如在仅含嗜中性粒细胞的样品中的FSC vs. SSC图所限定的)。吞噬作用的程度计算为总的单核细胞门中的% FL-1^+ve 单核细胞。

在含有未用抗体包被的CMFDA-标记的嗜中性粒细胞的样品中(“无Ab” 样品)，非特异性吞噬作用的背景水平是% FL-1^+ve单核细胞。在数据(% FL-1+ve单核细胞vs. Ab浓度)输入用于绘图的Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc)之前，从每个具有Ab的样品中扣除背景。数据经过非线性回归，使用S形剂量反应曲线(sigmoidal dose-response)(可变斜率)，即4-参数逻辑斯谛方程，以确定EC50值(如果合适的话)。

数据见表2B。“-“代表无可检测的吞噬作用和“+”至“++++”代表在测定中所测的低至高水平的吞噬作用。

ADCC (抗体依赖性细胞毒性)和CDC (补体依赖性细胞毒性)测定

建立以下体外测定，以便测试Fc变体经由ADCC或CDC依赖性机制介导细胞消耗的能力。

靶细胞

在这些测定中，靶细胞是表达hC5aR的Ramos克隆E2或人嗜中性粒细胞。使用标准程序，通过用编码hC5aR的哺乳动物表达载体稳定转染Ramos克隆E2细胞，开发表达hC5aR的Ramos克隆E2。所得细胞系表达高水平的人C5aR (为在人嗜中性粒细胞中的5-7倍)和CD20。按照以上对于吞噬作用测定所述，得到人嗜中性粒细胞。

用荧光细胞膜染料PKH-26对靶细胞进行染色。将所需数量的靶细胞(5 x 10⁴/样品/孔x4)在dPBS中稀释至15 ml并在室温下在1,200 rpm离心5分钟。然后将细胞重悬于2 µM PKH-26 (100 µl溶液，对于每1 x 10⁶个靶细胞)。在室温下让标记进行恰好3分钟，然后加入等体积的加热灭活的FCS (或加热灭活的人血清(Millipore))以终止标记反应。恰好1分钟后，将RPMI加入到15 ml的总体积。如上将细胞离心并以2 x 10⁶细胞/ml重悬于测定介质中。对于用抗体包被，将等分试样(25 µl即5 x 10⁴)的PKH-26标记的靶细胞分配到含有在测定介质中稀释的25 µl 200 µg/ml抗体(终浓度100μg/ml)的无菌U形底96孔板的孔中并在37°C在5% CO₂中孵育30分钟。

效应细胞

效应细胞是来自健康供体的单核细胞-消耗的PMBC。如上所述地得到PMBC。将重悬的细胞(淋巴细胞/单核细胞)以2 ml/孔，约4 x 10⁶个细胞/孔铺板到6-孔组织培养板(Corning)，或以每瓶20 mL接种到T75瓶(Corning)，并在37℃在5% CO₂中孵育2小时。通过吸出而除去未贴壁细胞(包括淋巴细胞和NK细胞)并在室温下在100x g离心10分钟。将细胞重悬于20 mL含有100 ng/ml重组人IL-2的培养基，以增加淋巴细胞和天然杀伤细胞的数目。将细胞在37°在5% CO₂中孵育过夜。次日将细胞在室温下在1,400 rpm离心10分钟，然后以2.5 x 10⁷个细胞/ml重悬于测定介质中，用作ADCC测定中的效应细胞。

ADCC测定

用PKH-26标记靶细胞并用抗体包被之后，将100 µl效应细胞或100 µl测定介质(对照，仅靶细胞)直接加入到50 µl靶细胞。将样品在37°C在5% CO₂中再孵育3小时。将样品转移到1.2 ml含有10 µl 10 µM To-Pro-3活力染料(TP-3)的微量滴定FACS管中，终浓度约625 nM，并通过FACS分析样品。在FSC vs. SSC图上，所有细胞(不包括碎片)都被门控(gated)。在FL-2 vs. FSC上分析门控的细胞并且FL-2阳性细胞(即PKH-26标记的靶细胞)被门控。用FlowJo软件(Tree Star, Inc. v6.3.4)分析FACS数据。

计算特异性ADCC，即分别扣除平均% TP3^+ve ‘无Ab仅靶’ (C)和平均% TP3^+ve ‘无Ab靶+效应子’ (D)之后，从相应样品的平均% TP3^+ve ‘靶+效应子’(B)中扣除平均% TP3^+ve‘仅靶’(A)；即

特异性ADCC = (B - D) – (A – C)或= (B – A) – (D – C)

方程1

使用单核细胞-消耗的、IL-2-刺激的人PBMC (主要是NK细胞，但也包括B细胞、T细胞和树突细胞，作为效应细胞群体)，得到表2B所给出的结果。靶细胞是表达hC5aR和CD20两者的转染的细胞系Ramos E2，使得能使用抗CD20抗体利妥昔单抗作为阳性对照。结果范围为：”+++”，表示Fc变体诱导与利妥昔单抗等同效能的ADCC；”+/-”，表示对于Fc变体，可观察到高度的供体变异；和”–”，表示对于Fc变体，未检测到明显的ADCC诱导。包括介导增加的ADCC的Fc变体(IgG1_S239D, I332E) (Chu SY, Vostiar I, Karki S等人；Mol Immunol,2008, 45(15):3926-3933)作为该测定的阳性对照。

CDC测定

也分析了Fc变体诱导CDC的效能。实验设置基本上按照用于ADCC测定所述，除了效应细胞用人血清替代之外。

将靶细胞，例如在含有3%兔补体血清的培养基中的Ramos E2细胞(2 x 10⁶细胞/ml)，与等体积的含有3%兔补体血清的2x抗体溶液(200 µg/ml)在96-孔U形底组织培养板中混合。一式两份的孔组含有在无补体的培养基中与25 µl 2x抗体溶液(200 µg/ml)混合的25 µl Ramos E2细胞(2 x 10⁶细胞/ml)。3孔组含有25 µl Ramos E2细胞(2 x 10⁶细胞/ml)加上在3%兔补体血清中的25 µl测定培养基(‘无Ab’样品)。另一3孔组含有25 µl Ramos E2细胞(2 x 10⁶细胞/ml)加上无补体的25 µl测定培养基(‘无Ab’样品)。孵育之前，将100 µl测定培养基(有或无3%兔补体血清，若适当)加入到各孔中。将样品在37°C在5% CO₂中孵育3小时。

靶细胞活力的测定

将荧光活力染料To-Pro-3 (Molecular Probes)加入到各样品中，立即进行流式细胞术分析。各管中的To-Pro-3终浓度为约62.5 nM。To-Pro-3阳性(TP3+)细胞定义为无活力或已裂解的。

流式细胞术&数据分析

在FACSCalibur (BD Biosciences)上分析样品，所获取数据用FlowJo软件(v6.3.4, TreeStar Inc.)进行分析。在FSC vs. SSC散点图中，对所有细胞(不包括碎片)设门(gating)，各样品收集5,000个靶细胞事件。创建在FL-4通道中的门控靶细胞的直方图，其显示出细胞对To-Pro-3的摄取水平。测定各样品中的TP3+细胞(即无活力细胞)数目，这些定义为主峰右侧的细胞，并且该数目表示为样品中的%的总靶细胞。

可将一式三份测定的样品分为4类(A、B、C和D)中的一类，如以下的分类概述所示。

分类概述

靶细胞与以下孵育：	100 µg/ml Ab	无Ab
			无补体	A	B
兔补体血清	C	D

所分析样品的分类

对于含有抗体的各样品，进行有或无补体的反应。含有抗体而无补体的样品得到抗体特异性背景裂解水平。分类B & D中的样品得到非特异性背景裂解，在抗体或者抗体和补体不存在时。

对于含3%补体的各样品和对于无补体的各样品，计算TP3+无活力的靶细胞的百分比(%裂解)。对于各抗体和‘无Ab’对照，将来自一式三份的样品的数据求平均值。

为了计算各抗体的特异性CDC活性，将在补体不存在时的抗体特异性裂解(在‘A’样品中的平均%裂解)从含有补体的Ab样品的%裂解(‘C_1/2/3’样品)中扣除，然后扣除非特异性背景裂解。非特异性背景裂解是含有补体的‘无Ab’样品中的裂解(在‘D’样品中的平均%裂解)，不含补体的‘无Ab’样品中的较少裂解(在‘B’样品中的平均%裂解)。包括了介导增加的CDC的Fc变体 (IgG1_S254W) (WO08030564)作为该测定的阳性对照。

特异性CDC (%裂解)=(C - A) – (D – B) [或= (C – D) – (A – B)]

方程2

在GraphPad Prism (v4.0)中进行统计学分析，以确定任何组之间的差异是否显著。根据所用的抗体，将来自所有4种测定的各样品的特异性CDC输入电子表格。使用参数检验比较各组：单向方差分析(ANOVA)，然后是Tukey氏多重比较事后检验。

结果包括在表2B中。结果范围为：”+++”，表示Fc变体诱导与IgG1 S254W突变体等同效能的CDC；”+/-”，表示对于Fc变体，可观察到高度的变异；和”–”，表示对于Fc变体，未检测到明显的CDC诱导。

表2B. 在基于细胞的效应子功能测定中的Fc变体活性。

得自Fc变体在吞噬作用、ADCC和CDC测定中的分析的结果概述。(- =无效应子功能；+ =效应子功能)。(1)包含IgG2的CH1和较低铰链区，和IgG4的剩余CH2-CH3的IgG2/IgG4Fc变体；(2)在IgG4 Fc区中引入S228P突变，以便消除半抗体的形成。

实施例5:抗hC5aR抗体Fc变体效能的表征

为了测试Fc区中的突变是否影响抗体分别抑制hC5a与hC5aR的结合和hC5a-介导的嗜中性粒细胞迁移的效能，在上述取代和迁移测定中测试不同的Fc变体。如上所述地进行嗜中性粒细胞迁移测定，不同之处在于所用的PMN是分离自hC5aR-KO/KI小鼠(mC5a-受体敲出/人C5aR敲入, WO 2005 060739)的小鼠PMN。如下获取细胞。骨髓PMN分离自两只hC5aR-KO/KI小鼠的股骨和胫骨。使用PBS将骨髓细胞从骨上冲洗下来，然后将细胞悬液通过Cell Strainer (BD Falcon, 352350；70微米尼龙网)过滤到50 ml管中并离心(10分钟,1600 rpm)。将细胞重悬于培养基中并在无菌的15 ml管中在3 ml Ficoll-Paque PLUS (GEHealthcare)之上小心分层。在室温下在600x g离心20分钟后，分离嗜中性粒细胞/红细胞沉淀。用裂解缓冲液(Sigma, R7757；在10 mM Tris-HCl中的8.3g/L氯化铵，pH 7.5)将红细胞裂解1分钟。两轮离心和洗涤后，将细胞沉淀重悬于反应混合物。通过显微术评价吉姆萨-染色的样品，悬液含有>95%嗜中性粒细胞。所测抗体的可变区与Ref. Ab Q的可变区相同。数据提供于表3。

对于Fc变体，在SPA分析中观察到在抑制hC5a与hC5aR的结合的效能中的显著差异(表3, 1列)。将Ref. Ab Q的IgG1形式与额外的IgG Fc变体一起分析，数据显示与IgG4和IgG2/IgG4 Fc变体两者相比，IgG1 Fc变体总体上更强效地抑制hC5a结合。Ref. Ab Q的F(ab’)₂片段也包括在分析中并且发现其抑制hC5a结合的程度与全长Ref. Ab Q (IgG4)相同。这些发现表明铰链区对于抗体抑制hC5a结合的能力是重要的并且这一概念得到了以下事实的支持：F(ab’)₂片段能够抑制嗜中性粒细胞迁移，其程度与Ref. Ab Q相同(表3)。另外，发现IgG1变体在抑制嗜中性粒细胞迁移中比包含IgG2或IgG4铰链区的IgG更强效(表3,2列)。

Ref. Ab的IgG1形式相对于IgG4形式的更高效能可涉及由于IgG铰链区的灵活性增加所致的亲合力增加。为了研究这一点，通过FACS分析Ref. Ab的IgG1和IgG4形式与人嗜中性粒细胞的结合。数据证明IgG1形式与嗜中性粒细胞的结合比IgG4形式具有更高的亲合力。数据未显示。

总之，这些发现支持了IgG1铰链区中增加的灵活性有助于与hC5aR的增加的结合，这导致增加的效能。

抗体Fc区	hC5a取代(SPA)	对人嗜中性粒细胞的迁移的抑制
			IgG4	++	++
IgG1	+++	ND
			IgG1(L234A_L235E_G237A_A330S_P331S)	+++	+++
IgG1 (S239D, I332E)	+++	++++
			IgG2/4	+	ND
IgG2/4 (V234A, G236A)	+	+
			Ref. Ab Q作为F(ab)₂	++	++

表3. Fc变体对hC5a结合的作用(SPA)和对hC5a的嗜中性粒细胞迁移的作用。

(+ = 低活性, ++=中等活性, +++/+高)。

实施例6. “完整”人抗hC5aR抗体的产生和表征.

根据实施例2中所述的分析，选择抗体32F3A6用于进一步研究，在该抗体的重组克隆期间，鉴定了VH框架区中的7个突变(其不同于人种系序列)，而在LC中未发现框架突变(图3)。通过将来自32F3A6的VH序列和VL序列与所有可用的人种系序列进行比对，发现突变。

为了使抗体甚至进一步人样(human-like)，使32F3A6的VH区中的7个点突变回复突变为人种系残基，并移植到包含5个突变L234A_L235E_G237A_A330S_P331S的IgG1 Fc区上，其显示出消除了对如上所述的吞噬作用、ADCC和CDC的诱导。所述化合物称为32F3A6GL。

将回复突变的抗体的效能与原始抗体进行比较，在抑制hC5a与hC5aR的结合的效能中(在SPA中分析)或在抑制hC5a-介导的嗜中性粒细胞迁移的效能中，在32F3A6或32F3A6GL之间未观察到差异(数据未显示)。

按照实施例4中所述，评估上述完整人抗体诱导嗜中性粒细胞吞噬作用、ADCC或CDC的能力，结果概述于表4。

使用单核细胞-消耗的人PBMC作为效应细胞，人嗜中性粒细胞作为靶细胞，获取表4中包括的关于特异性ADCC的结果。

表4.抗C5aR抗体的Fc-介导的细胞效应子功能。“-“表示无可检测的效应子功能，“+”至“+++”表示低至高水平的效应子功能，如实施例4所述的测定中测定的。ND (未测定)。

如先前所观察的，与野生型IgG1 Fc区相比，IgG1的Fc区中的5个点突变消除了吞噬作用、ADCC和CDC。

实施例7. 人抗hC5aR抗体(32F3A6 GL)的进一步表征

为了进一步阐明所鉴定抗体的功能性并测定亲和力和效能，在与Ref AB Q的比较中使用抗C5aR抗体中的一种，进行了额外的测定。通过对人嗜中性粒细胞的竞争配体结合测定来测定亲和力。该功能性是指通过竞争配体结合测定而测定的抗体亲和力，但也可认为是相互作用的亲合力的度量。离体测定测定了在体外环境中抗体中和C5a介导的作用的能力。效能测定分别测定了对人嗜中性粒细胞的C5a-诱导的Ca-流量、CD11b受体上调和CD62L下调的中和作用。对于32F3A6GL得到的数据见表5。

亲和力测定

从新鲜人血中分离嗜中性粒细胞

用PBS + 2% FBS将血稀释1:1并以3份Ficoll和4份血的比率(15 ml Ficoll和20ml血在50 ml管中)铺在Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare #17-1440-03)上，然后在室温下在400 x g离心30分钟使其分层。通过吸出，将中间的PBMC条带轻轻地除去。用塑料巴氏移液管吸出在堆积红细胞上分层的粒细胞。将粒细胞和红细胞转移并在新的50 ml管中沉淀。用1x PBS将沉淀稀释至40 ml并加入10 ml 4%葡聚糖500 (sigma, 31392)溶液的PBS (比率1:5)并通过颠倒而温和混合。20-30分钟之后，将所得的富含粒细胞的上清液移至新管并在室温下在250 x g离心5分钟。通过将细胞沉淀重悬于7.5 ml 0.2% NaCl中并温和混合55-60秒，在渗透性裂解下除去污染的红细胞。随后加入17.5 ml 1.2% NaCl，然后用PBS稀释至50 ml并在250 x g离心5分钟。将该步骤重复一次。随后将细胞沉淀重悬于1 ml反应混合物(dPBS/RPMI)。用NucleoCounter®监测活力和细胞计数。

对嗜中性粒细胞的竞争配体结合测定

人嗜中性粒细胞经纯化，洗涤并以约5 x 10⁶细胞/ml重悬于结合缓冲液(50 mMHEPES, pH 7.5, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂和0.5%牛血清白蛋白 (FractionV Ig Gfree))。对于每个样品，将40 μl细胞悬液(1 x 10⁵细胞/孔)接种到96-孔V-形板(Greiner,目录号651101)。使用以半对数稀释(half-log dilution)的12个浓度的竞争性未标记的配体，以1 μM开始，作为最大浓度，进行竞争研究。考虑到最终测定体积为120 μl，加入40 μl抗体。将40 µl放射性配体[¹²⁵I]-hC5a (Perkin Elmer, 目录号NEX250)加入到所有样品中，除了背景对照之外。在测定中的放射性配体的终浓度为1 nM，终体积为120 µL。所有样品一式三份运行并在4ºC孵育4小时。然后通过在4°C在1200 rpm离心2分钟以收集细胞并在100 μl洗涤缓冲液(50 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl和0.5%牛血清白蛋白(FractionV Ig G free))中洗涤3次。最终，将细胞重悬于30 μl洗涤缓冲液中并转移至OptiPlate (Perkin Elmer, 目录号6005290)并将150 μl MicroScint 20(Perkin Elmer, 目录号6013621)加入到各孔中。覆盖各板，混合孔在标定的Top Counter上计数，具有1h延迟。在单独的板上测定加入到该测定中的放射性配体的总量。各样品中的计数数量表示为%标准化的值，其中100%是计数的最大水平(其中加入1 nM [¹²⁵I]-hC5a和无冷抗体)，而0%是在1 μM冷hC5a存在下测定的非特异性结合。通过非线性回归，使用PRISM(GraphPad)分析数据。

钙流量测定

人嗜中性粒细胞用Fluo-4 AM细胞染料染色

将嗜中性粒细胞离心并在PBS中洗涤，然后以1 x 10⁷细胞/ml在细胞染料中重悬并在黑暗处在室温下孵育40分钟。将细胞离心并洗涤(以除去过量染料)，再次离心并以2 x10⁶细胞/ml重悬于细胞缓冲液中。将细胞(0.5 ml)等分至未经灭菌的玻璃FACS管中，每种样品一管，贮存在室温下并在2小时之内使用。各样品使用1 x 10⁶个嗜中性粒细胞。

测定

如下进行钙流量测定。简而言之，在0.5 ml细胞缓冲液中的装载Fluo-4 AM的1 x10⁶个嗜中性粒细胞在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析，其中嗜中性粒细胞使用x-轴FSC vs. y-轴SSC门控。在将不同试剂加入管中(例如抗体、C5a、伊屋诺霉素，其以10x终浓度溶于细胞缓冲液、而非I-MGB或C-MGB)之后，FL-1 (FITC)通道用于测定嗜中性粒细胞荧光。连续测定样品荧光，每秒钟获取平均荧光强度(MFI)值。将该数据保存在CellQuest (BD Biosciences)文件夹中并转移至Excel (Microsoft)和Prism (v4.0c,GraphPad Software Inc.)，进行进一步处理和分析。将试剂加入嗜中性粒细胞的顺序和孵育时间因所进行的测定类型不同而异。

C5a中和测定

制备10 x 3倍系列稀释的抗体，浓度范围为1000 µg/ml至1.37 µg/ml。将装载Fluo-4 AM的嗜中性粒细胞(1 x 10⁶在0.5 ml细胞缓冲液中)与50 µl 10x抗体溶液(管中的终Ab浓度: 100 – 0.137 µg/ml)在室温下一起孵育10分钟。通过FACS分析细胞加上抗体达约60秒钟，以确定基线荧光。然后加入50 µl 10 nM C5a，使终浓度为约1 nM并且荧光测量再持续约60秒钟。如果抗体阻断C5a-诱导的Ca²⁺-释放，就没有荧光峰(spike)。如果抗体不中和C5a，就有荧光峰。最后，加入50 µl 1µg/ml伊屋诺霉素至终浓度0.1 µg/ml和并且荧光测量再持续约60秒钟，以确保细胞仍然响应。

CD11b受体上调

测定设置

设计以下设置以测定所鉴定抗体中和C5a-诱导的嗜中性粒细胞活化的能力，即通过测量CD11b表达的变化。

将抗C5aR和同种型对照抗体在PBS中以3倍系列稀释(从600至0.003387 µg/ml)稀释至2x终浓度并将50 µl以一式两份分配到96-孔U形底板的各孔。将全肝素化血的50 µl等分试样加入各孔。4组对照孔(一式两份)含有50 µl PBS加上仅50 µl血。将各板在37°C在5%CO₂温箱中孵育20分钟。为了活化嗜中性粒细胞，将50 µl人C5a，终浓度10或100 nM (按照指定)，加入到含有Ab的孔和一组无抗体的对照孔。将PBS (50 µl)加入到第二组无抗体的对照孔。将终浓度5 µg/ml的豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)加入到第三组无抗体的对照孔。将各板在37°C在5% CO₂温箱中再次孵育20分钟。最终将在PBS中1/50稀释的50 µl抗CD11b-PE(BD Biosciences, 目录号555388)混合物(终浓度1/200)加入到所有孔中(除了第四组的2个无Ab和无C5a或PMA的对照孔，这些样品提供基线MFI值)。将各板在37°C在5% CO₂温箱中再次孵育20分钟，然后在2,000 rpm离心3分钟以沉淀血细胞。除去上清液(150 µl)并将沉淀重悬于200 µl 1x FACS裂解液以裂解红细胞。在室温下5分钟后，将各板再次离心，除去200-225 µl上清液并将沉淀重悬于160 µl 1x FACS裂解液。将细胞移至微量滴定管，用于通过流式细胞术进行分析。

FACS和数据分析

设置FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)，建立补偿参数用于通道FL-2。样品被门控以排除死细胞和碎片。嗜中性粒细胞鉴定为具有高FSC和SSC并且门控。计算在FL-2 (CD11b-PE)通道中的门控嗜中性粒细胞的平均荧光强度(MFI)。

结果表示为扣除背景的%最大CD11b表达。最大CD11b表达(MaxCD11b)是有C5a、但无Ab时孵育的嗜中性粒细胞的平均MFI。最小(背景) CD11b表达(MinCD11b)是无C5a和无Ab时孵育的嗜中性粒细胞的平均MFI。用于计算各样品的%最大CD11b表达的公式是：

% Max_样品= (MFI_样品- MFI_Min) / (MFI_Max – MFI_Min) x 100

将数据输入GraphPad Prism (v4.0)和拟合为S形剂量反应曲线(可变斜率)，即4-参数逻辑斯谛方程，使用非线性回归，以计算EC50。

CD62L受体下调

测定设置

设计以下设置以测定所鉴定抗体中和C5a-诱导的嗜中性粒细胞活化的能力，即通过测量CD62L表达的变化。

通过使用识别CD62L的缀合抗体(BD Biosciences, 目录号559772)，使以上CD11b测定适用于CD62L检测。特别针对CD62L的实验细节见下文。

FACS和数据分析

设置FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)，建立补偿参数用于通道FL-4。样品被门控以排除死细胞和碎片。嗜中性粒细胞鉴定为具有高FSC和SSC并且门控。计算在FL-4 (CD62L-APC)通道中的门控的嗜中性粒细胞的平均荧光强度(MFI)。

结果表示为扣除背景的%最大CD62L表达。最大CD62L表达(MaxCD62L)是无C5a和无Ab时孵育的嗜中性粒细胞的平均MFI。最小(背景)CD62L表达(MinCD62L)是有C5a、但无Ab时孵育的嗜中性粒细胞的平均MFI。用于计算各样品的%最大CD62L表达的公式是：

% Max_样品= (MFI_样品- MFI_Min) / (MFI_Max – MFI_Min) x 100

以上测定的结果概述于下表5。

表5.在亲和力测定、钙流量测定、CD11b和CD62L测定中获得的数据。

数据证实，32F3A6 GL以剂量依赖性方式抑制C5a的作用。对嗜中性粒细胞Ca²⁺释放的抑制随32F3A6 GL浓度增加而增加并且具有比Ref. Ab Q更高的功效，正如更低的IC50值所示。

同样，32F3A6 GL在CD11b和CD62L调节测定中也比Ref. Ab Q更有效，表现出为Ref. Ab Q效能的4-5倍。

在嗜中性粒细胞迁移(趋化作用)测定中对32F3A6 GL的进一步测试也显示出剂量依赖性，IC50为1.0 µg/ml。

实施例8. 在体内小鼠关节炎模型

在K/BxN模型中在hC5aR KO/KI小鼠中测试了在体内的作用(WO 2009/103113和Lee等人, Nat Biotechnol. 2006 Oct;24(10):1279-84)。K/BxN小鼠自发地发展通过针对GPI (自身抗原葡萄糖6-磷酸异构酶)的循环Ab而介导的自身免疫样疾病。来自关节炎性K/BxN小鼠的血清在其它小鼠品系中诱导疾病，其具有人RA标记的许多特征，包括具有关节破坏的慢性进行性疾病。

动物

8–27周龄的人C5aR KO/KI转基因小鼠(C57BL/6；H-2b；人C5aR+/+ /小鼠C5aR-/-；品系缩写: H5Rtg)。

K/BxN血清

为了产生用于实验的血清，将KRNtg雄性小鼠与NOD雌性小鼠杂交。处死携带KRN转基因的F1后代(8-10周龄)(其出现发炎的关节)并通过心脏穿刺而采血。在37°C孵育2小时并在4,000 rpm离心10分钟之后，收集血清。将来自多个小鼠的血清合并，等分并贮存于在-80°C。所有小鼠都注射同一批次的K/BxN血清。

关节炎的诱导和评分

在接受者H5Rtg小鼠中，通过在第0天和第2天i.p.注射150 μl K/BxN血清诱导炎性关节炎。通过测量爪大小并根据前后爪和踝关节的炎症程度确定临床评分，每天监测疾病进程。从第0天起，如下计算平均爪大小的变化。用卡尺每天测量每只后爪踝的厚度(以mm计)。每只后爪的一个或两个读数的平均值是平均每天的爪大小(PS)。平均每天爪大小减去第0天的平均爪大小得出实验的每一天的爪大小的平均变化(ΔPS)。根据表6所示的评分系统，对每只小鼠的每个爪都计算临床评分。对4只爪的评分求和，得出在实验的每一天的每只小鼠的总临床评分(CS)。

表6. 关节炎的临床评分系统

为了确定在第5天哪只小鼠进入治疗阶段，对每只小鼠计算“RA评分”，即通过将临床评分乘以从第0天起的爪大小的变化(以mm计)。通常只有RA评分>0.7的小鼠才进入本研究的治疗阶段。

用32F3A6GL的治疗性治疗

在疾病发作(第0天)之后，在第5天给予KO/KI hC5aR小鼠负荷剂量的32F3A6 GL然后给予9个日剂量。负荷剂量是10、1.5和0.5 mg/kg，日剂量是2、0.5和0.25 mg/kg。每个治疗组的临床评分(平均值+/-SD)见图4。与用无关对照抗体治疗的小鼠相比，用NNC0215-0384的治疗导致炎症的剂量依赖性降低。根据平均爪大小的变化观察到类似作用(未显示)。

实施例9. C5a在银屑病性关节炎患者中的表达水平

在来自11个银屑病性关节炎患者和12个骨关节炎患者(作为对照)的滑液样品中测定C5a。遵循市售C5a ELISA试剂盒的方案(BD OptEIA™, Human C5a ELISA Kit II (BDBiosciences；目录号557965))。数据见图5并概述于下表7。在银屑病性关节炎患者组中C5aR水平显著升高(p= 0.001;Mann-Whitney)，表明C5a在银屑病性关节炎中可能是滑液炎症的驱动者。

表7. 在来自对照和银屑病性关节炎患者的滑液中的C5a的检测水平。

实施例10. 在银屑病性关节炎患者的滑膜中的C5aR表达

含有来自PsA患者的经福尔马林固定和石蜡包埋的滑膜活检样品(n=9)和正常限度内(n=5)的组织微阵列(TMA)片得自Biochain Institute Inc. /BioCat GmbH,Heidelberg, Germany。一个PsA样品来自Dr. Bliddal (Frederiksberg Hospital,Denmark)和Dr. Søe (Gentofte Hospital, Denmark)的合作。所有的人体材料都在供者/或近亲的知情同意下，并在相关的当地伦理委员会BioCat Ge, personal communication；Cambridge BioSciences, Supplier information: Tissue Supply Network (www.bioscience. co.uk)的批准下获得。来自Drs Bliddal/Søe的样品在伦理许可证号H-4-2009-117下获得。使用了以下抗体：小鼠单克隆抗人C5aR (R&D Systems, MAB3648克隆347214 (IgG2a))。小鼠IgG2a同种型特异性对照(Dako, X0943,克隆DAK-GO5)。生物素缀合的驴抗小鼠Jackson ImmunoReseach (715-065-150)。

如下进行免疫组织化学。切片在二甲苯中脱去石蜡并在递减的乙醇浓度中再水化。抗原恢复在Tris-EGTA缓冲液(10mM；0.5 mM), pH 9.0中在微波炉中进行15分钟。按照制造商，内源过氧化物酶活性用3% H2O2阻断，内源生物素通过分别与抗生物素蛋白和生物素阻断液孵育10分钟而阻断。非特异性结合通过与含有3%脱脂奶、7%驴血清, 3%人血清和3.2 mg/ml多聚-L-赖氨酸(PLL)的TBS孵育30分钟而阻断。第一和第二抗体在含有0.5%脱脂奶、7%驴和3%人血清的Tris缓冲液中稀释，并分别在4℃孵育过夜和在室温下孵育60分钟。通过与Vectastain ABC过氧化物酶试剂盒(稀释在含有0.5% Du Pont封闭试剂(TNB)的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7,5))中孵育30分钟进行第一扩增步骤，接着通过在生物素化Tyramide中孵育6分钟进行第二扩增步骤。通过与Vectastain ABC过氧化物酶试剂盒(如上所述地稀释)再次孵育30分钟进行最后的扩增。用二氨基联苯胺实现显色反应。核用苏木精复染色，将切片再水化，在二甲苯中清洁并用Eukitt制片。对于在RA、OA和正常滑膜中的C5aR蛋白表达，进行观察者盲试的TMA评价。使用装备有DP70数码相机的Olympus BX51显微镜(Olympus Denmark A/S；Ballerup, Denmark)进行切片评价。

结果。

在8/10的银屑病性关节炎患者的滑膜下层(sublining layer)中，以及在10/10的银屑病性关节炎患者的基质中，发现C5aR-免疫阳性细胞与淋巴样聚集物混合在一起。对照未显示出在这些滑膜区室(synovial compartment)中的任何C5aR染色(0/5)。4/5的对照以及在10/10的银屑病性关节炎患者的内层细胞(lining layer cell)中检测到C5aR-免疫阳性滑膜细胞。结果概述于下表8。

滑膜区室	正常	银屑病性关节炎患者
			滑膜下层组织的淋巴样聚集物中的浸润的C5aR+细胞	0/5	8/10
基质中的C5aR+细胞	0/5	10/10
			内层中的C5aR+滑膜细胞	4/5	10/10

表8.在正常滑膜和银屑病性关节炎患者的滑膜中的C5aR⁺细胞的检测。在银屑病性关节炎患者与正常滑膜之间进行比较的C5aR表达差异的P-值(Fischer氏精确检验)：0.007 (淋巴样聚集物)和0.0003 (基质)。

实施例11. 抗C5aR对来自银屑病性关节炎患者的滑液所诱导的嗜中性粒细胞迁移的抑制。

嗜中性粒细胞迁移(趋化作用)测定

使用BD FluoroBlok 96-多孔插入系统，在Boyden室测定中分析了抗体抑制人嗜中性粒细胞(人PMN (多形核白细胞))的hC5a-依赖性迁移的效能。

人PMN得自抽入含有EDTA的小管中的人血样品。通过在室温下使血(4份)通过Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care)梯度(3份)离心30分钟(400 x g)，分离血细胞。将含PMN的层悬浮于含有葡聚糖-500 (Sigma)的PBS (磷酸缓冲盐水) 1小时，以除去污染的红细胞。将上清液在室温下离心5分钟(250 x g)，然后使用0.2% NaCl，使剩余红细胞经渗透性裂解55秒。通过1.2% NaCl + PBS使溶液等渗并在250 x g离心5分钟，然后重复渗透性裂解。离心后，将PMN重悬于反应混合物(RM): HBSS (目录号14175 Gibco)，其含有NaCl137mM, KCl 5.3mM, Na₂HPO₄ 0.33mM, NaHCO₃ 4mM, KH₂PO₄ 0.44mM, 葡萄糖 5mM；补充有MgSO₄•7H₂O 0.4mM, MgCl₂, 0.5mM, CaCl₂ 0.5mM, HEPES 20mM。通过NucleoCounter(Chemometec)测定细胞密度。通过显微术评价吉姆萨-染色的样品，PMN悬液含有>95%嗜中性粒细胞。

装载PMN: 钙黄绿素, AM, (Fluka)溶于DMSO (二甲亚砜)并用含有细胞(2x10⁶个细胞/ml)的RM稀释1000X，得到10 µM浓度。将悬液在37°C温箱中孵育30分钟，然后用RM洗涤3次以除去过量钙黄绿素。最后将细胞重悬于RM (4x10⁶个细胞/ml)。

通过膝穿刺，从2个银屑病性关节炎患者得到人滑液(SF)。离心除去细胞之后，将样品冷冻并贮存在-80^oC。对于迁移实验，将样品融化并用含有0.2% EDTA的RM稀释2X。

通过Boyden室技术，使用FluoroBlok^® 3μm孔径大小96-孔(目录号351161.BDFalcon (VWR))评价迁移。含有Fluoroblok膜的上室即插入物用在1mg/ml PBS中的人纤维蛋白原(目录号F3879-1G, Sigma)在37°C包被2小时。洗涤后，所述膜用含有2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭。用RM再次洗涤后，将10⁵钙黄绿素-装载的PMN (有或无hC5aR-抗体)(100μg/ml)加入到各孔并放入含有对照溶液或化学引诱物溶液(hC5a (Sigma,或滑液样品))的接收板(下室)。每组包括4-6孔。通过测定下室中的细胞荧光而实现细胞迁移的定量测定。因为FluoroBlok膜有效地阻断490-700 nm的光通过，未进入下室的细胞的荧光在485/530 nm处检测不到。在具有底部读数能力的荧光读板器(SpectraMax, Moleculardevices,或Fluoroscan, Thermo Labsystems)中，在485/538nm激发/发射波长处，在37°C，每5分钟对板读数一次，达60分钟。

通过在60分钟的荧光值评价迁移，表示为相对荧光值。在表9中，将在同种型抗体存在下的迁移设置为100%并计算抗C5aR抗体抑制迁移的能力。hC5aR抗体明显衰减迁移。10nM hC5a所引发的迁移被抑制83%。3个SF样品的值为：15%、70%和48%。结果证明C5aR-抗体抑制来自银屑病性关节炎患者的SF的化学引诱作用。

	hC5a (10 nM C5a)	SF 样品提供者1	SF 样品提供者1	SF 样品提供者1
					同种型抗体	100	100	100	100
抗C5aR	17	85	30	52

表9. 响应hC5a或来自3个银屑病性关节炎患者的滑液的PMN迁移及其被hC5aR抗体(Ref抗体Q)的抑制。将所有值都标准化至与同种型抗体孵育所检测的迁移。

实施例12. 在克罗恩病和溃疡性结肠炎的患者的肠中的C5aR的表达

正常限度内(n=14)、来自溃疡性结肠炎患者(n=21)和克罗恩病患者(n=25)的肠组织样品得自Cambridge Bioscience (Cambridge, UK)。所有的人体材料都在供者/或近亲的知情同意下，并在相关的当地伦理委员会Cambridge BioSciences, Supplierinformation: Tissue Supply Network (www. bioscience. co.uk)的批准下获得。所用抗体和免疫组织化学方案按照实施例9中所述。

半定量评分

对C5aR免疫阳性(C5aR⁺)细胞进行半定量评分如下：

对粘膜-结合的淋巴样区室(lymphoid compartment)单独评分：粘膜(M):上皮内淋巴细胞(IEL)区室(表面上皮)、固有层和滤泡-结合的上皮(FAE)。粘膜下层(SM): 分离的(单独的)淋巴滤泡(ILF)、淋巴集结(回肠)/结肠IEL (结肠)和分离的浸润淋巴细胞。外肌层(ME): IEL和分离的浸润淋巴细胞。在0-4的量表上对各区室评分：0, 无；1, 少；2 中等；3, 许多；和4, 大量的C5aR⁺细胞。对于各肠层(M, SM, ME)和全部肠的总和(M+SM+ME)计算累积评分。Max评分: M=12, SM=12, ME=8和对于全部肠为32。对于C5aR蛋白表达，通过在GraphPad Prism 5中的Kruskal-Wallis检验以及Dunn氏多重比较事后检验，分析免疫组织化学数据的半定量评分。P<0.05被认为是显著的。

结果

在23/25的CD患者、19/21的UC患者和7/14的正常肠样品中，在上皮内淋巴细胞区室中，在滤泡结合的上皮中，和在粘膜固有层中作为单独的细胞中发现C5aR阳性嗜中性粒细胞和骨髓样细胞(P-值(Fisher氏精确检验)分别为0.005和0.015)。另外，与7/14的正常肠样品相比，在21/25的CD患者和18/21的UC患者中，在淋巴集结/结肠-淋巴滤泡；分离的(单独的)淋巴滤泡和作为粘膜下层的单独细胞中发现C5aR阳性细胞(P-值(Fisher氏精确检验)分别为0.03和不显著)。最终，在CD患者和UC患者的浸润外肌层中，以及在正常肠中，发现C5aR阳性细胞。结果见图6并概述于表10。根据半定量分析，发现与正常肠相比(在整个肠壁中例如3个肠层(粘膜、粘膜下层和外肌层)中的累积评分)，C5aR在CD患者(P<0.01)和UC患者(P<0.05)的肠中表达显著更高。

表10. 与正常肠相比，在克罗恩病和溃疡性结肠炎的患者的肠中C5aR表达的概述。

尽管本文已经说明和描述了本发明的某些特征，但是现在对于本领域普通技术人员而言将出现许多修改、取代、变化和等同方案。因此应理解，所附实施方案意图涵盖落入本发明真实精神内的所有这样的修改和变化。

Claims

1.结合人C5aR的第二环的抗体，其中所述抗体选自：

a. 抗体，其中重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其分别由SEQ ID 1、2和3组成，和其中轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其分别由SEQ ID 5、6和7组成，

b 抗体，其中重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其分别由SEQ ID 9、10和11组成，和其中轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其分别由SEQ ID 13、14和15组成，

c. 抗体，其中重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其分别由SEQ ID 17、18和19组成，和其中轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其分别由SEQ ID 21、22和23组成，

d. 抗体，其中重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其分别由SEQ ID 25、26和27组成，和其中轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3序列，其分别由SEQ ID 29、30和31组成。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 4、12、20或28具有至少80、85、90或94%同一性的序列和其中所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO: 8、16、24或32具有至少80、85、90或94%同一性的序列。

3.权利要求2的抗体，其中所述抗体选自：

a. 抗体，其中

i. 所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 4具有至少96、97、98或99%同一性的序列和

ii. 所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 8具有至少96、97、98或99%同一性的序列，

b. 抗体，其中

i. 所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 12具有至少96、97、98或99%同一性的序列和

ii. 所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 16具有至少96、97、98或99%同一性的序列，

c. 抗体，其中

i. 所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 20具有至少96、97、98或99%同一性的序列和

ii. 所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 24具有至少96、97、98或99%同一性的序列，

d. 抗体，其中

i. 所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 28具有至少96、97、98或99%同一性的序列和

ii. 所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 32具有至少96、97、98或99%同一性的序列，

e. 抗体，其中

i. 所述抗体的重链可变区包含与SEQ ID NO: 39具有至少96、97、98或99%同一性的序列和

ii. 所述抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO 40具有至少96、97、98或99%同一性的序列。

4.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其中当通过对嗜中性粒细胞的竞争配体结合测定而测定时所述抗体的亲和力低于0.80 nM。

5.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体在SPA测定中能够取代C5a，其IC50低于10 nM。

6.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体抑制或降低C5a与C5aR的结合。

7.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体在体外抑制人嗜中性粒细胞的迁移。

8.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其中与在10nM C5a和无抗体存在下观察到的迁移水平相比，所述抗体减少嗜中性粒细胞的迁移至小于20%。

9.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体具有IgG1同种型的Fc铰链区。

10.权利要求9的抗体，其中所述抗体具有IgG1同种型的Fc区。

11.权利要求9的抗体，其中与由SEQ ID 33定义的IgG1参考序列相比，Fc区具有与一个或多个Fcγ受体的降低的结合亲和力。

12.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体在体外不显著诱导ADCC、CDC和/或嗜中性粒细胞的吞噬作用。

13.权利要求10的抗体，其中Fc区是包含在AA 328-334中的1-5个氨基酸取代的IgG1Fc突变体，其中IgG1 Fc参考序列如SEQ ID NO. 33中所定义。

14.权利要求13的抗体，其中Fc区是如SEQ ID NO: 33所示的IgG1，其具有一个或多个以下组的点突变：

a. N297Q和/或

b. L234A和L235E和/或

c. G236R和L328R和/或

d. N297Q、L234A和L235E和/或

e. N297Q、L234A、L235E和G237A和/或

f. L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。

15.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体。

16.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其用于治疗。

17.前述权利要求1-3中任一项的抗体，其用于治疗免疫性疾病或病症。

18.权利要求17的抗体，其中所述免疫性疾病或病症是类风湿性关节炎(RA)、银屑病性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、炎性肠病(IBD)或肠易激综合征。