KR101978757B1 - 치료적 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 C5a 수용체를 인식하는 사람 항체와 관련된다. C5aR에 결합함으로써 항체는 염증 전 신호가 억제되는 C5a 신호 전달을 억제한다. 염증의 자극에서 C5a 및 그것의 수용체의 역할에 기초하여 본 발명은 상기 사람 항-C5aR 항체의 치료적 사용 및 특히 면역학적 장애의 치료에 관하여 더 관련된다.

Description

치료적 항체{THERAPEUTIC ANTIBODIES}
본 발명은 치료적 항체의 분야에 관한 것이다.
각각의 보체 단백질 C3-C5의 단백질 가수분해는 아나필라톡신 (anaphylatoxin)으로 불리는 신호 전달 분자를 가진 아미노-말단 양이온성 단편을 발생시킨다. 이들 중 가장 강한 C5a는 가장 넓은 반응을 유도한다. 염증성 반응의 구성요소를 민무늬근을 수축시키는 능력과 함께, 백혈구의 마지네이션 (margination) 및 침투, 과립-결합된 단백질 가수분해 효소의 방출, 활성 산소 및 질소-유도 라디칼 (radical)의 생산, 혈류의 변화 및 모세관 누출로 생각하면, C5a 분자는 "완벽한" 염증 전-매개자이다. 나노몰 미만에서 나노몰 수준으로, C5a 분자는 모든 골수 계통 (호중구, 호산성 백혈구 및 호염기성 백혈구, 대식세포 및 단핵백혈구)의 주화성을 유도하고, 프로스타글란딘 및 순환 백혈구에 의해 크게 강화된 혈관 투과성을 유발한다. 더 높은 나노몰 농도는 NADPH 산화효소의 탈과립 및 활성화를 유도한다. 생물 활성의 이 폭은 다른 염증성 매개자와 대조를 이룬다. C5a는 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 건선 (psoriasis), 패혈증 (sepsis), 재관류 손상, 및 성인 호흡 장애 증후군 (adult respiratory distress syndrome)을 포함하는 다양한 장애의 발병에 수반된다 (Gerard and Gerard, 1994; Murdoch and Finn, 2000).
C5a의 활성은 C5a의 수용체 (C5aR)에 C5a의 결합에 의해 매개 된다. C5aR은 7개의 G-단백질-커플링 된 수용체의 패밀리에 속한다. C5aR은 ~1 nM의 Kd를 갖는, C5a에 대한 높은 친화도 수용체이고, 백혈구를 포함하는 많은 다른 세포 타입에 위치한다. 세포당 수용체의 수는 극도로 높으며, 최대 백혈구 당 200,000개의 부위이다. 수용체의 생물학적 활성은 결합을 포화시키는 범위에서 발생한다.
C5aR 구조는 7개의 막관통 수용체 패밀리에 따르며, 세포외 N-말단은 세포내 및 세포외 루프로서 교대하고, 세포내 C-말단 도메인으로 끝나는 내부 나선형 도메인에 의해 연결된 7개의 막관통 나선으로 이어진다. C5aR은 연장된 N-말단 세포외 도메인을 함유한다. 이 큰 N-말단 도메인은 IL-8 및 fMet-Leu-Phe (FMLP) 수용체 패밀리를 포함하는 펩티드와 결합하는, 전형적인 G-단백질 커플링 된 수용체이다.
C5aR 길항제로 C5a 반응의 억제는 다른 상보성 구성요소에 영향을 미치지 않고 C5a를 통해 매개 된 급성 염증성 반응을 감소시킨다. 이것을 위하여, C5aR 펩티드 길항제 및 항-C5a 수용체 항체가 이전에 설명되었다 (Watanabe et al., 1995; Pellas et al., 1998; Konteatis et al., 1994; Kaneko et al., 1995; Morgan et al., 1993). 예를 들어, WO 95/00164는 C5aR의 N-말단 펩티드 (잔기 9-29)에 관련된 항체를 설명한다. WO 03/062278은 또한 C5aR에 관련된 항체를 설명한다. 이들 마우스 항체 중 셋은 7F3, 6C12 및 12D4로 불렸다. 이들 항체는 우수한 속성, 예를 들어, 그것의 수용체에 결합하는 C5a의 차단, 시험관 내 호중구의 C5a-관련 이동의 중단, 및 동물 모델에서 염증의 방지에 매우 효과적인 것들을 갖는 것으로 나타났다. 만성 질환을 조절하기 위해 수개월 또는 수년 동안 연속적인 경우에 항체를 투여하는 것이 필요할 수도 있다. 하지만, 마우스 항체를 투여하는 것의 하나의 문제점은 사람 면역 시스템이 마우스 항체에 관련된 그것의 자체 항체를 생성할 수도 있다는 점이다 (HAMA 반응). HAMA 반응은 혈액에서 그것들을 신속하게 제거함으로써 마우스 항체를 중화할 수 있고, 따라서 마우스 항체가 그것의 표적에 결합하는 것을 방지한다. HAMA 반응의 발달을 막기 위해, 적용된 한 계획은 마우스 항체를 사람 서열을 가진 비-에피토프 결합 영역의 많은 "외부" 잔기로 대체함으로써 "사람화"하는 것이다.
사람화 과정의 주요 문제는 항원에 대한 친화도의 손실이었으며 (Jones et al., 1986), 일부 경우에, 특히 항원이 단백질일 때 10배 이상 손실되었다는 것이다 (Verhoeyen et al., 1988). 물론, 어떤 친화도의 손실도 매우 바람직하지 않다. 적어도, 그것은 사람화된 항체 중 더 많은 것이 더 비싼 비용 및 부작용의 더 큰 위험으로 환자에 주사되어야 한다는 것을 의미한다. 더 결정적으로, 감소된 친화도를 갖는 항체는 더 불량한 생물학적 기능, 예를 들어, 상보성 용해를 가질 수도 있다. 항체-의존적 세포 독성, 또는 바이러스 중화를 가질 수도 있다. 이러한 어려움에 직면해 있지만, 항-사람 C5aR 항체의 성공적인 사람화는 WO 2009/103113에 설명되었다.
환자에게 항체를 투여하는 것의 어떤 원하지 않는 부반응 (side reaction)의 위험을 추가로 최소화하기 위해 복수의 계획이 수년 동안 개발되었으며, 이것은 "완전한" 사람 항체의 생성에 의해 환자에서 항-약물 항체의 형성의 가능성을 감소시키는 것을 포함한다.
오늘날에도 치료적 적용에 적합한 항체의 확인은 도전적인 작업이다. 그러므로 진단적 및/또는 치료적 방법에 사용될 수 있는 대안의 및/또는 개선된 C5aR 길항제는 높은 관심으로 남아있다.
본 발명은 항-C5aR 항체 및 진단적 및/또는 치료적 방법에 그것들의 사용에 관한 것이다. 발명자는 여러 양태에서 이전에 설명된 항-C5aR 항체보다 기능적으로 우수한 일련의 항체 결합 사람 C5aR을 확인하였다.
여기에 입증된 바와 같이 발명자는 사람 C5aR (hC5aR)에 결합하는 일련의 사람 항체를 확인하였고 hC5aR에 결합하는 hC5a를 대체하고 hC5a 매개 된 호중구 이동을 억제할 수 있다. 게다가 발명자는 이들 항-hC5aR 항체 중 하나의 프레임워크 영역에 존재하는 비-사람 잔기를 항체의 힘에 영향을 미치지 않고 사람 생식세포 잔기로 성공적으로 전환하였다.
게다가 Fc 영역을 변화시킴으로써 발명자는 시험관 내에서 식균작용, ADCC 또는 CDC를 유발하지 않는 항-hC5aR 항체를 확립하였다. 본 발명의 상세한 설명은 전형적인 구체예의 개시로부터 명백할 것이다.
본 발명의 양태는 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 서열의 다음 그룹; SEQ ID 1, 2 및 3, SEQ ID 9, 10 및 11, SEQ ID 17, 18 및 19, SEQ ID 25, 26 및 27 또는 각각의 상기 서열의 변이체 중 하나를 포함하고 1, 2, 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR 서열은 서열의 다음 그룹; SEQ ID 5, 6 및 7, SEQ ID 13, 14 및 15, SEQ ID 21, 22 및 23, SEQ ID 29, 30 및 31 또는 각각의 상기 서열의 변이체 중 하나를 포함하고 1, 2, 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 hC5aR에 특이적으로 결합하는 사람 항체에 관한 것이며, 상기 항체는 바람직하게 hC5aR의 두 번째 세포외 루프에 결합한다.
본 발명의 양태는 hC5aR에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이며, 항체 Fc 영역은 Fc감마 수용체 (FCγR) 상호작용을 통해 식균작용, ADCC 및/또는 CDC를 유발하는 항체의 능력을 감소시키는 IgG1, IgG2, IgG4 및 IgG4/G2 참조 서열과 비교하여 변형되었다. 특정 구체예에서 항체 Fc 영역은 IgG1이고 더 특정 구체예에서 Fc 영역은 점 돌연변이의 다음 그룹 중 하나 이상을 포함한다
I) N297Q 및/또는
II) L234A 및 L235E 및/또는
III) G236R 및 L328R 및/또는
IV) N297Q, L234A 및 L235E 및/또는
V) N297Q, L234A, L235E 및 G237A 및/또는
VI) L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S.
추가의 양태에서 본 발명은 면역학적 질환 또는 장애의 치료를 위한 본 발명에 따르는 항체의 사용에 관한 것이다.
추가의 양태에서 본 발명은 여기에 설명된 바와 같이 항체의 치료량이 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 장애를 치료하거나 방지하는 방법을 제공하고, 방법은 본 발명의 항체를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 장애는 자가 면역 질환과 같은 면역병리학적 장애이다.
본 발명의 추가의 양태 및 구체예는 여기에서 전형적인 구체예를 포함하는 개시로부터 명백해질 것이다. 본 개시로부터 여기에 특성화된 바와 같이 본 발명은 다양한 이득 및 장점을 가진 새로운 치료적 항체를 제공한다.
도 1은 본 출원에서 분리되고 특성화된 단클론성 항체의 선택의 가변 영역의 정렬을 나타낸다.
도 2는 마우스 및 사람 C5aR 키메라에 대한 항체의 선택의 결합 특이성을 나타낸다. 참조 항체 Q의 결합과 비교하여, 키메라 사람/마우스 C5aR에 대한 32F3A6, 35F12A2 및 35F32A3의 결합은 개략적으로 나타난다. 사람 및 마우스 C5aR로부터 유도된 영역은 각각 가는 선 및 굵은 선으로 나타난다.
도 3은 가장 가까운 생식세포 사람 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 가진 한 항체의 가변 영역의 정렬을 나타낸다. "/"는 "서열의 틈", 예를 들어, V, D 또는 J 세그먼트 사이를 나타낸다.
도 4는 K/BxN-hC5aR-KO/KI 혈청 이동 모델에서 염증으로 확립된 후 5일 후에 0.5, 1.5 또는 10mg/kg 복강 내 단일 로딩 용량이 제공된 후, 이어서 각각 0.25, 0.5 또는 2 mg/kg의 9일 일일량이 제공된 세 개의 처리 그룹에 대한 임상 점수를 나타내며, 에러 바 (error bar)는 ±SD를 나타낸다. 대조군은 IgG1 3G12를 받았다.
도 5는 관절낭액 건선성 관절염 (synovial fluid Psoriatic Arthritis) 및 골관절염 (Osteoarthritis) 환자 (대조군)에서 C5aR 단백질 발현을 나타낸다. C5a 수준은 건선성 관절염 환자 그룹에서 크게 향상되었다 (p = 0.001; 만-휘트니).
도 6은 크론 병 (Crohn's disease) 및 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)에서 C5aR 단백질 발현의 반 정량 분석을 나타낸다. C5aR 단백질 발현은 면역조직화학법에 의해 조사되었고 GraphPad Prism 5에서 던 다중비교 사후 검사 (Dunn's multiple comparison post-test)와 함께 크러스칼-왈리스 검정 (Kruskal-Wallis test)에 의해 분석되었고, P<0.05는 유의한 것으로 생각된다. * P<0.05; ** P<0.01; *** P<O.001.
정의
달리 지시되지 않으면, 본 발명에 활용된 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 표준 과정이고, 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (에디터), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (에디터), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), and F.M. Ausubel et al. (에디터), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모든 업데이트를 포함), Ed Harlow and David Lane (에디터) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (에디터) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons (현재까지 모든 업데이트를 포함)와 같은 출처의 문헌을 통해 설명되고 해명된다.
여기에 사용된 바와 같이, "C5a 수용체", "C5aR", "C5aRI" 또는 "사람 C5aR" 및 이들의 변형은 C5a 아나필라톡신 수용체 및 CD88 항원으로도 업계에 알려져 있는 사람 보체 성분 5 수용체 1을 나타낸다. C5aR은 7개의 막관통 G-단백질-커플링 된 수용체의 패밀리에 속하고, C5a에 결합한다 (Gerard and Gerard, 1991). 하지만, 당업자가 또한 용어 "C5aR"에 의해 포함되는 이 분자의 자연 발생한 대립 유전자 변이체가 있다는 것을 알 것이기 때문에, 사람 C5aR의 아미노산 서열의 예는 SEQ ID NO: 41에 제공된다. 사람 C5aR의 다양한 도메인은 다음과 같이 정의된다:
아미노산 11 - 37: 세포외 도메인 N-말단,
아미노산 38 - 61: 막관통 도메인,
아미노산 62 - 71: 세포내 도메인,
아미노산 72 - 94: 막관통 도메인,
아미노산 95 - 110: 세포외 도메인 - 세포외 루프 1,
아미노산 111 - 132: 막관통 도메인,
아미노산 133 - 149: 세포내 도메인,
아미노산 150 - 174: 막관통 도메인,
아미노산 175 - 206: 세포외 도메인 - 세포외 루프 2,
아미노산 207 - 227: 막관통 도메인,
아미노산 228 - 242: 세포내 도메인,
아미노산 243 - 264: 막관통 도메인,
아미노산 265 - 283: 세포외 도메인 - 세포외 루프 3,
아미노산 284 - 307: 막관통 도메인,
아미노산 308 - 350: 세포내 도메인 - C-말단.
용어 "치료"는, 여기에 사용된 바와 같이, 이들이 필요한 어떤 사람 또는 다른 동물 대상체의 의학적 치료를 나타낸다. 상기 대상체는 상기 특이적 치료의 사용이 상기 사람 또는 다른 동물 대상체의 건강에 이롭다는 것을 나타내는 잠정적 또는 확정적 진단을 제공하는 의사 또는 수의사에 의해 신체 검사를 경험한 것으로 예상된다. 상기 치료의 시기 및 목적은 대상체의 건강의 현상에 따라, 개개마다 다를 수도 있다. 따라서, 상기 치료는 예방적, 완화적, 증상성 및/또는 치유성일 수도 있다. 본 발명에 관하여, 예방적, 완화적, 증상성 및/또는 치유성 치료는 본 발명의 별도의 양태를 나타낼 수도 있다.
의학적 치료에 관하여 용어 "대상체"는 여기에 사용된 바와 같이 어떤 동물, 특히 포유동물, 예를 들어, 사람, 말, 소, 고양이 및 개를 의미하기 위한 것이고, 적절한 경우, 용어 "환자"와 교체 가능하게 사용될 수도 있다. 바람직하게는, 대상체는 사람이다. 여기에 사용된 바와 같이 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료" 및 이들의 변형은 장애의 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 제거하기 위해 충분한 본 발명의 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "방지하는", "방지하다" 또는 "방지" 또는 이들의 변형은 질환의 적어도 하나의 증상에 걸린 대상체를 보호하거나, 장애의 증상의 심각도를 감소시키는 것을 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "세포의 노출"은 사람 C5aR과 접촉/결합할 수 있는 항체를 제공하는 것을 나타내며 C5aR이 세포에 존재한다는 것을 제공한다.
용어 "효과적인 농도 50 퍼센트" ("EC50"으로 축약됨)는 항체 표적의 분자의 특정 효과 (예를 들어 사람 C5aR에 사람 C5a의 결합을 억제/대체)의 50 퍼센트가 필요한 본 발명의 항체의 농도를 나타낸다. 더 낮은 EC50 값이 더 강한 항체에 해당한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "억제하는"은 정의된 활성의 큰 감소, 및 가능한 완벽하게 폐지하는 것을 나타낸다. 바람직하게, 정의된 활성은 적어도 50 퍼센트, 더 바람직하게 적어도 75 퍼센트 및 더 바람직하게 적어도 90 퍼센트만큼 감소하거나 억제된다.
이 명세서를 통해 단어 "포함하다", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만, 어떤 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹도 제외하지 않는다는 것을 나타내는 것으로 생각될 것이다.
구체예에서, 분자는 본질적으로 정의된 서열로 구성된다.
또 다른 구체예에서, 분자는 정의된 서열로 구성된다.
구체예에서, 항체 또는 DNA 서열과 같은 분자는 분리된 분자이다. 용어 "분리된 항체"는 그것의 자연 환경의 또 다른/다른 성분(들)으로부터 분리되고 및/또는 회수되고 및/또는 그것의 자연 환경에서 성분의 혼합물로부터 정제된 항체를 나타낸다.
용어 "항체"는, 여기에 나타난 바와 같이, 전체 항체 및 어떤 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 이들의 단일 사슬을 포함한다. 전체 길이 항체 (또는 전체 항체)는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 네 개의 폴리펩티드 사슬, 두 개의 중쇄 (H) 및 두 개의 경쇄 (L)를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (여기에서 LCVR 또는 VL로 축약됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는, 더 보존된 영역과 함께 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는, 초가변성의 영역으로 더 세분될 수 있다.
각 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되며, 다음 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 첫 번째 성분 (C1q)를 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린의 결합을 매개할 수도 있다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 전체 항체 및 어떤 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 그것의 해당 항원에 특이적으로 결합하는 이들의 단일 사슬을 설명하기 위해 사용된다. 분리된 CDR 또는 항원-결합 잔기 또는 폴리펩티드가 기능적 항체 단편을 형성하기 위해 함께 결합하거나 연결될 수 있는 경우, 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (전형적으로 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인), 단일 사슬 Fv (scFv; 예를 들어. Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; 및 Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883을 참고하면 된다), dsFv, Fd (전형적으로 VH 및 CH1 도메인), 및 dAb (전형적으로 VH 도메인) 단편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인; 단일 VH 및 단일 VL 사슬을 포함하는 1가 분자; 미니바디, 이중체, 삼중체, 사중체, 및 카파 바디 (예를 들어, Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57); 낙타 IgG; IgNAR; 뿐만 아니라 하나 이상의 분리된 CDR 또는 기능적 파라토프를 포함한다. 다양한 타입의 항체 단편이 예를 들어, Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; WO2005040219, 및 공개된 미국 특허 출원 20050238646 및 20020161201에 설명되거나 재검토되었다.
용어 "상보성 결정 영역" ("CDR") 또는 "초가변 영역"은, 여기에 사용될 때, 항원 결합의 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. CDR은 일반적으로 경쇄 가변 도메인의 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); (Kabat ef al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242) 및/또는 "초가변 루프"의 그들의 잔기 (경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917)로 구성된다. 전형적으로, 이 영역의 아미노산 잔기의 번호 붙이기는 Kabat et al., 상기에 설명된 방법에 의해 수행된다. "카바트 위치", "카바트 잔기", 및 "카바트에 따라"와 같은 구절은 여기에서 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이 번호 붙이기 시스템을 나타낸다. 카바트 번호 붙이기 시스템을 사용하여, 펩티드의 실제의 선형 아미노산 서열은 더 적은 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수도 있으며, 가변 도메인의 프레임워크 (FR) 또는 CDR의 단축, 또는 이들로 삽입에 해당한다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 아미노산 삽입을 포함할 수도 있다. CDR H2의 잔기 52 다음에 아미노산 삽입 (카바트에 따라 잔기 52a, 52b 및 52c) 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (카바트에 따라 예를 들어 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수도 있다. 잔기의 카바트 번호 붙이기는 "표준" 카바트 번호 붙여진 서열과 항체의 서열의 상동성의 영역에 정렬에 의해 특정 항체에 대하여 결정될 수도 있다.
용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 여기에 정의된 바와 같이, CDR 내에 있지 않은 그들의 VH 및 VL 아미노산 잔기를 나타낸다.
항체의 단편 결정가능 영역 ("Fc 영역 Fc 도메인")은 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체, 뿐만 아니라 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용하는 항체의 "꼬리" 영역이다.
단클론성 항체는 전형적으로 원하는 항원으로 면역화된 마우스의 비장 세포와 골수종 세포를 융합함으로써 만들어진다. 사람 단클론성 항체는 사람 항체를 암호화하는 형질변환 동물 (예를 들어 마우스 또는 다른 적합한 종)으로부터 얻어질 수 있다. 대안으로, 레퍼토리 클로닝 또는 파지 디스플레이/효모 디스플레이로 불리는, 기술을 수반하는 재조합 단클론성 항체가 만들어질 수 있다. 재조합 항체 조작은 마우스 대신에, 항체를 생성하는 바이러스 또는 효모의 사용을 수반한다.
용어 "사람화된 항체"는, 여기에 사용된 바와 같이, 서열, 보통 적어도 비-사람 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 최소한의 상보성 결정 영역 (CDR 서열)을 함유하는 사람/비-사람 키메라 항체를 나타낸다. 따라서, 사람화된 항체는 수령자의 초가변 영역의 잔기가 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-사람 영장류와 같은 비-사람 종 (기증자 항체)의 초가변 영역의 잔기에 의해 대체되는 사람 면역글로불린 (수령자 항체)이며, 이것은 원하는 특이성, 친화도, 및 수용력을 갖는다.
항체 경쇄 및 중쇄 유전자가 다른 종에서 유래한 면역글로불린 가변 및 불변 영역 유전자로부터, 전형적으로 유전적 조작에 의해, 구성되면 사람 생식세포 서열로부터 유도되지 않은, 적어도 CDR을 포함하는 사람화된 항체는 "키메라 항체"로도 나타날 수도 있다. 예를 들어, 마우스 단클론성 항체의 유전자의 가변 세그먼트는 사람 불변 세그먼트에 결합할 수도 있다.
용어 "사람 항체"는, 여기에 사용된 바와 같이, 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다는 사람 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도되는 가변 영역을 가진 항체를 포함하는 것이다. 그렇기는 하지만 이러한 항체는 생체 내 또는 시험관 내 성숙화에 의해 발생하는 돌연변이로 인해 사람 생식세포 서열에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 게다가, 항체가 불변 영역을 함유하면, 불변 영역은 또한 주로 사람 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 본 발명의 사람 항체는 그래도 사람 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다 (예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 생성 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 반면에, 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "사람 항체"는 CDR 서열이 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식세포로부터 유도되는 항체 또는 대안의 항원성 결합 영역을 포함하고 이후에 사람 프레임워크 서열에 이식되는 것은 아니다 (상기 사람화된 항체를 참고하면 된다). 사람 항체는 사람 단클론성 항체일 수도 있다. 이러한 사람 단클론성 항체는 불멸성 세포에 융합된 사람 중쇄 이식유전자 및 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질변환 비사람 동물, 예를 들어, 형질변환 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 히브리도마 (hybridoma)에 의해 생산될 수도 있다. 사람 항체는 또한 사람 생식세포 서열의 선택에 의거한 서열 라이브러리로부터 분리될 수도 있으며, 천연 및 합성 서열 다양성으로 더 다양화될 수 있다. 사람 항체는 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus)를 가지고 림프구의 형질전환으로 이어지는 사람 림프구의 시험관 내 면역화에 의해 제조될 수도 있다. 사람 항체의 서열은 재조합 방법에 의해 항체의 생산을 허용하는 것이 확인될 수도 있다.
게다가, 사람화된, 사람 및 완전한 사람 항체는 수령자 항체 또는 기증자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 개선하기 위해 만들어진다.
용어 "항체 유도체"는 항체의 콘쥬게이트 및 또 다른 약제 또는 항체와 같이, 항체의 어떤 변형된 형태도 나타낸다.
용어 "항원"은 항원을 인식하는 항체를 생산하기 위해 면역성 척추동물의 면역화에 사용된 분자 실체물을 나타낸다. 여기에서 용어 항원은 더 널리 사용되고 일반적으로 항체에 의해 특이적으로 인식된 표적 분자를 포함하는 것이며, 따라서, 항체를 생성하는 면역화 과정에 사용된 단편 또는 분자의 모방체 또는 면역화에서 스크리닝에 사용된 이러한 분자 및 또한 항체가 파지 디스플레이 스크리닝과 같은 대안의 방법에 의해 얻어지는 경우에 스크리닝에 사용된 분자를 포함한다.
용어 "에피토프"는, 여기에 사용된 바와 같이, 항체와 같은, "항원 결합 폴리펩티드", 및 그것의 해당하는 "항원" 사이의 분자적 상호작용의 맥락에서 정의된다. 일반적으로, "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 지역 또는 영역, 즉, 항체와 물리적으로 접촉된 지역 또는 영역을 나타낸다.
단백질 에피토프는 항체 (에피토프의 면역 우성 성분으로도 불림)에 결합에 있어서 직접적으로 수반되는 항원의 아미노산 잔기 및 결합에 직접적으로 수반되지 않는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어, Ab에 의해 효과적으로 차단된 항원의 아미노산 잔기를 포함한다 (다시 말해서, 아미노산 잔기는 항체의 "용매-제외된 표면" 및/또는 "발자국 (footprint)" 내에 있다). 특정 항원은 많은 다른 에피토프를 포함할 수도 있으며, 이것은 선형 펩티드 항원의 결정요인, 원래의 (성숙한) 구조에서 서로 근처에 위치하는 하나 이상의 비-연속성 아미노산으로 구성된 구조적 항원의 결정요인; 및 탄수화물 기와 같이, 전체 또는 일부가, 항원에 공유결합에 의해 부착된 분자 구조로 구성된 번역 후 항원의 결정요인을 포함하지만, 이에 제한되지 않을 수도 있다.
사용된 에피토프 매핑 (mapping) 방법에 의존적으로, 에피토프의 설명 및 정의가 상세한 설명과 다른 수준으로 얻어진다는 사실로부터, 같은 Ag 상의 다른 Ab에 대한 에피토프의 비교가 상세한 설명의 다른 수준에서 유사하게 수행될 수 있다는 것으로 이어진다.
용어 "결합", 특이적으로 결합" 및 "결합 특이성"은 항체 또는 이들의 항원 결합 단편의 선택성을 설명하기 위해 여기에 사용된다.
본 발명에 따르는 항체는 C5aR에 특이적으로 결합할 수도 있으며, 크게 더 낮은 친화도가 예를 들어, 적어도 2배 더 낮거나, 5배 더 낮거나 10배 더 낮은 친화도일 수도 있는 경우, 항체는 다른 항원에 대하여 크게 더 낮은 친화도를 가진다는 것을 나타낸다. 항체는 추가로 종 특이적일 수도 있는데, 예를 들어, 항체는 사람 C5aR에 특이적으로 결합하지만 높은 친화도로 마우스 C5aR에 결합하지 않는다.
용어 "결합 친화도"는 두 개의 분자, 예를 들어, 항체, 또는 이들의 단편, 및 항원 사이에서 비-공유 상호작용의 강도의 측정값으로서 여기에 사용된다. 용어 "결합 친화도"는 1가 상호작용 (고유 활성)을 설명하기 위해 사용된다. 1가 상호작용을 통한, 두 개의 분자, 예를 들어, 항체 또는 이들의 단편, 및 항원 사이의 결합 친화도는 해리 상수 (KD)의 결정에 의해 정량화될 수도 있다. 차례로, KD는 복합체 형성 및 해리의 동역학의 측정에 의해, 예를 들어, SPR 방법에 의해 결정될 수 있다. 1가 복합체의 결합 및 해리에 해당하는 속도 상수는 각각 결합 속도 상수 ka (또는 kon) 및 해리 속도 상수 kd (또는 koff)로 나타난다. KD는 방정식 KD = kd/ka를 통해 ka 및 kd와 관련된다.
게다가, "친화도"는 분자 (예를 들어, 항체) 및 리간드 (예를 들어, 항원)의 단일 결합 부위 사이의 결합의 강도에 관한 것이다. 리간드 Y에 대한 분자 X의 친화도는 해리 상수 (Kd)에 의해 나타나며, 이것은 용액에 존재하는x분자의 절반의 결합 부위를 차지하기 위해 필요한 Y의 농도이다. 더 작은 Kd는 더 강하거나 더 높은 친화도 상호작용을 나타내고, 더 낮은 농도의 리간드가 부위를 차지하기 위해 필요하다. 유사하게는, 상호작용의 특이성은, 원하지 않는 상호작용의 KD 값과, 원하는 상호작용, 예를 들어, 항체 및 항원 사이의 특이적 상호작용에 대한 KD 값의 결정 및 비교에 의해 평가될 수도 있다.
전형적으로, 표적에 관련된 항체에 대한 KD는 환경 또는 대조군의 관련 없는 물질 또는 동반 물질과 같은, 다른, 비-표적 분자에 관련된 KD보다 2배, 바람직하게 5배, 더 바람직하게 10배 더 작을 것이다. 더 바람직하게, KD는 50배, 예를 들어, 100배, 또는 200배; 더 바람직하게 500배, 예를 들어, 1,000배, 또는 10,000배 더 작을 수도 있다.
이 해리 상수의 값은 잘 알려진 방법에 의해 직접적으로 결정될 수 있고, 예를 들어, Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984)에 제시된 것들과 같은 방법에 의해 복합체 혼합물에 대해서도 계산될 수 있다. 예를 들어, KD는 Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)에 의해 개시된 것들과 같은 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 검정을 사용하여 확립될 수도 있다. 표적에 대한 항체와 같이 리간드의 결합 능력을 평가하는 다른 표준 검정은 업계에 알려져 있다 - 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유동 세포분석법을 포함한다. 항체의 결합 동력학 및 결합 친화도는 또한 업계에 알려진 표준 검정, 예를 들어, SPR에 의해 평가될 수 있다.
표적에 항체의 결합이 상기 표적의 또 다른 리간드, 예를 들어, 또 다른 항체에 의해 표적의 결합과 비교되는 경쟁적 결합 검정이 수행될 수 있다. 50% 억제가 일어나는 농도는 Ki로서 알려져 있다. 이상적인 조건 하에, Ki는 KD와 동등하다. Ki 값은 KD보다 절대 적지 않고, 그래서 Ki의 측정은 편의상 KD에 대한 상한을 제공하는 것으로 대체될 수 있다.
당업자로서 인정하는 바와 같이, "결합능 (avidity)"은 두 개의 분자, 예를 들어, 항체 및 항원 사이의 상호작용의 전체 강도에 관한 것이다. 결합능은 상호작용의 친화도 및 원자가 둘 다에 의존적이다.
특정 항체의 기능성을 결정하는 추가의 검정은 특정 항원에 대하여 특이적이고 항체 결합의 영향인 세포 기반 검정을 포함할 수도 있다.
업계에 알려진 바와 같이 용어 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는, 둘 이상의 폴리펩티드의 서열 사이의 관계에 관한 것이다. 업계에서, "동일성"은 또한 둘 이상의 아미노산 잔기의 스트링 (string) 사이의 매치 (match)의 수에 의해 결정된, 폴리펩티드 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 해결된 갭 (gap) 정렬된 (있으면) 둘 이상의 서열 중 더 작은 것 사이의 동일한 매치의 퍼센트를 측정한다. 관련된 폴리펩티드의 동일성은 알려진 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 방법은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)에 설명된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
동일성을 결정하는 바람직한 방법은 테스트 된 서열 사이에서 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 설명된다. 두 개의 서열 사이에서 동일성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))를 포함하는, GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 미국 국립 생물 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI) 및 다른 근원 (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 상기)으로부터 공개적으로 이용 가능하다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘은 또한 동일성을 결정하기 위해 사용될 수도 있다.
예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)을 사용하여, 퍼센트 서열 동일성이 결정되는 두 개의 폴리펩티드는 그것들의 각각의 아미노산의 최적의 매치를 위해 정렬된다 (알고리즘에 의해 결정된, "매치된 폭"). 갭 오프닝 패널티 (gap opening penalty) (이것은 3번의 평균 기울기로서 계산된다; "평균 기울기"는 사용되는 비교 매트릭스의 기울기의 평균이다; "기울기"는 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산 매치로 할당된 점수 또는 수이다) 및 갭 연장 패널티 (gap extension penalty) (이것은 보통 분수 (1/10) 배이다), 뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스는 알고리즘과 함께 사용된다. 표준 비교 매트릭스 (PAM 250 비교 매트릭스에 대하여 Dayhoff et al., Atlas of protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978); BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대하여 Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992))가 또한 알고리즘으로 사용된다.
펩티드 서열 비교를 위해 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); 비교 매트릭스: Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)의 BLOSUM 62; 갭 패널티: 12, 갭 길이 패널티: 4, 유사성의 한계점: 0.
GAP 프로그램은 상기 파라미터로 유용하다. 상기 언급된 파라미터는 GAP 알고리즘을 사용하여 펩티드 비교를 위한 디폴트 파라미터이다 (끝 갭에 대한 패널티 없음).
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기의, 상기 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 대하여 효과가 거의 없거나 전혀 없는 또 다른 잔기로의 치환을 수반할 수도 있다. 이것은 하나의 아미노산의, 같은 그룹의 다른 아미노산으로 치환이 보존적 치환으로 생각되는 다음 그룹의 아미노산에 의해 예시된다: 친수성: Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Thr. 지방족: Val, lie, Leu, Met. 염기성: Lys, Arg, His. 방향족: Phe, Tyr, Trp. 게다가, 어떤 잔기도 알라닌으로 빈번하게 치환될 수 있다.
게다가, 원하면, 비천연 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체는 치환 또는 본 발명의 항체 및/또는 면역글로불린 사슬에 추가로서 도입될 수 있다. 이러한 아미노산은 공통 아미노산의 D-이소머, 2,4-디아미노부티르산, a-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 6-아미노 헥사노익산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트랄린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 베타-알라닌, 플루오로-아미노산, 베타-메틸 아미노산, Ca-메틸 아미노산, Na-메틸 아미노산과 같은 디자이너 아미노산, 및 일반적인 아미노산 유사체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 및/또는 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열 돌연변이는 본 발명의 핵산으로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 원하는 폴리펩티드의 시험관 내 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 돌연변이는 아미노산 서열 내 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 조합은 최종 구조에 도달하도록 만들어질 수 있으며, 최종 폴리펩티드 생성물이 원하는 특성을 소유한다는 것이 제공된다. 돌연변이 (변화된) 폴리펩티드는 업계에 알려진 어떤 기술을 사용해서도 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 시험관 내 돌연변이 생성을 받을 수 있다. 이러한 시험관 내 돌연변이 생성 기술은 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터에 서브클로닝 (subcloning)하고, 벡터를 이. 콜리 (E. coli) XL-I 레드 (Stratagene)와 같은 "돌연변이 유발 유전자" 균주로 형질전환하고 형질전환된 박테리아를 적합한 숫자의 세대로 증식시키는 것을 포함한다. 돌연변이된/변화된 DNA로부터 유도된 생성물은 그것들이 수용체-결합 및/또는 -억제 활성을 갖는지 결정하기 위해 여기에 설명된 기술을 사용하여 쉽게 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 돌연변이를 설계하는데 있어서, 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이의 속성은 변형되는 특징(들)에 의존할 것이다. 돌연변이되는 부위는, 예를 들어, (1) 달성된 결과에 의존하여 처음에 보존적 아미노산 선택으로 및 다음에 더 많은 라디칼 선택으로 치환함으로써, (2) 표적 잔기를 결실함으로써, 또는 (3) 위치한 부위에 인접한 다른 잔기를 삽입함으로써 개별적으로 또는 연속적으로 변형될 수 있다.
아미노산 서열 결실는 일반적으로 1 내지 15개의 잔기, 더 바람직하게 약 1 내지 10개의 잔기 및 전형적으로 약 1 내지 5개의 인접한 잔기를 범위로 한다.
설명
발명자는 생물학적 치료제 및 특정 항체의 기능성 및 효험에 대하여 적절한 여러 양태를 확인하였고, 본 발명의 주 영역은 C5aR에 결합하는 C5a의 억제에 의한 염증성 질환의 치료용 항체이다.
본 발명의 양태는 기능성 및/또는 CDR의 아미노산 서열, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및/또는 Fc 도메인의 서열을 특징으로 하는 일련의 항체 중 하나 이상에 관한 것이다.
한 구체예에서 항체는 표준 항체 도메인 및 영역을 포함하는 전체 길이 항체이다.
한 구체예에서 항체는 항체 단편이고, 이러한 단편은 통상적인 재조합 또는 단백질 조작 기술을 사용하여 얻어질 수도 있다. 본 발명의 항체 단편은 절단에 의해, 예를 들어, 폴리펩티드의 N 및/또는 C-말단 끝에서 하나 이상의 제거에 의해 만들어질 수도 있다. 단편은 또한 하나 이상의 내부 결실에 의해 발생할 수도 있다. 본 발명의 항체는 본 발명이 기초한 항체 중 어느 하나의 단편일 수도 있거나, 이를 포함할 수도 있다. 본 발명의 항체는 이들 항체 중 하나의 항원 결합 부분, 또는 이들의 변이체일 수도 있거나, 이를 포함할 수도 있다, 예를 들어, 본 발명의 항체는 이들 항체 중 하나의 Fab 단편이거나 이들의 변이체일 수도 있거나, 그것은 이들 항체 중 하나로부터 유도된 단일 사슬 항체, 또는 이들의 변이체일 수도 있다.
본 발명의 항체는 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 비-사람 영장류와 같은 포유동물 종을 포함하는 다른 종의 것일 수도 있다. 항체는 설치류 항체 및 더 특히 마우스 항체일 수도 있다. 대안으로 항체는 닭과 같은 비-포유동물 종의 것일 수도 있다. 항체는 추가로 사람화된 항체 또는 사람 항체일 수도 있다.
본 발명의 항체는 여기에 설명된 바와 같이 C5aR에 결합에 대하여 본 발명의 또 다른 항체와 경쟁하는 능력을 가질 수도 있다. 이러한 교차-경쟁 항체는 표준 결합 검정에서 본 발명의 알려진 항체와 교차-경쟁하는 그것들의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 이러한 교차-경쟁은 두 개의 항체가 동일하거나, 중첩되거나 유사한 에피토프에 결합한다는 것을 제안할 수도 있다.
사람 항체
여기 실시예에 설명된 바와 같이, 발명자는 사람 면역글로불린 생식세포 자리를 포함하는 형질변환 마우스로부터 유도된 일련의 항-C5aR 항체를 확인하였다. 항체는 단클론성 히브리도마 항체로서 분리되고 결합 특성이 평가되었다. 언급된 바와 같이 C5aR은 7개의 막관통 GPCR이고 원래의 구조를 유지하는 가용성 형태는 생산하는 것이 불가능하다. hC5aR에 결합하는 hC5a를 차단하는 사람 항체를 생성하기 위해, 형질변환 마우스는 원래의 hC5aR을 발현하는 세포로 면역화되었다. 하지만, 차단 항체는 얻기 매우 힘들었고 원하는 차단 성질을 가진 사람 항체가 확인되기 전에 32번의 융합이 발명자에 의해 수행되었다. 35번의 융합 및 100,000개 이상의 히브리도마 상층액의 스크리닝으로부터 총 11개의 차단 항체가 얻어졌다.
게다가, hC5aR의 속성으로 인해 표준 Biacore 분석에 의해 항체의 친화도를 결정하는 것이 불가능했고, 그러므로 검정은 기능적 hC5aR-의존적 판독에 기초하여 확립되었으며, 실시예 2 및 실시예 7에 설명된 바와 같이 이것으로부터 IC50 및 EC50 값이 결정되었다.
한 양태에서 본 발명은 C5aR에 결합하는 사람 항체에 관한 것이고 항체가 hC5aR에 특이적으로 결합하는 것이 더 바람직하며, hC5aR에 대한 결합은 특히 마우스 C5aR과 같은 다른 종의 C5aR에 대한 결합보다 더 강하다. 한 구체예에서 항체는 C5aR의 제2 세포외 루프 및 더 바람직하게 사람 C5aR의 제2 루프에 결합하는 것이 바람직하다. 한 구체예에서 항체는 사람 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합하지만 쥐 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합하지 않는다. 추가의 구체예에서 본 발명에 따르는 항체는 원래의 구조에서만 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합할 수도 있다.
항-C5aR 항체의 기능성은 C5aR에 대한 C5a의 결합을 크게 억제하거나 감소시키는 상기 항체의 능력에 의존적이다.
한 구체예에서 본 발명은 C5aR에 결합하는 사람 항체 또는 서열 정의에 의해 여기에 설명된 항체 (하기 참조)에 관한 것이며, 상기 항체는 C5aR에 대한 C5a의 결합을 크게 억제하거나 감소시킬 수 있다. 이것은 여기에서 실시예 2에 설명된 바와 같이 대체 검정(SPA)에 의해 결정될 수도 있으며, 이것으로부터 IC50 값이 결정될 수 있다. 분리되고 설명된 11개의 항체는 50 nM 이하의 IC50 농도를 갖는 것이 표 1로부터 명백하다. 본 발명의 추가의 구체예에서 항체는 SPA 검정에서 hC5a를 대체할 수 있으며, 50 nM 이하, 예를 들어, 40 nM 이하, 예를 들어, 30 nM 이하, 예를 들어, 20 nM 이하, 예를 들어, 10 nM 이하, 예를 들어, 5 nM 이하 또는 4 nM 이하의 IC50를 갖거나 3 nM 이하, 또는 2.5 nM 이하 또는 2.0 nM 이하의 IC50을 갖는다.
추가의 검정에서 사람 호중구의 C5a-의존적 이동을 억제하는 항-C5aR 항체의 능력을 평가하였고 확인된 사람 항체 중 일부는 이전에 설명된 C5aR 항체보다 C5a-매개된 호중구 이동의 더 강한 억제제인 것으로 발견되었다 (WO 2009/103113의 Q). 따라서 한 구체예에서 본 발명은 서열 정의에 의해 여기에 설명된 항체 (하기 참조) 또는 C5aR에 결합하는 사람 항체에 관한 것이며, 상기 항체는 사람 호중구의 이동을 크게 억제할 수 있다. 한 구체예에서 항체는 이동을 10 nM C5a의 존재 및 항-C5aR 항체의 부재시 관찰된 이동의 수준과 비교하여 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20%, 또는 10% 미만으로 억제한다. 한 이러한 구체예에서 이동은 10 nM C5a의 존재 및 항체의 부재시 30분 후 관찰된 이동의 수준과 비교하여 10 nM C5a 및 항체의 존재시 30분 후에 측정된다. 대안으로 호중구 이동을 억제하는 항체의 능력은 같은 설정에 기초한 IC50 값을 사용하여 발현될 수 있다. 한 이러한 구체예에서 IC50은 2.5 μg/ml 이하, 예를 들어, 2.5 μg/ml 이하, 예를 들어, 1.5 μg/ml 이하, 예를 들어, 1.2 μg/ml 이하 또는 1.0 μg/ml 이하이다.
표준 Biacore 분석에 대한 대안으로서 hC5aR 항체의 기능성은 실시예 7에 설명된 바와 같이 호중구에서 경쟁 결합 검정에 의해 결정될 수도 있다. 이 기능성은 경쟁 리간드 결합 검정에 의해 측정된 항체의 친화도로서 나타나지만 상호작용의 결합능의 측정으로도 고려될 수 있다. 한 구체예에서 본 발명은 서열 정의에 의해 여기에 설명된 항체 (하기 참조) 또는 C5aR에 결합하는 사람 항체에 관한 것이며, 호중구에서 경쟁 리간드 결합 검정에 의해 측정된 항체의 친화도 또는 결합능은 0.80nM, 0.70nM, 0.60nM 이하, 예를 들어, 0.50nM, 0.45nM, 0.40nM 또는 0.35nM 이하이다.
항체를 특성화하는 추가의 옵션은 실시예 7에 유사하게 설명된 칼슘-유동 검정을 사용하여 조사되었으며, 이것은 생체 외에서 C5a 유발된 호중구 활성화를 억제하는 항체의 능력을 측정한다. 추가의 구체예에서 본 발명은 서열 정의에 의해 여기에 설명된 항체 (하기 참조) 또는 C5aR에 결합하는 사람 항체에 관한 것이며, 칼슘-유동 검정에서 결정된 IC50은 7.0 μg/ml 이하, 예를 들어, 5.0 μg/ml 이하, 예를 들어, 2 μg/ml 이하이다.
추가적인 생체 외 검정은 CD11b 및 CD62L 발현과 같은 2차적인 효과에 기초한 C5a 유발된 호중구 성숙화를 억제하거나 중화하는 항체의 능력을 결정하기 위해 사용될 수 있다. CD11b 및 CD62L은 그것들이 C5a/C5aR 상호작용에 의한 활성화시 각각 상향 및 하향-조절되기 때문에 호중구의 성숙화 마커이다.
CD11b 상향조절 검정의 효과가 결정되었다. 한 구체예에서, 본 발명은 서열 정의에 의해 여기에 설명된 항체 (하기 참조) 또는 C5aR에 결합하는 사람 항체에 관한 것이며, CD11b 상향조절 검정에서 결정된 IC50은 3 μg/ml 이하, 예를 들어 3 μg/ml 이하, 예를 들어 2 μg/ml 이하, 예를 들어 2 μg/ml 이하 또는 예를 들어 1. 5 μg/ml 또는 1.O μg/ml 이하이다.
유사하게, CD62L 하향-조절 검정에서 항체의 효과가 결정되었다. 한 구체예에서, 본 발명은 서열 정의에 의해 여기에 설명된 항체 (하기 참조) 또는 C5aR에 결합하는 사람 항체에 관한 것이며, CD62L 하향-조절 검정에서 결정된 IC50은 1.8 μg/ml 이하, 예를 들어 1.5 μg/ml 이하, 예를 들어 1.2 μg/ml 이하 또는 1.0 μg/ml 이하이다.
네 개의 단클론성 항체가 가변 영역의 서열 및 특히 CDR 서열을 결정하기 위한 시퀀싱을 위해 선택되었다. 정렬 서열은 도 1에 제공되고 서열은 유사하게 첨부된 서열 목록에 포함된다.
서열 목록은 분리된 항체에 관하여 다음 서열을 포함한다:
SEQ ID 1-3: Vh 35F32A3 CDR 1-3
SEQ ID 4: Vh 35F32A3
SEQ ID 5-7: Vl 35F32A3 CDR 1-3
SEQ ID 8: Vl 35F32A3
유사한 방식으로, SEQ ID 9-16는 32F3A6을 설명한다.
유사한 방식으로, SEQ ID 17-24는 35F12A2를 설명한다.
유사한 방식으로, SEQ ID 25-32는 35F24A3을 설명한다.
가변 영역 또는 CDR 서열에 의해 정의된 항체
따라서 본 발명에 따르는 항체는 CDR 서열, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 서열 및 항체의 기능성을 변화시키지 않고 당업자에 의해 수행될 수 있는, 이들의 작은 변형에 기초하여 정의될 수도 있다. 이것은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 예를 들어, 각각의 CDR 서열 내에 하나, 둘 또는 세 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
한 양태에서 본 발명은 CDR 영역의 서열에 의해 정의된 C5aR 결합 항체에 관한 것이며, 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 다음 그룹으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다:
a) 상기 서열 중 아무것도 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하지 않거나, 그 중 하나, 둘 또는 셋은 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하는 경우, SEQ ID 1, 2 및 3; 및
b) 상기 서열 중 아무것도 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하지 않거나, 그 중 하나, 둘 또는 셋은 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하는 경우, SEQ ID 9, 10 및 11; 및
c) 상기 서열 중 아무것도 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하지 않거나, 그 중 하나, 둘 또는 셋은 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하는 경우, SEQ ID 17, 18 및 19; 및
d) 상기 서열 중 아무것도 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하지 않거나, 그 중 하나, 둘 또는 셋은 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하는 경우, SEQ ID 25, 26 및 27.
한 구체예에서 본 발명은 CDR 영역의 서열에 정의된, C5aR 결합 항체에 관한 것이며, 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다;
여기에서 상기 CDR1 서열은 SEQ ID 1, 9, 17, 25 또는 상기 서열 중 하나를 포함하며, 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되고;
여기에서 상기 CDR2 서열은 SEQ ID 2, 10, 18, 26 또는 상기 서열 중 하나를 포함하며, 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되고;
여기에서 상기 CDR3 서열은 SEQ ID 3, 11, 19, 27 또는 상기 서열 중 하나를 포함하며, 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
한 구체예에서 본 발명은 CDR 영역의 서열에 의해 정의된 C5aR 결합 항체에 관한 것이며, 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 다음 그룹으로부터 선택된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다
a) 상기 서열 중 아무것도 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하지 않거나, 그 중 하나, 둘 또는 셋은 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하는 경우, SEQ ID 5, 6 및 7; 및
b) 상기 서열 중 아무것도 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하지 않거나, 그 중 하나, 둘 또는 셋은 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하는 경우, SEQ ID 13, 14 및 15; 및
c) 상기 서열 중 아무것도 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하지 않거나, 그 중 하나, 둘 또는 셋은 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하는 경우, SEQ ID 21, 22 및 23; 및
d) 상기 서열 중 아무것도 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하지 않거나, 그 중 하나, 둘 또는 셋은 다른 아미노산 잔기와 치환된 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)을 포함하는 경우, SEQ ID 29, 30 및 31.
한 양태에서 본 발명은 CDR 영역의 서열에 의해 정의된, C5aR 결합 항체에 관한 것이며, 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다;
여기에서 상기 CDR1 서열은 SEQ ID 5, 13, 21, 29 또는 상기 서열 중 하나를 포함하며, 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되고;
여기에서 상기 CDR2 서열은 SEQ ID 6, 14, 22, 30 또는 상기 서열 중 하나를 포함하며, 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되고;
여기에서 상기 CDR3 서열은 SEQ ID 7, 15, 23, 31 또는 상기 서열 중 하나를 포함하며, 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
한 구체예에서 본 발명은 중쇄의 가변 영역의 CDR이 SEQ ID 1, 2 및 3 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 갖는 상기 서열을 포함하고 가변 경쇄의 CDR이 SEQ ID 5, 6 및 7 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 갖는 상기 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 중쇄의 가변 영역의 CDR이 SEQ ID 9, 10 및 11 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 갖는 상기 서열을 포함하고 가변 경쇄의 CDR이 SEQ ID 13, 14 및 15 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 갖는 상기 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 중쇄의 가변 영역의 CDR이 SEQ ID 17, 18 및 19 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 갖는 상기 서열을 포함하고 가변 경쇄의 CDR이 SEQ ID 21, 22 및 23 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 갖는 상기 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 중쇄의 가변 영역의 CDR이 SEQ ID 25, 26 및 27 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 갖는 상기 서열을 포함하고 가변 경쇄의 CDR이 SEQ ID 29, 30 및 31 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 갖는 상기 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 구체예는 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR 서열이 서열 중 다음 그룹 SEQ ID 1, 2 및 3, SEQ ID 9, 10 및 11, SEQ ID 17, 18 및 19, SEQ ID 25, 26 및 27 또는 서열당 최대 두 개의 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지는 상기 서열 중 하나를 포함하고 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR 서열은 다음 그룹 SEQ ID 5, 6 및 7, SEQ ID 13, 14 및 15, SEQ ID 21, 22 및 23, SEQ ID 29, 30 및 31 또는 서열당 최대 두 개의 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 구체예는 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR 서열이 서열 중 다음 그룹 SEQ ID 1, 2 및 3, SEQ ID 9, 10 및 11, SEQ ID 17, 18 및 19, SEQ ID 25, 26 및 27 또는 서열당 최대 하나의 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지는 상기 서열 중 하나를 포함하고 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR 서열은 다음 그룹 SEQ ID 5, 6 및 7, SEQ ID 13, 14 및 15, SEQ ID 21, 22 및 23, SEQ ID 29, 30 및 31 또는 서열당 최대 하나의 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 구체예는 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR 서열이 서열 중 다음 그룹 SEQ ID 1, 2 및 3, SEQ ID 9, 10 및 11, SEQ ID 17, 18 및 19, SEQ ID 25, 26 및 27을 포함하고 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 상기 CDR 서열은 다음 그룹 SEQ ID 5, 6 및 7, SEQ ID 13, 14 및 15, SEQ ID 21, 22 및 23, SEQ ID 29, 30 및 31을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 구체예는 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO: 4, 12, 20 또는 28과 적어도 80, 85, 90 또는 94% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO: 4, 12, 20 또는 28과 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO 8, 16, 24 또는 32와 적어도 80, 85, 90 또는 94% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO 8, 16, 24 또는 32와 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 한 구체예는 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO: 4, 12, 20 또는 28과 적어도 80, 85, 90 또는 94% 동일한 서열을 포함하고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO 8, 16, 24 또는 32와 적어도 80, 85, 90 또는 94% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO: 4와 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO 8과 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO: 12와 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO 16과 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 따라서 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO: 20과 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO 24와 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 따라서 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO: 28과 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO 32와 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO: 39와 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역이 SEQ ID NO 40과 적어도 96, 97, 98 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다.
한 구체예에서 본 발명은 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO 39에 의해 확인되고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO 40에 의해 확인되는 항체이다.
항체의 성숙화 중에 자발적 돌연변이는 여기에서 실시예 6 및 7에 설명된 바와 같이, 프레임워크 영역에서 발생할 수도 있고, 분리된 단클론성 항체 중 하나의 가변 영역은 가변 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대하여 가장 가까운 사람 생식세포를 확인하기 위해 사람 항체 생식세포 서열과 비교되었다. 면역 반응의 위험을 최소화하기 위해, 프레임워크 영역에서 사람 생식세포 서열을 가진 항체를 해석하기 위해 프레임워크 영역에 점 돌연변이를 도입함으로써 항체를 추가로 최적화하는 것이 결정되었고, 실험에서 나타날 수 있는 바와 같이 항체의 기능성에 영향을 미치지 않았다. 한 구체예에서 본 발명은 여기에서 상기 설명된 참조 항체의 가변 영역에 대한 서열 동일성에 의해 정의된 항체에 관한 것이며, 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 본 발명에 따라, 가장 가까운 사람 생식세포 서열에 대한 동일성을 증가시키기 위해 하나 이상의 돌연변이를 도입하는 것이 매력적일 수도 있지만, 다른 돌연변이도 고려될 수 있다. 한 구체예에서 이러한 돌연변이(들)는 보존적 돌연변이(들)이다.
Fc 영역에 의해 정의된 항체
Fc 영역은 항체가 면역 시스템을 활성화하는 것이 가능하게 하고 항체는 Fc 영역 내 변형을 포함하도록, 전형적으로 그것의 기능적 성질 중 하나 이상, 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 결합, Fc-수용체 결합g, 단백질 안정성 및/또는 항원-의존적 세포 독성, 또는 이들의 결핍을 변화시키도록 조작될 수도 있다. 게다가, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수도 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있다) 그것의 글리코실화를 변화시키기 위해, 즉 항체의 하나 이상의 기능적 속성을 변화시키기 위해 변형될 수도 있다.
본 발명의 한 양태는 C5aR 결합 항체 또는 서열 정의에 의해 여기에 설명된 항체 (하기 참조)에 관한 것이며, Fc 영역은 하나 이상의 FcγR에 대하여 감소되거나 폐지된 결합 친화도를 가진다.
한 구체예에서 본 발명은 상기 설명된 바와 같이, C5aR 결합 항체, 바람직하게 사람 C5aR 또는 서열 정의에 의해 여기에 설명된 항체 (하기 참조)에 관한 것이며, Fc 영역은 하나 이상의 FcγR에 대하여 감소된 결합 친화도를 가진다.
한 구체예에서 본 발명의 항체는 각각 SEQ ID NO 33, 34, 35 및 36에 의해 정의된 IgG1, IgG2, IgG2/4 또는 IgG4 Fc 참조 서열에 비교하여 하나 이상의 FcγR에 대하여 감소된 결합 친화도를 나타낸다. 특이적 아미노산 잔기는 FcγR 상호작용 및 Fc 영역의 이러한 특이적 아미노산 잔기가 다른 아미노산에 의해 치환된 경우 항체를 적용하는 것이 유리할 수도 있다는 점을 통해 여기에서 매개된 효과의 원인이 될 수도 있다.
한 구체예에서 상기 Fc 영역은 각각 SEQ ID 33, 34, 35 및 36에 의해 정의된 IgG1, IgG2, IgG4/G2 또는 IgG4Fc 참조 서열과 비교하여 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하며, 하나 이상의 Fcγ 수용체 또는 보체 성분에 대한 친화도를 감소시킨다.
Fc 영역에서 점 돌연변이의 도입의 결과를 평가하기 위해 일련의 항-C5aR 항체에 대한 효과기 기능이 실시예 4에 설명된 바와 같이 평가되었다. 식균작용 검정은 사람 단핵백혈구에 의해 (hC5aR을 발현하는) 호중구의 식균작용을 유발하는 항-hC5aR 항체의 능력에서 Fc 영역의 역할을 측정하도록 확립하였다. 표 2에서 나타난 바와 같이 다수의 Fc 변이체는 설명된 검정에서 항-C5aR 항체에 의해 유발된 식균작용의 수준을 감소시킨다.
한 구체예에서 본 발명에 따르는 항체는 시험관 내에서 호중구의 식균작용을 크게 유발하지 않으며, 식균작용의 수준이 항-C5aR 항체의 부재시 측정된 배경보다 크게 높지 않다는 것을 의미한다. 한 구체예에서 항체는 식균작용의 어떤 검출 가능한 유발도 일으키지 않는다. 식균작용의 수준을 평가하는 검정은 실시예 4에 설명된 바와 같이 사람 호중구를 사용하여 수행될 수도 있다.
대안의 검정에서 ADCC (항체 의존적 세포 독성) 및 CDC (보체 의존적 세포 독성)을 유발하는 항-hC5aR 항체의 능력이 평가되었다. ADCC 또는 CDC 의존적 메카니즘을 통해 세포 고갈을 매개하는 Fc 변이체의 능력을 테스트하기 위해 검정이 확립되었고, 생체 내 설정에서 활성을 모방할 수 있는 것으로 추정되었다.
검정은 실시예 4에 설명된 바와 같이 표적 세포 및 효과기 세포 (단핵백혈구 고갈된 PMBC)로서 hC5aR을 발현하는 세포 또는 반응을 유도하기 위해 혈청을 함유하는 보체를 지원한다.
한 구체예에서 본 발명에 따르는 항체는 ADCC를 크게 유발하지 않으며, ADCC의 수준이 항-C5aR 항체의 부재시 측정된 배경보다 크게 높지 않다는 것을 의미한다. 한 구체예에서 항체는 ADCC의 어떤 검출 가능한 유발도 발생하지 않았다, 즉, ADCC의 수준은 배경보다 높지 않다.
한 구체예에서 본 발명에 따르는 항체는 CDC를 크게 유발하지 않는다. 한 구체예에서 항체는 CDC의 어떤 검출가능한 유발도 발생하지 않았다, 즉, CDC의 수준은 배경보다 높지 않다.
한 구체예에서 본 발명에 따르는 항체는 서열이 효과기 세포 기능 또는 기능들을 변화시키도록 변형된 경우 Fc 영역을 포함한다. Fc 서열의 변형은 아미노산 서열에서 점 돌연변이에 의해 얻어질 수도 있다. 중쇄 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG4 또는 IgG2/4 키메라 서열일 수도 있다. 참조 서열은 다음과 같은 서열 목록으로 정의된다: SEQ ID NO: 33에 의한 IgG1, SEQ ID NO: 34에 의한 IgG2, SEQ ID NO: 35에 의한 IgG2/4 및 SEQ ID NO: 36에 의한 IgG4.
한 구체예에서 Fc 영역은 IgG1 (SEQ ID NO: 33), IgG2 (SEQ ID NO: 34), IgG2/4 (SEQ ID NO: 35), 또는 IgG4 (SEQ ID NO: 36)이며, 다음 점 돌연변이 중 하나 이상을 갖는다
a. E233P
b. L234A 또는 V234A 또는 F234L 또는 F234V
c. L235E 또는 L235A
d. G236R 또는 G236A
e. G237A
f. S239D
g. S254W
h. N297Q
i. L328R
j. A330S
k. P331S
I. I332E.
Fc 변이체들의 차이는 FcγR 또는 상기 설명된 보체 시스템의 성분과 상호작용하는 그것들의 능력에 있다. Fc 영역의 서열 차이는 항체의 구조 및 가요성에 더 영향을 미치며, 이것은 또한 항체 기능에 영향을 미칠 수도 있다. 실시예 5 및 표 3에 설명된 바와 같이, 발명자는 Fc 영역이 추가적인 점 돌연변이가 있거나 없는 IgG1 타입 중 하나인 항-hC5aR 항체가 IgG4 타입의 Fc 영역을 가진 해당 항체보다 hC5aR 매개된 효과의 더 강한 억제제인 것을 추가로 입증한다. 따라서, 본 발명의 구체예는 IgG1 이소타입의 Fc 영역 또는 IgG1 이소타입의 적어도 Fc 힌지 영역 (hinge region)을 갖는 여기에 정의된 항체 중 어느 하나에 관한 것이다.
한 구체예에서 IgG1 Fc 영역은 SEQ ID NO 33d에 정의된 바와 같이 IgG1 Fc 참조 서열과 비교하여 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함한다. Fc 영역은 더 적은 돌연변이, 예를 들어, AA 231 내지 240 내에서 1 내지 8개의 아미노산 치환, 또는 예를 들어, AA 328 내지 334 내에서 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 설명된 바와 같이 시험관 내에서 호중구의 식균작용, ADCC 및/또는 CDC를 크게 유발하는 항체의 능력을 감소시키는 치환 중에 선택된 아미노산 치환은 바람직하다.
한 구체예에서 항체 Fc 영역은 다음 점 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 IgG1이다:
a) N297Q 및/또는
b) L234A 및/또는
c) L235E 또는 L235A 및/또는
d) G236R 또는 G236A 및/또는
e) G237A 및/또는
f) L328R 및/또는
g) A330S 및/또는
h) P331S.
한 구체예에서 항체 Fc 영역은 다음 점 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 IgG1이다:
a) N297Q 및/또는
b) L234A 및 L235E 및/또는
c) L234A 및 G236R 및/또는
d) L235E 및 G236R 및/또는
e) L234A, L235E 및 G236R 및/또는
f) G236R 및 L328R 및/또는
g) N297Q, L234A 및 L235E 및/또는
h) N297Q, L234A, L235E 및 G236R 및/또는
i) N297Q, L234A, L235E 및 G237A 및/또는
j) L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S.
k) N297Q, L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S.
한 구체예에서 항체 Fc 영역은 다음 점 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 IgG1이다:
a) N297Q 및/또는
b) L234A 및 L235E 및/또는
c) G236R 및 L328R 및/또는
d) N297Q, L234A 및 L235E 및/또는
e) N297Q, L234A, L235E 및 G237A 및/또는
f) L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S.
중쇄 및 경쇄 둘 다의 프레임워크 영역 내 점 돌연변이가 본 발명의 범위 내에 있는 아미노산 잔기의 치환에 대한 표준 기준에 기초하여 도입될 수도 있다는 것은 당업자에게 분명하다. 여기에 설명된 바와 같이 기능적 검정은 이러한 돌연변이가 항체의 기능성에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하기 위해 사용될 수도 있다.
확인된 항체의 결합 특이성은 가변 영역 또는 CDR에 의해 제공된다는 것이 상기로부터 명백하고, 유사한 항원 결합 영역을 소유하는 항체의 다른 타입이 본 발명에 포함되는 것은 분명하다.
본 발명의 한 구체예에서 항체는 전체 길이 항체이다. 본 발명의 한 구체예에서 항체는 항체 단편 또는 단일 사슬 항체이다. 한 구체예에서 항체는 단클론성 항체이다. 한 구체예에서 항체는 사람, 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 비-사람 영장류 항체이다. 한 구체예에서 항체는 마우스 또는 사람 항체이다. 한 구체예에서 항체는 사람 항체이다. 한 구체예에서 항체는 사람화된 항체이다. 명세서의 정의 부분에 설명된 바와 같이 사람화된 항체는 적어도 사람 생식세포 서열로부터 유도되지 않은 CDR 영역을 포함한다. 사람 항체가 생식세포 서열과 비교하여 하나 이상의 점 돌연변이를 포함할 수도 있다는 것은 상기로부터 더 명백하지만 서열이 적어도 프레임워크 영역 또는 Fc 영역에서는 사람 생식세포 서열과 적어도 95% 동일해야하는 것이 일반적으로 고려된다.
약학적 조제물
본 발명은 약학적 조성물/조제물을 더 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 본 발명에 따르는 폴리펩티드 또는 항체, 뿐만 아니라 이러한 조성물을 포함하는 키트를 포함한다.
본 발명에 따르는 항체는 본 발명의 양태에서 약학적 조성물에서 조제될 수도 있다. 이러한 약학적 조성물은 약전 또는 Remington과 같은 분야의 일반적인 지식에 기초하여 제조될 수도 있다.
한 구체예에서 본 발명에 따르는 약학적 조성물은 약학적은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 여기에 설명된 항체를 포함한다. 조제물은 수성 조제물 또는 투여 전에 물 또는 수성 버퍼 조성물에서 재구성되는 건조 조제물의 형태일 수도 있다.
본 발명에 따르는 항체의 약학적 조성물은 염 및/또는 버퍼, 예를 들어, WO2011/104381에 설명된 조성물을 포함할 수도 있다.
추가의 구체예에서 본 발명에 따르는 항체의 약학적 조성물, 예를 들어, WO2011/147921에 설명된 조성물은 다양한 사용에 적합할 수도 있다.
치료 방법
본 발명의 양태는 대상체의 장애를 치료하거나 방지하는 방법, 여기에 설명된 항체의 치료량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. WO 2009/103113와 같은 이전 간행물에 설명된 바와 같이 항-C5aR 항체는 다양한 질환 및 장애의 치료에 사용 가능하다/적합하다. 따라서 본 발명의 구체예는 면역학적 질환 또는 장애 특히 염증성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 여기에서 실시예 8은 마우스 관절염 모델에서 본 발명에 따르는 항-C5aR 항체의 기능성을 입증함으로써 이것을 더 지지한다. 실시예 9-11은 건선성 관절염, 크론 병 및 궤양성 대장염 환자의 조직 샘플에서 C5aR의 상향-조절을 입증한다. 항-C5aR 항체가 건선성 관절염 환자의 관절낭액에 의해 유발된 PMN의 세포 이동을 억제할 수 있다는 것이 추가로 입증된다.
치료 방법은 질환 또는 장애의 치유를 목적으로 할 수도 있지만, 만성 질환 또는 장애와 같은 면역학적 및 염증성 질환을 포함하는 일부 질환에 관하여, 하나 이상의 증상의 경감이 또한 치료로 생각되며, 이것은 증상의 부분적 경감만이 얻어지거나 효과가 일시적이거나 부분적인 경우에는 대상체에 대한 큰 개선일 수도 있다.
본 발명에 따르는 방법은 류머티스성 관절염 (RA), 건선, 건선성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus; SLE), 홍반성 신염 (lupus nephritis), 타입 I 당뇨병, 그레이브스 병 (Grave's disease), 염증성 장 질환 (Inflammatory bowel disease; IBD), 크론 병 (CD), 궤양성 대장염 (UC), 과민성 대장 증후군 (irritable bowel syndrome), 다발성 경화증 (multiple sclerosis; MS), 자가 면역 심근염 (myocarditis), 카와사키 병 (Kawasaki disease), 관상 동맥 질환 (coronary artery disease), 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 간질성 폐 질환 (interstitial lung disease), 자가 면역 갑상선염 (thyroiditis,), 경피증 (scleroderma), 전신성 경피증 (systemic sclerosis), 골관절염, 아토피성 피부염 (atoptic dermatitis), 백반 (vitiligo), 이식편대숙주 병 (graft vs. host disease), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 자가 면역 신염, 구드파스츄어 증후군 (Goodpasture's syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), ANCA-결합된 혈관염 (vasculitis), 포도막염 (uveitis), 경피증, 수포성 류천포창 (bullous pemphigoid), 알츠하이머 병 (Alzheimer's Disease), 근위축성 측색 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴 무도병 (Huntington's Chorea), 낭포성 섬유병 (cystic fibrosis), 통풍 (gout), 나이-관련 황반 변성 (macular degeneration), 알레르기 (allergy), 천식 (asthma) 및 급성 또는 만성 염증의 결과인 다른 자가 면역 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 질환의 치료를 포함한다. 추가의 구체예에서 질환 또는 장애는 급성 또는 만성 염증이며, 장애는 자가 면역 질환일 수도 있다. 한 구체예에서, 장애는 류머티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 홍반성 신염, 크론 병 (CD) 또는 궤양성 대장염 (UC) 또는 과민성 대장 증후군을 포함하는 염증성 장 질환 (IBD)이다. 추가의 구체예에서, 장애는 RA 또는 SLE이다. 만성 질환 이외에 항-C5aR 항체는 이식, 허혈/재관류 손상 (예를 들어 급성 심근경색 (acute myocardial infarction), 뇌졸중 (stroke)), 패혈증 (예를 들어 SIRS, MODS, ALI), 아테롬성 동맥 경화증 (atherosclerosis) 및 뇌 내 출혈 (intracerebral haemorrhage; ICH)은 같은 급성 징후에 관하여 적절할 수도 있다.
추가의 양태에서 본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 위한, 여기에 설명된 항체, 분리된 항체 또는 항체 조성물에 관한 것이다. 추가의 구체예에서, 상기 항체, 분리된 항체 또는 항체 조성물은 치료 방법에 관하여 여기에서 상기 설명된 질환 및 장애 중 하나 이상의 치료를 위한 것이다.
본 발명의 양태는 질환 또는 장애의 치료용 의약의 제조를 위해, 여기에 설명된 항체, 분리된 항체 또는 항체 조성물의 사용에 관한 것이며, 질환 또는 장애는 치료 방법에 관하여 여기에서 상기 설명된 바와 같을 수도 있다.
투여의 방식
본 발명의 항체는 비경구, 예를 들어, 정맥 내, 예를 들어, 근육 내, 예를 들어, 피하에 투여될 수도 있다. 대안으로, 본 발명의 항체는 비-비경구 경로, 예를 들어, 경구로 또는 국부적으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 항체는 예방적으로 투여될 수도 있다. 바람직한 구체예에서 항체는 정맥 내 또는 피하에 투여된다.
투여의 투약량 및 시기는 질환/장애 또는 문제의 증상, 뿐만 아니라 문제의 대상체를 포함하는 다양한 인자에 의존할 가능성이 클 것이다. 일반적으로 항체는 0.010 mg/kg에서 최대 4-6 mg/kg의 용량으로 투여되는 것으로 예상된다. 유사하게 항체의 투약 요법은 또한 개개의 대상체 및 상기 대상체의 질병 상태에 의존할 것이지만, 본 발명에 따라 항체 (또는 항체 조성물)이 1주일에 한 번 또는 2주일에 한 번 또는 더 낮은 간격으로, 예를 들어, 한 달에 한 번 대상체에 투여되는 치료를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체는 요구에 따라 투여될 수도 있다, 즉, 예를 들어, 특정 증상이 발생하거나 특정 생물마커가 기정 수준에 도달할 때 항체는 환자 경험에 기초하여 투여될 수도 있다.
특이적 조합 치료
본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 치료제 또는 조제물과 함께 동시 투여될 수도 있다. 다른 약제는 본 발명의 항체의 효과를 향상시키는 약제일 수도 있다. 다른 약제는 환자의 다른 증상 또는 질병을 치료하기 위한 것일 수도 있다. 예를 들어, 다른 약제는 진통제, 면역억제제 또는 항-염증제일 수도 있다. 다른 약제는 또 다른 단클론성 항체, 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 2008/022390 및 WO 2009/103113에 설명된 것들 중 하나일 수도 있다.
둘 이상의 약제의 조합된 투여는 많은 다른 방법으로 달성될 수도 있다. 한 구체예에서, 항체 및 다른 약제는 단일 조성물에서 함께 투여될 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 및 다른 약제는 결합된 치료의 일부로서 별도의 조성물에서 투여도리 수도 있다. 예를 들어, 조절자는 다른 약제 전에, 후에 또는 동시에 투여될 수도 있다.
본 발명에 따르는 항체는 다른 약물 (예를 들어 메토트렉세이트, 덱사메타손, 및 프레드니손) 및/또는 다른 생물학적 약물과 함께 투여될 수도 있다. 본 발명에 따르는 한 구체예에서 항체는 WO 2009/103113에 설명된 바와 같이 아자티오프린, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 시클로스포린, D-페니실아민, 금염 (나트륨 오로티오말레이트, auranofm), 레플루노미드, 메토트렉세이트, 미노시클린, 술파살라진 및 시클로포스파미드, 글루코코르티코스테로이드, 미코페놀산 또는 미코페놀레이트 및 타크롤리무스 및 별도의 구체예에서 플라퀘닐, 아줄피딘 및 메토트렉세이트, 덱사메타손 및/또는 프레드니손 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 항류머티즘 약의 ATC 코드 M01C 등급 및 면역억제제의 ATC 코드 L04로부터 선택된 하나 이상의 치료제(들)과 함께 투여될 수도 있다.
또 다른 예에서, 본 발명의 항체는 또한 다른 항체와 조합하여 (CCR2 및 CCR3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 케모킨 수용체와 결합하는 항체 또는 항-TNF 또는 다른 항염증제 또는 기존의 혈장 생성물, 예를 들어, 예방적 또는 치료적 처리에 사용되는 상업적으로 이용 가능한 감마 글로불린 및 면역 글로불린 생성물과 조합하여) 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 항생제 및/또는 항미생물제와 함께 제공된 별도로 투여된 조성물로서 사용될 수 있다.
항체는 IFN-베타, Orencia™ (CTLA4-lg), Humira™ (항-TNF), Cimzia™ (항-TNF, PEG Fab), Tysabri™ (a4-인테그린 mAb), Simponi™, Rituxan/MabThera™, Actemra/RoActemra™, Kineret™, 랍티바, 우스테키무맙, Asprin™, Ibuprofen™ 등과 유사한 비-스테로이드성 항-염증제 (NSAIDS), 코르티코스테로이드, Plaquenil™, Azulfidine™, 메토트렉세이트™ 등과 유사한 질환-변형 항류머티즘제 (DMARDS), Copaxone™ (글라티리머 아세테이트), Gilneya™ (핑골리모드), Flagyl™, Cipro™과 유사한 항생제, 국소 코르티코스테로이드, 비타민 D 유사체 크림 (Dovonex™), 국소 레티노이드 (Tazorac™), 보습제, 국소 면역조절제 (타크롤리무스 및 피메크롤리무스), 콜타르, 안트랄린, 등을 포함하는 국소 (피부 적용됨) 약물과 같은 면역 조절자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 자가 면역에 이미 사용된 약제와 같은 약제와 조합하여 투여될 수도 있고 추가적으로 또한 PUVA, UVB 및 CellCept™ (미코페놀레이트 모페틸)과 유사한 빛 치료는 본 발명에 따르는 항체를 사용하는 치료와 결합될 수도 있다.
본 발명의 항체가 상기 치료 요법에 추가될 수도 있는 경우에 치료되는 대상체는 이미 하나 이상의 다른 약물(들)로 치료되는 중일 수도 있다.
항제 제조 방법
항체는 재조합 숙주에서 항체의 생성 또는 항체의 발현을 위한 히브리도마 클론에 주로 의존하는 업게에 알려진 다양한 방법에 의해 제조될 수도 있으며, 후자는 WO2010/000864에 설명된다. 업계의 지식에 기초하여, 중쇄 및 경쇄가 하나 또는 두 개의 별도의 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수도 있는 경우 원하는 항체 사슬을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 항체의 재조합 발현을 위해 구성되고 사용될 수 있다.
추가의 양태에서 본 발명은 여기에 설명된 항체의 항체 사슬의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오티드(들)에 관한 것이다.
추가의 구체예는 여기에 설명된 항체의 항체 사슬의 폴리펩티드 서열(들)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 항체 사슬의 하나 이상의 폴리펩티드 서열(들)의 발현을 지지하는 조건 하에 상기 설명된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따르는 항체를 생산하는 공정에 관련된다. 공정은 항체 사슬이 하나의 인접한 폴리뉴클레오티드 상에서 두 개의 별도의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)에 의해 암호화되고 선택적으로 항체는 상기 숙주 세포 배양물로부터 회수된다는 것을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명은 여기에 제한되지 않고, 다음 구체예에 의해 설명될 수도 있다.
구체예
1. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며,
상기 CDR1 서열은 SEQ ID 1 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR2 서열은 SEQ ID 2 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR3 서열은 SEQ ID 3 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체.
2. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 1, 2 및 3 또는 상기 서열의 변이체를 포함하고 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)이 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체.
3. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역이 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 1, 2 및 3과 동일한 항체.
4. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며,
상기 CDR1 서열은 SEQ ID 5 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR2 서열은 SEQ ID 6 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR3 서열은 SEQ ID 7 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체.
5. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 5, 6 및 7 또는 상기 서열의 변이체를 포함하고 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체.
6. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 5, 6 및 7과 동일한 항체.
7. 중쇄의 가변 영역은 구체예 1, 2 또는 3 중 어느 하나의 것으로 정의되고 경쇄의 가변 영역은 구체예 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 것으로 정의되는 항체.
8. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며,
상기 CDR1 서열은 SEQ ID 9 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR2 서열은 SEQ ID 10 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR3 서열은 SEQ ID 11 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체.
9. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 9, 10 및 11 또는 상기 서열의 변이체를 포함하고 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체.
10. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 9, 10 및 11과 동일한 항체.
11. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며,
상기 CDR1 서열은 SEQ ID 13 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR2 서열은 SEQ ID 14 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR3 서열은 SEQ ID 15 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체.
12. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 13, 14 및 15 또는 상기 서열의 변이체를 포함하고 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체.
13. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 13, 14 및 15과 동일한 항체.
14. 중쇄의 가변 영역은 구체예 8, 9 또는 10 중 어느 하나의 것으로 정의되고 경쇄의 가변 영역은 구체예 11, 12 또는 13 중 어느 하나의 것으로 정의되는 항체.
15. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며,
상기 CDR1 서열은 SEQ ID 17 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR2 서열은 SEQ ID 18 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR3 서열은 SEQ ID 19 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체.
16. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 17, 18 및 19 또는 상기 서열의 변이체를 포함하고 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체.
17. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 17, 18 및 19와 동일한 항체.
18. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며,
상기 CDR1 서열은 SEQ ID 21 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR2 서열은 SEQ ID 22 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR3 서열은 SEQ ID 23 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체.
19. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 21, 22 및 23 또는 상기 서열의 변이체를 포함하고 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체.
20. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 21, 22 및 23과 동일한 항체.
21. 중쇄의 가변 영역은 구체예 15, 16 또는 17 중 어느 하나의 것으로 정의되고 경쇄의 가변 영역은 구체예 18, 19 또는 20 중 어느 하나의 것으로 정의되는 항체.
22. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며,
상기 CDR1 서열은 SEQ ID 25 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR2 서열은 SEQ ID 26 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR3 서열은 SEQ ID 27 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체.
23. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 25, 26 및 27 또는 상기 서열의 변이체를 포함하고 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체.
24. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 25, 26 및 27과 동일한 항체.
25. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며,
상기 CDR1 서열은 SEQ ID 29 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR2 서열은 SEQ ID 30 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하고 및/또는
상기 CDR3 서열은 SEQ ID 31 또는 1, 2 또는 3개의 아미노산(들) 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 상기 서열을 포함하는 항체.
26. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 29, 30 및 31 또는 상기 서열의 변이체를 포함하고 1, 2 또는 3개의 아미노산(들)은 다른 아미노산 잔기로 치환되는 항체.
27. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 CDR 서열은 SEQ ID 29, 30 및 31과 동일한 항체.
28. 중쇄의 가변 영역은 구체예 22, 23 또는 24 중 어느 하나의 것으로 정의되고 경쇄의 가변 영역은 구체예 25, 26 또는 27 중 어느 하나의 것으로 정의되는 항체.
29. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 4, 12, 20 또는 28과 적어도 80, 85, 90 또는 94% 동일한 서열을 포함하는 항체.
30. 구체예 29에 있어서, 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 항체.
31. 구체예 29에 있어서, 상기 돌연변이(들)는 보존적 돌연변이인 항체.
32. 구체예 29에 있어서, 상기 돌연변이(들)는 가장 가까운 사람 생식세포 서열과 동일성을 증가시키는 항체.
33. 구체예 32에 있어서, 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO 39에 의해 확인되는 항체.
34. 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 8, 16, 24 또는 32와 적어도 80, 85, 90 또는 94% 동일한 서열을 포함하는 항체.
35. 구체예 34에 있어서, 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 프레임워크 ㅇ여영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 항체.
36. 구체예 35에 있어서, 상기 돌연변이(들)는 보존적 돌연변이인 항체.
37. 구체예 35에 있어서, 상기 돌연변이(들)는 가장 가까운 사람 생식세포 서열에 대한 동일성을 증가시키는 항체.
38. 구체예 34에 있어서, 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO 40에 의해 확인되는 항체.
39. 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 4, 12, 20 또는 28과 적어도 80, 85, 90 또는 94% 동일한 서열을 포함하고 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 8, 16, 24 또는 32와 적어도 80, 85, 90 또는 94% 동일한 서열을 포함하는 항체.
40. 구체예 39에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 4와 적어도 96%, 예를 들어 97%, 예를 들어 98% 또는 예를 들어 99% 동일성을 갖고 상기 경쇄 가변 영역의 서열은 SEQ ID NO: 8, 16, 24 또는 32와 적어도 96%, 예를 들어 97%, 예를 들어 98% 또는 예를 들어 99% 동일성을 갖는 항체.
41. 구체예 39 또는 40에 있어서, 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 프레임워크 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 항체.
42. 구체예 41에 있어서, 상기 돌연변이(들)는 보존적 돌연변이인 항체.
43. 구체예 41에 있어서, 상기 돌연변이(들)는 가장 가까운 사람 생식세포 서열에 대한 동일성을 증가시키는 항체.
44. 구체예 41에 있어서, 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO 39에 의해 확인되고 및/또는 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO 40에 의해 확인되는 항체.
45. 구체예 1 내지 구체예 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 C5aR 결합 항체
46. 구체예 1 내지 구체예 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편 또는 단일 사슬 항체인 항체.
47. 구체예 1 내지 구체예 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인 항체.
48. 구체예 1 내지 구체예 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람, 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 비-사람 영장류 항체인 항체.
49. 구체예 1 내지 구체예 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 마우스 또는 사람 항체인 항체.
50. 구체예 1 내지 구체예 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람 항체 또는 사람화된 항체인 항체.
51. 구체예 1 내지 구체예 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람 항체인 항체.
52. C5aR에 결합하는 사람 항체.
53. 구체예 1 내지 구체예 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람 C5aR 결합 항체.
54. 구체예 1 내지 구체예 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합하는 항체.
55. 구체예 1 내지 구체예 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합하는 항체.
56. 구체예 1 내지 구체예 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람 C5aR에 결합하지만 쥐 C5aR에 결합하지 않는 항체.
57. 구체예 1 내지 구체예 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합하지만 쥐 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합하지 않는 항체.
58. 구체예 1 내지 구체예 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 원래의 구조에서만 사람 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합하는 항체.
59. 구체예 1 내지 구체예 58 중 어느 하나에 있어서, 항체는 사람 C5aR에 대한 C5a의 결합을 크게 억제하거나 감소시키는 항체.
60. 구체예 1 내지 구체예 59 중 어느 하나에 있어서, 항체는 SPA 검정에서 C5a를 대체할 수 있고, IC50은 10 nM 이하 또는 5 nM 이하 또는 바람직하게 3 nM 이하인 항체.
61. 구체예 1 내지 구체예 60 중 어느 하나에 있어서, 항체는 시험관 내에서 사람 호중구의 이동을 크게 억제하는 항체.
62. 구체예 1 내지 구체예 61 중 어느 하나에 있어서, 항체는 10 nM C5a의 존재 및 항체의 부재시 30분 후에 관찰된 이동의 수준과 비교하여 10 nM C5a의 존재시 30분 후에 측정될 때, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만으로 이동을 감소시키고 같은 설정에서 IC50은 2.5 μg/ml 이하, 예를 들어 2.5 μg/ml 이하, 예를 들어 1.5 μg/ml 이하, 예를 들어 1.2 μg/ml 이하 또는 1.0 μg/ml 이하인 항체.
63. 구체예 1 내지 구체예 62 중 어느 하나에 있어서, 호중구 상에서 경쟁 리간드 결합 검정에 의해 측정된 항체의 친화도는 0.80 nM 이하, 예를 들어 0.50 nM 이하 또는 0.35 nM인 항체.
64. 구체예 1 내지 구체예 63 중 어느 하나에 있어서, 항체는 생체 외에서 C5a 유발된 호중구 활성화를 중화시키며 IC50은 칼슘-유동 검정에서 7.0 μg/ml 이하, 예를 들어 5.0 μg/ml 이하, 예를 들어 2.5 Mg/ml 이하로 결정되는 항체.
65. 구체예 1 내지 구체예 64 중 어느 하나에 있어서, 항체는 생체 외에서 C5a 유발된 호중구 성숙화를 억제하며
a. IC50은 CD11b 상향-조절 검정에서 3.5 μg/ml 이하, 예를 들어 2.5 μg/ml 이하, 예를 들어 1.5 μg/ml 이하 또는 1.0 μg m 이하인 것으로 결정되거나
b. IC50은 CD62L 하향-조절 검정에서 1.8 μg/ml 이하, 예를 들어 1.5 μg/ml 이하, 예를 들어 1.2 μg/ml 이하 또는 1.0 μg/ml 이하인 것으로 결정되는 항체.
66. C5aR 결합 항체로서, Fc 영역은 각각 SEQ ID NO 33, 34, 35 및 36에 의해 정의된 IgG1, IgG2, IgG4 또는 IgG4/G2 Fc 참조 서열과 비교하여 감소된 친화도/하나 이상의 Fcγ 수용체에 대하여 감소된 결합을 갖는, C5aR 결합 항체.
67. 구체예 1 내지 구체예 66 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역은 각각 SEQ ID NO 33, 34, 35 및 36에 의해 정의된 IgG1, IgG2, IgG4 또는 IgG4/G2 Fc 참조 서열과 비교하여 하나 이상의 점 돌연변이를 유발하고, 하나 이상의 Fcγ 수용체에 대한 친화도를 감소시키는 항체.
68. 구체예 1 내지 구체예 67 중 어느 하나에 있어서, 항체는 시험관 내에서 호중구의 식균작용을 크게 유발하지 않는 항체.
69. 구체예 1 내지 구체예 68 중 어느 하나에 있어서, 항체는 시험관 내에서 ADCC를 크게 유발하지 않는 항체.
70. 구체예 1 내지 구체예 69 중 어느 하나에 있어서, 항체는 시험관 내에서 CDC를 크게 유발하지 않는 항체.
71. 구체예 1 내지 구체예 70 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역은 IgG1 (SEQ ID NO: 33), IgG2 (SEQ ID NO: 34), IgG2/4 (SEQ ID NO: 35), 또는 IgG4 (SEQ ID NO: 36)이며, 다음 점 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 항체:
a. E233P
b. L234A 또는 V234A 또는 F234L 또는 F234V
c. L235E 또는 L235A
d. G236R 또는 G236A
e. G237A
f. N297Q
g. L328R
h. A330S
i. P331S.
72. 구체예 1 내지 구체예 71 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역은 IgG1 또는 IgG1 돌연변이인 항체.
73. 구체예 1 내지 구체예 72 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역은 SEQ ID NO. 33에서 정의된 IgG1 Fc 참조와 비교하여 1 내지 10개의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 Fc 돌연변이인 항체.
74. 구체예 1 내지 구체예 73 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역은 AA 231 내지 240에서 1 내지 8개의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 Fc 돌연변이며, IgG1 Fc 참조 서열은 SEQ ID NO. 33에 정의된 바와 같은 항체.
75. 구체예 1 내지 구체예 74 중 어느 하나에 있어서, Fc 영역은 AA 328 내지 334에서 1 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하는 IgG1 Fc 돌연변이며, IgG1 Fc 참조 서열은 SEQ ID NO. 33에 정의된 바와 같은 항체.
76. 구체예 1 내지 구체예 75 중 어느 하나에 있어서, 항체 Fc 영역은 IgG1이며, 점 돌연변이의 다음 그룹 중 하나 이상을 갖는 항체
a. N297Q 및/또는
b. L234A 및 L235E 및/또는
c. G236R 및 L328R 및/또는
d. N297Q, L234A 및 L235E 및/또는
e. N297Q, L234A, L235E 및 G237A 및/또는
f. L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S.
77. 구체예 52 내지 구체예 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 전체 길이 항체 또는 항체 단편 또는 단일 사슬 항체인 항체.
78. 구체예 1 내지 구체예 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인 항체.
79. 구체예 1 내지 구체예 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람, 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 비 사람 영장류 항체인 항체.
80. 구체예 1 내지 구체예 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 마우스 또는 사람 항체인 항체.
81. 구체예 1 내지 구체예 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람 항체 또는 사람화된 항체인 항체.
82. 구체예 1 내지 구체예 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람 항체인 항체.
83. 면역 질환 또는 장애의 치료를 위한 구체예 1 내지 구체예 80 중 어느 하나의 항체.
84. 구체예 83에 있어서, 장애는 염증성 질환인 항체.
85. 구체예 83에 있어서, 장애는 급성 또는 만성 염증인 항체.
86. 구체예 83에 있어서, 장애는 자가 면역 질환인 항체.
87. 구체예 83 내지 구체예 86 중 어느 하나에 있어서, 항체는 정맥 내 또는 피하에 투여되는 항체.
88. 구체예 83 내지 구체예 87 중 어느 하나에 있어서, 항체는 0.010 mg/kg에서 최대 6 mg/kg의 용량으로 투여되는 항체.
89. 구체예 83 내지 구체예 88 중 어느 하나에 있어서, 항체는 1주일에 한 번 또는 2주일 마다 투여되는 항체.
90. 구체예 83 내지 구체예 89 중 어느 하나에 있어서, 항체는 또 다른 약물과 조합하여 투여되는 항체.
91. 구체예 83 내지 구체예 90 중 어느 하나에 있어서, 질환 또는 장애는 류머티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 홍반성 신염, 염증성 장 질환 (IBD), 크론 병 (CD), 궤양성 대장염 (UC) 또는 과민성 대장 증후군인 항체.
92. 구체예 83 내지 구체예 91 중 어느 하나에 있어서, 환자는 메토트렉세이트와 같은 또 다른 약물로 치료되는 중인 항체.
93. 대상체의 장애를 치료하거나 방지하는 방법으로서, 구체예 1 내지 구체예 82 중 어느 하나에 따르는 항체의 치료량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
94. 구체예 93에 있어서, 장애는 면역 질환 또는 장애인 방법.
95. 구체예 93 또는 구체예 94에 있어서, 항체는 정맥 내 또는 피하에 ㅌ투투여되는 방법.
96. 구체예 93 내지 구체예 95 중 어느 하나에 있어서, 항체는 0.010 mg/kg에서 최대 6 mg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
97. 구체예 93 내지 구체예 96 중 어느 하나에 있어서, 항체는 1주일에 한 번 또는 2주일 마다 투여되는 방법.
98. 구체예 93 내지 구체예 97 중 어느 하나에 있어서, 항체는 적어도 하나의 다른 약물과 조합하여 투여되는 방법.
99. 구체예 93 내지 구체예 98 중 어느 하나에 있어서, 장애는 자가 면역 질환과 같은 면역병리학적 장애인 방법.
100. 구체예 93 내지 구체예 99 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 류머티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 홍반성 신염, 염증성 장 질환 (IBD), 크론 병 (CD), 궤양성 대장염 (UC) 또는 과민성 대장 증후군으로 고통받는 환자인 방법.
101. 구체예 93 내지 구체예 100 중 어느 하나에 있어서, 환자는 또 다른 약물로 치료되는 중인 방법.
102. 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 구체예 1 내지 구체예 82 중 어느 하나에 따르는 항체를 포함하는 약학적 조성물.
103. 구체예 102에 있어서, 수성 조제물 또는 투여 전에 물/수성 버퍼에서 재구성되는 건조 조제물의 형태인 약학적 조성물.
104. 구체예 1 내지 구체예 82 중 어느 하나에 따르는 항체의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
105. 구체예 104에 따르는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
106. 구체예 1 내지 구체예 82 중 어느 하나에 따르는 항체를 생산하는 공정으로서, 상기 항체의 하나 이상의 폴리펩티드 서열(들)의 발현을 지지하는 조건 하에 구체예 105에 따르는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 공정.
107. 구체예 106에 있어서, 중쇄 및 경쇄는 하나의 인접한 폴리뉴클레오티드 상에서 두 개의 별도의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화되는 공정.
108. 구체예 106 또는 107에 있어서, 숙주 세포 배양액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 공정.
109. 의약품의 제조를 위한 구체예 1 내지 구체예 82 중 어느 하나에 따르는 항체의 사용.
110. 류머티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 홍반성 신염, 염증성 장 질환 (IBD) 또는 과민성 대장 증후군과 같은 면역 질환 또는 장애의 치료용 의약품의 제조를 위한 구체예 1 내지 구체예 82 중 어느 하나에 따르는 항체의 사용.
실시예
실시예 1: 사람 항- hC5aR 항체의 생성
면역화 및 스크리닝
일반적으로, 올바른 원래의 단백질 구조를 갖는 가용성 단백질은 불가능하면 생성하는 것이 매우 어렵기 때문에 GPCR에 대한 항체를 개발하는 것이 어렵다. 전통적으로 GPCR을 과발현하는 세포는 면역화에 사용되지만, 결과의 항체 반응은 매우 비특이적인 경향이 있으며, 이것은 원하는 프로파일을 갖는 항체를 확인하는 것을 어렵게 만든다, 즉, 리간드 결합 및 GPCR 신호 전달을 차단할 수 있다. 정말로, 발명자는 C5aR에 결합하는 C5a를 차단하는 사람 항-hC5aR 항체를 개발하는 것이 매우 도전적이라 것을 발견하였고, 이들 항체가 확인되기 전에 많은 면역화 계획이 적용되었다.
HumAb 마우스 (Medarex)를 높은 발현의 사람 C5aR을 갖는 L1.2-마우스 세포 (마우스 림프종 B-세포주)로 면역화하였고 (세포 당 -80,000 카피) (Lee et al Nat. Biotechnol, 2006; 10:1279-1284) 면역화된 마우스의 비장 세포를 표준 과정을 사용하여 세포 융합에 사용하였다. 가용성 hC5aR의 부족으로 인해, 상층액을 표준 ELISA 검정에서 스크리닝 할 수 없고 그러므로 세포 기반 결합 검정을 확립하였다. 얻어진 히브리도마 상층액을 WO2008/022390에 설명된 바와 같이 FACS 분석에 의해 많은 수의 원래의 hC5aR (세포 당 -1,000,000 카피)을 안정적으로 발현하는 트랜스펙션된 래트 세포주 (RBL)에 결합에 대하여 테스트하였다. 일반적으로 히브리도마 상층액을 트랜스펙션되지 않은 세포 (CellTracker로 표지됨) 및 hC5aR-트랜스펙션된 세포, 또는 hC5aR 넉아웃 (knock-out)/넉인 (knock-in) (KOKI) 마우스 (WO 2005/060739)의 호중구의 혼합물과 함께 배양하였고, APC-콘쥬게이트된 F(ab')2 염소 항-사람 IgG (IgG-APC)와 함께 배양하였다. hC5aR-트랜스펙션된 세포에 결합하지만 트랜스펙션되지 않은 세포에는 결합하지 않는 세포를 확인하였고, 항-hC5aR을 생산하는 히브리도마를 서브클로닝하였고 사람 호중구 및 KOKI 마우스로부터 분리된 골수 유도 호중구에 결합에 대하여 테스트하였다 (데이터 미도시). 항-hC5aR 항체를 단백질 A 세파로스 및 표준 프로토콜을 사용하여 히브리도마 상층액으로부터 정제하였다.
실시예 2: 항- hC5aR 항체의 확인 및 특성화
언급된 바와 같이 사람 항-hC5aR 항체를 얻는 공정은 문제가 있었고, hC5a/hC5aR 차단 항체가 확인되기 전에 32번의 융합이 수행해야 했다. 100,000개의 히브리도마 상층액의 35번의 융합 및 스크리닝으로부터 hC5aR에 결합하는 hC5a를 차단할 수 있는 11개의 클론만이 확인되었다. 항체의 특성화에 적용된 검정은 다음에서 설명된다. 참조 항체 (참조 항체 Q)는 WO2009/103113에서 설명된다. 게다가, 칼슘-유동 검정 및 CD11b 상향조절에서 친화도 및 기능성 결정에 맞는 추가의 검정은 실시예 7에서 설명된다.
대체 검정
hC5aR에 결합하는 hC5a를 대체하는 항-hC5aR 항체의 힘을 결정하기 위해 Scintillation Proximity Assay (SPA)을 적용하였다. SPA의 상세한 설명이 미국 특허 4568649 및 제조사 (Amersham Biosciences)에 의해 제공된 프로토콜에 제공된다. 간략히 말하면, RBL-hC5aR 세포로부터 정제된 수용체-운반 막 단편은 맥아 응집소 (WGA)로 코팅된 섬광 미크로 입자에 결합한다. 방사선-표지된 hC5a (125I) 트레이서 (tracer)의 추가 후에, 수용체에 결합은 입자로부터 빛의 방출을 일으킬 것이다. SPA-원칙에 특이적으로, 서로 바로 근접한 방사성 동위원소 및 입자만 빛을 방출할 것이다, 즉, 수용체에 결합된 방사성 표지된 hC5a가 WGA-입자가 빛을 생성할 정도로 가깝다. 따라서 방출된 빛의 양은 수용체-결합된 125I-hC5a의 양의 표현이다. 검정은 경쟁 검정이며, 여기에서 항-hC5aR/비표지된 hC5a는 수용체에 결합에 대하여 트레이서와 경쟁한다. 검정에서, 125I-표지된 C5a의 고정된 양은 WGA-입자 및 C5aR 수용체에 추가되며, 분 당 개수 (cpm)로서 측정된 빛의 특정 양의 방출을 일으킨다. 비표지된 C5a 또는 항-C5aR이 추가되면, 수용체에 이것의 결합은 125I C5a의 대체로 인해 더 낮은 cpm을 유발할 것이다.% 대체를 다음과 같이 계산하였다:
Figure 112013118072917-pct00001
S: 샘플
S최대: 비특이적 결합. 특이적으로 결합된 125I-hC5a를 대체하기 위해 충분한 양의 비표지된 hC5a를 추가함으로써 측정됨.
S0: 최대 결합. 비표지된 hC5a는 추가되지 않는다.
IC50 값은 C5a의 50%를 대체하는 농도로서 정의된다. cpm을 실험 간 일정하게 유지하였고 그러므로 IC50 값은 시간이 흐름에 따라 수십 년 동안 트레이서로서 관련된다. 125I-hC5a를 대체하는 사람 항-hC5aR 항체의 힘 (IC50)이 결정되었고 데이터는 표 1에 제공된다.
호중구 이동 (주화성) 검정
hC5a (또는 mC5a)-의존적 호중구 이동을 억제하는 항체의 힘을 보이덴 챔버 (Boyden chamber)에서 분석하였다. 사람 또는 동물 혈액으로부터 분리된 호중구를 칼세인으로 염색하였고 보이덴 챔버의 상단 구획에 추가하였고 항체와 혼합하였다. hC5a 또는 mC5a를 보이덴 챔버의 하단 구획에 적용하고 호중구에 대한 화학주성인자로서 작용한다. 하단 챔버로 이동하는 호중구의 능력은 3 또는 5 μm 플루오로블록 (fluoroblok) 막을 통과하는 칼세인-염색된 호중구의 수를 셈으로써 결정된다.
사람 PMN (다형핵 백혈구 (PolyMorphoNuclear leukocyte); 과립구)을 EDTA를 함유한 바이알로 뽑은 사람 혈액 샘플로부터 얻었다. 상온에서 30분 동안 (400xg) Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care) 구배 (3 부분)를 통한 혈액 세포를 혈액의 원심분리 (4 부분)에 의해 분리하였다. PMN-함유층을 오염성 적혈구를 제거하기 위해 1시간 동안 덱스트란-500 (Sigma)를 함유하는 PBS (포스페이트 완충된 식염수)에 현탁하였다. 상층액을 상온에서 5분 동안 (250xg) 원심분리하였고 남은 적혈구를 0.2% NaCl을 사용하여 55초 동안 삼투에 의해 용해시켰다. 용액을 1.2% NaCl + PBS에 의해 등장성으로 만들었고 삼투성 용해를 반복하기 전에, 5분 동안 250xg로 원심분리하였다. 원심분리 후 PMN을 반응 혼합물 (RM)에 재현탁하였다: HBSS (제품 번호 14175 Gibco)는 NaCl 137 mM, KCl 5.3 mM, Na2HP04 0.33 mM, NaHC03 4 mM, KH2P04 0.44 mM, 글루코스 5 mM을 함유하고; MgSO4·H20 0.4 mM, MgCl2, 0.5 mM, CaCl2 0.5 mM, HEPES 20 mM로 보충된다. 세포 밀도를 NucleoCounter (Chemometec)에 의해 결정하였다. PMN 현탁은 Giemsa-염색된 샘플의 현미경 관찰에 의해 평가된 바와 같이 >95% 호중구를 함유하였다.
로딩 PMN: 칼세인, AM, (Fluka)을 DMSO (디메틸 술폭시다)에 녹였고 10 μM의 농도를 수득하기 위해 세포가 들어있는 RM (ml 당 2x106개의 세포)에 1000X로 희석하였다. 현탁액을 37℃의 배양기에서 30분 동안 배양하였고 과도한 칼세인을 제거하기 위해 RM으로 3번 세척하였다. 최종적으로 세포를 RM에 재현탁하였다 (4x106 세포/ml).
이동을 FluoroBlok® 3 μm 공극 크기의 96-웰 (제품 번호 351161.BD Falcon (VWR))을 사용하는 보이덴 챔버 기술에 의해 평가하였다. 상단 챔버, 즉, 플루오로블록 막을 함유하는 삽입물을 37℃에서 2시간 동안 1 mg/ml PBS 중의 사람 피브리노겐 (제품 번호 F3879-1G, Sigma)으로 코팅하였다. 세척 후 막을 PBS 중의, 2% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 용액으로 차단하였다. RM을 사용한 또 다른 세척 후, hC5aR-항체가 있거나 없는 105개의 칼세인-로딩된 PMN을 각 웰에 추가하였고 대조군 용액 또는 화학주성인자 hC5a (Sigma, C5788)을 함유하는 수신자 플레이트 (낮은 챔버)에 배치하였다. 각 그룹은 적어도 6개의 웰로 구성되었다. 그 후에 플레이트를 플레이트 리더 (SpectraMax, Molecular devices, 또는 Fluoroscan, Thermo Labsystems.)에서 37℃에서 60분 동안 5분 마다 485/538 nm로 측정하였다. 상대적 형광 단위에서 30분의 값을 이동의 측정값으로 사용하였다.
곡선 맞춤. 이동을 억제하는 항체의 능력을 GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)를 사용하여 결정된 IC50으로 표현하였다.
표 1은 사람 호중구의 hC5a-의존적 (10 nM) 이동을 억제하는 10 μg/ml 사람 mAbs의 능력을 테스트하는 대체 검정 및 주화성 검정의 데이터를 포함한다. 항체의 부재시 얻어진 값을 100으로 설정하였다. 데이터를 3개의 기능자로부터 컴파일 (compile)하였다. 평균 값은 표 1에 포함된다. 세 개의 mAbs 32F3A6, 35F12A2 및 35F32A3은 두 개의 검정에서 가장 강한 힘을 나타냈으며, 이것은 대조군 항체의 힘과 같거나 약간 더 크다. 참조 항체는 WO2009/103113에 설명된 Q이다.
Figure 112013118072917-pct00002
표 1. 항-hC5aR 항체의 기능적 특성.
항- hC5aR mAb CDR 서열의 특성화
항-hC5aR Ab 35F32A3, 32F3A6, 35F12A2 및 35F24A3의 가변 영역을 재조합에 의해 클로닝하였고 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 표준 방법을 사용하여 특성화하였다. 아미노산 서열은 도 1 및 첨부된 서열 목록에 포함된다.
결합 특이성의 특성화
사람-마우스 C5aR 키메라 구조를 C5aR의 결합 영역을 결정하기 위해 사용하였다. 키메라 수용체는 HEK 세포에서 일시적으로 발현되었고 개개의 항체의 결합을 세포주의 변화를 제외하고 이전에 WO 2008/022390에 설명된 바와 같이 FACS에 의해 결정되었다. 32F3A6, 35F32A3 및 35F12A2의 결합은 세포외 루프 2의 사람 서열에 의존적인 반면에, 사람 N-말단은 불필요하다 (도 2).
실시예 3. Fc 변이체의 발생
네 개의 사람 IgG 하위 등급 (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)은 Fc 영역의 95% 이상의 상동성을 공유하지만, 힌지 영역에서 큰 차이를 나타낸다. Fc 영역은 효과기 기능, 예를 들어, 항체-의존적 세포-매개된 세포 독성 (ADCC) 및 보체 의존적 세포 독성 (CDC)을 매개한다. ADCC에서, 항체의 Fc 영역은 자연 살해 세포 및 단핵백혈구와 같은 면역 효과기 세포의 표면상의 활성화 Fc 수용체 (FcγR)에 결합하고, 표적화된 세포의 식균작용 또는 용해로 이어진다. CDC에서, Fc 영역은 FcγR-결합 부위와 다른 부위에서 보체와 결합하고, 항체는 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 촉발함으로써 표적화된 세포를 살해한다. 다양한 IgG 이소폼 (isoform)은 순서 IgG4 < IgG2 < IgG1 < IgG3으로 증가하는 효과기 기능의 다른 수준을 발휘한다. 많은 IgG Fc 변이체는, 모두 참조항체 Q의 가변 영역을 포함하며, QuickChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (제품 번호. 200518, Stratagene)를 사용하여 부위-관련 돌연변이 생성에 의해 발생하였고 실시예 4에 설명된 바와 같이 특성화되었다.
실시예 4: Fc 변이체의 효과기 기능의 특성화
FcgR 에 대한 Fc 변이체의 결합 친화도
FcγR에 대한 Fc 변이체의 친화도를 CM5 센서 칩 (GE)를 사용하여 BIAcore T100 기구에서 수행한 표면 플라스몬 공명 (SPR) 측정법에 의해 결정하였다. Fc 변이체를 아민-커플링 화학법을 사용하여 유동 세포에 고정하였다. Fc 변이체에 대한 FcγR의 친화도를 측정하는 동력학 SPR에 대하여, His-FcγR을 분해물질로서 사용하였고 HBS-EP 완충액 중의 유동 세포에 주사하였다. 높은 친화도 수용체 FcγRI를 40 μl/분의 유속, 180초의 접촉 시간, 및 300초의 해리 시간으로 주사하였다. 칩 표면을 10 mM NaOH 및 500 mM NaCl을 함유하는 용액으로 재생하였다. 친화도 (Kd 값)를 표 2a에 나열한다.
Figure 112013118072917-pct00003
표 2a. FcγR에 대한 Fc 변이체 친화도 (M의 Kd)의 분석으로부터 얻은 결과의 요약. (- = 결합 안 함; 0 = 결합시 변화 없음; nda = 너무 약한 결합으로 인해 계산되지 않은 Kd). (1) CH1 및 IgG2의 더 낮은 힌지 영역, 및 IgG4의 나머지 CH2-CH3을 포함하는 IgG2/IgG4 Fc 변이체; (2) 점 돌연변이 S228P를 포함하는 IgG4 돌연변이.
식균작용 검정
호중구의 식균작용을 매개하는 감소되거나 폐지된 능력을 가진 Fc 변이체를 확인하기 위해 시험관 내 식균작용 검정을 확립하였다. 다음에 설명된 식균작용 검정은 형광 염료, CMFDA로 사람 말초 혈액으로부터 분리된 사람 호중구 (식균작용의 표적 세포)를 표지하고, 또한 사람 말초 혈액으로부터 분리된, 사람 단핵백혈구의 배양물에 그것들을 추가하는 것을 수반한다. CMFDA-표지된 호중구를 테스트 mAbs (또는 PBS)로 미리 코팅하였고, 사람 단핵백혈구로 배양 후, CD14/CMFDA 이중 양성 단핵백혈구는 FACS에 의해 결정된다. 다양한 Fc 변이체의 결과를 표 2b에 제공한다.
테스트된 모든 항체는 WO2009/103113에 설명된 Q 항체의 가변 영역을 포함하고 상기 참조 항체로서 사용한다.
단핵백혈구 및 대식세포 둘 다는 호중구의 항체 의존적 식균작용을 매개할 수 있는 것으로 발견되었고 두 개의 세포 타입을 사용하는 식균작용을 확립하였다. 결과는 두 검정에서 질적으로 유사하지만, 대식세포 검정이 더 가변적이기 때문에, 주로 단핵백혈구를 사용하여 분석을 수행하였다.
사람 단핵백혈구의 제조
사람 단핵백혈구 및 림프구를 퍼콜 (percoll) 구배 원심분리를 사용하여 항응고제로서 EDTA를 함유한 튜브 (K2E, BD Biosciences, 제품 번호 367525)에서 건강한 사람 지원자로부터 수거된 말초 정맥혈로부터 분리하였다. 100 ml 혈액은 일반적으로 ~8-20x107개의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 제공하였다. 적어도 3배의 부피의 dPBS를 상온 (RT)에서 10분 동안 100xg로 원심분리된, 분리된 세포에 추가하였다. 상층액을 제거한 후 사전 단계로서 림프구/단핵백혈구 층을 같은 부피의 dPBS:배양 배지의 50:50 혼합물에 재현탁하였고 상온에서 10분 동안 100xg로 다시 원심분리하였다. 상층액을 제거하였고 림프구/단핵백혈구 층을 배양 배지에 1-2x106 세포/ml로 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 6-웰 조직 배양 플레이트 (Corning, Costar 제품 번호 3516)에 4x106 세포/웰의 2 ml/웰로 평판 배양하였고 5% CO2에서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 비-부착 세포 (림프구 및 죽은 세포)를 흡인에 의해 제거하였고 부착된 세포 (단핵백혈구)를 세척 배지의 흡인 전에 부드럽게 돌리면서 1 ml 배양 배지 (RPMI 1640 (Invitrogen-GIBCO, 제품 번호 11875) + 56℃에서 30분 동안 열 불활성화된 10% FCS (Invitrogen-GIBCO, 제품 번호 16000) + 25 mM Hepes (Invitrogen-GIBCO, 제품 번호 15630) + 1% Pen/Strep (Invitrogen-GIBCO, 제품 번호 15070))로 네 번 세척하였다. 혈액-유도된 단핵백혈구로 세척 후에 1 ml 신선한 배양 배지를 각 웰에 추가하였다. 웰당 단핵백혈구의 수를 측정하기 위해 세포를 한 웰에서 긁어냈고 배양 배지에 현탁하였다.
사람 호중구의 제조
사람 호중구를 퍼콜 구배 원심분리를 사용하여 건상한 지원자로부터 수거된 말초 정맥혈로부터 분리하였고 CellTracker™ Green (5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트, CMFDA)으로 염색하였다. 100 ml 혈액은 일반적으로 ~10-20x107 호중구를 제공하였다. 염색을 DMSO 중의 CellTracker™ Green CMFDA를 10 mM 최종 농도로 용해시킴으로써 수행하였다. 호중구를 dPBS에서 1x107 세포/ml로 재현탁하였고 CMFDA를 2 μM의 최종 농도로 추가하였다. 세포 및 염료를 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 과도한 염료를 세포를 dPBS로 세 번 세척함으로써 제거하였다 (상온에서 5분 동안 300 x g로 원심분리에 의해). 세포 계수를 최종 세척 단계 후 수행하였다. CMFDA-표지된-호중구를 dPBS 중의 2x106 세포/ml로 재현탁하였고 항체 (최종 농도 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 또는 100 g/ml) 또는 PBS (항체가 없는 대조군)와 함께 배양하였다. 일부 검정에서 (지시된 바와 같이) 호중구+Ab 배양 단계는 또한 4 mg/ml 사람 IgG를 함유하였다. 세포 플러스 항체를 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 호중구를 상온에서 5분 동안 300 x g로 원심분리 후 dPBS로 두 번 세척하였고 1x107 세포/ml로 배양 배지에 재현탁하였다.
FACS 분석
항체로 미리 코팅된 (상기 설명된 바와 같이 제조된), CMFDA-표지된 호중구를 1 ml 배양 배지에서 원하는 농도로 단핵백혈구에 추가하였다 (상기 설명된 바와 같음). 6-웰 플레이트의 각 웰의 총 부피는 2 ml이었다. 일부 검정에서 (지시된 바와 같이) 배양 배지는 또한 4 mg/ml 사람 IgG를 함유하였다. 5:1 (호중구: 단핵백혈구)의 비율을 일반적으로 사용하였다. 부착된 단핵백혈구의 수가 웰 당 4x105개 보다 적으면, 2x106개의 호중구를 추가하였다 (즉 5:1이 넘는 호중구:단핵백혈구 비율). 단핵백혈구의 수가 웰 당 4x105개를 넘으면 호중구의 수의 다섯 배를 호중구: 단핵백혈구 비율을 5:1로 유지하기 위해 추가하였다. 배양물을 5% C02 배양기에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
배양 후 비-부착 및 비-섭취된 호중구를 제거하기 위해 배지를 흡인하였다. 부착 단핵백혈구를 1 ml/웰 배양 배지로 세 번 세척하였다 (부드럽게 돌리면서). 단핵백혈구를 웰에서 배양 배지 중의 세포를 Cell Scraper (Corning, 제품 번호 CP3010)로 긁어냄으로써 15 ml 튜브에 수거하였다. 세포를 상원에서 5분 동안 300 x g로 원심분리하였고 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛을 FACS 전에 고정하기 위해 160 μl PBS 중의 1 중량% 파라포름알데히드에 재현탁하였다.
샘플을 FACSCalibur 유동 세포분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다. CMFDA로 표지된 호중구를 확인하였고 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)를 사용하여 FL-1 (형광 발광 채널 1)에서 측정하였고, 단핵백혈구를 단핵백혈구 유일 샘플을 피코에리트린 표지된 항-CD14로 염색함으로써 확인하였으며, 이것은 FL-2 (형광 발광 채널 2)에서 측정하였다. 단핵백혈구 게이트를 단핵백혈구 유일 샘플의 FSC (전방 산란) 대 SSC (측면 산란) 프로파일을 사용하여 정의하였고 배양 중에 크기가 증가하는 단핵백혈구를 포함하기 위해 넓어졌다 (FSC 및 SSC 축을 따라). 이 게이트는 호중구 유일 샘플의 FSC 대 SSC 프로파일에서 정의된 호중구를 함유하는 FSC 대 SSC 프로파일의 영역을 제거하였다. 식균작용의 정도를 총 단핵백혈구 게이트 중의 FL-1+ ve 단핵백혈구의 퍼센트로 계산하였다.
비-특이적 식균작용의 배경 수준은 항체로 코팅되지 않은 CMFDA-표지된 호중구를 함유하는 샘플 ("항체 없음" 샘플) 중의 FL-1+ ve 단핵백혈구의 퍼센트였다. 데이터 (% FL-1+ ve 단핵백혈구 대 항체 농도)를 그래프로 나타내기 위해 Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc)에 대입하기 전에 배경을 항체가 있는 각 샘플에서 뺐다 데이터는 적절한 경우 EC50 값을 결정하기 위해 에스자 용량-반응 (가변 기울기), 즉, 4-파라미터 로그 방정식을 사용하여 비-선형 회귀를 받았다.
데이터는 표 2b에 제공된다. "-"는 검출 가능한 식균작용이 없음을 나타내고 "+"에서 "++++"는 검정에서 측정된 바와 같이 식균작용의 낮은 수준에서 높은 수준을 나타낸다.
ADCC (항체 의존적 세포 독성) 및 CDC ( 보체 의존적 세포 독성) 검정
ADCC 또는 CDC 의존적 메카니즘을 통해 세포 고갈을 매개하는 Fc 변이체의 능력을 테스트하기 위해 다음 시험관 내 검정을 확립하였다.
표적 세포
이들 검정에서 표적 세포는 Ramos 클론 E2를 발현하는 hC5aR 또는 사람 호중구였다. 표준 과정을 사용하여 Ramos 클론 E2 세포를 hC5aR을 암호화하는 포유동물 발현 벡터에 안정적으로 트랜스펙션함으로써 Ramos 클론 E2를 발현하는 hC5aR을 개발하였다. 결과의 세포주는 높은 수준의 사람 C5aR (사람 호중구에서보다 5-7배 더 높음) 및 CD20을 발현한다. 식균작용 검정에 관하여 상기 설명된 바와 같이 사람 호중구를 얻었다.
표적 세포를 형광 발광 세포 막 염료, PKH-26으로 염색하였다. 필요한 수의 표적 세포 (5x104/샘플/웰x4)를 dPBS의 15 ml로 희석하였고 상온에서 5분 동안 1,200 rpm으로 원심분리하였다. 세포를 2 μM PKH-26 (모든 1x106 표적 세포에 대하여 100 μl)에 재현탁하였다. 표지 반응을 중단하기 위해 동량의 열-불활성화된 FCS (또는 열-불활성화된 사람 혈청 (Millipore))를 추가하기 전에 표지를 상온에서 정확히 3분 동안 진행하는 것을 허용하였다. 정확히 1분 후 RPMI를 15 ml의 총량에 추가하였다. 세포를 상기와 같이 원심분리하였고 검정 배지에서 2x106 세포/ml로 재현탁하였다. PKH-26의 항체 앨리쿼트 (25 μl 즉 5x104)로 코팅하기 위해 표지된 표적 세포를 검정 배지에 희석된 200 μg/ml 항체의 25 μl을 함유하는 멸균 U-바닥 96-웰 플레이트의 웰에 분배하였고 (최종 농도 100 μg/ml) 5% C02에서 37℃에서 30분 동안 배양하였다.
효과기 세포
효과기 세포는 건강한 기증자의 단핵백혈구-고갈된 PMBC였다. PMBC를 상기 설명된 바와 같이 얻었다. 재현탁된 세포 (림프구/단핵백혈구)를 ~4x106 세포/웰의 2 ml/웰로 6-웰 조직 배양 플레이트 (Corning)에 또는 플라스크 당 20 mL로 T75 플라스크 (Corning)에 평판 배양하였고 5% CO2에서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 비부착 세포 (림프구 및 NK 세포를 포함)를 흡인에 의해 제거하였고 상온에서 10분 동안 100 x g로 원심분리하였다. 세포를 림프구 및 자연 살해 세포의 수를 증가시키기 위해 재조합 사람 IL-2의 100 ng/ml을 함유하는 20 mL 배지에 재현탁하였다. 다음날 세포를 상온에서 10분 동안 1,400 rpm으로 원심분리하였고 ADCC 검정에서 효과기 세포로 사용되는 2.5x107 세포/ml로 검정 배지에 재현탁하였다.
ADCC 검정
PKH-26으로 표적 세포의 표지 및 항체로 코팅 후 100 μl 효과기 세포 또는 100 μl 검정 배지 (대조군, 표적 세포 유일)를 50 μl 표적 세포에 직접적으로 추가하였다. 샘플을 5% CO2에서 37℃에서 추가 3시간 동안 배양하였다. 샘플을 ~625 nM의 최종 농도를 위해 10 μl의 10 μM To-Pro-3 생존 염료 (TP-3)를 함유하는 1.2 ml 미세역가 FACS 튜브로 옮겼고 샘플을 FACS로 분석하였다. FSC 대 SSC 플롯에서 부스러기를 제외한 모든 세포를 게이트 (gate)하였다. 게이티드 (gated) 세포를 FL-2 대 FSC에서 분석하였고 FL-2 양성 세포 (즉, PKH-26 표지된 표적 세포)를 게이트하였다. FACS 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc. v6.3.4)를 사용하여 분석하였다.
각각 평균% TP3+ ve '항체 없는 표적 유일' (C) 및 평균% TP3+ ve '항체 없는 표적+효과기' (D)를 뺀 후 해당 샘플의 '평균% TP3+ ve 표적+효과기' (B)에서 평균% TP3+ ve '표적 유일' (A)을 뺌으로써 특이적 ADCC를 계산하였다; 즉
특이적 ADCC = (B - D) - (A - C) 또는 = (B - A) - (D - C) 방정식 1
표 2b에 제공되는 결과를 단핵백혈구-고갈된, IL-2-자극된 사람 PBMC, 주로 NK 세포를 사용하여 얻었지만 효과기 세포 집단으로서, B-세포, T-세포 및 수지상세포을 포함한다. 표적 세포는 양성 대조군으로서 항-CD20 항체 리툭시맙의 사용을 가능하게 하는 hC5aR 및 CD20 둘 다를 발현하는 트랜스펙션된 세포주 Ramos E2였다. 결과는 리툭시맙과 같은 힘을 갖는 ADCC를 포함하는 Fc 변이체를 나타내는 "+++", 높은 정도의 기증자 변화가 관찰되는 Fc 변이체를 나타내는 "+/-" 및 ADCC의 유의한 유발이 검출되지 않는 Fc 변이체를 나타내는 "-"의 범위에 있다. 증가된 ADCC를 매개하는 Fc 변이체 (IgG1_S239D, I332E) (Chu SY, Vostiar I, Karki S et al; Mol Immunol, 2008, 45(15):3926-3933)는 검정에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다.
CDC 검정
Fc 변이체를 또한 CDC를 유발하는 그것들의 힘에 대하여 분석하였다. 실험 설정은 본질적으로 효과기 세포가 사람 혈청으로 대체된다는 점을 제외하고 ADCC 검정에 대하여 설명된 바와 같다.
표적 세포, 예를 들어, 3% 토끼 보체 혈청이 들어있는 배지에서 Ramos E2 세포 (2x106 세포/ml)를 동량의 2x 항체 용액 (200 μg/ml)과 혼합하였고, 96-웰 U-바닥 조직 배양 플레이트에 3% 토끼 보체 혈청을 함유한다. 웰의 복제 세트는 보체가 없는 배지의 25 μl 2x 항체 용액 (200 μg/ml)과 혼합된 25 μl Ramos E2 세포 (2x106 세포/ml)를 함유하였다. 3개의 웰의 세트는 25 μl Ramos E2 세포 (2x106 세포/ml) 플러스 3% 토끼 보체 혈청 중의 25 μl 검정 배지 ('항체 없는' 샘플)를 함유하였다. 3개의 웰의 또 다른 세트는 25 μl Ramos E2 세포 (2x106 세포/ml) 플러스 보체가 없는 25 μl 검정 배지 ('항체가 없는' 샘플)를 함유하였다. 배양 전에, 적절하게 3% 토끼 보체 혈청이 있거나 없는 100 μl 검정 배지를 각 웰에 추가하였다. 샘플을 5% CO2에서 37℃에서 3시간 동안 배양하였다.
표적 세포 생존력의 결정
형광 생존 염료 To-Pro-3 (Molecular Probes)를 유동 세포분석법에 의한 분석 직전에 각 샘플에 추가하였다. 각 튜브의 To-Pro-3의 최종 농도는 -62.5 nM이었다. To-Pro-3 양성 (TP3+) 세포를 살아있지 않거나 용해된 것으로 정의하였다.
유동 세포분석법 & 데이터 분석
샘플을 FACSCalibur (BD Biosciences)에서 분석하였고 획득한 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (v6.3.4, TreeStar Inc.)를 사용하여 분석하였다. FSC 대 SSC 산란 플롯에서, 부스러기를 제외한 모든 세포상에 게이트하여, 5,000개의 표적 세포 이벤트를 각 샘플에 대하여 수거하였다. FL-4 채널에서 게이티드 표적 세포의 막대 그래프를 생성하였으며 이것은 세포에 의한 To-Pro-3 흡수의 수준을 나타냈다. 각 샘플에서 TP3+ 세포 (즉, 살아있지 않은 세포)의 수를 결정하였고 - 이들은 주요 피크의 우측면에 있는 세포로서 정의되었다 - 이 수는 샘플에서 총 표적 세포의 퍼센트로서 표현되었다.
세 번 검정된 샘플을 하기 범주 개요에 나타난 바와 같이 4개의 범주, A, B, C 및 D 중 하나로 분류될 수 있다.
범주 개요
Figure 112013118072917-pct00004
분석된 샘플의 범주
항체를 함유하는 각 샘플에 대하여, 보체가 있거나 없이 반응을 수행하였다. 보체가 없는 항체를 함유하는 샘플은 항체 특이적 배경 용해의 수준을 제공하였다. 범주 B & D의 샘플은 항체 또는 항체 및 보체 둘 다의 부재시 비-특이적 배경 용해를 제공한다.
TP3+ 살아있지 않은 표적 세포의 퍼센트 (% 용해)를 3% 보체가 있는 각 샘플에 대하여 및 보체가 없는 각 샘플에 대하여 계산하였다. 각 항체 및 '항체 없는' 대조군에 대하여, 삼중 샘플의 데이터의 평균을 계산하였다.
각 항체에 대한 특이적 CDC 활성을 계산하기 위해, 비-특이적 배경 용해를 빼기 전에 보체의 부재시 항체-특이적 용해 ('A' 샘플에서 평균% 용해)를 보체가 있는 항체 샘플 ('C1/2/3' 샘플)의% 용해로부터 뺐다. 비-특이적 배경 용해는 보체가 없는 '항체 없는' 샘플에서 용해 ('B' 샘플의 평균% 용해)보다 더 적은, 보체가 있는 '항체 없는' 샘플에서 용해 ('D' 샘플의 평균% 용해)였다. 증가된 CDC를 매개하는 Fc 변이체 (IgG1_S254W) (WO08030564)는 검정에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다.
특이적 CDC (% 용해) = (C - A) - (D - B) [또는 = (C - D) - (A - B)] 방정식 2
그룹 중 어떤 것들 사이의 차이가 유의한지 결정하기 위해 GraphPad Prism (v4.0)에서 통계 분석을 수행하였다. 4번의 검정 모두의 각 샘플의 특이적 CDC 활성을 사용된 항체에 따르는 스프레드시트 (spreadsheet)에 대입하였다. 그룹을 파라미터 테스트를 사용하여 비교하였다: 일원 분산 분석(one-way analysis of variance; ANOVA) 후 이어서 터키 다중 비교 사후 검정 (Turkey's multiple comparison post test).
결과는 표 2b에 포함된다. 결과는 IgG1 S254W 돌연변이와 같은 힘으로 CDC를 유발하는 Fc 변이체를 나타내는 "+++", 높은 정도의 변이가 관찰되는 Fc 변이체를 나타내는 "+/-" 및 CDC의 유의한 유발이 검출되지 않는 Fc 변이체를 나타내는 "-"의 범위에 있다.
Figure 112013118072917-pct00005
표 2b. 세포 기반 효과기 기능 검정에서 Fc 변이체의 활성.
결과의 요약을 식균작용에서 Fc 변이체의 분석, ADCC 및 CDC 검정으로부터 얻었다 (- = 효과기 기능 없음; + = 효과기 기능). (1) CH1 및 IgG2의 더 낮은 힌지 영역, 및 IgG4의 나머지 CH2-CH3를 포함하는 IgG2/IgG4 Fc 변이체; (2) 절반 항체의 형성을 제거하기 위해 IgG4 Fc 영역에 도입된 S228P 돌연변이.
실시예 5: 항- hC5aR 항체 Fc 변이체의 힘의 특성화
Fc 영역의 돌연변이가 hC5aR에 결합하는 hC5a를 억제하는 항체의 힘 및 hC5a-매개된 호중구 이동에 영향을 미치는지 각각 테스트하기 위해, 다른 Fc 변이체를 상기 설명된 대체 및 이동 검정에서 테스트하였다. 사용된 PMN이 hC5aR-KO/KI 마우스 (mC5a-수용체 넉아웃/사람 C5aR 넉인, WO 2005 060739)로부터 분리된 마우스 PMN인 점을 제외하고 상기 설명된 바와 같이 호중구 이동 검정을 수행하였다. 세포를 다음과 같이 얻었다. 두 마리의 hC5aR-KO/KI 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 골수 PMN을 분리하였다. 골수 세포를 세포 현탁액이 Cell Strainer (BD Falcon, 352350; 70 미크론 나일론 그물망)를 통해 50 ml 튜브로 여과되기 전에 PBS를 사용하여 뼈에서 떼어냈고 원심분리하였다 (10분, 1600 rpm). 세포를 배지에 재현탁하였고 멸균 15 ml 튜브에서 3 ml Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)의 상단에 조심스럽게 쌓았다. 상온에서 20분 동안 600 x g로 원심분리 후, 호중구/적혈구 펠렛을 분리하였다. 적혈구를 Lysing Buffer (Sigma, R7757; 10 mM Tris-HCl pH 7.5 중의 8.3g/L 염화 암모늄)를 사용하여 1분 동안 용해시켰다. 두 라운드의 원심분리 및 세척 후 펠렛을 반응 혼합물에 재현탁한다. 현탁액은 Giemsa-염색된 샘플의 현미경 관찰에 의해 평가된 바와 같이 >95% 호중구를 함유하였다. 테스트된 항체의 가변 영역은 참조 항체 Q의 가변 영역과 동일했다. 데이터는 표 3에 제공된다.
hC5aR에 결합하는 gC5a를 억제하는 힘에서 SPA 분석에서 Fc 변이체에 대하여 유의한 차이를 관찰하였다 (표 3, 컬럼 1). 참조 항체 Q의 IgG1 버젼을 추가적인 IgG Fc 변이체와 함께 분석하였고, 데이터는 IgG1 Fc 변이체가 일반적으로 IgG4 및 IgG2/IgG4 Fc 변이체 둘 다 보다 더 강하게 결합하는 hC5a를 억제한다는 것을 나타냈다. 참조 항체 Q의 F(ab')2 단편은 분석에 포함되고 전체 길이 참조 항체 Q (IgG4)와 같은 정도로 hC5a 결합을 억제하는 것을 발견하였다. 이 발견은 힌지 영역이 hC5a 결합을 억제하는 항체의 능력에 중요하고 이 개념은 F(ab')2 단편이 참조 항체 Q와 같은 정도로 호중구 이동을 억제할 수 있다는 사실에 의해 지지된다 (표 3). 또한 IgG1 변이체를 IgG2 또는 IgG4 힌지 영역을 포함하는 IgG보다 호중구 이동을 억제하는데 있어서 더 강한 것으로 발견되었다 (표 3, 컬럼 2).
IgG4 버젼보다 참조 항체의 IgG1 버젼의 더 강한 힘은 IgG 힌지 영역의 증가된 가요성으로 인한 증가된 결합능에 관련될 수 있다. 이것을 조사하기 위해, 사람 호중구에 대한 참조 항체의 IgG1 및 IgG4 버젼의 결합을 FACS에 의해 분석하였다. 데이터는 IgG1 버젼이 IgG4 버젼보다 더 높은 결합능으로 호중구에 결합한다는 것을 입증했다. 데이터 미도시.
종합해보면, 이 발견은 IgG1 힌지 영역에서 증가된 가요성이 hC5aR에 증가된 결합에 기여하며, 이것은 증가된 힘으로 이어진다는 것을 지지한다.
Figure 112013118072917-pct00006
표 3. hC5a 결합 (SPA) 및 hC5a를 향한 호중구 이동에 대한 Fc 변이체의 효과.
(+ = 낮은 활성, ++= 중간 활성, +++/+ 높음).
실시예 6. "완전한" 사람 항- hC5aR 항체의 생성 및 특성화
실시예 2에 설명된 분석으로부터, 항체 32F3A6을 추가 연구를 위해 선택하였다. 이 항체의 재조합 클로닝 중에, 사람 생식세포 서열과 다른 VH 프레임워크 영역에서 7개의 돌연변이가 확인되는 한편, LC에서는 프레임워크 돌연변이가 발견되지 않았다 (도 3). 돌연변이는 이용 가능한 사람 생식세포 서열로 32F3A6의 VH 및 VL 서열을 정렬함으로써 발견되었다.
항체를 만들기 위해 32F3A6의 VH 영역에서 추가의 사람-유사 7개의 점 돌연변이가 다시 사람 생식세포 잔기로 돌연변이되었고, 다섯 개의 돌연변이를 포함하는 IgG1 Fc 영역에 이식되었으며 이것은 상기 설명된 바와 같이 식균작용, ADCC 및 CDC의 유발을 폐지하는 것으로 나타났다. 화합물은 32F3A6 GL로 나타난다.
역-돌연변이된 항체의 힘을 본래의 항체와 비교하였고 hC5aR에 대한 hC5a 결합을 억제하는 힘 (SPA에서 검정됨) 또는 32F3A6 또는 32F3A6 GL 사이에서 hC5a-매개된 호중구 이동을 억제하는 힘에서 차이가 관찰되지 않았다 (데이터 미도시).
호중구 식균작용, ADCC 또는 CDC를 유발하는 상기 설명된 완전한 사람 항체의 능력을 실시예 4에 설명된 바와 같이 평가하였고 표 4에서 요약된다.
표 4에 포함된, 효과기 세포로서 단핵백혈구-고갈된 사람 PBMC, 및 표적 세포로서 사람 호중구를 사용하여 특이적 ADCC와 관련된 결과를 얻었다.
Figure 112013118072917-pct00007
표 4. 항-C5aR 항체의 Fc-매개된 세포의 효과기 기능. 실시예 4에 설명된 검정에서 측정된 바와 같이 "-"는 검출 가능한 효과기 기능이 없다는 것을 나타내고 "+"에서 "+++"는 낮은 수준에서 높은 수준의 효과기 기능을 나타낸다. ND (미결정).
이전에 관찰된 바와 같이 IgG1의 Fc 영역에서 5개의 점 돌연변이는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 식균작용, ADCC 및 CDC를 폐지한다.
실시예 7. 항- hC5aR 항체 (32F3A6 GL )의 추가의 특성화
확인된 항체의 기능성을 더 설명하고 친화도 및 힘을 결정하기 위해, 참조 항체 Q와 비교하여 항-C5aR 항체 중 하나를 사용하여 추가적인 검정을 수행하였다. 친화도를 사람 호중구에서 경쟁 리간드 결합 검정에 의해 결정하였다. 이 기능성은 경쟁 리간드 결합 검정에 의해 측정된 항체의 친화도로서 나타나지만, 상호작용의 결합능의 고려된 측정값도 될 수 있다. 생체 외 검정은 시험관 내 설정에서 C5a 매개된 작용을 중화하는 항체의 능력을 측정한다. 힘 검정을 사람 호중구에서 각각 C5a-유발된 Ca-유동의 중화, CD11b 수용체 상향-조절 및 CD62L 하향-조절을 측정하였다. 32F3A6GL에 대하여 얻어진 데이터는 표 5에 제공된다.
친화도 측정
신선한 사람 혈액으로부터 호중구의 분리
혈액을 PBS + 2% FBS로 1:1로 희석하였고 3부의 피콜 및 4부의 혈액 (50 ml 튜브에 15 ml 피콜 및 20 ml 혈액)의 비율로 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare #17-1440-03) 상에 쌓았고 이후에 상온에서 30분 동안 400 x g로 원심분리에 의해 층화하였다. 흡인에 의해 중간의 PBMC 밴드를 부드럽게 제거하였다. 충전된 (packed) 적혈구 상에 층화된 과립구를 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 흡인하였다. 과립구 및 적혈구를 옮겼고 새로운 50 ml 튜브에서 펠릿화하였다. 펠릿을 1xPBS를 가지고 40 ml로 희석하였고 PBS중의 4% DEXTRAN 500 (sigma, 31392) 용액 (비율 1:5)을 추가하였고 부드럽게 뒤집으면서 혼합하였다. 20-30분 후, 얻어진 과립구가 풍부한 상층액을 새로운 튜브로 옮겼고 상온에서 5분 동안 250 x g로 스핀 다운 (spin down)하였다. 오염성 적혈구를 0.2% NaCl의 7.5 ml에 세포 펠릿을 재현탁함으로써 삼투성 용해로 제거하였고 55-60초 동안 부드럽게 혼합하였다. 이후에 1.2% NaCl의 17.5 ml을 추가하였고 PBS을 가지고 50 ml로 희석하였고 5분 동안 250 x g로 스핀 다운하였다. 이 단계를 한 번 더 반복하였다. 이후에 세포 펠릿을 1 ml 반응 혼합물 (dPBS/RPMI)에 재현탁하였다. 생존력 및 세포 수를 NucleoCounter®를 사용하여 관찰하였다.
호중구 상에서 경쟁 리간드 결합 검정.
사람 호중구를 정제하였고, 세척하였고 결합 버퍼 (50 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 및 0.5% 소 혈청 알부민 (FractionV Ig G 없음))에서 ~5x106 세포/ml로 재현탁하였다. 각 샘플에 대하여 40 μl 세포 현탁액 (1x105 세포/웰)을 96-웰 V-형 플레이트 (Greiner, 제품 번호 651101)에 분주하였다. 경쟁 연구를 가장 높은 농도로서 1 μM로 시작하는 절반 로그 희석법 (half-log dilution)으로 12개의 농도의 경쟁성 미표지 리간드를 사용하여 실행하였다. 40 μl의 항체를 120 μl의 최종 검정 부피를 고려하여 추가하였다. 40 μl 방사성 리간드 [125I]-hC5a (Perkin Elmer, 제품 번호 NEX250)를 배경 대조군을 제외한 모든 샘플에 추가하였다. 검정에서 방사성 리간드의 최종 농도는 1 nM였고 최종 부피는 120 μL였다. 모든 샘플을 세 번 실행하였고 4℃에서 4시간 동안 배양하였다. 4℃에서 2분 동안 1200 rpm으로 원심분리하여 세포를 수거하였고 100 μl의 세척 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl 및 0.5% 소 혈청 알부민 (FractionV Ig G 없음))으로 세 번 세척하였다. 최종적으로, 세포를 30 μl 세척 버퍼에 재현탁하였고 OptiPlate (Perkin Elmer, 제품 번호 6005290)로 옮겼고 150 μl의 MicroScint 20 (Perkin Elmer, 제품 번호 6013621)을 각 웰에 추가하였다. 플레이트를 덮었고, 잘 혼합하였고 1시간 지연하여 보정된 Top Counter에서 계수하였다. 각 샘플의 수를 퍼센트의 표준화된 값으로 표현하였고 100%는 1 nM [125I]-hC5a를 추가하고 차가운 항체를 추가하지 않은 경우 개수의 최대 수준이고, 0%는 1 μM 차가운 hC5a의 존재시 결정된 비특이적 결합이다. 데이터를 PRISM (GraphPad)을 사용하여 비선형 회귀 분석에 의해 분석하였다.
칼슘-유동 검정
Fluo-4 AM 세포 염료로 사람 호중구의 염색
호중구를 원심분리하였고 PBS로 세척하였고 세포 염료에서 1x107 세포/ml로 재현탁하였고 어둠에서 상온에서 40분 동안 배양하였다. 세포를 원심분리하였고 세척하였고 (과도한 염료를 제거하기 위해), 다시 원심분리하였고 세포 버퍼에서 2x106 세포/ml로 재현탁하였다. 세포 (0.5 ml)를 멸균되지 않은 유리 FACS 튜브 - 각 샘플에 대하여 하나의 튜브 - 로 앨리쿼트하였고 상온에서 저장하였고 두 시간 내에 사용하였다. 각 샘플은 1x106 호중구를 사용하였다.
검정
칼슘 유동 검정을 다음과 같이 수행하였다. 간략히 말하면, 0.5 ml 세포 버퍼 중의 Fluo-4 AM으로 로딩된 1x106개의 호중구를 FACSCalibur 유동 세포분석기 (BD Biosciences)에서 x-축 FSC 대 y-축 SSC을 사용하여 게이트된 호중구로 분석하였다. FL-1 (FITC) 채널을 튜브에 다양한 시약 (예를 들어 항체, C5a, 이오노마이신 - I-MGB 또는 C-MGB 대신에 세포 버퍼 중의 10% 최종 농도로 용해됨)의 추가 후 호중구 형광 발광을 측정하기 위해 사용하였다. 샘플 형광 발광을 1초 마다 획득한 평균 형광 강도 (MFI) 값으로 연속적으로 측정하였다. 이 데이터를 CellQuest (BD Biosciences) 파일에 저장하였고 추가의 가공 및 분석을 위해 엑셀 (Microsoft) 및 Prism (v4.0c, GraphPad Software Inc.)로 옮겼다. 호중구에 시약을 추가하는 순서 및 배양 시간은 수행된 검정의 타입에 따라 달랐다.
C5a 중화 검정
1000 μg/ml 내지 1.37 μg/ml의 범위의 농도를 갖는, 항체의 10x 3배 단계 희석액을 제조하였다. Fluo-4 AM 로딩된 호중구 (0.5 ml 세포 버퍼 중의 1x106)를 50 μl 10x 항체 용액과 함께 상온에서 10분 동안 배양하였다 (튜브에서 최종 항체 농도: 100-0.137 μg/ml). 세포 플러스 항체를 기저 형광 발광을 확립하기 위해 ~60초 동안 FACS로 분석하였다. 50 μl 10 nM C5a를 ~1 nM의 최종 농도를 제공하기 위해 추가하였고 형광 발광 측정을 또 다른 ~60초 동안 계속하였다. 항체가 C5a-유발된 Ca2 +-방출을 차단하면 형광 발광의 스파이크 (spike)가 없었다. 항체가 C5a를 중화하지 않으면 형광 발광의 스파이크가 있었다. 마지막으로, 50 μl 1 μg/ml 이오노마이신을 0.1 μg/ml의 최종 농도로 추가하였고 형광 발광 측정을 세포가 여전히 반응성이라는 것을 보장하기 위해 또 다른 ~60초 동안 계속하였다.
CD11b 수용체 상향조절
검정 설정
다음 설정을 CD11b 발현의 변화를 측정함으로써 C5a-유발된 호중구 활성화를 중화하는 확인된 항체의 능력을 결정하도록 설계하였다.
항-C5aR 및 이소토프 대조군 항체를 3배 단계 희석에서 2x 최종 농도로 PBS에서 희석하였고 (600 내지 0.003387 μg/ml) 50 μl를 96-웰 U-바닥 플레이트의 웰에 두 번 분배하였다. 전체 헤파린 처리된 혈액의 50 μl 앨리쿼트를 각 웰에 추가하였다. 대조군 웰의 네 개의 세트 (이중으로)는 50 μl PBS 플러스 50 μl 혈액만을 함유하였다. 플레이트를 5% C02에서 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 호중구 50 μl 사람 C5a를 활성화하기 위해, 명시된 최종 농도 10 또는 100 nM를 항체를 함유한 웰 및 항체가 없는 대조군 웰의 한 세트에 에 추가하였다. 최종 농도 5 μg/ml인 포볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA)를 항체가 없는 대조군의 세 번째 세트에 추가하였다. 플레이트를 다시 5% CO2 배양기에서 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 최종적으로 PBS (최종 농도 1/200)에서 1/50으로 희석된 항-CD11b-PE (BD Biosciences, 제품 번호 555388)의 혼합물의 50 μl를 모든 웰에 추가하였다 (항체가 없고 C5a 또는 PMA가 없는 2개의 대조군 웰의 네 번째 세트를 제외 - 이들 샘플은 기저 MFI 값을 제공하였다). 플레이트를 5% C02 배양기에서 37℃에서 20분 동안 다시 배양하였고 2,000 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 혈액 세포를 펠릿화하였다. 상층액 (150 μl)을 제거하였고 펠릿을 200 μl 1xFACS Lysis Solution에 재현탁하여 적혈구 세포를 용해하였다. 상온에서 5분 후에 플레이트를 다시 원심분리하였고, 200-225 μl 상층액을 제거하였고 펠릿을 160 μl 1xFACS Lysis Solution에 재현탁하였다. 세포를 유동 세포분석법에 의한 분석을 위해 미세역가 튜브로 옮겼다.
FACS 및 데이터 분석
FACSCalibur 유동 세포분석기 (BD Biosciences)를 채널 FL-2에 대하여 확립된 보상 파라미터로 설정하였다. 샘플을 죽은 세포 및 부스러기를 제외하기 위해 게이트하였다. 호중구는 높은 FSC 및 SSC를 갖고 게이트된 것으로 확인되었다. FL-2 (CD11b-PE) 채널에서 게이티드 호중구의 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하였다.
결과를 배경을 뺀 최대 CD11b 발현의 퍼센트로서 표현하였다. 최대 CD11b 발현 (MaxCD11b)은 C5a와 함께 하지만 항체 없이 배양된 호중구의 평균 MFI였다. 최소 (배경) CD11b 발현 (MinCD11b)은 C5a가 없고 항체가 없이 배양된 호중구의 평균 MFI였다. 각 샘플에 대한 최대 CD11b 발현의%를 계산하기 위해 사용된 식은 다음과 같다:
% Max샘플 = (MFI샘플 - MFI최소)/(MFI최대 - MFI최소)x100
데이터를 GraphPad Prism (v4.0)에 대입하였고 에스자 용량-반응 곡선 (가변 기울기), 즉, EC50을 계산하기 위해 비-선형 회귀 분석을 사용하는 4-파라미터 로그 방정식에 맞췄다.
CD62L 수용체 하향-조절
검정 설정
다음 설정을 CD62L 발현의 변화를 측정함으로써 C5a-유발된 호중구 활성화를 중화하는 확인된 항체의 능력을 결정하도록 설계하였다.
상기 CD11b 검정을 CD62L을 인식하는 콘쥬게이트된 항체 (BD Biosciences, 제품 번호 559772)를 사용함으로써 CD62L 검출에 적용하였다. CD62L에 특이적인 실험의 상세한 설명은 하기 제공된다.
FACS 및 데이터 분석
FACSCalibur 유동 세포분석기 (BD Biosciences)를 채널 FL-4에 대하여 확립된 보상 파라미터로 설정하였다. 샘플을 죽은 세포 및 부스러기를 제외하기 위해 게이트하였다. 호중구는 높은 FSC 및 SSC를 갖고 게이트된 것으로 확인되었다. FL-4 (CD62L-APC) 채널에서 게이티드 호중구의 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하였다.
결과를 배경을 뺀 최대 CD62L 발현의 퍼센트로서 표현하였다. 최대 CD62L 발현 (MaxCD62L)은 C5a가 없고 항체가 없이 배양된 호중구의 평균 MFI였다. 최소 (배경) CD62L 발현 (MinCD62L)은 C5a와 함께 하지만 항체가 없이 배양된 호중구의 평균 MFI였다. 각 샘플에 대한 최대 CD62L 발현의%를 계산하기 위해 사용된 식은 다음과 같다:
% Max샘플 = (MFI샘플 - MFI분)/(MFI최대 - MFI최소)x100
데이터를 GraphPad Prism (v4.0)에 대입하였고 에스자 용량-반응 곡선 (가변 기울기), 즉, EC50을 계산하기 위해 비-선형 회귀 분석을 사용하는 4-파라미터 로그 방정식에 맞췄다.
상기 검정의 결과는 하기 표 5에 요약된다.
Figure 112013118072917-pct00008
표 5. 친화도 검정, 칼슘-유동 검정, CD11b 및 CD62L 검정에서 얻은 데이터.
데이터는 32F3A6 GL이 용량-의존적 방식으로 C5a의 작용을 억제한다는 것을 확인하였다. 호중구 Ca2 + 방출에 대한 억제는 더 낮은 IC50 값에 의해 나타난 바와 같이 참조 항체 Q보다 32F3A6 GL의 증가하는 농도 및 더 높은 효험으로 증가하였다.
유사하게, 32F3A6 GL은 또한 참조 항체 Q보다 4-5배 높은 힘을 나타내는 CD11b 및 CD62L 조절 검정에서 참조 항체 Q보다 더 효율적이다.
호중구 이동 (주화성) 검정에서 32F3A6의 추가의 테스트는 또한 1.0 μg/ml의 IC50의 용량 의존성을 나타냈다.
실시예 8. 관절염의 생체 내 마우스 모델
생체 내 효과를 hC5aR KO/KI 마우스의 K/BxN에서 테스트하였다 (WO 2009/103113 및 Lee et al, Nat Biotechnol. 2006 Oct;24(10):1279-84). K/BxN 마우스는 GPI에 대한 순환 항체 (자가-항원 글루코스 6-포스페이트 이소머라제)에 의해 매개된 자가 면역-유사 질환을 자발적으로 개발한다. 관절염 K/BxN 마우스의 혈청은 관절 파괴와 함께 만성 점진적 질환을 포함하는 사람 RA의 홀 마크 (hall mark)의 많은 특징을 갖는 다른 마우스 균주의 질환을 유발한다.
동물
사람 C5aR KO/KI 형질변환 마우스 (C57BL/6; H-2b; 사람 C5aR+/+ / 마우스 C5aR-/-; 균주 축약형: H5Rtg)는 8-27주령이었다.
K/ BxN 혈청
실험을 위해 혈청을 생산하기 위해, KRNtg 수컷 마우스를 NOD 암컷 마우스와 교배하였다. 염증이 생긴 관절을 발달시키는, KRN 이식유전자를 갖고 있는 F1 새끼 (8-10주령)를 희생시켰으며, 혈액을 심장 천자에 의해 수거하였다. 37℃에서 2시간 배양 후 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 혈청을 수거하였다. 다수의 마우스의 혈청을 모았고, 앨리쿼트하였고 -80℃에 저장하였다. 모든 마우스에 같은 배치의 K/BxN 혈청을 주사하였다.
관절염 유발 및 채점
염증성 관절염을 수령자 H5Rtg 마우스에서 제0 일 및 제2 일 둘 다에 150 μl K/BxN 혈청을 복강 내 주사함으로써 유발하였다. 질환 진행을 발 크기를 측정하고 앞발 및 뒷발 및 발목 관절에서 염증의 정도에 기초한 임상 점수를 결정함으로써 매일 관찰하였다. 제0 일의 평균 발 크기의 변화를 다음과 같이 계산하였다. 각 뒷발의 발목의 두께 (mm)를 캘리퍼스를 사용하여 매일 측정하였다. 각 뒷발의 하나 또는 두 개의 판독의 평균은 평균 매일 발 크기 (PS)였다. 제0 일에 평균 발 크기를 평균 매일 발 크기에서 빼서 실험의 매일 발 크기의 평균 변화 (APS)를 제공한다. 임상 점수를 표 6에 나타난 채점 시스템에 기초하여 각 마우스의 각 발에 대하여 계산하였다. 4개의 발의 점수를 합하여 실험의 매일 각 마우스에 대한 총 임상 점수를 제공하였다.
Figure 112013118072917-pct00009
표 6. 관절염 임상적 채점 시스템
제5 일에 마우스가 치료 단계에 진입했는지 결정하기 위해, "RA 점수"를 임상 점수를 제0 일에 발 크기의 변화 (mm)와 곱합으로써 각 마우스에 대하여 계산하였다. 일반적으로 > 0.7ml RA 점수를 가진 마우스만이 연구의 치료 단계에 진입하였다.
32F3A6 GL 로 치료적 처리
질환 발병 (제0 일) 후 KO/KI hC5aR 마우스에 제5 일에 32F3A6 GL의 로딩 용량 및 9번의 매일 투여량을 제공하였다. 로딩 용량은 10, 1.5 및 0.5 mg/kg이었고 매일 투여량은 2, 0.5 및 0.25 mg/kg이었다. 각 처리 그룹에 대한 임상 점수 (평균 +/- SD)는 도 4에 나타난다. NNC0215-0384의 처리는 무관한 대조군 항체가 처리된 마우스와 비교하여 염증의 투여량-의존적 감소를 생산하였다. 평균 발 크기의 변화에 기초하여 유사한 효과를 관찰하였다 (미도시).
실시예 9. 건선성 관절염 환자에서 C5a 발현 수준
C5a를 11개의 건선성 관절염 및 대조군으로서 12개의 골관절염의 관절낭액 샘플에서 측정하였다. 상업적 C5a ELISA 키트의 프로토콜은 다음과 같다 (BD OptEIA™, 사람 C5a ELISA Kit II (BD Biosciences; 제품 번호 557965)). 데이터는 도 5에 제공되고 하기 표 7에 요약된다. C5a 수준은 건선성 관절염 환자 그룹에서 유의하게 향상되었으며 (p = 0.001;만-휘트니) C5a가 건선성 관절염에서 활막 염증의 구동자일 수도 있다는 것을 나타낸다.
Figure 112013118072917-pct00010
표 7. 대조군 및 건선성 관절염 환자의 관절낭액에서 C5a의 검출 수준
실시예 10. 건선성 관절염에 걸린 환자의 활막에서 C5aR 발현
포르말린 고정되고 파라핀 임베딩된 (embedded), PsA에 걸린 (n=9), 및 정상 범위 내의 (n=5) 환자의 활막 생체조직검사를 함유하는 조직 미크로어레이 (TMA) 슬라이드를 Biochain Institute Inc./BioCat GmbH, Heidelberg, Germany로부터 얻었다. 하나의 PsA 샘플은 Dr. Bliddal (Frederiksberg Hospital, Denmark) 및 Dr. Soe (Gentofte Hospital, Denmark)과 함께 공동 연구로부터 얻었다. 모든 사람 재료를 기증자/또는 가까운 친척의 사전 동의, 및 관련 지역 윤리위원회, BioCat Ge, 개인적 통신; Cambridge Biosciences, 공급자 정보: Tissue Supply Network (www. bioscience.co.uk)의 승인으로 얻었다. Drs Bliddal/Soe의 샘플을 윤리적 허가 번호 H-4-2009-117하에 얻었다. 다음 항체를 사용하였다: 마우스 단클론성 항-사람 C5aR (R&D Systems, MAB3648 클론 347214 (IgG2a)), 마우스 IgG2a 이소타입 특이적 대조군 (Dako, X0943, 클론 DAK-G05), 비오틴 콘쥬게이트된 당나귀 항-마우스 Jackson ImmunoReseach (715-065-150).
면역조직화학법을 다음과 같이 수행하였다. 섹션을 자일렌에서 탈파라핀화하였고 감소하는 농도의 알콜에서 재수화하였다. 항원 회수를 전자레인지에서 15분 동안 Tris-EGTA 버퍼 (10 mM; 0.5 mM), pH 9.0에서 수행하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% H2O2로 차단하였고, 제조사의 지시에 따라 내인성 비오틴을 각각 아비딘 및 비오틴 차단 용액과 함께 10분 동안 배양에 의해 차단하였다. 비-특이적 결합을 3% 탈지유, 7% 당나귀 혈청, 3% 사람 혈청, 및 3.2 mg/ml 폴리-L-리신 (PLL)을 함유하는 TBS와 함께 30분 동안 배양에 의해 차단하였다. 1차 및 2차 항체를 0.5% 탈지유, 7% 당나귀 및 3% 사람 혈청을 함유하는 Tris 버퍼에 희석하였고, 배양을 각각 4℃에서 하룻밤 동안, 및 상온에서 60분 동안 수행하였다. 1차 증폭 단계를 Vectastain ABC 퍼옥시다제 키트와 함께 배양에 의해 수행하였고, 0.5% Du Pont Blocking Reagent (TNB)을 함유하는 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7,5)에서 30분 동안 희석한 후, 이어서 2차 증폭 단계를 비오티닐화된 티라미드에서 6분 동안 배양하였다. 최종 증폭을 Vectastain ABC 퍼옥시다제 키트와 함께 추가적인 배양에 의해 수행하였고, 30분 동안 상기 설명된 바와 같이 희석하였다. 발색 반응을 디아미노벤지딘으로 달성하였다. 핵을 헤마톡실린으로 대비염색하였고 섹션을 재수화하였고, 자일렌에서 세척하였고 Eukitt로 증가하였다. RA, OA 및 정상 활액에서 C5aR 단백질 발현에 대한 TMA의 평가를 관찰자에게 맹검으로 수행하였다. DP70 디지털 카메라가 장착된 Olympus BX51 현미경 (Olympus Denmark A/S; Ballerup, Denmark)을 섹션의 평가에 사용하였다.
결과
C5aR-면역양성 세포가 건선성 관절염에 걸린 10명의 환자 중 8명에서, 및 건선성 관절염에 걸린 10명의 환자 중 10명의 스트로마 (stroma)에서 활막 서브라이닝 층 (sublining layer)의 림프구 집합체에서 혼합된다는 것을 발견하였다. 대조군은 이들 활막 구획에서 어떤 C5aR 염색도 나타내지 않았다 (0/5). C5aR-면역양성 활막세포를 대조군 5명 중 4명, 뿐만 아니라 건선성 관절염에 걸린 10명의 환자 중 10명의 라이닝 층 세포에서 검출하였다. 결과는 하기 표 8에 요약된다.
Figure 112013118072917-pct00011
표 8. 정상 활막 및 건선성 관절염에 걸린 환자의 활막에서 C5aR+ 세포의 검출. 정상 활막과 비교하여 건선성 관절염에 걸린 환자에서 C5aR 발현 간의 차이에 대한 P-값 (피셔의 정확 검정 (Fischer's exact test)): 0.007 (림프구 집합체) 및 0.0003 (스트로마).
실시예 11. 항- C5aR 로 건선성 관절염 환자의 관절낭액 에 의해 유발된 호중구 이동의 억제.
호중구 과립구 이동 (주화성) 검정
사람 호중구 과립구 (사람 PMN (다형핵 백혈구))의 hC5a-의존적 이동을 억제하는 항체의 힘을 BD FluoroBlok 96-다중웰 삽입 시스템을 사용하는 보이덴 챔버에서 분석하였다.
사람 PMN을 EDTA를 함유하는 바이알로 뽑은 사람 혈액 샘플로부터 얻었다. 혈액 세포를 상온에서 30분 동안 (400 x g) Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care) 구배 (3부)를 통한 혈액 (4부)의 원심분리에 의해 분리하였다. 오염 적혈구를 제거하기 위해 PMN-함유 층을 dextran-500 (Sigma)을 함유하는 PBS (포스페이트 완충된 식염수)에 1시간 동안 현탁하였다. 상층액을 상온에서 5분 동안 (250 x g) 원심분리하였고 나머지 적혈구를 55초 동안 0.2% NaCl을 사용하여 삼투성 용해하였다. 삼투성 용해를 반복하기 전에, 용액을 1.2% NaCl + PBS에 의해 등장성으로 만들었고 5분 동안 250 x g로 원심분리하였다. 원심분리 후 PMN을 반응 혼합물 (RM)에 재현탁하였다: HBSS (제품 번호 14175 Gibco)는 NaCl 137 mM, KCl 5.3 mM, Na2HP04 0.33 mM, NaHC03 4 mM, KH2P04 0.44 mM, 글루코스 5 mM을 함유하고; MgSO4·7H20 0.4 mM, MgCl2, 0.5 mM, CaCl2 0.5 mM, HEPES 20 mM로 보충된다. 세포 밀도를 NucleoCounter (Chemometec)로 결정하였다. PMN 현탁액은 Giemsa-염색된 샘플의 현미경 관찰에 의해 평가된 바와 같이 >95% 호중구를 함유하였다.
로딩 PMN: 칼세인, AM, (Fluka)을 DMSO (디메틸 술폭시드)에서 용해하였고 세포가 있는 RM (ml 당 2x106개의 세포)에서 1000X로 희석하였다. 현탁액을 37℃의 배양기에서 30분 동안 배양하였고 과도한 칼세인을 제거하기 위해 RM으로 3번 세척하였다. 최종적으로 세포를 RM에 재현탁하였다 (4x106 세포/ml).
사람 관절낭액 (SF)을 무릎 천자에 의해 2명의 건선성 관절염 환자로부터 얻었다. 원심분리에 의해 세포의 제거 후 샘플을 냉동하였고 -80℃에 저장하였다. 이동 실험을 위해 샘플을 녹였고 0.2% EDTA를 함유하는 RM을 사용하여 2X로 희석하였다.
이동을 FuoroBlok® 3μm 공극 크기 96-웰 (제품 번호 351161.BD Falcon (VWR))을 사용하는 보이덴 챔버 기술에 의해 평가하였다. 상단 챔버, 즉, 플루오로블록 막을 함유하는 삽입물을 37℃에서 2시간 동안 1 mg/ml PBS 중의 사람 피브리노겐 (제품 번호 F3879-1G, Sigma)으로 코팅하였다. 세척 후 막을 PBS 중의, 2% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 용액으로 차단하였다. RM을 사용한 또 다른 세척 후, hC5aR-항체 (100 μg/ml)가 있거나 없는 105개의 칼세인-로딩 된 PMN을 각 웰에 추가하였고 대조군 용액 또는 화학주성인자 hC5a (Sigma, 또는 관절낭액의 샘플)을 함유하는 수신자 플레이트 (낮은 챔버)에 배치하였다. 각 그룹은 4-6개의 웰로 구성되었다. 세포 이동의 정량을 낮은 챔버에서 세포의 형광 발광을 측정함으로써 달성한다. 플로오로블록 막이 490-700 nm에서 빛의 통과를 효과적으로 차단하기 때문에, 낮은 챔버로 들어가지 않은 세포의 형광 발광은 485/530 nm에서 검출되지 않는다. 플레이트를 바닥 판독 능력을 가진 형광 발광 플레이트 리더(SpectraMax, Molecular devices, 또는 Fluoroscan, Thermo Labsystems)에서 37℃에서 60분 동안 5분 마다, 485/538nm 들뜸/방출 파장에서 판독하였다.
이동을 상대적인 형광 발광 값으로 표현되는, 60분에서의 형광 발광 값에 의해 평가하였다. 표 9에서, 이소타입 항체의 존재시 이동을 100%로 설정하고 이동을 억제하는 항-C5aR 항체의 능력을 계산한다. 이동은 hC5aR 항체에 의해 분명하게 감소하였다. 10 nM hC5a에 의해 유도된 이동은 83% 억제하였다. 세 개의 SF 샘플에 대한 값은 15%, 70% 및 48%였다. 결과는 C5aR-항체가 건선성 관절염 환자의 SF의 화학주성 효과를 억제하였다는 것을 입증한다.
Figure 112013118072917-pct00012
표 9. hC5a 또는 세 명의 건선성 관절염 환자의 관절낭액에 대한 반응에서 PMN의 이동 및 hC5aR 항체 (참조 항체 Q)에 의한 이들의 억제. 모든 값을 이소타입 항체와 함께 배양될 때 검출된 이동에 대하여 표준화한다.
실시예 12. 크론 병 및 궤양성 대장염에 걸린 환자의 장에서 발현하는 C5aR
정상 범위 내의 (n=14), 궤양성 대장염 (n=21) 및 크론 병 (n=25)에 걸린 환자의 장 조직 샘플을 Cambridge Bioscience (Cambridge, UK)로부터 얻었다. 모든 사람 재료를 기증자/또는 가까운 친척의 사전 동의, 및 관련 지역 윤리위원회, Cambridge Biosciences, 공급자 정보: Tissue Supply Network (www. bioscience.co.uk)의 승인으로 얻었다. 사용된 항체 및 면역조직화학 프로토콜은 실시예 9에 설명된 바와 같다.
반-정량적 채점
C5aR 면역양성 (C5aR+) 세포를 다음과 같이 반정량적으로 채점하였다:
점막-관련 림프성 구획을 개별적으로 채점하였다: 점막 (M): 상피 내 림프구 (IEL) 구획 (표면 상피), 고유판 (lamina propria), 및 모낭-관련 상피 (FAE). 점막하 조직 (SM): 분리된 (단독) 림프성 모낭 (ILF), 페이에르 판 (Peyer's patch) (회장 (ileum))/결장 IEL (결장) 및 분리된 침투성 림프구. 외 근육층 (ME): IEL 및 분리된 침투성 림프구. 각 구획을 0-4의 스케일로 채점하였다: 0, 없음; 1, 약간; 2, 보통; 3, 많음 및 4, 풍부한 수의 C5aR+ 세포. 축적된 점수를 각 장의 층 (M, SM, ME) 및 전체 장에 대한 합계 (M+SM+ME)에 대하여 계산하였다. 최대 점수: M=12, SM=12, ME=8 및 전체 장에 대하여 32. C5aR 단백질 발현에 대한 면역조직화학적 데이터의 반-정량적 채점을 GraphPad Prism 5에서 던 다중비교 사후 검사와 함께 크러스칼-왈리스 검정에 의해 분석하였다. P<0.05는 유의한 것으로 생각되었다.
결과
C5aR 양성 호중구 및 골수-유사 세포는 CD에 걸린 환자 25명 중 23명, UC에 걸린 21명의 환자 중 19명에서 및 14개의 정상 장 샘플 중 7개에서 상피 내 림프구 구획에서, 모낭 관련 상피에서, 및 점막의 고유판에서 단독 세포로서 발견되었다 (P-값 (피셔의 정확 검정) 각각 0.005 및 0.015). 게다가, C5aR 양성 세포는 14개의 정상 장 샘플 중 7개와 비교하여 CD에 걸린 25명의 환자 중 21명 및 21명의 UC 환자 중 18명에서 페이에르 판/결장-림프성 모낭; 분리된 (단독) 림프성 모낭에서 및 점막하 조직의 단독 세포로서 발견되었다 (P-값 (피셔의 정확 검정) 각각 0.03 및 유의하지 않음). 최종적으로, C5aR 양성 세포는 CD 및 UC에 걸린 환자의 침투성 외 근육층, 뿐만 아니라 정상 장에서 발견되었다. 결과는 도 6에 나타나고 표 10에 요약된다. 반-정량 분석에 기초하여 C5aR은 CD (P<0.01) 및 UC (P<0.05)에 걸린 환자의 장에서 훨씬 더 높게 발현된다는 것을 발견하였으며, 전체 장벽의 정상 장, 예를 들어, 세 개의 장의 층 (점막, 점막하 조직, 및 외 근육층)을 통해 누적된 점수와 비교하였다.
Figure 112013118072917-pct00013
표 10. 정상 장과 비교하여 크론 병 및 궤양성 대장염에 걸린 환자의 장에서 C5aR 발현의 요약.
본 발명의 특정 성질이 여기에 도시되고 설명되는 한편, 많은 변형, 치환, 변화, 및 동등물이 현재 당업자에게 발생할 것이다. 그러므로, 첨부된 구체예가 본 발명의 진정한 사상 내에 있는 이러한 모든 변형 및 변화를 커버하는 것으로 생각되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> THERAPEUTIC ANTIBODIES <130> 8318.204-WO <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 Asp Tyr Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 Val Ile Trp Phe Asp Gly Ile Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 3 Thr Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Glu Phe Phe Gln His 1 5 10 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ile Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Gly Thr Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Glu Phe Phe Gln His Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 5 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 6 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 7 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 1 5 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly 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Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 17 Asn Tyr Gly Met His 1 5 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 18 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ile Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 19 Thr Tyr Tyr Thr Ser Gly Ser Ser Lys His Phe Gln Pro 1 5 10 <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His 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Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 25 Asn Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 26 Ala Phe Ser Ser Asp Gly Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 27 His Ala Asp Tyr Ala Asn Tyr Pro Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 28 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Phe Ser Ser Asp Gly Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Leu Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Cys Cys Ala 85 90 95 Arg His Ala Asp Tyr Ala Asn Tyr Pro Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 30 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 31 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 32 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 33 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 34 <211> 326 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 34 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 35 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 35 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 36 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 36 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 <210> 38 <211> 105 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 38 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gly Ser Tyr Tyr Lys Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 40 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Arg 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 41 <211> 350 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Asp Ser Phe Asn Tyr Thr Thr Pro Asp Tyr Gly His Tyr Asp Asp 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Asp Leu Asn Thr Pro Val Asp Lys Thr Ser Asn Thr 20 25 30 Leu Arg Val Pro Asp Ile Leu Ala Leu Val Ile Phe Ala Val Val Phe 35 40 45 Leu Val Gly Val Leu Gly Asn Ala Leu Val Val Trp Val Thr Ala Phe 50 55 60 Glu Ala Lys Arg Thr Ile Asn Ala Ile Trp Phe Leu Asn Leu Ala Val 65 70 75 80 Ala Asp Phe Leu Ser Cys Leu Ala Leu Pro Ile Leu Phe Thr Ser Ile 85 90 95 Val Gln His His His Trp Pro Phe Gly Gly Ala Ala Cys Ser Ile Leu 100 105 110 Pro Ser Leu Ile Leu Leu Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu Leu Ala 115 120 125 Thr Ile Ser Ala Asp Arg Phe Leu Leu Val Phe Lys Pro Ile Trp Cys 130 135 140 Gln Asn Phe Arg Gly Ala Gly Leu Ala Trp Ile Ala Cys Ala Val Ala 145 150 155 160 Trp Gly Leu Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Phe Leu Tyr Arg Val 165 170 175 Val Arg Glu Glu Tyr Phe Pro Pro Lys Val Leu Cys Gly Val Asp Tyr 180 185 190 Ser His Asp Lys Arg Arg Glu Arg Ala Val Ala Ile Val Arg Leu Val 195 200 205 Leu Gly Phe Leu Trp Pro Leu Leu Thr Leu Thr Ile Cys Tyr Thr Phe 210 215 220 Ile Leu Leu Arg Thr Trp Ser Arg Arg Ala Thr Arg Ser Thr Lys Thr 225 230 235 240 Leu Lys Val Val Val Ala Val Val Ala Ser Phe Phe Ile Phe Trp Leu 245 250 255 Pro Tyr Gln Val Thr Gly Ile Met Met Ser Phe Leu Glu Pro Ser Ser 260 265 270 Pro Thr Phe Leu Leu Leu Lys Lys Leu Asp Ser Leu Cys Val Ser Phe 275 280 285 Ala Tyr Ile Asn Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Val Val Ala Gly 290 295 300 Gln Gly Phe Gln Gly Arg Leu Arg Lys Ser Leu Pro Ser Leu Leu Arg 305 310 315 320 Asn Val Leu Thr Glu Glu Ser Val Val Arg Glu Ser Lys Ser Phe Thr 325 330 335 Arg Ser Thr Val Asp Thr Met Ala Gln Lys Thr Gln Ala Val 340 345 350

Claims (15)

  1. C5aR 결합 항체로서,
    (a) SEQ ID NO: 9로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) SEQ ID NO: 10로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) SEQ ID NO: 11로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3; 및
    (d) SEQ ID NO: 13로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) SEQ ID NO: 14로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2;
    (f) SEQ ID NO: 15로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 C5aR 결합 항체.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 12과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고, 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 16과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  3. 제2 항에 있어서, 상기 항체는 사람 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  4. 제1 항에 있어서, 상기 항체의 중쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 39에 의해 확인되고, 상기 항체의 경쇄의 가변 영역은 SEQ ID NO: 40에 의해 확인되는 항체.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 사람 C5aR의 제2 세포외 루프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 호중구에 대한 경쟁 리간드 결합 검정에 의해 측정된 항체의 친화도는 0.80 nM 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
  7. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 C5aR에 대한 C5a의 결합을 크게 억제하거나 감소시키는 것을 특징으로 하는 항체.
  8. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 시험관 내에서 사람 호중구의 이동을 크게 억제하는 것을 특징으로 하는 항체.
  9. 제 1항에 있어서, Fc 영역은 SEQ ID NO 33, 34, 35 및 36에 의해 각각 정의된 IgG1, IgG2, IgG4 또는 IgG4/G2 Fc 참조 서열과 비교하여 하나 이상의 Fcγ수용체에 대하여 감소된 결합 친화도를 갖는 항체.
  10. 제1 항 내지 제4 항 또는 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 시험관 내에서 호중구의 ADCC, CDC 또는 식균작용을 크게 유발하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
  11. 제1 항 내지 제4 항 또는 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 IgG1이며, 다음 점 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 항체
    a. N297Q;
    b. L234A 및 L235E;
    c. G236R 및 L238R;
    d. N297Q, L234A 및 L235E;
    e. N297Q, L234A, L235E 및 G237A; 또는
    f. L234A, L234E, G237A, A330S 및 P331S.
  12. 치료에 사용되는 제1 항 내지 제4 항 또는 제9 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  13. 류머티스성 관절염 (RA), 건선성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 홍반성 신염, 염증성 장 질환 (IBD), 또는 과민성 대장 증후군 치료에 사용되는 제1 항 내지 제4 항 또는 제9 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  14. 삭제
  15. 삭제
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Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012168199A1 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Novo Nordisk A/S Therapeutic antibodies
US9657105B2 (en) * 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
PL3702373T3 (pl) 2013-09-13 2022-12-05 Beigene Switzerland Gmbh Przeciwciała anty-PD1 i ich zastosowanie jako środki terapeutyczne i diagnostyczne
CN113307880A (zh) * 2014-01-13 2021-08-27 希望之城公司 在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法
US20170107294A1 (en) * 2014-03-21 2017-04-20 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
TWI726608B (zh) 2014-07-03 2021-05-01 英屬開曼群島商百濟神州有限公司 抗pd-l1抗體及其作為治療及診斷之用途
CA2955788C (en) 2014-07-22 2024-01-16 Ziyong Sun Anti-pd-1 antibodies
MX2017001597A (es) 2014-08-05 2017-11-17 Cb Therapeutics Inc Anticuerpos anti-pd-l1.
EP3213075B1 (en) * 2014-10-31 2020-04-29 CellTrend GmbH Diagnosis of an autoimmune disease using detection of antibodies directed against c5a-receptor
RU2753695C2 (ru) * 2015-11-04 2021-08-19 Сол Дж. ПРАЙСМЕН Химерные рецепторы антигена, нацеленные на her2
JP2019509014A (ja) * 2015-11-23 2019-04-04 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． Ｃｄ３９血管アイソフォームターゲティング剤
US20170145086A1 (en) * 2015-11-25 2017-05-25 Visterra, Inc. Antibody molecules to april and uses thereof
CN106957366B (zh) * 2016-01-12 2022-02-01 上海昀怡健康科技发展有限公司 一种C5aR抗体及其制备方法和应用
AR107505A1 (es) 2016-01-22 2018-05-09 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos anti-factor de la coagulación xi
GEP20227382B (en) 2016-06-14 2022-05-25 Merck Sharp & Dohme Anti-coagulation factor xi antibodies
WO2018007885A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Beigene, Ltd. COMBINATION OF A PD-l ANTAGONIST AND A RAF INHIBITOR FOR TREATING CANCER
CN110087680B (zh) 2016-08-19 2024-03-19 百济神州有限公司 使用包含btk抑制剂的组合产品治疗癌症
EP3573989A4 (en) 2017-01-25 2020-11-18 Beigene, Ltd. CRYSTALLINE FORMS OF (S) -7- (1- (BUT-2-YNOYL) -PIPERIDINE-4-YL) -2- (4-PHENOXYPHENYL) -4,5,6,7-TETRAHYDROPYRAZOLO [1,5-A ] PYRIMIDINE-3-CARBOXAMIDE, MANUFACTURING AND USES THEREOF
US11578136B2 (en) 2017-03-16 2023-02-14 Innate Pharma Compositions and methods for treating cancer
US10376595B2 (en) 2017-04-03 2019-08-13 Inflarx Gmbh Treatment of inflammatory diseases with inhibitors of C5a activity
WO2018218056A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 Birstol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
CN110799543A (zh) 2017-06-26 2020-02-14 百济神州有限公司 肝细胞癌的免疫治疗
WO2019034580A1 (en) * 2017-08-14 2019-02-21 Morphosys Ag HUMANIZED ANTIBODIES FOR CD3
WO2019092148A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 Innate Pharma Antibodies with functionalized glutamine residues
US11786529B2 (en) 2017-11-29 2023-10-17 Beigene Switzerland Gmbh Treatment of indolent or aggressive B-cell lymphomas using a combination comprising BTK inhibitors
US20190300610A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Vista antigen-binding molecules
EA202092518A1 (ru) 2018-06-18 2021-08-23 Иннейт Фарма Композиции и способы лечения рака
WO2020115115A1 (en) * 2018-12-05 2020-06-11 Morphosys Ag Multispecific antigen-binding molecules
MX2021011040A (es) * 2019-03-14 2021-12-10 Morphosys Ag Anticuerpos dirigidos contra c5ar.
BR112022010757A2 (pt) * 2019-12-03 2022-08-16 Shanghai Jiao Tong Univ School Of Medicine Região de anticorpo fc com afinidade de ligação aumentada para fc-gama-riib.
TW202140553A (zh) * 2020-01-13 2021-11-01 美商威特拉公司 C5ar1抗體分子及其用途
GB2595299B (en) * 2020-05-21 2022-08-03 Mabsolve Ltd Modified immunoglobulin FC regions
JP2023537417A (ja) 2020-08-12 2023-08-31 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム アブドラリマブによる皮下抗Ｃ５ａＲアンタゴニスト治療レジメン
EP4237451A1 (en) 2020-11-02 2023-09-06 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Bcma/taci antigen-binding molecules
JP2024502863A (ja) 2021-01-13 2024-01-23 ビステラ， インコーポレイテッド ヒト化補体５ａ受容体１抗体及びその使用方法
CA3210971A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Bart-Jan DE KREUK Non-activating antibody variants
TW202328196A (zh) 2021-09-16 2023-07-16 新加坡商蜂鳥生物科技私人有限公司 使用vista抗原結合分子的癌症之治療及預防
WO2023046979A1 (en) 2021-09-27 2023-03-30 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
AU2022361691A1 (en) * 2021-10-08 2024-03-28 Genmab A/S Antibodies binding to cd30 and cd3
WO2023109928A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 上海宝济药业有限公司 抗免疫球蛋白降解酶酶切的Fc变体
WO2024008960A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Agency For Science, Technology And Research Cnx antigen-binding molecules
WO2024062073A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003062278A1 (en) * 2002-01-25 2003-07-31 G2 Therapies Ltd MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST EXTRACELLULAR LOOPS OF C5aR
WO2008022390A1 (en) 2006-08-22 2008-02-28 G2 Inflammation Pty Ltd Anti-c5ar antibodies with improved properties

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4568649A (en) 1983-02-22 1986-02-04 Immunex Corporation Immediate ligand detection assay
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
JPH02262599A (ja) 1989-01-03 1990-10-25 Merck & Co Inc ヒト多形核白血球からの精製Ｃ５ａレセプター
DK0479909T3 (da) 1989-06-29 1997-04-07 Medarex Inc Bispecifikke reagenser til AIDS-behandling
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5284746A (en) 1990-02-08 1994-02-08 Zymogenetics, Inc. Methods of producing hybrid G protein-coupled receptors
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
CA2102511A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 Paul J. Higgins Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
EP0672068A4 (en) 1992-09-25 1997-02-26 Commw Scient Ind Res Org TARGET MOLECULES BINDING POLYPEPTIDES.
PL174494B1 (pl) 1992-11-13 1998-08-31 Idec Pharma Corp Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chłoniaka z limfocytów B i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chłoniaka z limfocytów B
US5514555A (en) 1993-03-12 1996-05-07 Center For Blood Research, Inc. Assays and therapeutic methods based on lymphocyte chemoattractants
US5480974A (en) 1993-06-18 1996-01-02 The Scripps Research Institute Antibodies to human C5a receptor
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5861272A (en) 1995-06-02 1999-01-19 Human Genome Sciences, Inc. C5A receptor
US20010036650A1 (en) 1994-08-16 2001-11-01 Human Genome Sciences, Inc. C5a receptor
JPH08109200A (ja) 1994-08-19 1996-04-30 Takeda Chem Ind Ltd 抗Ｃ５ａレセプター抗体、その製造法および用途
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
AU718311B2 (en) 1995-06-05 2000-04-13 Incyte Pharmaceuticals, Inc. A C5a-like seven transmembrane receptor
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
EP0972027A1 (en) 1997-01-31 2000-01-19 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human c5a-like receptor
US6323322B1 (en) 1997-04-30 2001-11-27 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US8007798B2 (en) 1997-11-21 2011-08-30 Genentech, Inc. Treatment of complement-associated disorders
AU2002231194A1 (en) 2000-11-07 2002-05-21 Genetics Institute, Llc G protein-coupled receptor protein and nucleic acid molecules and uses therefor
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
WO2002059263A2 (en) 2000-12-19 2002-08-01 Sunol Molecular Corporation Transgenic animals comprising a humanized immune system
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
TWI334439B (en) * 2001-08-01 2010-12-11 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
ES2283594T5 (es) 2001-08-17 2016-03-15 Genentech, Inc. Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a C5 y C5a sin impedir la formación de C5b
DE60234944D1 (de) 2001-09-27 2010-02-11 Merck & Co Inc Isolierte dna-moleküle, die für einen humanisierten calcitonin gene-related peptide receptor kodiered assayverfahren
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US20040110226A1 (en) * 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
JP2006513702A (ja) 2002-09-09 2006-04-27 ヌラ インコーポレーティッド Ｇタンパク質共役受容体およびその使用
AU2002952086A0 (en) 2002-10-16 2002-11-07 The University Of Queensland Treatment of osteoarthritis
DE60333228D1 (de) * 2002-12-02 2010-08-12 Amgen Fremont Inc Gegen den tumor nekrose faktor gerichtete antikörper und deren verwendungen
US7807389B2 (en) 2003-03-14 2010-10-05 University Of Rochester Methods and compositions related to joint inflammation diseases
ATE412903T1 (de) 2003-03-17 2008-11-15 Bayer Healthcare Ag Diagnostik- und therapie- verfahren von mit c5a rezeptor verbundenen krankheiten
US8101720B2 (en) * 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
WO2005040219A1 (en) 2003-10-28 2005-05-06 Novo Nordisk A/S Laminin-5 gamma2-binding peptides, related compositions, and use thereof
EP2322637B1 (en) 2003-12-24 2016-05-18 Novo Nordisk A/S Transgenic mouse comprising a polynucleotide encoding human or humanized C5AR
EP1586583A3 (en) 2004-04-16 2005-11-16 Alligator Bioscience AB (publ) Compounds that block C5a complement receptor and their use in therapy
DK2567976T3 (en) * 2005-03-23 2017-10-23 Genmab As ANTIBODIES AGAINST CD38 FOR TREATMENT OF MULTIPLE MYLOMA
WO2007055374A1 (ja) 2005-11-14 2007-05-18 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation 骨粗鬆症治療剤
CN101501073A (zh) 2006-08-22 2009-08-05 G2英弗勒美欣私人有限公司 抗体制备方法
WO2008030564A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Verenium Corporation Aglycosylated antibodies and methods of making and using those antibodies
AU2008314697B2 (en) * 2007-10-22 2013-08-29 Merck Serono S.A. Single IFN-beta fused to a mutated lgG Fc fragment
RU2010138612A (ru) 2008-02-20 2012-03-27 Джи2 ИНФЛЕММЕЙШН ПТИ ЛТД (AU) ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ C5аR
WO2009149081A1 (en) 2008-06-02 2009-12-10 Novelmed Therapeutics, Inc. Method for treating inflammatory conditions
WO2009151634A1 (en) 2008-06-12 2009-12-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Complement inhibitory agents as therapeutics in posttraumatic and degenerative arthritis
WO2010000864A1 (en) 2008-07-04 2010-01-07 Novo Nordisk A/S Method for producing monoclonal antibodies
SG172338A1 (en) 2008-12-22 2011-07-28 Chemocentryx Inc C5ar antagonists
WO2011100477A2 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Taiga Biotechnologies, Inc. Antibodies and processes for preparing the same
EP3708190A1 (en) 2010-02-26 2020-09-16 Novo Nordisk A/S Stable antibody containing compositions
CN105055306B (zh) 2010-05-28 2019-10-01 诺沃—诺迪斯克有限公司 包含抗体和防腐剂的稳定的多剂量组合物
JP2013533871A (ja) * 2010-06-30 2013-08-29 ノヴォ ノルディスク アー／エス 組織因子経路インヒビターに特異的に結合することが可能な抗体
EP2593130A2 (en) * 2010-07-15 2013-05-22 Novo Nordisk A/S Stabilized factor viii variants
WO2012088247A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Medimmune, Llc Anti-c5/c5a/c5adesr antibodies and fragments
WO2012168199A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Novo Nordisk A/S Therapeutic antibodies
CN105392803B (zh) 2013-05-08 2019-12-06 诺和诺德股份有限公司 C5aR拮抗剂的用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003062278A1 (en) * 2002-01-25 2003-07-31 G2 Therapies Ltd MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST EXTRACELLULAR LOOPS OF C5aR
WO2008022390A1 (en) 2006-08-22 2008-02-28 G2 Inflammation Pty Ltd Anti-c5ar antibodies with improved properties

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Current Opinion in Biotechnology. Vol. 20, No. 6, pp. 685-691 (2009) 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
PL2718322T3 (pl) 2019-07-31
BR112013031198B1 (pt) 2020-10-20
JP2017081941A (ja) 2017-05-18
US20130004514A1 (en) 2013-01-03
AU2012266487B2 (en) 2016-12-08
EP3424953A1 (en) 2019-01-09
JP6416177B2 (ja) 2018-10-31
US20210238300A1 (en) 2021-08-05
CN103596982A (zh) 2014-02-19
US20130295116A1 (en) 2013-11-07
CN103596982B (zh) 2016-11-02
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