ES2283594T5 - Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a C5 y C5a sin impedir la formación de C5b - Google Patents

Description

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DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a C5 y C5a sin impedir la formación de C5b

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Patente de EE.UU. Nº 60/313,137 presentada el 17 5 de agosto de 2001.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a inhibidores de la inflamación que se unen a las proteínas C5 y C5a del sistema del complemento sin inhibir la formación de los complejos de ataque a la membrana (en lo sucesivo abreviadamente MAC, por la expresión inglesa Membrane Attack Complexes) denominados C5b y C5b-9.

10 Fundamento de la invención

El sistema del complemento juega un papel central en la eliminación de los complejos inmunes y en las respuestas inmunes a agentes infecciosos, antígenos extraños, células infectadas por virus y células tumorales. Sin embargo, una activación inapropiada o excesiva del sistema del complemento puede conducir a consecuencias perjudiciales, incluso potencialmente letales, debido a una inflamación grave que da como resultado la destrucción de tejidos. 15 Estas consecuencias se manifiestan clínicamente en diversos trastornos que incluyen choque septicémico, lesiones miocárdicas así como lesiones intestinales por isquemia/reperfusión, rechazo de injertos, insuficiencia orgánica, nefritis, inflamación patológica y enfermedades autoinmunes. La septicemia, por ejemplo, es la causa principal de mortalidad produciendo, sólo en Estados Unidos, más de 200.000 muertes al año. A pesar de los importantes avances en los últimos años en el tratamiento de las infecciones graves, continúa aumentando la prevalencia y

20 mortalidad por septicemia. Por consiguiente, la inhibición de la activación excesiva o no controlada de la cascada del sistema del complemento podría proporcionar ventajas clínicas a pacientes con dichas enfermedades y estados.

El sistema del complemento está compuesto por un grupo de proteínas que normalmente están presentes en el suero en estado inactivo. La activación del sistema del complemento se realiza principalmente por dos vías distintas, denominadas vía clásica y vía alternativa (V.M. Holers, en Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. 25 Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). La vía clásica es una cascada dependiente del calcio/magnesio, que es activada normalmente por la formación de complejos antígeno-anticuerpo. También puede ser activada de manera independiente de los anticuerpos por la unión de proteína C reactiva, complejada con un ligando, y por muchos agentes patógenos incluyendo las bacterias gram-negativas. La vía alternativa es una cascada dependiente del magnesio que es activada por deposición y activación de C3 sobre ciertas superficies sensibles (por ejemplo,

30 polisacáridos de paredes celulares de levaduras y bacterias y ciertos materiales polímeros).

Estudios recientes han mostrado que el complemento también puede ser activado por la vía de la lectina, que implica la unión inicial de la lectina unida a la manosa y la posterior activación de C2 y C4, que son comunes a la vía clásica (Matsushlta, M. et al., J. Exp. Med. 176: 1497-1502 (1992); Suankratay. C. et al., J. lmmunol. 160: 3006-3013 (1998)). Las pruebas acumuladas indican que la vía alternativa participa en el aumento de la actividad tanto de la vía 35 clásica como de la vía de la lectina (Suankratay, C., ibid; Farries, T.C. et al., Mol. lmmunol. 27: 1155-1161(1990)). La activación de la vía del complemento genera fragmentos biológicamente activos de las proteínas del complemento, por ejemplo anafitotoxinas C3a, C4a y C5a y complejos de ataque a la membrana (MAC) C5b-9, que median las respuestas inflamatorias a través de la implicación de la quimiotaxia de los leucocitos, la activación de macrófagos, neutrófilos, plaquetas, mastocitos y células endoteliales, el aumento de la permeabilidad vascular, la citolisis y las

40 lesiones de tejidos.

La proteína C5a del complemento es uno de los mediadores pro-inflamatorios más potentes del sistema del complemento. C5a es la forma activada de C5. La proteína C5 del complemento (peso molecular 190 kD) está presente en el suero humano en una cantidad de aproximadamente 80 μg/ml (Kohler, P.F. et al., J. Immunol. 99: 1211-1216 (1967)). Está compuesta por dos cadenas polipeptídicas, α y β, con pesos moleculares aproximados de

45 115 kD y 75 kD, respectivamente (Tack, B.F. et al., Biochemistry 18: 1490-1497 (1979)). Biosintetizada como una pro-molécula monocatenaria, la proteína C5 se escinde enzimáticamente en una estructura bicatenaria durante el tratamiento y la secreción. Después de la escisión, las dos cadenas se mantienen juntas por al menos un enlace disulfuro, así como por interacciones no covalentes (Ooi, Y.M. et al., J. lmmunol. 124: 2494-2498(1980)).

Las estructuras primarias de aminoácidos de C5 de seres humanos y múridos se obtuvieron a partir de los datos de 50 secuenciación del cDNA (Wetsel, R.A. et al., Biochemistry 27: 1474-1482 (1988); Haviland, D.L. et al., J. Immunol.

146: 362-368 (1991); Wetsel, R.A. et al., Biochemistry 26: 737-743 (1987)). La secuencia de aminoácidos deducida de la pre-pro-C5 humana precursora tiene 1676 aminoácidos. Las cadenas α y β de la C5 madura tienen 999 y 655 aminoácidos, respectivamente. C5 está glicosilada en su cadena α, en particular la asparagina del residuo 64.

La C5 se escinde en los fragmentos C5a y C5b durante la activación de las vías del complemento. Las enzimas

55 convertasas responsables de la activación de C5 son complejos de múltiples subunidades de C4b, C2a y C3b para la vía clásica y de (C3b)2, Bb y P para la vía alternativa (Goldlust, M.B. et al., J. Immunol. 113: 998-1007 (1974);

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específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Los animales pueden también inmunizarse con construcciones de DNA que expresan las proteínas codificadoras in vivo para inducir anticuerpos específicos. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos que se fusionan con las células del mieloma utilizan un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula del hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células del hibridoma así preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parenterales no fusionadas. Por ejemplo, si a las células de mieloma parenterales les falta la enzima hipoxantinaguanina-fosforribosilo-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluiría típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), las cuales evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Entre estas líneas de células de mieloma están las líneas de mieloma de múridos, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 proporcionadas por The Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, y las células SP2/0 o X63-Ag8-653 proporcionadas por The American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA. También están descritas las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133-3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). También pueden usarse la línea de célula de mieloma de ratón NS0 (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire UK).

Se valora la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno del medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma puede determinarse por inmunoprecipitación o por una valoración in vitro de la unión, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoenzimático (ELISA).

Después de identificar las células del hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse por métodos de dilución limitante y cultivarse por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o PRMI-1640. Además, las células del hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico o suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente por procedimientos convencionales (Innis M. et al., en PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic, San Diego, CA (1990), Sanger, F.S. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 74: 5463-5467 (1977)). Las células del hibridoma sirven como fuente de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede ser colocado en vectores de expresión, que son transfectados a continuación a células hospedadoras, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células del mieloma que de otra manera no producen la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. A continuación se describirá con más detalle la producción recombinante de anticuerpos.

En una realización adicional, pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de colección de anticuerpos de fagos generados usando las técnicas descritas en McCafferty, et al., Nature 348: 552-554 (1990). Clackson, et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks, et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos humanos y de múridos, respectivamente, usando colecciones de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por mezclamiento de las cadenas (Marks, et al., Bio/Tecnology 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para la construcción de colecciones muy amplias de fagos (Waterhouse, et al., Nucl. Acids. Res. 21:22652266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridomas de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El DNA también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes humanos de cadenas pesada y ligera en lugar de las secuencias de múridos homólogas (Pat. de EE.UU. Nº 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)) o uniendo covalentemente a la secuencia codificadora de la inmunoglobulina todo o parte de la secuencia codificadora de un polipéptido no inmunoglobulina.

Típicamente, los dominios constantes de un anticuerpo son sustituidos por dichos polipéptidos que no son inmunoglobulinas o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de un anticuerpo en el que se combina con el antígeno para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con el antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio en de combinación con el antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

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Otra alternativa es utilizar una fusión eléctrica en lugar de una fusión química para formar hibridomas. Esta técnica está bien establecida. En lugar de fusión, también se puede transformar una célula B para hacerla inmortal usando, por ejemplo, un virus de Epstein Barr, o un gen transformante. (Véase, por ejemplo, “Continuously Proliferating Human Cell Lines Synhesizing Antibody of Predetermined Specificity”, Zurawaki, V.R. et al., en Monoclonal Antibodies, ed. por Kennett R.H. et al., Plenum Press, N.Y. 1980, pp 19-33).

B. Anticuerpos humanos y humanizados

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente, que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan con frecuencia residuos “de importación”, que son obtenidos típicamente de un dominio variable “de importación”. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verheyen, et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano por las secuencias CDR o CDR de roedores. En consecuencia, en dichos anticuerpos “humanizados”, ha sido sustituido un dominio variable humano sustancialmente menor que el intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos típicamente humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR están sustituidos por residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se usan para formar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado “mejor ajuste”, se selecciona la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor de la colección completa de secuencias humanas de dominio variable conocidas. A continuación se acepta la secuencia humana que esté más próxima a la del roedor como el marco (FR) humano para el anticuerpos humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede usarse el mismo marco para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Además es importante que los anticuerpos sean humanizados de forma que mantengan la alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están fácilmente disponibles y son familiares a los expertos en la técnica. Existen programas de ordenador que ilustran y presentan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en la función de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De este modo, pueden seleccionarse los residuos de FR y combinarse a partir de las secuencias receptoras y de importación para conseguir la característica deseada del anticuerpo, tal como mayor afinidad por el(los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la unión con el antígeno.

Alternativamente, el experto puede producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, por inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Dichos ratones transgénicos son proporcionados por Abgenix, Inc., Fremont, California y Medarex, Inc., Annandale, New Jersey. Se ha descrito que la supresión (deleción) homozigótica del gen de la región de unión (JH) de cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la disposición de genes de inmunoglobulina humanos de línea germinal en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos por inoculación de antígenos. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in lmmunol.

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(1993); y Duchosal et al., Nature 355:258 (1992). De las colecciones que presentan fagos también pueden derivarse anticuerpos humanos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581597 (1991); Vaughan, et al., Nature Biotech 14:309 (1996)).

C.

Anticuerpos desimnumizados™

Los anticuerpos desinmunizados™ son anticuerpos en los que han sido eliminados los epítopos potenciales del linfocito T, como se ha descrito en la Solicitud de Patente PCT/GB98/01473. Por consiguiente, se espera que sea eliminada o sustancialmente reducida la inmunogenicidad en seres humanos cuando se multiplican in vivo.

Adicionalmente, los anticuerpos pueden modificarse químicamente por conjugación covalente a un polímero para aumentar su semivida en circulación. Los polímeros y métodos para unirlos a los péptidos preferidos se muestran en las Patentes de EE.UU. Nos 4.766.106; 4.179.337; 4.495.255; y 4.509.546. Los polímeros preferidos son polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a la temperatura ambiente y tiene un peso molecular medio preferido entre 1000 y 40.000, más preferiblemente entre 2000 y 20.000, más preferiblemente entre

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D. Generación de los MAb anti-C5/C5a

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser generados por métodos de hibridoma tradicionales muy conocidos en la técnica. En resumen, los ratones son inmunizados con C5 purificada procedente de sueros humanos como inmunógeno emulsionado en coadyuvante completo de Freund e inyectado subcutánea e intraperitonealmente en cantidades que varían entre 10-100 µg. Después de 10 a 15 días, los animales inmunizados son revacunados con más C5, emulsionado en coadyuvante completo de Freund. A continuación los animales son periódicamente revacunados en un programa de inmunización semanal a bisemanal.

Para cada fusión, se prepararon suspensiones de una sola célula a partir del bazo de un ratón inmunizado y se usaron para fusión con células de mieloma SP2/0. Las células SP2/0 (1 x 108) y las células de bazo (1 x 108) se fusionaron en un medio que contenía polietilenglicol al 50% (Peso molecular = 1450) (Kodak, Rochester, NY) y dimetilsulfóxido al 5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). A continuación se ajustaron las células hasta una concentración de 1,7 x 105 células de bazo/ml de la suspensión en medio DMEM (Gibco, Grand Island, NY), complementado con suero bovino fetal al 5% y HAT (hipoxantina sódica 10 nM, aminopterina 40 μM y timidina 1,6 mM). Se añadieron 250 μl de la suspensión celular a cada pocillo de aproximadamente 50 microplacas de 96 pocillos. Después de aproximadamente 10 días se retiraron los líquidos sobrenadantes del cultivo para clasificar la reactividad con C5 humano purificado por ELISA.

Pocillos de microplacas de ensayo Immulon II (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) se revistieron durante una noche con C5 humano a 0,1µg/ml (50 μl/pocillo). A continuación se saturaron los sitios de unión no específicos en los pocillos por incubación con 200 μl de BLOTTO al 5% (leche desnatada en polvo) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante una hora. A continuación se lavaron los pocillos con tampón PBST (PBS que contiene TWEEN® 20 al 0,05%). Se añadieron 50 μl de líquido sobrenadante de cada pocillo de fusión al pocillo revestido junto con 50 μl de BLOTTO durante una hora a la temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con PBST. A continuación se detectaron los anticuerpos unidos por reacción con IgG (Fc específico) anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante una hora a la temperatura ambiente. A continuación se lavaron los pocillos con PBST. Se añadió a los pocillos disolución de sustrato de peroxidasa que contenía 3,3,5,5-tetrametilbencidina al 0,1% (Sigma, St. Louis, MO) y peróxido de hidrógeno al 0,003% (Sigma, St. Louis, MO) en acetato de sodio 0,1M a pH 6,0 para el desarrollo de color durante 30 minutos. Se terminó la reacción por adición de 50 μl de H2SO4 2M por pocillo. Se leyó la densidad óptica (DO) a 450 nm con un lector ELISA (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA).

Los hibridomas en pocillos positivos a la reactividad de C5 se clonaron en una sola célula por un método de dilución limitante. A continuación se ampliaron los hibridomas monoclonales y se recogieron los líquidos sobrenadantes del cultivo para purificación por cromatografía con la proteína A. A continuación se caracterizó la reactividad de los anticuerpos purificados con C5 y C5a humanos por ELISA, para la determinación de las constantes de afinidad y unión cinética por BIACORE, para los efectos sobre la hemolisis mediada por el complemento, tanto por la vía clásica como por la vía alternativa y para la inhibición de la fijación de 125I-C5a a neutrófilos humanos purificados.

Los anticuerpos también pueden seleccionarse por el método de selección o clonación (denominado panning) de una colección de scFv humanos a los que se une C5 (Griffiths et. al., EMBO J. 12:725-734 (1993)). La especificidad y actividad de clones específicos pueden evaluarse por ensayos conocidos (Griffiths et al.; Clarkson et. al., Nature,

352: 642-648 (1991)). Después de una primera etapa de exploración, se obtiene una colección de fagos que contienen una pluralidad de diferentes anticuerpos monocatenarios sobre el fago mejorando la unión al C5. Etapas de exploración subsiguientes proporcionan más colecciones con mayores afinidades de unión. Cuando los efectos de avidez son un problema, pueden usarse colecciones que presentan fagos monovalentes en las que menos del 20%, menos del 10% o menos del 1% del fago presenta más de una copia de un anticuerpo sobre la superficie del fago. La presentación monovalente puede realizarse con el uso de un fagémido y un fago auxiliar. El fago adecuado incluye el fago filamentoso M13, fl y fd. También se conoce la presentación de la proteína de fusión con las proteínas del revestimiento del virus y pueden usarse en esta invención.

Adicionalmente se caracterizó el MAb 137-26, que se une tanto a la C5 como a la C5a con afinidad comparable. El MAb 137-26 no inhibe la activación de C5, pero inhibe con gran potencia la unión de C5a a C5aR en neutrófilo humanos purificados. Los experimentos que demuestran estas propiedades se explican con más detalle en los Ejemplos siguientes.

Para seleccionar anticuerpos que se unen a un epítopo particular en el antígeno de interés (por ejemplo, los que bloquean la unión de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria al C5), puede realizarse una valoración habitual de bloqueo cruzado, tal como la descrita en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativamente, puede realizarse la cartografía del epítopo, por ejemplo como describen Champe et al., en J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) para determinar si el anticuerpo se une al epítopo de interés.

E. Preparación de otros inhibidores de la invención

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Pueden aislarse o seleccionarse otras moléculas adecuadas para uso en la invención de colecciones (quimiotecas) de compuestos por medios convencionales, por ejemplo, determinando si se unen a C5/C5a, y realizar a continuación una selección funcional para determinar si inhiben la actividad de C5b. Las Patentes de EE.UU. Nº

5.901.069 y 5.463.564 describen un sistema automatizado para generar y seleccionar una colección de compuestos. Métodos más centrados implican una selección competitiva frente al MAb 137-26, o realizar un modelo tridimensional del sitio de unión y a continuación preparar una familia de moléculas que se adaptan al modelo. Se seleccionan entonces las que presentan características de unión óptimas. Además, pueden identificarse otras moléculas por valoración de la competición o una selección funcional de inhibidores con las mismas propiedades que MAb 137-26.

F. Utilización de los inhibidores de la invención

Las moléculas de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía y a una concentración que sea terapéuticamente eficaz para la indicación o finalidad buscada. Para conseguir este objetivo, los anticuerpos pueden formularse empleando una variedad de excipientes aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos se administran por inyección. Los métodos para realizar esta administración son conocidos por los expertos en la técnica. También puede ser posible obtener composiciones que puedan ser administradas por vía tópica u oral, o que puedan ser capaces de transmitirse por las membranas mucosas.

La dosificación y modo de administración dependerá del paciente y del agente que se va a administrar. La dosificación puede determinarse por experimentación habitual en ensayos clínicos o extrapolación de modelos animales en los que fue eficaz el anticuerpo.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de enfermedades y estados mediados por la producción excesiva o no controlada de C5a. A continuación se describe la prueba de la utilidad de los inhibidores de la invención en el tratamiento de estas enfermedades y estados.

Ejemplo 1: Reactividad del MAb 137-26 con C5 y C5a humanas

Se analizó la reactividad de MAb 137-26 con C5 y C5a recombinante humanas purificadas (Sigma, St. Louis, MO). Los procedimientos del ELISA se describieron anteriormente. MAb 137-26 se une a C5a de manera dependiente de la dosis con gran potencia (Fig. 1). Otro MAb 137-76 anti-C5, específico de la cadena β de C5 humano, no se une a C5a, debido a que C5a reside en la cadena α de C5. Un anticuerpo irrelevante de isotipo similar usado como control negativo tampoco reacciona con C5a. Por otro lado, tanto MAb 137-26 como MAb 137-76 se unen a C5 (Fig. 2).

La constante de equilibrio de afinidad y las constantes cinéticas de unión (asociación y disociación) de MAb 137-26 con C5a y C5 se determinaron también por un instrumento BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden). Todas las

medidas de unión se realizaron en solución salina tamponada de HEPES (HBS)(HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, Tensioactivo P20 al 0,005%) a 25ºC. Para medir las constantes del índice de unión de C5 y C5a a MAb 137-26, se inmovilizaron anticuerpos IgG(Fc) anti-ratón de conejo en un chip sensor CM5 por acoplamiento amínico usando N-hidroxisuccínico y N-etil-N’-(3-dietilaminopropil)carbodiimida. A continuación el chip sensor recubierto capturó MAb 137-26 antes de la inyección de C5 a concentraciones diferentes. Los datos se resumen en la Tabla 1. El MAb 137-26 tiene una alta afinidad de unión tanto para la C5a como para la C5 en solución. Los resultados también indican que MAb 137-26 se une a un epítopo compartido tanto por C5a como por C5.

Tabla 1 Constantes cinéticas de C5 y C5a que se unen a MAb 137-26

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kOFF kD

(M-1s-1)

(s-1) (M)

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1,42 x 105 6,97 x 10-5 4,92 x 10-10

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3,7 x 106 2,25 x 10-4 6,09 x 10-11

KON, constante cinética de asociación KOFF, constante cinética de disociación KD, constante de equilibrio de disociación = kON/kOFF

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Ejemplo 2: Hemolisis mediada por el complemento

Para estudiar los efectos de MAb 137-26 sobre la activación de C5 en suero humano, se analizó el anticuerpo para determinar la inhibición de la hemolisis mediada por las vías clásica y alternativa del complemento.

Para los experimentos por la vía clásica, se sensibilizaron eritrocitos de pollo (5 x 107 células/ml) en solución salina tamponada de gelatina/veronal (GVB++) que contenía MgCl2 0,5 mM y CaCl2 0,15 mM con inmunoglobulinas purificadas de eritrocitos anti-pollo de conejo a 8 μg/ml (Inter-Cell Technologies, Hoperwell, NJ) durante 15 minutos a 4 ºC. A continuación se lavaron las células con GVB++. Las células lavadas se volvieron a poner en suspensión en el mismo tampón a 1,7 x 108 células/ml. En cada pocillo de una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos, se mezclaron 50 μl de suero humano normal (5,2%) con 50 μl de GVB++ de MAb 137-26 diluido en serie o un MAb 17562 anti-C2 como control positivo. A continuación se añadieron a los pocillos que contenían las mezclas 30 μl de la suspensión de eritrocitos de pollo sensibilizados y lavados. Se mezclaron 50 μl de suero humano normal (5,2%) con 80 μl de GVB++ para obtener el fondo de color del suero. Como control negativo se empleó un MAb anti-VIH-1 gp 120 de isotipo similar. La concentración final en el suero humano usada fue 2%. Se incubó la mezcla a 37 ºC durante 30 minutos. Se agitó la placa en un microagitador de placas durante 15 segundos. A continuación se centrifugó la placa a 300 x g durante 3 minutos. Se recogieron los líquidos sobrenadantes (80 μl) y se transfirieron a pocillos de una microplaca de fondo plano de 96 pocillos para medir la DO a 405 nm por un lector de placas ELISA. El porcentaje de inhibición de la hemolisis se define como:

100 x [(DOsin MAb – DOfondo de color del suero) – (DOcon MAb – DOfondo de color del suero)]/(DOsin MAb – DOfondo de color del suero).

La Fig. 3 muestra que MAb 137-26 y el MAb G3-519 control irrelevante no inhiben la hemolisis por la vía clásica de eritrocitos de pollo sensibilizados, mientras que el control positivo, MAb 175-62, inhibe eficazmente la hemolisis. La C2 está implicada específicamente en la vía clásica del complemento.

Para la vía alternativa, se lavaron tres veces eritrocitos de conejo no sensibilizados con solución salina tamponada de gelatina/veronal (GVB/Mg-EGTA) que contenía MgCl2 2mM y EGTA 1,6 mM. Se usó EGTA a una concentración de 10 mM para inhibir la vía clásica (K. Whaley et al., en A.W. Dodds (Ed.), Complement: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, 1997, pp 19-47). Los procedimientos de valoración son similares a los de la valoración de la hemolisis por la vía clásica antes descritos. La concentración final del suero humano utilizado en la valoración era del 10%. Se usó MAb 166-32 anti-factor D como control positivo. Como control negativo se uso el mismo MAb anti-VIH-1 gp 120 irrelevante del mismo isotipo antes descrito.

La Fig. 4 muestra que MAb 137-26 no inhibe la hemolisis por la vía alternativa de eritrocitos de conejo no sensibilizados, mientras que el MAb 166-32 anti-factor D inhibe fuertemente la hemolisis. El factor D es específico para la vía alternativa del complemento. El anticuerpo control negativo no produce ningún efecto.

Considerados juntos, los resultados verifican que MAb 137-26 no inhibe la activación de C5 y por consiguiente no es inhibida la formación de C5a y C5b-9. el MAb-137-26 no inhibe la activación de las vías clásica y alternativa del complemento.

Ejemplo 3: Inhibición de la unión de 125I-C5a a neutrófilos humanos purificados por MAb 137-26

Se purificaron neutrófilos humanos a partir de sangre completa humana y se diluyeron con Dextran T-500/solución salina. La mezcla se incubó a la temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos o hasta que apareció una capa superficial claramente definida. Esta capa superficial se transfirió a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Después de la centrifugación, el sedimento celular se puso en suspensión en 30 ml de PBSB frío (BSA al 1% en PBS). La suspensión celular se extendió en capas sobre la parte superior de 10 ml de Histopaque-1077 (Sigma, St. Louis, MO) en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Después de otra centrifugación, el sedimento celular se volvió a poner en suspensión en 20 ml de NaCl al 0,2% frío durante 30 segundos para lisar los eritrocitos. A continuación, se añadieron 20 ml de NaCl al 1,6% frío a la suspensión celular, se volvió a centrifugar y a continuación se volvieron a poner en suspensión los neutrófilos en PBSB. Se mantuvieron los neutrófilos en hielo hasta que se utilizaron para la unión 125I-C5a.

El MAb 137-26 se diluyó en serie en tubos de centrífuga Eppendorf de 1,5 ml con un tampón de unión (medio BSA al 1% en RPMI1640) obteniendo concentraciones finales que variaban de 640 nM a 0,04 nM. Se añadieron 4 μl de 125I-C5a 4 nM (NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA) a 36 μl de MAb 137-26 diluido para incubación a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Como control positivo se usó C5a humana recombinante purificada (Sigma, St. Lous, MO), mientras que como control negativo se usó anticuerpo monoclonal irrelevante de isotipo similar. Para la unión máxima de 125I-C5a, se usaron en cambio 36 μl del tampón de unión sin los anticuerpos o C5a. Para incubación en hielo se añadieron a cada tubo 50 μl de la suspensión de neutrófilos. Al final de un periodo de incubación de 40 minutos, se transfirió la mezcla de cada tubo a la parte superior de un otro tubo Eppendorf que contenía 800 μl de un tampón de separación (BSA al 6% en PBS). A continuación se centrifugaron los tubos a 2000 x g durante 3 minutos a la temperatura ambiente. Después que se aspiró el líquido sobrenadante, el sedimento celular se volvió a poner en suspensión en 0,5 ml de agua desionizada para lisar las células. A continuación se mezcló el lisado celular con 3 ml de fluido de centelleo Ulmina Gold (Packard Instrument, Meriden, CT) para recuento radiactivo.

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